Økonomisk og effektiv protokol til isolering og generering af knoglemarvsafledte dendritiske celler fra mus. Procedurer, der involverer dyreforsøgspersoner, er blevet godkendt af Institutionen Dyreetisk Komité ved Nanjing Medical University.One.Introduction. Med stigningen i tumorimmunitetsforskning øges efterspørgslen efter DC-celler gradvist.
DCs er dog sjældne i alle væv. Den traditionelle metode til hovedsageligt at inducere differentiering af knoglemarv i LLC’er er kompliceret og dyr. To. Isolering af knoglemarv og forberedelse af BM-celler Vi ofrer mus og fikserer på musens operationsbord.
Skær huden på de venstre udsatte muskler og lårbensarterien. Skær ikke lårbensarterien direkte. Ellers vil det forårsage kraftig blødning og forurene synsfeltet.
Skær alle musklerne omkring lårbenet. Stræk langsomt musens underekstremter udad, indtil lårbenets prolaps og kan observeres. Adskil underbenene fra kroppen.
Skær bagbenet for at opnå et frit og komplet lårben. Fjern musklerne ved hjælp af gasbind. Riv ikke musklerne direkte.
Musens lårben er skrøbeligt. Placer lårbenet i 75% alkohol i to til fem minutter. Tre. Injektionskultur af BMDC Skyl restalkoholen med PBS.
Spænd midterste og nederste del af lårbenet med hæmostatiske tang, og klem den nederste ende af lårbenet med en anden hæmostatisk tang. De hæmostatiske tang påføres bogstaveligt på lårbenet, og lårbenet er brudt fra epifyselinjen. Brug en ml sprøjte til at gennembore knoglemarvshulrummet fra epifyselinjen.
Brug komplet medium to dele flush knoglemarvshulrummet, indtil knoglen bliver hvid. Saml skyllevæsker. Supplering af det komplette medium indeholdende GM CSF / IL-4 til 24 ml og frø i en 6-brønds plade med 4 ml pr. Brønd. Four.Resultater.
Efter to dage skal du udskifte alle medier, der indeholder GM-CSF/IL-4. Halvdelen erstattede komplet medium indeholdende GM-CSF / IL-4 på den fjerde og sjette og ottende dag. Antallet af celler nåede et højdepunkt på den syvende dag og faldt derefter gradvist.
DC-celler dannede et stort antal synapser, der viste en typisk moden DC-cellemorfologi. Flow submetriske analyser viser, at forholdet mellem CD11c pålagde hvad 71% på den sjette dag, bredt forhold stiger til 96,1% på den 10. dag. Udtrykket af CD11c, CD80 og MSC2 steg gradvist med stigende dyrkningstid. Fem.Konklusion.
Kort sagt etablerede vi en økonomisk og effektiv protokol til isolering og generering af knoglemarvsafledte dendritiske celler fra mus, hvilket kun tager 10 minutter at adskille knoglemarvsceller. Et stort antal DC’er med høj renhed blev høstet efter seks til syv dages dyrkning med 10ng pr. Ml, GM-CSF og IL-4.