Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uracil-DNA-glycosylaseassay ved matrixassisteret laserdesorption/ionisering Time-of-flight Massespektrometrianalyse

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

En ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode til assay uracil-DNA-glycosylaseaktivitet blev udviklet ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri til direkte apurinisk/ apyrimidinisk stedholdig produktanalyse. Assayet viste sig at være ret simpelt, specifikt, hurtigt og let at bruge til DNA-glycosylasemåling.

Abstract

Uracil-DNA-glycosylase (UDG) er en nøglekomponent i baseudskæringsreparationsvejen til korrektion af uracil dannet ved hydrolytisk deaminering af cytosin. Det er således afgørende for vedligeholdelse af genomintegritet. En meget specifik, ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode blev udviklet til at måle UDG-aktivitet. En syntetisk DNA-duplex indeholdende en stedsspecifik uracil blev spaltet af UDG og derefter underkastet Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse. En protokol blev etableret for at bevare det apuriniske / apyrimidiniske sted (AP) produkt i DNA uden strengbrud. Ændringen i m/z-værdien fra substratet til produktet blev anvendt til at evaluere uracilhydrolyse ved UDG. Et G: U-substrat blev anvendt til UDG-kinetisk analyse, der gav Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM / s og Kcat = 9,31 s-1. Anvendelse af denne metode på en uracil glycosylasehæmmer (UGI) assay gav en IC50-værdi på 7,6 pM. UDG-specificiteten ved anvendelse af uracil på forskellige positioner inden for enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-substrater viste forskellige spaltningseffektiviteter. Således kan denne enkle, hurtige og alsidige MALDI-TOF MS-metode være en glimrende referencemetode til forskellige monofunktionelle DNA-glycosylaser. Det har også potentialet som et redskab til SCREENING AF DNA-glycosylasehæmmere.

Introduction

Selvom uracil er en normal base i RNA, er det en almindelig og meget mutagent læsion i genomisk DNA. Uracil kan opstå ved spontan/enzymatisk hydrolytisk deaminering af en deoxycytidin. I hver levende celle forekommer denne deaminering 100-500 gange om dagen under fysiologiske forhold1,2. Hvis disse ændringer ikke repareres, kan der være en ændring i DNA-sekvenssammensætningen, hvilket forårsager mutation. Da uracil i DNA foretrækker at parre sig med dATP under replikation, hvis cytosin deaminerer til uracil, vil der i to replikationshændelser være en ny G: C til A: T overgangsmutation i halvdelen af afkom DNA3.

Blandt de cellulære strategier til opretholdelse af genetisk stabilitet er base excision repair (BER) en væsentlig mekanisme, der reparerer beskadigede baser, såsom uracil, i DNA4. BER er en meget evolutionært bevaret proces. Der er to generelle BER-veje: den korte patchvej, der fører til en reparationskanal af et enkelt nukleotid, og den lange patchvej, der producerer en reparationskanal på mindst to nukleotider5. BER er en koordineret mekanisme, der forekommer i flere trin. Det første trin i BER er den enzymatiske hydrolyse af den beskadigede nukleotidbase ved hjælp af en skadesspecifik DNA-glycosylase for at generere et apurinisk/apyrimidinisk (AP) mellemliggende sted6. Dette efterfølges af spaltningen af sukkerfosfatrygraden på AP-stedet af en endonuklease, oprydning af DNA-enderne med en lyase, gap-fyldning af en DNA-polymerase og forsegling af det endelige nick med en ligase5.

Uracil-DNA-glycosylase (UDG) hydrolyserer uracil fra uracilholdigt DNA til BER i Escherichia coli. Konventionelle UDG-assays ved hjælp af radioaktivt mærket DNA, der involverer forskellige separationsteknikker6,7,8,9,10,11,12,13, er normalt tidskrævende, arbejdskrævende, med dyre mærkningsreagenser, komplicerede procedurer og kræver intensiv træning og praksis for at reducere risikoen for eksponering for radioaktive materialer. Fluorometriske oligonukleotidassays er udviklet som erstatning for radioisotopmærkning14, ud over molekylære fyrtårne og Förster resonansenergioverførselsteknologi15,16,17,18,19,20. Der kræves dog specifik mærkning for alle ovennævnte metoder. For nylig er der udviklet etiketfrie biosensorer assays21,22,23 og kolorimetriske metoder baseret på dannelsen af en G-quadruplex24,25,26. Imidlertid komplicerer flere A: U-par eller specielt designede sekvenser i sonderne enzymenhedsdefinitionen.

MALDI-TOF MS er en teknologi, der kan være til stor nytte i DNA-analyse. Udviklede anvendelser omfatter enkeltnukleotidpolymorfisme genotyping27,28, modificeret nukleotidanalyse29 og DNA-reparation mellemidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bør let anvendes til DNA-glycosylaseanalyse til påvisning af AP-site-holdige DNA-produkter. AP-steder i DNA er imidlertid tilbøjelige til at bryde streng under mange eksperimentelle forhold33. Et UDG-assay præsenteres her ved hjælp af MALDI-TOF MS til direkte måling af AP-produktionsstedet uden betydelig strengbrudsstøj. Denne etiketfri metode er let at arbejde med og har et stort potentiale for farmaceutisk anvendelse af DNA-glycosylasehæmmerscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af substrat/skabelon

  1. Design uracil substrat/skabelon duplex med et afbalanceret G + C indhold på ~ 50 ± 10% og minimum smeltetemperatur på 50 ° C for duplex regionen.
    BEMÆRK: En nukleotidforskel mellem 18 nt substrater og 19 nt skabeloner (tabel 1 og figur 1) hjælper med bedre MS signalfortolkning og passende udglødning. Skabelonstrengen fungerer som komplementært DNA til at generere A-U- eller G-U-mismatch (tabel 1), men kan også bruges som referencesignal i MS-målinger. Anvendelsen af HPLC-oprensede syntetiske oligonukleotider er tilfredsstillende for denne undersøgelse.
  2. DNA opløses i 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl(pH 8,0 ved 25 °C) (TE) i en koncentration på 100 μmol/l som lager og opbevares ved -20 °C. Fortynd denne 20 μL stamme med TE til et endeligt volumen på 800 μL (25 gange fortynding til 4 μmol/L). DNA-opløsningens absorbans måles i et UV-synligt spektrofotometer ved λ = 260 nm for at sikre fabrikantens tildelte koncentration. For eksempel: A260 = 0,204 for 4 μmol/l U+9 og A260 = 0,192 for 4 μmol/l T1 (tabel 1).
  3. Udfør MALDI-TOF MS-analyse (afsnit 4-6) for oligonukleotidkvalitetskontrol ved at inspicere unikke spidsbelastningssignaler ved angivne m/z-værdier samt ved at kontrollere, at signal-støj-forholdet er >100 (figur 1B og figur 1D).

2. DNA-glycosylaseassay

  1. Ved anvendelse af et G:U-substrat af T1/U+9-dupleks (tabel 1 og figur 1A) til glycosylasereaktionen, f.eks. i et sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 ml, tilsættes 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG-reaktionsbuffer, 5 μL T1-stam og 5 μL U+9-stamme (trin 1,2.).
    BEMÆRK: Vælg den rigtige type mikropipette, og følg producentens anvisninger for at håndtere den ønskede lydstyrke. Brug for eksempel en 2 μL pipette til at dispensere 0,1-2 μL væske, brug en 10 μL pipette til at dispensere 2-10 μL væske, og brug en 100 μL pipette til at dispensere 20-100 μL væske for at sikre nøjagtighed og præcision af resultaterne. Det beskrevne volumen af reagensblandingen er til 10 assays; juster lydstyrken for det ønskede antal reaktioner. 1x UDG-reaktionsbufferen indeholder 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol og 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 ved 25 °C). Se materialetabellen for kilden til 10x UDG-reaktionsbuffer.
  2. Luk røret sikkert; inkuberes i et vandbad i 30 minutter ved 65 °C, derefter i 30 minutter ved 37 °C og til sidst på is i 3 minutter for at sikre korrekt udglødning af substratet/skabelonduplekset.
  3. I et sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 ml tilsættes 49 μL iskold 1x UDG-reaktionsbuffer og 1 μL UDG (5.000 enheder/ml; se materialetabellen), fortynding til 0,1 enheder/μL. Foretag serielle fortyndinger med 1x UDG-buffer til de ønskede enzymkoncentrationer på 0,05, 0,02 eller 0,01 enheder/μL. Opbevar altid den fortyndede UDG på is.
    BEMÆRK: I en 10 μL reaktion kan 0,1 enheder UDG spalte mere end 30 pmol uracil fra en T1 / U + 9 duplex på 3 minutter.
  4. I et sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 ml tilsættes 9,0 μL substratblanding fra trin 2,2 og forvarmer røret til 37 °C. Der tilsættes 1,0 μL af den fortyndede UDG fra trin 2.3. Brug en timer til at time reaktionen og svirpe røret for at blande indhold.
    BEMÆRK: For et enhedsdefinitionsassay er inkubationstiden 30 minutter. For et kinetisk assay skal du bruge en tidsforløbsanalyse på 0,5, 1, 2, 3, 5 minutter for at opnå den indledende hastighed. For et UGI-hæmningsassay skal reaktionen tid i 15 minutter.
  5. Centrifugering af rørene med reaktionsblandingen i 3-5 s ved 3.200 × g ved omgivelsestemperatur. Derefter overføres reaktionen straks til 37 °C.
  6. Reaktion opsigelse
    1. Forbered opløsninger af 0,25 M HCI og 0,23 M Tris base. I et 15 ml reagensglas tilsættes 10 ml af en opløsning på 1 mM EDTA og 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 ved 25 °C) for at efterligne 1x UDG-reaktionsbuffer. Syr med 1 ml 0,25 M HCl og kontroller med en pH-meter for at sikre, at pH er ~ 2 ± 0,5. Neutraliser med 1 ml 0,23 M Tris-base og kontroller med en pH-meter for en endelig pH på 6,5 ± 0,5.
      BEMÆRK: Brug af pH-teststrimler er en hurtig og nem måde at bekræfte pH-niveauerne i reagensblandingen på.
    2. Der tilsættes 1 μL 0,25 M HCl for at syrne 10 μL-reaktionsblandingen for at inaktivere enzymet og lægge det på is i 6 minutter. Tilsæt 1 μL 0,23 M Tris-base for at neutralisere DNA-produkterne for at undgå brud på AP-stedet ved langvarig eksponering for syre. Tilsæt 13 μL TE for at øge volumenet af produktblandingen til matrixchipoverførsel , og læg den derefter på is.
      BEMÆRK: AP-produktet er kemisk ustabilt og skal analyseres af MALDI-TOF MS inden for 2 dage. Efter langvarig opbevaring i mere end en uge forekommer akkumuleringen af en betydelig del af strengbrud på grund af β/δ eliminationsreaktioner af AP-produkterne (figur 1D-G).
  7. Overfør alle 25 μL UDG-reaktionsprodukter fra mikrocentrifugerør til en 384-brønds mikrotiterplade.
    BEMÆRK: Høje koncentrationer af kationer, såsom natrium eller kalium i buffere, genererer interferens i MALDI-TOF MS-analysen og kræver derfor afsaltning. Da E. coli UDG-reaktionsbuffer indeholder meget lave koncentrationer af kationer, er afsaltning ikke nødvendig. Modificer imidlertid denne protokol for at måle andre DNA-glycosylasereaktioner indeholdende metalkationer, der kræver afsaltning som beskrevet tidligere35.

3. Overfør UDG-reaktionsprodukter til en matrixchip

  1. Åbn døren til nanoliterdispenseren (se materialetabellen), og læg mikrotiterpladen med 384 brønde fra trin 2.7 på dækkets pladeholder.
  2. Indsæt matrixchiparrayet i den tilsvarende spejderpladeposition. Placer den lastede spejderplade på nanoliterdispenserens behandlingsdæk, og luk døren.
  3. Tryk på knappen Kør på overførselsskærmen, og vent på, at instrumentet begynder at dispensere prøver fra 384-brønds mikrotiterpladen til matrixchippen.
  4. Brug fanen Vision til at vise billedet af chippen og dispenseringsvolumenerne for hvert sted under dispensering. Sørg for, at det plettede volumen på chippen ligger i området 5-10 nL.

4. Opsæt assayparametrene på massespektrometeret

  1. Brug programprogrammet (se tabellen over materialer) til at forberede en .xlsx fil, der indeholder den forudsagte signal m/z-værdi til import.
    BEMÆRK: Indstillingerne i FILE I.xlsx (tabel 2) er eksempelindstillinger for UDG-analysen af G:U-substratet i afsnit 2.
  2. Brug programprogrammet til at oprette og definere et nyt UDG-assay ved at højreklikke på Import Assay Group i Designer Format og vælge filen .xlsx fra rullelisten (f.eks. FILE I.xlsx fra trin 4.1).
  3. Højreklik på knappen Kunde:Projekt:Plade, og klik øverst i rullemenuen for at etablere en ny analyseplade. Indtast et filnavn (f.eks. CTT20210620 for laboratoriekoden og analysedatoen) i dialogboksen, og vælg pladetypen 384-brønds pladetype, og tryk på OK på rullelisten Pladetype med 384 brønde, og tryk på OK. Se efter en tom plade, der skal vises til højre på skærmen.
  4. Klik på indstillingen Assay ; vælg assay (f.eks. FILE I.xlsx) fra rullelisten.
  5. Hvis du vil tildele det valgte assay (f.eks. FILE I.xlsx) til hver prøvepletposition på pladen, skal du flytte markøren til hver position på den tomme plade, klikke for at fremhæve brønden og højreklikke for at vælge Tilføj plex.
  6. Brug en stationær eller bærbar computer til at udarbejde en arbejdsliste i .xlsx format uden overskrift (f.eks. 0620.xlsx i tabel 3) til alle prøverne på chippen fra trin 2.7. Klik på knappen Tilføj nyt eksempelprojekt; vælg filen (f.eks. 0620.xlsx) på rullelisten for at importere arbejdslisten.
  7. Se efter alle testeksempelkoderne på arbejdslisten (f.eks. fra 0620.xlsx) til venstre på skærmen. Klik på eksempelkoden på arbejdslisten, og højreklik på den tilsvarende placering af pladen for at linke testene til hver position.

5. Massespektrometerdrift

  1. Brug applikationsprogrammet til at forbinde massespektrometeret (se materialetabellen) med prøvechippen (fra afsnit 3), der skal analyseres.
  2. Klik på standardindstillingen. Indtast et filnavn fra trin 4.3 i dialogboksen (f.eks. CTT20210620); i eksperimentets navn, indtast chip-id'et i chipstregkoden, og gem indstillingerne.
  3. Start massespektrometerstyringsprogrammet (se materialetabellen).
  4. Tryk på ind /ud-knappen på massespektrometeret, og lad dækket strække sig. Tag chipholderen ud, og indsæt prøvechippen fra trin 3.4 i chipholderen. Anbring den belastede chipholder på det forlængede dæk, og tryk på ind/ud-knappen, så prøvechippen kan komme ind i instrumentet.
  5. Dobbeltklik på ikonet Erhverv for programprogrammet. I vinduet Hent skal du klikke på fanen Automatisk kørsel for at starte instrumentet og hente massespektre fra prøverne på chippen.

6. Visning af massespektre og analyse af dataene

  1. Kør dataanalyseprogrammet (se tabellen over materialer).
  2. Gennemse databasetræet, og vælg chip-id'et fra trin 5.2. Klik for at fremhæve et mål godt på chippen, og klik på spektrumikonet for at vise massespektret.
  3. Højreklik for at vælge Tilpasningsdialog for at beskære et bestemt spektrumområde i et nyt vindue. Klik på X-aksen for at indtaste de øvre og nedre grænser for m/z, og tryk på OK for at få vist det angivne områdespektrum, herunder de signaler, der er af interesse.
    BEMÆRK: Mængden af DNA er proportional med topintensiteten ved hver m/z-værdienhed.
  4. Mål tophøjden af signalernes m/z-værdier svarende til U-substrat, AP-produkt og skabelon. Klik på toppen og se tophøjden i øverste venstre hjørne af skærmen.
    BEMÆRK: Et spektrum på 1.600 bredde/1.200 enheder er en rimelig dimension til inspektion på en computerskærm såvel som til registrering.
  5. For at gemme spektret til registrering skal du højreklikke på Eksporter og vælge JPEG filtype i rullelisten. Klik på Destination og Gennemse disk for at vælge lagerenheden på rullelisten (f.eks. Flash-disk E:). Indtast filnavnet (f.eks. 0620_1-2.jpg), og klik på Eksporter.
  6. Hvis det er nødvendigt, skal du udskrive en eksporteret JPEG-fil og måle tophøjden manuelt ved hjælp af en lineal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skabeloner og underlag
Ved at tage syntetiske oligonukleotider med U i midten (U + 9) parret med en G-skabelon som et eksempel (figur 1A) kan en tom kontrol af ækvivalarmængder af skabelon og uracilholdigt substrat anvendes til kvalitetskontrol af syntetisk oligonukleotidrenhed (figur 1B; signalerne matcher den udpegede m / z og den lave baggrundsstøj). I analysen af MS-dataene blev tophøjderne målt (figur 2). 19 nt skabelon-DNA'et forventedes at forblive uændret efter glycosylasehydrolyse; signalet kan derfor tjene som reference for kvantiteten af AP-produktet (figur 1C).

Reaktionstilstand og massespektre
Dette DNA-glycosylaseassay er enkelt og let at udføre ved hjælp af et ikke-mærket oligonukleotid til en standardreaktion for at opnå rene og pålidelige resultater (figur 1). Rækken af MS-spektre bør omfatte alle signaler, der genereres fra substrater, skabeloner og reaktionsprodukter (figur 1B). Forskellen på 1 nt mellem substratet og den tilsvarende skabelon frembragte en godt adskilt signalprofil for både skabelonen og substratet (figur 1B). De ækvimolære primere U+9 og T1 viste lignende spidsintensiteter uden signifikante forskelle. Omfattende fordøjelse af UDG (0,5 enheder til en 30 minutters reaktion) viste fuldstændig uracilspaltning. Signalet fra AP-produktet var også godt adskilt fra signalet fra det uracilholdige substrat (figur 1C d+9 AP-produkt m/z = 5447,6 versus figur 1B U+9 substrat m/z = 5541,6). Den relativt milde MALDI-ioniseringsteknik36, der blev anvendt i denne undersøgelse, minimerede signalerne forbundet med strengbrud induceret af β-eliminationsreaktion på AP-steder37, som ikke var signifikante i massespektrene. Samlet set er reaktionsbaggrunden meget ren uden mærkbar støj (figur 1C).

Under ækvimolære forhold var AP-produktets relative signalintensitet sammenlignelig med U-substratets ved hjælp af T1-skabelonen som reference (figur 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). Beregningen af UDG-aktivitet er således baseret på det nøjagtige input af det U-holdige substrat (50 pmol eller 20 pmol) ifølge Eq (1).

UDG-aktivitet = (signal fra AP-produkt) / (Signal fra U-substrat + signal fra AP-produkt) × [U] (1)

UDG kinetiske parametre bestemt ved MALDI-TOF MS-assay
Som vist i figur 2 viste UDG-reaktioner fra 0,01 enheder til 0,1 enheder gennem hele 3 minutters reaktion både dosis- og tidsafhængighed. En koncentration på 3,2 pM (0,1 enheder pr. 100 μL-reaktion) blev anvendt til bestemmelse af de kinetiske parametre, Km og kcat, for et G:U-substrat (tabel 1). Aliquoterne af UDG-reaktionen blev fjernet og slukket i 30 s og 60 s. Kinetiske data blev opnået under betingelser, hvor det uracilholdige substrat var mindre end 50% fordøjet, og fem substratkoncentrationer fra 10 til 200 nM blev underkastet analyse. Presteady-state tidsforløbet viste fremragende linearitet til satsanalyse. Et eksempel på et reaktionshastighedsplot er vist i figur 3A, hvor de relative MS-signalintensiteter for produktet og substratet omdannes til koncentration (nM). UDG-reaktionshastigheden (v) præsenteres som nM for AP-stedet produceret pr. Sekund. Km og Vmax blev beregnet ud fra et Lineweaver-Burk-plot (figur 3B). De KINETISKE UDG-parametre afledt af MALDI-TOF MS-assayet blev således bestemt til at være Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 og Kcat = 9,31 s-1. Værdierne er sammenlignelige med resultaterne af tidligere 3H-uracilfrigivende assays, hvor Km = 40 nM og Kcat = 13,3 s-138. 

G:U+9 duplex blev udsat for UDG-følsomhedsassays. Enheden målt ved MALDI-TOF MS-assay blev plottet mod producentens definerede enhed ved hjælp af en konventionel 3H-uracilfrigivende metode38. Som vist i figur 3C var den MALDI-TOF MS-målte enhed proportional med den definerede enhed fra 0,001 enheder til 0,02 enheder med korrelationsligningen y = 0,933x + 0,0003 og bestemmelseskoefficienten R2 = 0,9974. Detektionsgrænsen er 0,001 enheder som variationskoefficient = 9,2%, ~ 5 gange signal-støj-forholdet. Dette MALDI-TOF MS-assay giver således tilstrækkelig følsomhed, da UDG for det meste anvendes på enhedsniveau39.

Substratspecialitet af UDG
Et af de karakteristiske træk ved dette UDG MALDI-TOF MS-assay er, at det er etiketfrit, hvilket giver høj alsidighed til substratdesign. Denne funktion er meget nyttig til analyse af SUBSTRATSPECIALITETEN AF UDG. Som vist i tabel 1 kan uracil indsættes et hvilket som helst sted nær 5' eller 3'-enden af enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA til et specificitetsassay. For substratspec specificitet er det velkendt, at UDG er meget aktiv i at fjerne uracil fra enkeltstrenget DNA38. Som vist i tabel 1 blev uraciludskæring fra det enkeltstrengede substrat (ssU) faktisk reduceret 3,7 gange, når den blev udglødet til den komplementære DNA-streng og dannede G: U-duplex. For den almindeligt anvendte A:U duplex6,7,8 blev reaktionshastigheden yderligere sænket med næsten 10 gange i forhold til ssU. UDG virkede ikke på U ved DNA-endestationen (tabel 1-substrater af G:U+1, G:U-1 og G:U-2), hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser40,41. Interessant nok udviste U i 2. og 3. position fra 5'-endestationen en højere UDG-katalytisk hastighed end U i midten med henholdsvis 2 gange og 1,5 gange (tabel 1, G: U + 2 og G: U + 3 versus G: U). UDG udskåret U 3-nt fra 3'-enden med 8% mindre aktivitet end U i midten (tabel 1, G:U-3 versus G:U).

Uracil glycosylasehæmmer hæmning af UDG-reaktionen
Uracil glycosylasehæmmer (UGI) er et bakteriofagprotein, som hæmmer E. coli UDG ved reversibel proteinbinding med en støkiometri på 1:142. UGI's hæmning af UDG-aktivitet er vist i figur 4. I nærvær af 0,05 enheder (100 pM) UGI blev aktiviteten på 0,05 enheder UDG (8 pM) hæmmet til et uopdageligt niveau. IC50 var 7,6 pM. Således kan UDG MALDI-TOF MS-assayet let ændres til et massescreeningsassay til opdagelse af hæmmere af andre DNA-glycosylaser.

Figure 1
Figur 1: Modelsystem for et DNA-glycosylaseassay. (A) Læsionsstreng indeholdende en enkelt uridin (U+9) blev udglødet til en skabelon (T1), hvilket dannede en G:U-mismatch (fed). Uracil-DNA-glycosylase detekterer og fjerner uracilen og danner et AP-sted (d). Når MALDI-TOF MS udsættes for MALDI-TOF MS, kan forskellen i m/z-værdier mellem U-holdige DNA- og AP-produkter løses som vist i B. (B) Et 18 nt DNA indeholdende et enkelt uridin (U+9) udglødet til en 19 nt skabelon (T1) (tabel 1) blev testet som et enzymemne på 50 pmol substrat i 40 μL reaktionsbuffer og underkastet MS-analyse. (C) En næsten fuldstændig enzymfordøjelse af 50 pmol substrat i en 10 μL-reaktion under anvendelse af 0,5 enheder UDG ved 37 °C i 30 min. (D) Et 18 nt DNA indeholdende et enkelt uridin (U+3) udglødet til T1-enzymemne med 50 pmolsubstrat i 40 μL-reaktionsbuffer blev underkastet MS-analyse. (E) En næsten fuldstændig enzymfordøjelse af 50 pmol U+3-substrat i en 10 μL-reaktion under anvendelse af 0,5 enheder UDG ved 37 °C i 30 minutter til fremstilling af d+3 og underkastet MS-analyse inden for 30 timer. (F) Reaktionstilstanden var den samme som i E , bortset fra at d+3-produktet var i 0,1 M NaOH ved 95 °C i 30 minutter for at udløse en beta-eliminationsreaktion, der producerede B15-fragmenteret produkt og underkastes medlemsstaternes analyse. G) Reaktionstilstanden var den samme som i E , bortset fra at d+3-produktet blev opbevaret ved -20 °C i mere end 7 dage. en brøkdel af d+3 omdannet til B15-fragmenterede produkter. Dette tal er ændret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MS = massespektrometri; MALDI-TOF MS = Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid-of-flight MS; AP = apurinisk/apyrimidin; UDG = Uracil-DNA-glycosylase; T1 = 19 nt G-indeholdende skabelon; U+9 = 18 nt U-holdige substrat; d+9 = 18 nt AP-lokalitetsholdigt produkt; U+3 = 18 nt U-holdige substrat; d+3 = 18 nt AP-produkt, der indeholder et websted B15 = 15 nt beta-eliminerende fragmenteret produkt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tidsforløbsanalyse for UDG-aktivitet ved forskellige enzymkoncentrationer. Substrat-DNA, 50 pmol, indeholdende en G:U-læsion blev inkuberet med 0,01, 0,02, 0,05 og 0,1 enheder UDG ved 37 °C. Aliquots (10 μL) blev taget fra reaktionsblandingen ved 0, 0,5, 1, 2 og 3 min og slukket med et lige stort volumen phenol/chloroform. A) MALDI-TOF-massespektre, der illustrerer koncentrationsafhængigheden af UDG's behandling af G:U-substrater. (B) Mængden af produktet blev afbildet som en funktion af tiden. UDG: 0,01 (lukkede trekanter med fast linje), 0,02 (åben trekant med stiplet linje), 0,05 (lukket cirkel med fast linje) og 0,1 enheder (åbne cirkler med fast linje). Dataene er gennemsnittet af tre uafhængige bestemmelser, og fejllinjerne repræsenterer 1 S.D. Dette tal er ændret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MALDI-TOF = Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid for flyvning; AP = apurinisk/apyrimidin; UDG = Uracil-DNA-glycosylase; T = 19 nt G-indeholdende skabelon; U = 18 nt U-holdige substrat; AP = 18 nt AP-webstedsholdigt produkt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af kinetiske parametre for UDG ved hjælp af MALDI-TOF-analyse. Michaelis-Menten kurve og Lineweaver-Burk plots for at bestemme Km og kcat for UDG enzymkatalyseret udskæring af Uracil fra DNA. DNA-glycosylase MALDI-TOF MS-assay blev udført under anvendelse af 0,1 enheder UDG og forskellige koncentrationer (10, 30, 60, 100, 200 nM) af substrater i 100 μL-reaktion i 30 s og 60 s. (A) Michaelis-Menten-kurve genereret fra tre uafhængige eksperimenter. Fejlbjælkerne repræsenterer 1 SD. (B) Lineweaver-Burk plot for analysen; de angivne aflytninger tillader beregning af Km og Vmax. C) UDG-assay ved MALDI-TOF MS-analyse sammenlignet med den enhed, der er tildelt af fabrikanten. Enzymaktivitet blev målt ved fjernelse af uracil, der dannede AP-sted i en 10 μL-reaktion indeholdende 50 pmol (0,56 μg) G:U inden for en 18/19 nt DNA-duplex i 30 minutter ved 37 °C. UDG blev fortyndet med buffer [50% glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] på is. En enhed blev defineret som mængden af enzym, der katalyserede frigivelsen af 60 pmol uracil pr. Minut. Fejllinjer viser standardafvigelsen for seks eksperimenter. Dette tal er ændret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MALDI-TOF = Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid for flyvning; UDG = Uracil-DNA-glycosylase; AP = apurinisk/apyrimidin; V, reaktionshastighed nM/s. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: UDG-enzymhæmningskurve ved tilsætning af UGI. Hæmningskurven blev bestemt under anvendelse af reaktioner på 20 μL med 0,05 enheder UDG (8 pM) og 50 pmol substrat i 15 minutter i nærvær af UGI fra 0,001 enheder (5 pM) til 0,1 enheder (200 pM). Data er gennemsnittet af tre uafhængige bestemmelser, og fejllinjerne repræsenterer 1 S.D. Data passer med en online IC50-lommeregner (se materialetabellen). Dette tal er ændret fra 43. Forkortelser: UDG = Uracil-DNA glycosylase; UGI = uracil glycosylasehæmmer. Klik her for at se en større version af denne figur.

DNA-substrater Oligonukleotidesa DNA-sekvensb Indledende ratec k kat
(pmol/sek.) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0.560 ± 0.098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0.756 ± 0.083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0.448 ± 0.087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A:U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0.053 ± 0.018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.256 ± 0.044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.567 ± 0.016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDd ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

Tabel 1: Substratsammensætninger og UDG-specificiteter. Denne tabel viser det 18 nt U-holdige DNA udpeget af U±N. '+' angiver at tælle uracilpositionen fra 5' endestationen, og '-' angiver at tælle uracilpositionen fra 3' endestationen. For eksempel er U+9 den 9. position fra 5' endestationen, U-3 er 3. position fra 3' endestationen. Den komplementære 19 nt-skabelon for T1 til T7 ville blive parret med det U-holdige DNA, der danner G:U- eller A:U-mismatch som angivet. Uracil baser er med fed skrift. Reaktionerne blev brugt 50 pmol U-substrater, 0,05 enheder UDG, i 10 μL som beskrevet i protokolafsnit 2. Denne tabel er ændret fra 43. Forkortelser: UDG = uracil DNA glycosylase; nt = nukleotid; ND, ikke detekterbar.

2.-PCRP 1.-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ OPKALD EXT1_ MASSE
NA NA NA NA NA NA NA F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
NA NA NA NA NA NA NA F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

Tabel 2: FIL I.xlsx fil. Indstillingerne blev brugt til figur 1B, C og figur 2A; 0 minutters indgange. MALDI-TOF MS-systemet, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev designet specielt til at analysere enkeltnukleotidpolymorfisme ved en enkelt nukleotidforlængelse af den udvidede primer ind i regionen med forstærket gensekvensvariation. Til UDG-assay blev der kun brugt seks felter ved udarbejdelsen af assaygruppen FILE I. Forkortelser: WELL = det brøndnummer, der er tildelt assayet; TERM = opsigelsesmix; SNP_ID = navnet på inputsekvensen af enkeltnukleotidpolymorfismen; 2.-PCRP = fremadgående ampliconprimer; 1.-PCRP = omvendt ampliconprimer; AMP_LEN = amplicon længde; UP_CONF = uniplex forstærkningsscore; MP_CONF = multiplex forstærkning score; Tm = smeltetemperatur; PcGC = procent GC-indhold; PWARN = advarselskoder for analysedesign; UEP_DIR = retning af primerforlængelse; UEP_MASS = uudvidet grundmasse; UEP_SEQ = uudvidet primersekvens; EXT1_CALL = navn givet til analytten 1 massetop; EXT1_MASS = analytmasse 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

Tabel 3: 0620.xlsx fil. Disse indstillinger blev brugt til UGI-hæmningsreaktionerne i figur 4A. Forkortelse: UGI = uracil glycosylasehæmmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir indeholder en detaljeret procedure for anvendelse af en UDG MALDI-TOF MS-analysemetode til direkte påvisning af AP-holdige DNA-produkter. De vigtigste fordele ved denne metode er, at uracilholdige substrater er etiketfrie, skalerbare, nemme at arbejde med og giver større fleksibilitet i substratdesign.

Den UDG-leverandøranbefalede phenol/chloroformekstraktion muliggør inaktivering af enzymet for at forhindre nedbrydning af produkt-DNA. Phenolekstraktionsprotokollen involverer imidlertid kedelig faseseparation af farlige kemikalier. En alternativ syretermineringsmetode ved anvendelse af HCI til at sænke reaktionens pH til 2 ± 0,5 inaktiverede også effektivt UDG. Efterfølgende neutralisering med Tris-base kunne forhindre DNA-skader. Når AP-produktet blev underkastet MS-analyse inden for 30 timer, var der ingen tegn på basistab eller modifikation i massespektrene (figur 1E). Tris-bufferen i reaktionerne blev forsynet med den kommercielle UDG. Imidlertid kan forskellige aminer, herunder Tris, skære AP-steder via beta-eliminering, omend ved høje reagenskoncentrationer44. Nogle alternativer, såsom HEPES og fosfatbuffer, kan overvejes for at undgå risikoen for spaltning af AP-stedet ved beta-eliminering.

Som en potentiel UDG-referencemetode anbefales en dupleks af centreret G:U-substrat (tabel 1, T1/U+9) som standardsubstrat af følgende årsager: 1. For fysiologisk relevans er G:U bedre end A:U, da deaminering af cytosin i G:C-par resulterer i G:U-læsioner. 2. Mens E. coli UDG demonstrerer højere specificitet til hydrolysere U fra enkeltstrenget DNA, er reparation af en U-læsion i enkeltstrenget DNA ualmindeligt. 3. For alle de testede G:U-substrater viste G:U+2 og G:U+3 højere reaktionshastigheder end G:U+9. Imidlertid er en DNA-deamineringslæsion ved siden af et strengbrud ualmindeligt. For at efterligne indfødte læsioner ville det være mere hensigtsmæssigt at placere en G: U i midten af DNA-duplekset.

Interessant nok genererede MALDI-TOF MS-metoden UDG kinetiske parametre, og enzymenhederne i G: U-reaktionen (figur 3A-C) lignede meget konventionelt afledte resultater ved anvendelse af 3H-uracil38. Det enkelte G:U-substrat i denne undersøgelse er imidlertid meget forskelligt fra PBS1-bakteriofag-DNA, der tidligere er beskrevet med flere A:U fra DNA-syntesefejl38. Desuden viste UDG 3 gange højere aktivitet med G: U end med A: U-substratet (tabel 1, Km og Kcat i G: U versus A: U). Dette tilsyneladende modstridende resultat kan tilskrives DNA-sekvensen af PBS1-substrat indeholdende 36% af U i form af flere A: U-læsioner45 sammenlignet med kun 3% af U i G: U-substrat (tabel 1). I mellemtiden er UDG et meget 'processivt' enzym, dvs. en enkelt protein-DNA-bindende begivenhed fremkalder flere uracilspaltninger12. Fundet af en næsten perfekt en-til-en-sammenhæng mellem disse to UDG-metoder gør denne MS-metode til en attraktiv mulighed i stedet for det traditionelle radioisotopassay.

Denne tilgang er let skalerbar. Alle UDG-reaktioner i denne undersøgelse blev udført manuelt ved hjælp af mikropipetter og mikrocentrifugerør, med ~ 30 tests udført på en given dag. Således blev mindre end en tiendedel af kapaciteten af 384-brønds pladeformatchiparrayet til MALDI-TOF MS-systemet (se materialetabellen) beskrevet i afsnit 3-5 anvendt. I modsætning hertil kan tilpasningen af et automatiseret pipetteringssystem til en 384-brønds mikroplade let øge den daglige produktion af denne tilgang ved hjælp af syretermineringsmetoden. Således ville 300 UDG-reaktioner tage ~ 1 time. MALDI-TOF MS-systemet (se materialetabellen) kunne udsende massespektredata for op til 300 reaktioner på 1 time. Derfor vil en strømlinet proces kræve 2 timer til at gennemføre 300 UDG MALDI-TOF MS-assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan, R.O.C. [tilskudsnummer MOST109-2314-B-002 -186 til K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 til S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 til W.-h.F.]. H.-L.C. er modtager af et ph.d.-stipendium fra National Taiwan University. Finansiering af open access-afgift: Ministeriet for Videnskab og Teknologi, R.O.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Biokemi udgave 182 Reparation af basisudskæring MALDI-TOF massespektrometri Uracil-DNA-glycosylase apurinisk/apyrimidinisk sted glycosylasehæmmer
Uracil-DNA-glycosylaseassay ved matrixassisteret laserdesorption/ionisering Time-of-flight Massespektrometrianalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter