Summary
Her præsenterer vi en økonomisk og effektiv metode til at isolere og generere knoglemarvsafledte dendritiske celler med høj renhed fra mus efter 7 dages dyrkning med 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.
Abstract
Efterspørgslen efter dendritiske celler (LLC'er) stiger gradvist, efterhånden som immunologiforskningen skrider frem. DCs er dog sjældne i alle væv. Den traditionelle metode til isolering af DC'er involverer primært inducering af knoglemarvsdifferentiering (BM) i DC'er ved at injicere store doser (>10 ng / ml) granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), hvilket gør proceduren kompleks og dyr. I denne protokol blev der ved anvendelse af alle BM-celler dyrket i 10 ng / ml GM-CSF / IL-4-medium efter 3-4 halvkulturudvekslinger høstet op til 2,7 x 107 CD11c + celler (DC'er) pr. Mus (to lårben) med en renhed på 80% -95%. Efter 10 dage i kultur steg ekspressionen af CD11c, CD80 og MHC II, mens antallet af celler faldt. Antallet af celler toppede efter 7 dages dyrkning. Desuden tog denne metode kun 10 minutter at høste alle knoglemarvsceller, og et stort antal LLC'er blev opnået efter 1 uges dyrkning.
Introduction
Dendritiske celler (DC'er) er de mest kraftfulde antigenpræsenterende celler (APC'er) til aktivering af naive T-celler og inducering af specifikke cytotoksiske T-lymfocytresponser (CTL) mod infektionssygdomme, allergisygdomme og tumorceller 1,2,3. DCs er den primære forbindelse mellem medfødt immunitet og adaptiv immunitet og spiller en væsentlig rolle i immunologisk forsvar og opretholdelse af immuntolerance. I de sidste 40 år har mange forskere forsøgt at definere delmængderne af LLC'er og deres funktioner i betændelse og immunitet. I henhold til disse undersøgelser udviklerDC'er sig langs myeloide og lymfoide slægter fra knoglemarvsceller. Tumorvacciner har fået betydelige milepæle i de senere år og har en lovende fremtid. Mekanisk modulerer tumorvacciner immunresponsen og forhindrer tumorvækst ved at aktivere cytotoksiske T-lymfocytter ved anvendelse af tumorantigener. Vaccinen baseret på DCs spiller en vigtig rolle i tumorimmunterapi og er blevet identificeret som en af de mest lovende antitumorterapier 1,4. Derudover erDC'er blevet anvendt i vid udstrækning til test af nye molekylære målrettede lægemidler og immun checkpoint-hæmmere5.
Forskere har akut brug for et stort antalDC'er med høj renhed for yderligere at studereDC'ernes rolle. DCs er imidlertid sjældne i forskellige væv og blod, der kun tegner sig for 1% af blodlegemer hos mennesker og dyr. In vitro-dyrkning af knoglemarvsdendritiske celler (BMDC) er en vigtig metode til opnåelse af store mængder DC-celler. I mellemtiden er Lutz-protokollen til generering af VC'er fra knoglemarv blevet brugt i vid udstrækning af forskere6. Selvom protokollen er effektiv til opnåelse af DC-celler, er den kompleks og dyr, hvilket involverer tilsætning af høje koncentrationer af cytokiner og lysis af røde blodlegemer.
I denne undersøgelse rapporterer vi en metode til isolering af næsten alle knoglemarvsceller fra museknoglemarv (BM) og inducering af differentiering i BMDC efter 7-9 dages inkubation in vitro med en lavere koncentration af GM-CSF og IL-4. Denne procedure tager kun 10 minutter at høste næsten alle knoglemarvsceller og suspendere dem i et komplet medium. Kort fortalt leverer vi en effektiv og omkostningseffektiv dyrkningsmetode til BMDC i denne forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee.
1. Isolering af knoglemarv og forberedelse af BM-celler
- Ofre C57BL/6 mus (18-22 g, 6-8 uger gamle) via CO2 kvælning. Fastgør musen på musens operationsbord. Desinficer overfladerne med 70% ethanol.
- Skær benets hud for at udsætte musklerne og lårbensarterien. Klem og riv lårbensarterien ved hjælp af to tang, og træk derefter den proksimale ende mod maven.
BEMÆRK: Skær ikke lårbensarterien direkte. Ellers vil det forårsage overdreven blødning og forurene synsfeltet. - Skær alle musklerne omkring lårbenet.
- Stræk langsomt musens underekstremter udad, indtil lyden af hofteleddets forskydning høres, og lårbenshovedprolapsen er synlig.
- Adskil underbenene fra kroppen ved hjælp af en saks langs indersiden af lårbenshovedet.
- Skær bagbenene fra enden af knæleddet for at opnå et frit og komplet lårben.
- Fjern musklerne fastgjort til lårbenet ved hjælp af gasbind.
BEMÆRK: Riv ikke musklerne direkte. Lårbenet af mus er delikat, dets integritet skal opretholdes. - Sænk lårbenet i 75% alkohol i 2-5 min.
2. Induktionskultur af BMDC
- Skyl den resterende alkohol med PBS. Brug hæmostatiske tang til at klemme den midterste og nederste del af lårbenet og et andet sæt til at klemme den nederste ende af lårbenet. De hæmostatiske tang påføres sideværts på lårbenet, og lårbenet adskilles fra epifyselinjen.
BEMÆRK: Epifyselinjen er ikke let synlig, før lårbenet brækker. Dette og de næste trin udføres alle i et sterilt miljø. - Brug en 1 ml sprøjte (nål: 0,6 mm x 25 mm) til at trænge ind i knoglemarvshulrummet fra epifyselinjebruddet og drej nålen for at trænge ind i lårbenshovedet og gennem knoglemarvshulen. Pulsér og skyl knoglemarvshulrummet ved hjælp af 1 ml af det komplette medium, der indeholder GM-CSF / IL-4, indtil knoglen bliver hvid.
BEMÆRK: Komplet dyrkningsmedium: 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml GM-CSF og 10 ng / ml IL-4. - Resuspend alle cellerne i 24 ml komplet dyrkningsmedium (~ 5 x 105 celler / ml). Efter blanding blev alt mediet podet på en 6-brønds plade med 4 ml / brønd og derefter inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at lyse erytrocytter. - Udskift alt mediet efter 2 dage med et medium, der indeholder GM-CSF/IL-47. På den fjerde, sjette og ottende dag skal halvdelen af mediet udskiftes med det komplette medium, der indeholder 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.
BEMÆRK: I dette trin fjernes suspenderede celler såsom erytrocytter og lymfocytter. - Tag billeder hver dag for at registrere cellevækst. Fra dag seks skal du høste en brønd af celler om dagen for at tælle cellenummeret og detektere CD11c, CD80 og MHC II ekspression 6,7.
3. Flowcytometrisk detektion af ekspressionen af CD11c, CD80 og MHC II
- Efter vask af LLC'erne med PBS skal du genbruge 1 x 106 celler i 100 μL FACS-buffer, tilsæt 0,5 μg anti-mus CD16/32-antistof og inkuber i 10 minutter på is for at blokere ikke-specifikke antigensteder.
- Tilsæt 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 og 0,04 μg APC-MHC II-antistoffer, og inkuber på is i 30 minutter.
- Centrifugering ved 1.000 x g i 3 minutter ved 4 °C, supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml 4 % paraformaldehyd, fastgøres i 30 minutter ved 4 °C og suspenderes igen i 300 μL FACS-buffer.
- Udfør flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 1 x 10 7-1,7 x 107 celler blev ekstraheret fra to lårben og blev genophængt i 24 ml medium, før de blev plantet i en 6-brønds plade (figur 1A). Efter 2 dage blev ikke-klæbende celler fjernet ved fuldstændigt at ændre kulturmediet. Før mediet blev skiftet, blev der observeret et betydeligt antal suspenderede celler (figur 1B). Efter 3 dages kultur begyndte småcellekolonier at danne sig. På den sjette dag steg størrelsen og antallet af kolonier betydeligt. På den syvende dag toppede antallet af celler (22 x 106-27 x 106) og faldt derefter gradvist (figur 2A). Overfladen af DC-cellerne blev ru med længere pseudopodi og udviste typisk moden DC-cellemorfologi (figur 2B). Flowcytometrisk analyse viste, at forholdet mellem CD11c-positive og samlede celler var 71% på den sjette dag, mens forholdet steg til 96,1% på den tiende dag (figur 2C,2D).
For at evaluere ekspressionen af co-stimulerende molekyler blev CD11c, CD80 og MHC II co-farvet8. Som vist som figur 3A steg ekspressionen af CD11c, CD80 og MHC II gradvist med stigende dyrkningstid fra dag 6 til dag 10. Derudover viste flowcytometrisk analyse en gradvis stigning i proportionerne af CD11c og CD80 dobbeltpositive, CD11c og MHCII dobbelt-positive (figur 3B,3D) og triple-positive celler (figur 3C,3D).
Figur 1: Repræsentative billeder af UDVIKLINGSLANDE på forskellige kulturtider. (A) Flowdiagram over dyrkning af BMDC. (B) Repræsentative billeder afDC'er på forskellige kulturtider. Knoglemarvsceller blev suspenderet i 24 ml dyrkningsmedium med 10 ng / ml GM-CSF og IL-4 og podet i en 6-brønds plade. BF, før du skifter kulturmedium; AF, efter at have skiftet kulturmedie. Rød pil, DC koloni. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Antallet og renheden af LLC'er på forskellige dyrkningstidspunkt. (A) Samlet antal celler i alle dyrkningsmedier. (B) Repræsentative billeder af DC'er. (C,D) Flowcytometrisk og grafisk repræsentation af analysen af andelen af DC'er. Positive celler blev sorteret efter CD11c. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ekspressionen af co-stimulerende molekyler i DCs. (A) Ekspressionen af CD11c, CD80 og MHC ΙΙ i DCs. (B) Flowcytometrisk analyse af andelen af CD11c og CD80 dobbeltpositive, CD11c og MHC ΙΙ dobbeltpositive og triple-positive celler. (C, D) Flowcytometrisk analyse fra dag 6- Dag 10 og grafisk repræsentation for at vise den statistiske analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mennesker og mus har forskellige DC-undergrupper, herunder klassiske DC'er (cDC'er, herunder cDC1'er og cDC2'er) plasmacytoid-DC'er (pDC'er) og monocytafledte DC'er (MoDC'er)9,10,11. Det er generelt accepteret, at cDC1'er regulerer cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) reaktioner på intracellulære patogener og kræft, og cDC2'er regulerer immunresponser på ekstracellulære patogener, parasitter og allergener12. Et betydeligt antal DC'er kan produceres in vitro fra BM-stamceller i mus i nærvær af GM-CSF og IL-4 6,13,14. Renheden og mængden af DC'er spiller nøgleroller i vellykket DC-immunterapi. Forskere har vist, at to doser på 1 x 105 til 1 x 106 DC'er kunne fremkalde effektive cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) responser i en xenograftmodel 15,16,17,18. Dette indebærer, at et stort antal DC'er med høj renhed skal dyrkes for yderligere at undersøgeDC'ernes rolle i tumorimmunterapi.
Den traditionelle metode til opnåelse af knoglemarvsceller er at skære de to ender af lårbenet og skylle med mediet 6,7. I denne undersøgelse brugte vi innovativt fysiologiske anatomiske strukturer til at skære lårbenet. Hæmostatiske tang blev brugt til at klemme den nedre ende af lårbenet og bevæge den sideværts. Epifyselinjen er fysiologisk svag, hvilket gør dem modtagelige for brud, når de er stressede19. Efter at lårbenet er adskilt fra epifyselinjen, forbliver en lille mængde knogle i marvhulen. Nålen kan let trænge ind i knoglen ind i knoglemarvshulen. Metoden er enkel at betjene, beskytter dyrebare knoglemarvsceller og giver et cellulært grundlag for dyrkning af et stort antal LLC'er. Vi dyrkede DC'erne ved hjælp af en kombination af 10 ng / ml GM-CSF og 10 ng / ml IL-4, hvilket bidrager mere til modningen af DC'er end GM-CSF alene. Labeur og Son rapporterede, at den kombinerede anvendelse af GM-CSF og IL-4 i MEDIET DC'er inducerede højere ekspression af modningsmarkører, såsom IFN-ɣ, TNF-α og IL-6, og forbedret antigen-præsentationsevne 7,20,21. Son et al. foreslog også, at kombinationen af GM-CSF og IL-4 fremmer modningen af DC'er 7,21.
I denne undersøgelse dyrkede vi direkte de indsamlede knoglemarvsceller uden at lysere erytrocytterne og adskilte dem ved gradientcentrifugering, hvilket kan resultere i celletab og i sidste ende til en reduktion i høstedeDC'er. Før mediet blev ændret, var der flere suspenderende celler i kultursystemet, herunder erytrocytter, T-celler, B-celler og granulocytter. Under co-kultur kan disse celler producere cytokiner for at fremme modningen af LLC'er.
Med hensyn til begrænsninger brugte denne protokol kun to lårben af musen, undtagen de mindre skinneben, hvilket resulterede i tab af nogle mesenkymale stamceller. Kort sagt udviklede vi en omkostningseffektiv og effektiv protokol til isolering og generering af knoglemarvsafledte dendritiske celler fra mus, hvilket kun tager 10 minutter at adskille knoglemarvsceller. Et stort antal DC'er med høj renhed blev høstet efter 6 dage til 7 dages inkubation med 10 ng / ml GM-CSF og IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter, og at de ikke har noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Program of Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 og TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
