Drosophila melanogaster Larva Injektion Protokoll
Summary
Drosophila melanogaster vuxna flugor har använts i stor utsträckning som modellorganismer för att undersöka de molekylära mekanismer som ligger till grund för värd antimikrobiella medfödda immunsvar och mikrobiella infektionsstrategier. För att främja D. melanogaster larva stadium som ett extra eller alternativt modellsystem beskrivs en larval injektion teknik.
Abstract
Användningen av okonventionella modeller för att studera medfödd immunitet och patogen virulens ger ett värdefullt alternativ till däggdjursmodeller, vilket kan vara kostsamt och väcka etiska frågor. Okonventionella modeller är notoriskt billiga, lätta att hantera och kultur, och tar inte mycket utrymme. De är genetiskt mottagliga och har fullständiga genomsekvenser, och deras användning presenterar inga etiska överväganden. Fruktflugan Drosophila melanogaster, till exempel, har gett stora insikter om en mängd olika beteenden, utveckling, metabolism och immunitetsforskning. Mer specifikt har D. melanogaster vuxna flugor och larver flera medfödda försvarsreaktioner som delas med ryggradsdjur. Mekanismerna som reglerar immunsvar har mestadels avslöjats genom genetiska och molekylära studier i D. melanogaster-modellen . Här tillhandahålls en ny larval injektion teknik, som ytterligare kommer att främja undersökningar av medfödda immunprocesser i D. melanogaster larver och utforska patogenesen vid ett brett spektrum av mikrobiella infektioner.
Introduction
Drosophila melanogaster har använts enormt inom biologisk och biomedicinsk forskning i flera årtionden, eftersom det sofistikerade utbudet av genetiska och molekylära verktyg stadigt har utvecklats för analys av ett brett spektrum av studier1,2,3,4. De evolutionärt bevarade aspekterna av utveckling, homeostas och medfödd immunitet i D. melanogaster har gjort det till en värdefull modellorganism för att studera olika mänskliga och insektssjukdomar5,6. I synnerhet har den grundläggande rollen för D. melanogaster-modellen för att studera immunitet till stor del exemplifierats i studier av vuxna flugor. D. melanogaster larver studier har dock också bidragit till den nuvarande kunskapen och främst utforskat cellulära immunsvar, särskilt för veps- och nematoder infektioner som uppstår genom insekts nagelband7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver har tre olika typer av blodkroppar, gemensamt kallade hemocyter: plasmatocyter, kristallceller och lamellocyter11,12,13. Dessa celler kan montera en rad immunsvar när D. melanogaster larver är infekterade med patogener som bakterier, svampar, virus och parasiter14,15,16. Cellulära immunsvar inkluderar direkt uppslukande (fagocytos) av små molekyler eller bakterier, melanisering, inkapsling av större patogener som parasitoidägg och produktion av reaktiva syrearter (ROS) och kväveoxidsynthaser (NOS)17,18,19.
Däremot har färre studier publicerats om användningen av D. melanogaster larval modell för att analysera humorala immunsvar. Detta beror främst på tillämpningen av utfodringsanalyser för oral infektion av D. melanogaster larver och flera utmaningar i samband med mikroinjektion larver inklusive exakt hantering av larver och korrekt användning av mikroneedle, särskilt under penetration20,21. Således har den begränsade kunskapen om larvinfektion och tekniska svårigheter (dvs. hög dödlighet) ofta gjort D. melanogaster larvmodellen svår att använda. En larvmodell kommer att ha potential att identifiera nya molekylära mekanismer som kommer att ge ytterligare insikter om värdpatogeninteraktioner och induktion av specifika värdfödda immunsvar mot patogena infektioner.
Här beskrivs ett enkelt och effektivt protokoll som kan användas för att injicera D. melanogaster larver med olika patogener, såsom bakterier, i detalj. I synnerhet används D. melanogaster larver för injektioner med den mänskliga patogenen Photorhabdus asymbiotica och de icke-patogena bakterierna Escherichia coli. Denna metod kan användas för manipulering och analys av D. melanogasters immunsvar på olika mikrobiella infektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster är bland de mest värdefulla, experimentellt manipulerade modellerna som används för undersökningar av medfödd immunitet och patogenes av olika mikrobiella infektioner. Detta beror på dess enkla och snabba livscykel, enkla underhåll i ett laboratorium, väletablerad evolutionär genetik och olika genetiska verktygslåda. Tidigare metoder för D. melanogaster larver injektioner, såsom att använda en hybrid mikrofluidic enhet eller en Narishige micromanipulator, kräver h?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar av institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University (GWU) för kritisk läsning av manuskriptet. GT fick stöd genom ett Harlan sommarstipendium från GWU. Alla grafiska figurer gjordes med BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
