Summary
पुनः संयोजक अंग एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल है जो कोशिका भेदभाव की प्रक्रिया और भ्रूण संकेतों के प्रभाव में पैटर्न की पीढ़ी का अध्ययन करने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल चिकन अंग-मेसोडर्मल कोशिकाओं के साथ पुनः संयोजक अंगों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है, जो विभिन्न जीवों से प्राप्त अन्य सेल प्रकारों के अनुकूल है।
Abstract
सेल विभेदन कोशिका प्रतिबद्धता की ठीक-ठाक प्रक्रिया है जो विकासशील ऊतकों और अंगों की स्थापना के दौरान विभिन्न विशेष सेल प्रकारों के गठन के लिए अग्रणी है। यह प्रक्रिया वयस्कता में सक्रिय रूप से बनाए रखी जाती है। कोशिका विभेदन अंगों के विकास और होमियोस्टैसिस के दौरान एक सतत प्रक्रिया है। सेल भेदभाव के शुरुआती चरणों को समझना अन्य जटिल प्रक्रियाओं जैसे कि मॉर्फोजेनेसिस को जानने के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, पुनः संयोजक चिकन अंग एक प्रयोगात्मक मॉडल है जो भ्रूण पैटर्निंग संकेतों के तहत सेल भेदभाव और पैटर्न पीढ़ी के अध्ययन की अनुमति देता है। यह प्रयोगात्मक मॉडल विवो वातावरण में एक की नकल करता है; यह एक प्रारंभिक अंग कली से प्राप्त एक एक्टोडर्मल कवर में reagreggated कोशिकाओं को इकट्ठा करता है। बाद में, एक्टोडर्म्स को स्थानांतरित कर दिया जाता है और इसके विकास की अनुमति देने के लिए एक चूजे के भ्रूण रिसेप्टर में प्रत्यारोपित किया जाता है। इस परख मुख्य रूप से mesodermal अंग कली कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, इसे अन्य जीवों से अन्य स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
कशेरुकी अंग कोशिका भेदभाव, सेल प्रसार, कोशिका मृत्यु, पैटर्न गठन, और मॉर्फोजेनेसिस 1,2 का अध्ययन करने के लिए एक दुर्जेय मॉडल है। विकास के दौरान, अंग पार्श्व प्लेट मेसोडर्म1 से व्युत्पन्न कोशिकाओं से उभार के रूप में उभरते हैं। अंग कलियों में एक एक्टोडर्म द्वारा कवर किए गए मेसोडर्मल कोशिकाओं का एक केंद्रीय कोर होता है। इस प्रारंभिक संरचना से, एक संपूर्ण और अच्छी तरह से गठित अंग उभरता है। अंग कली के उत्पन्न होने के बाद, तीन अक्षों को पहचाना जाता है: (1) प्रोक्सिमो-डिस्टल अक्ष ([पीडी] कंधे से उंगलियों तक), (2) डोरसो-वेंट्रल अक्ष ([डीवी] हाथ के पीछे से हथेली तक), और (3) पूर्वकाल-पश्चवर्ती ([एपी] अंगूठे से उंगली तक)। समीपस्थ-डिस्टल अक्ष एपिकल एक्टोडर्मल रिज (एईआर) पर निर्भर करता है, जो अंग कली के डिस्टल टिप पर स्थित विशेष एक्टोडर्म है। एईआर को आउटग्रोथ, उत्तरजीविता रखरखाव, प्रसार, औरसिग्नल प्राप्त करने वाली कोशिकाओं की अविभाजित स्थिति 2,3 के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, ध्रुवीकरण गतिविधि (ZPA) का क्षेत्र एंटेरोपोस्टीरियर पैटर्निंग4 को नियंत्रित करता है, जबकि पृष्ठीय और एक्टोडर्म डोर्सोवेंट्रल पैटर्निंग 7,8 को नियंत्रित करता है। त्रि-आयामी पैटर्निंग के एकीकरण का तात्पर्य इन तीन अक्षों के बीच जटिल क्रॉसस्टॉक5 है। अंग विकास के दौरान आणविक मार्ग को समझने के बावजूद, तंत्र के बारे में खुले प्रश्न जो पैटर्निंग को नियंत्रित करते हैं और एक पूरे अंग को बनाने के लिए उचित आउटग्रोथ अनुत्तरित रहते हैं।
एडगर ज़विलिंग ने 1964 में पुनः संयोजक अंग (आरएल) प्रणाली विकसित की ताकि अंग मेसेनकाइमल कोशिकाओं और विकासशील अंगों में एक्टोडर्म के बीच बातचीत का अध्ययनकिया जा सके। आरएल प्रणाली इसे एक दाता चूजे के भ्रूण के पृष्ठीय भाग में ग्राफ्ट करने के लिए भ्रूण अंग एक्टोडर्म में विघटित-reaggregated अंग कली मेसोडर्म को इकट्ठा करती है। एक्टोडर्म द्वारा प्रदान किए गए संकेत भेदभाव जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं और एक स्पैटिओ-टेम्पोरल तरीके से जीन को पैटर्न करते हैं, इस प्रकार एक अंग जैसी संरचना के गठन को प्रेरित करते हैं जो अंग विकास 7,8,9 के दौरान होने वाले सेल कार्यक्रमों को दोहरा सकते हैं।
आरएल मॉडल अंग घटकों के गुणों और मेसोडर्मल और एक्टोडर्मल कोशिकाओं के बीच बातचीतको समझने के लिए मूल्यवान है। एक आरएल को एक एक्टोडर्मल कवर 6 के अंदर प्रयोगात्मक रूप से इकट्ठा करने या फिर से संयोजित अंग कली मेसोडर्मल कोशिकाओं द्वारा बनाई गई अंग जैसी संरचना के रूप में परिभाषित किया जा सकताहै। आरएल का मॉर्फोजेनेसिस मेसोडर्मल कोशिकाओं (या अन्य प्रकार) की विशेषताओं पर निर्भर करता है जो एक्टोडर्मल पैटर्निंग संकेतों का जवाब देंगे। इस प्रयोगात्मक प्रणाली के फायदों में से एक इसकी बहुमुखी प्रतिभा है। यह विशेषता मेसोडर्मल कोशिकाओं के स्रोत को अलग-अलग करके कई संयोजनों के निर्माण की अनुमति देती है, जैसे कि विभिन्न विकास ता्मक चरणों से कोशिकाएं, अंग के साथ विभिन्न पदों से, या पूरे (अविच्छिन्न) या पुन: एकत्रित कोशिकाएं 7,8,9,10। एक अन्य उदाहरण चिकन के अलावा अन्य प्रजातियों से भ्रूण एक्टोडर्म प्राप्त करने की क्षमता है, उदाहरण के लिए, कछुए11, बटेर, या माउस12।
इस अर्थ में, आरएल तकनीक अंग विकास और विकासवादी दृष्टिकोण से अंग मेसेनकाइमल और एक्टोडर्मल कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने में मदद करती है। इस तकनीक में भ्रूण एक्टोडर्म12,13,14 द्वारा प्रदान किए गए संकेतों का लाभ उठाकर एक अंग जैसी संरचना में अंतर करने के लिए पूर्वज कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों की क्षमता का विश्लेषण करने की भी बड़ी क्षमता है। इन विट्रो संस्कृतियों के विपरीत, आरएल एक विकासशील अंग 9,15 से भ्रूण संकेतों की व्याख्या करके एक सेल आबादी के भेदभाव और मॉर्फोजेनेटिक क्षमता का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल में, reaggregated mesodermal अंग कली कोशिकाओं के साथ सफल आरएल प्रदर्शन करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान की जाती है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल को पुन: एकत्रित कोशिकाओं या यहां तक कि विभिन्न एक्टोडर्म स्रोतों के विभिन्न स्रोतों के साथ अनुकूलित करने की संभावना को खोलता है।
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Protocol
इस शोध की समीक्षा की गई थी और Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, मेक्सिको सिटी, मेक्सिको) के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के सामान्य चरणों का एक योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट चित्र 1A में दिखाया गया है।
1. भ्रूण इनक्यूबेशन और व्यवहार्यता का निर्धारण
- लगभग साढ़े तीन दिनों के लिए 38 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर निषेचित चिकन अंडे को इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 22 एचएच चरण (हैमिल्टन और हैमबर्गर, 1 9 51 के अनुसार) 16 तक नहीं पहुंच जाते।
नोट: ताजा निषेचित चिकन अंडे को एक सप्ताह तक 15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।- निषेचित अंडों को इनक्यूबेट करने के लिए, अंडों को आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में नीचे नुकीले पक्ष के साथ लंबवत रखें। इनक्यूबेशन के दौरान अंडे को घुमाएं क्योंकि विकासशील भ्रूण को शेल झिल्ली का पालन करने से रोकना आवश्यक है।
नोट: निषेचित मुर्गी के अंडे स्थानीय खेतों से प्राप्त किए जा सकते हैं। निषेचित सफेद लेगहॉर्न चिकन अंडे आमतौर पर देर से भ्रूण में पंखों के रंजकता से बचने के लिए उपयोग किए जाते हैं। तीन संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए अलग-अलग पर्याप्त अंडे को इनक्यूबेट करने पर विचार करें: (1) अंग मेसोडर्मल कोशिकाएं, (2) अंग एक्टोडर्म्स, और (3) आरएल को ग्राफ्ट करने के लिए दाता भ्रूण।
- निषेचित अंडों को इनक्यूबेट करने के लिए, अंडों को आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में नीचे नुकीले पक्ष के साथ लंबवत रखें। इनक्यूबेशन के दौरान अंडे को घुमाएं क्योंकि विकासशील भ्रूण को शेल झिल्ली का पालन करने से रोकना आवश्यक है।
- इनक्यूबेशन के साढ़े तीन दिनों के बाद, इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, 70% इथेनॉल के साथ स्वैब करें, और सूखने की अनुमति दें।
- रक्त वाहिकाओं का निरीक्षण करने और भ्रूण का पता लगाने के लिए अंडे को कैन्डलिंग करने वाले विकासशील भ्रूण की पहचान करें। उन अंडों को छोड़ दें जिनमें भ्रूण नहीं है।
नोट:: इस बिंदु पर, mesodermal कोशिकाओं, ectoderms, और RL के लिए होस्ट प्राप्त करने के लिए अंडे वितरित करें।
2. एक्टोडर्म्स को भरने के लिए अंग मेसोडर्मल कोशिकाओं को प्राप्त करना
नोट: जोड़तोड़ शुरू करने से पहले, यह अत्यधिक 70% इथेनॉल समाधान के साथ swabbing द्वारा काम कर रहे क्षेत्र, माइक्रोस्कोप, और सभी वाद्य कीटाणुरहित करने के लिए अनुशंसित है।
- एक खिड़की खोलने के लिए एक कुंद संदंश के अंत के साथ अंडे के कुंद छोर पर टैप करें और संदंश का उपयोग करके शेल के लगभग 1 सेमी x 1 सेमी को हटा दें।
- अंडे को प्लास्टिक या दफ़्ती धारक में स्थानांतरित करें और उन्हें स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे एक-एक करके रखें। वायु झिल्ली की पहचान करें और फिर एक छोटे से छेद को चुनकर इसे हटा दें जहां कोई बर्तन नहीं पाए जाते हैं। ठीक सर्जिकल संदंश की सहायता से इस क्षेत्र को खींचें।
नोट: हवा की झिल्ली को अंडे को खिड़की के तुरंत बाद देखी जाने वाली सफेद और अपारदर्शी झिल्ली के रूप में पहचाना जा सकता है।- अंडे के छिलके के किसी भी छोटे टुकड़े को हटा दें जो भ्रूण के संपर्क में आ सकता है।
नोट:: सत्यापित करें कि भ्रूण प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले 22 HH चरण में हैं। पहले के चरणों में भ्रूण को टेप के साथ अंडे की खिड़की को सील करने के बाद इनक्यूबेटर में वापस किया जा सकता है।
- अंडे के छिलके के किसी भी छोटे टुकड़े को हटा दें जो भ्रूण के संपर्क में आ सकता है।
- ठीक सर्जिकल संदंश का उपयोग करके एमनियन को फाड़कर एमनियोटिक थैली को पूरी तरह से खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एमनियन को एक पारदर्शी झिल्ली के रूप में पहचाना जा सकता है जो भ्रूण को बारीकी से कवर करता है और एमनियोटिक द्रव से भरा होता है। - कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके अंडे से भ्रूण को सावधानीपूर्वक हटा दें और फिर बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा समाधान (1x पीबीएस) वाले एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। शेष अंडे के लिए इस चरण को दोहराएं। विचार करें कि मेसोडर्मल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए केवल ~ 8-10 भ्रूण पर्याप्त हैं।
- बर्फ-ठंडे 1x पीबीएस में एक बार भ्रूण को धोएं, और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की सहायता से ( सामग्री की तालिका देखें), किसी भी शेष झिल्ली को वापस ले लें। हिंडलिंब कलियों का पता लगाएं।
नोट: अंग कलियों गोल संरचनाओं को भ्रूण के पूर्वकाल-पीछे अक्ष के साथ फ्लैंक से प्रोट्रूशन के रूप में स्थित किया जाता है। hindlimbs forelimbs की तुलना में अधिक पश्चवर्ती रूप से स्थित हैं। - स्वच्छ 1x PBS में भ्रूण को बनाए रखें, और ठीक सर्जिकल संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, प्रत्येक हिंडलिंब कली को अनुदैर्ध्य रूप से स्निप करें। पूरे हिंडलिंब कलियों को विच्छेदित करने के लिए भ्रूण के फ्लैंक के बहुत करीब कली को काटें। शेष भ्रूण के साथ इस चरण को दोहराएं।
- अंग कलियों को एक खाली 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
- 1x PBS की किसी भी अधिकता को हटाने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें और 0.5% ट्रिप्सिन समाधान के 500 μL के साथ PBS को प्रतिस्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए थर्मोब्लॉक में अंग कलियों को इनक्यूबेट करें।
- ट्रिप्सिन समाधान को हटा दें और इसे हैंक्स बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन में 2 मिलीग्राम / एमएल पर कोलेजेनेस प्रकार IV के 500 μL के साथ बदलें ( सामग्री की तालिका देखें), फिर इसे 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोब्लॉक में इनक्यूबेट करें।
नोट: ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन एक्टोडर्म्स को थोड़ा अलग करता है, जबकि कोलेजेनेस मेसोडर्मल कोशिकाओं को अलग करता है। - इनक्यूबेशन के बाद, जितना संभव हो उतना कोलेजनेज निकालें और एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक ठंडे ड्यूलबेको के संशोधित ईगल मध्यम-उच्च ग्लूकोज (डीएमईएम-एचजी) माध्यम के साथ इसे 1 मिलीलीटर के साथ बदलें। मिश्रण को धीरे से ~ 10 बार पिपेट करें।
- एक्टोडर्म्स को पीछे छोड़ने के लिए 70 μm के सेल छलनी के साथ कोशिकाओं वाले निलंबन को फ़िल्टर करें।
नोट: निस्पंदन भी किसी भी undigested अंग कलियों को हटा देगा, एकल कोशिकाओं के निलंबन के पीछे छोड़ देगा। - फ़िल्टर करने के बाद, निलंबन को फिर से 5-10 बार पिपेट करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, फिर supernatant को छोड़ दें।
- अतिरिक्त कोलेजेनेस को धोने के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम-एचजी के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर निलंबन centrifuge.
- पिपेटिंग द्वारा माध्यम को सावधानीपूर्वक छोड़ दें और फिर ट्यूब के निचले भाग में कोशिकाओं को परेशान किए बिना 10% एफबीएस के साथ पूरक ताजा डीएमईएम-एचजी के 1 एमएल के साथ इसे प्रतिस्थापित करें।
- कोशिकाओं को थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के बाद एक कॉम्पैक्ट पैलेट (रीएग्रीगेट) बनाने की अनुमति दें।
नोट: जबकि मेसोडर्मल कोशिकाएं गोली बना रही हैं, यह अंग एक्टोडर्म्स प्राप्त करने के लिए सुविधाजनक है।
3. अंग एक्टोडर्म्स प्राप्त करना
- एक्टोडर्म्स प्राप्त करने के लिए चुने गए अन्य 22 एचएच चिकन भ्रूण के साथ अलग-अलग अनुभाग 2 से चरण 1-6 को दोहराएं।
नोट: इस उद्देश्य के लिए भ्रूण की संख्या वांछित RL की अंतिम संख्या के लिए आनुपातिक है। 2: 1 एक्टोडर्म्स-आरएल का अनुपात उपयुक्त है। - हिंडलिंब कलियों को प्राप्त करने के बाद, उन्हें एक खाली माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें। किसी भी अतिरिक्त 1x PBS निकालें और बाँझ 1x PBS में 0.5% ट्रिप्सिन के 500 μL के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। एक थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
- एंजाइमेटिक पाचन के बाद, एक बाँझ पेट्री डिश में अंग कलियों वाले ट्रिप्सिन समाधान को स्थानांतरित करें।
- एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके जितना संभव हो सके अतिरिक्त ट्रिप्सिन को हटा दें; बर्फ के साथ पेट्री पकवान बाढ़ 1x PBS FBS के 10% के साथ पूरक जब तक सभी अंग कलियों को कवर कर रहे हैं.
नोट: FBS घोड़े के सीरम के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। - स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अंग कलियों की पहचान करें; अंग मेसोडर्मल कोशिकाओं से थोड़ा अलग पारदर्शी झिल्ली के रूप में एक्टोडर्म की पहचान करें (चित्रा 1 बी)।
- ठीक सर्जिकल संदंश की सहायता से अंग कली के सबसे समीपस्थ छोर को पकड़ो, जबकि ध्यान से अलग करें और अन्य संदंश का उपयोग करके एक्टोडर्म परत को अलग करें।
नोट: एक्टोडर्म्स प्राप्त करना मेसोडर्मल सेल क्लम्पिंग और एक्टोडर्म्स से संलग्न होने के कारण मुश्किल हो सकता है, इस प्रकार उन्हें चिपचिपा होने का कारण बनता है। पेट्री डिश में केवल एक्टोडर्म्स को बनाए रखने के लिए मेसोडर्मल कोशिकाओं को लगातार त्यागने की सिफारिश की जाती है। - बर्फ-ठंडे 1x PBS-10% FBS समाधान में एक्टोडर्म्स को बनाए रखें।
नोट: एक्टोडर्म्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि reaggregated मेसोडर्म तैयार नहीं है। हालांकि, एक्टोडर्मल प्राप्त करने के साथ गोली के इनक्यूबेशन समय का समन्वय करना बेहतर है।
4. एक्टोडर्मल कवर के अंदर मेसोडर्मल कोशिकाओं को इकट्ठा करना
नोट: इसके लिए, बाँझ 1x PBS-10% FBS समाधान के साथ पेट्री डिश में खाली एक्टोडर्म्स होना आवश्यक है जिसमें मेसोडर्मल कोशिकाओं का एक गठित छर्रा होता है।
- गोली का गठन होने के बाद (अनुभाग 2 देखें), पाइपेटिंग द्वारा ट्यूब से माध्यम के ~ 600 μL को छोड़ दें।
- ध्यान से एक पिपेट टिप का उपयोग करके नीचे से गोली को अलग करें और इसे मुंहतोड़ या नष्ट किए बिना।
- जब गोली ट्यूब के नीचे से पूरी तरह से अलग हो जाती है, तो खाली एक्टोडर्म्स (चित्रा 1 सी) वाले पेट्री डिश में गोली को स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब को उल्टा कर दें।
- ठीक सर्जिकल संदंश की एक जोड़ी की सहायता से गोली का एक छोटा सा टुकड़ा काटें और इसे एक्टोडर्म के जितना संभव हो उतना करीब रखें।
- जैसे कि यह एक बैग था, सर्जिकल संदंश के साथ एक्टोडर्म खोलें, और गोली के टुकड़े को एक्टोडर्मल कवर में जितना संभव हो उतना कसकर रखें। वांछित के रूप में कई RLs के लिए इस चरण को दोहराएँ (चित्रा 1D)।
नोट: गोली के टुकड़ों को एक-एक करके काटें, और 1x PBS-10% FBS समाधान को साफ बनाए रखने के लिए एक्टोडर्म्स भरें। गोली के आकार को प्रत्येक एक्टोडर्म के अनुरूप होने की आवश्यकता होती है। - एक्टोडर्म और मेसोडर्म को कमरे के तापमान पर ~ 30 मिनट के लिए एक साथ ठीक करने की अनुमति दें और फिर उन्हें भ्रूण मेजबान में ग्राफ्ट करें। अप्रयुक्त एक्टोडर्म और मेसोडर्म को छोड़ दें।
5. एक मेजबान भ्रूण में भरा ectoderm के प्रत्यारोपण
नोट: एक्टोडर्म्स को प्रत्यारोपित करने से पहले, एक बेंचटॉप पर एक दूसरे के बगल में दो स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की व्यवस्था करें, एक भ्रूण हेरफेर और आरएल ग्राफ्टिंग के लिए। दूसरा भरे हुए एक्टोडर्म्स को बनाए रखने के लिए है जो भ्रूण में स्थानांतरित करने के लिए तैयार है।
- भरे हुए एक्टोडर्म्स को ग्राफ्ट करने के लिए वांछित अंडों की संख्या का चयन करें।
- एक कुंद संदंश के अंत का उपयोग करते हुए, एक खिड़की खोलने के लिए 22 एचएच मेजबान भ्रूण के अंडे के खोल को टैप करें। वायु झिल्ली की पहचान करें और, ठीक सर्जिकल संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, इसे पूरी तरह से हटा दें।
- भ्रूण के दाहिने फ्लैंक को उजागर करने के लिए अग्रभाग के पास एमनियोटिक थैली खोलें। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक राशि को ही खोलें.
- फोरलिम्ब स्थिति द्वारा निर्देशित, 2-3 सोमाइट्स की लंबाई के लिए एक टंगस्टन सुई ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ घाव खरोंच प्रदर्शन करें, जब तक कि यह खून बहने तक मेसोडर्म को थोड़ा नुकसान पहुंचाता है।
- व्यक्तिगत रूप से एक भरे हुए एक्टोडर्म (आरएल) को चूजे के भ्रूण में स्थानांतरित करें और सोमाइट घाव पर पुनः संयोजक अंग के आधार को रखें।
नोट: आरएल स्थानांतरण एक प्लास्टिक पिपेट के साथ या एक कोण भट्ठा चाकू के साथ किया जा सकता है। - 0.025 मिमी व्यास और 0.5-1 मिमी लंबाई के पैलेडियम तार के दो टुकड़ों के साथ आरएल को सही ढंग से ठीक करें ( सामग्री की तालिका देखें)। आरएल के आधार को घाव के साथ संरेखित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह मेजबान भ्रूण के फ्लैंक से जुड़ा होगा और संवहनी (चित्रा 1 ई)।
- टेप के साथ खिड़की को सील करें, और अंडे को इनक्यूबेटर में वापस कर दें। विश्लेषण के लिए वांछित समय बिंदुओं पर भ्रूण एकत्र करें।
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Representative Results
एक अच्छी तरह से प्रदर्शन पुनः संयोजक अंग को पहचानना
ग्राफ्टिंग के बाद, हेरफेर किए गए भ्रूण को आरएल को विकसित करने की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर में वापस कर दिया गया था। इनक्यूबेशन समय प्रयोग की आवश्यकताओं के साथ सहसंबद्ध है। फिर भी, आरएल को आरोपण के 12 घंटे के बाद आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आरोपण पर्याप्त था, आरएल को एक प्रोट्यूबरेंस के रूप में देखा गया था जो दाता भ्रूण की मेसोडर्मल दीवार से सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ था (चित्रा 2 ए)। इसके विपरीत, चाहे या तो सेल व्यवहार्यता और / या ग्राफ्ट विफल हो गया, आरएल को मेसोडर्मल दीवार से अलग कर दिया गया था या एक मोटा आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया गया था (चित्रा 2 बी)।
पुनः संयोजक अंगों की रूपात्मक और पैटर्निंग परीक्षा
रूपात्मक परीक्षा के लिए, कंकाल तत्वों के गठन और उनके पैटर्निंग का निरीक्षण करने के लिए आरएल को एल्शियन ब्लू17 के साथ दाग दिया गया था। प्रक्रिया के दौरान आरएल को याद करने से बचने के लिए दाता भ्रूण के पूरे ट्रंक को दागने की सिफारिश की जाती है (चित्रा 3 ए)। वैकल्पिक रूप से, आरएल को साफ़ करने से पहले, इथेनॉल समाधान में छवियों को आरएल की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने या मात्रात्मक माप करने के लिए प्राप्त किया गया था (चित्रा 3 बी)। दाग या unstained RL ऊतक संरचना का निरीक्षण करने या सेल प्रकार की पहचान करने के लिए कटा हुआ था (चित्रा 3 सी)।
चित्रा 1: पुनः संयोजक अंगों (आरएल) के प्रयोगात्मक डिजाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) आरएल को एक दाता 22 एचएच चिक भ्रूण से अंग कली मेसोडर्म को इकट्ठा करके एक और 22 एचएच चिक भ्रूण दाता से प्राप्त एक एक्टोडर्मल कवर के अंदर किया गया था। एक्टोडर्म्स को मेसोडर्मल कोशिकाओं के साथ कसकर भरा गया था। असेंबली के बाद, भरवां एक्टोडर्म्स को स्थानांतरित कर दिया गया था और पिछले सोमाइट के घाव के शीर्ष पर पैलेडियम तारों के साथ तय किया गया था। (बी) ट्रिप्सिन उपचार के बाद इसके एक्टोडर्म के साथ एक अंग कली अलग हो जाती है। (सी) गोली खाली एक्टोडर्म्स के पास इसके गठन के बाद प्राप्त की गई थी, जो भरने के लिए तैयार थी। (d) मेसोडर्मल कोशिकाओं से भरा एक एक्टोडर्मल कवर दिखाया गया है। (ई) पैलेडियम तारों के साथ मेजबान भ्रूण में आरएल को ठीक करना। कृपया ध्यान दें कि आरएल को फोरलिंब कली के पास भ्रूण के दाहिने फ्लैंक पर तैनात किया गया था; पी: गोली. स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 2: ताजा प्राप्त चिकन-चिकन पुनः संयोजक अंग। (ए) मेसोडर्म दीवार से जुड़ा एक 24 घंटे का आरएल दिखाया गया है। (बी) एक असफल 24 घंटे आरएल दिखाया गया है। कृपया ध्यान दें कि पैलेडियम तार आरएल को ठीक नहीं कर रहा है; नतीजतन, आरएल मेसोडर्मल दीवार से अलग हो गया और एक किसी न किसी आकृति विज्ञान को प्रस्तुत किया। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 3: पुनः संयोजक अंगों का रूपात्मक विश्लेषण(ए) 6-दिवसीय चिकन-चिकन आरएल में कंकाल तत्वों को प्रदर्शित करने के लिए अल्शियन नीले रंग का धुंधला होना। (बी) एक ही आरएल (ए) में अल्शियन नीले रंग को साफ करने से पहले दिखाया गया था। (सी) एक आरएल का सैगिटल स्लाइस जो अल्शियन नीले रंग के दाग के साथ और हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ सना हुआ है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
सामान्य तौर पर, आरएल प्रोटोकॉल को पांच चरणों में विभाजित किया जा सकता है: (1) भ्रूण इनक्यूबेशन, (2) एक्टोडर्म्स को भरने के लिए अंग मेसोडर्मल कोशिकाओं को प्राप्त करना, (3) एक्टोडर्म्स प्राप्त करना, (4) एक्टोडर्मल कवर के अंदर मेसोडर्मल कोशिकाओं को इकट्ठा करना, और (5) मेजबान भ्रूण में भरे हुए एक्टोडर्म्स का प्रत्यारोपण। आरएल तकनीक की प्रमुख सीमा लंबी, विस्तृत प्रोटोकॉल है, जिसमें कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं जिन्हें उचित प्रदर्शन करने के लिए धैर्य की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, महत्वपूर्ण क्षणों को पहचानने की आवश्यकता है। मेसोडर्मल सेल खरीद के दौरान, कोशिकाओं की अखंडता और व्यवहार्यता आवश्यक है। सेल मृत्यु उचित आरएल विकास को रोक देगी। एक समान नस में, मेसोडर्मल और एक्टोडर्मल कोशिकाओं के बीच बातचीत की गारंटी देने के लिए सही एक्टोडर्म हेरफेर आवश्यक है। जब एक्टोडर्म्स को भरवां किया जाता है, तो मेसोडर्मल कोशिकाओं को एईआर के नीचे डिस्टल एक्टोडर्म के जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। मेसोडर्मल और एक्टोडर्मल खरीद दोनों के लिए, दाता भ्रूण का विकास चरण भी महत्वपूर्ण है। यह माना जाना चाहिए कि मेसोडर्मल कोशिकाएं अपने विकास के चरण के अनुसार अलग-अलग प्रतिक्रिया देंगी। हालांकि, विकासशील चरण को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार स्वतंत्र रूप से चुना जा सकता है। फिर भी, 22 एचएच चरण को एक्टोडर्म्स प्राप्त करना आसान बनाने के लिए बनाए रखने की आवश्यकता है, इस प्रकार सेलुलर अखंडता और सिग्नलिंग को बनाए रखना। अंत में, भ्रूण की दीवार और इसके विकास के लिए सही आरएल एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए अच्छा ग्राफ्टिंग और फिक्सिंग आवश्यक है।
एडगर ज़विलिंग ने पहली बार 19646 में आरएल सिस्टम की सूचना दी, जिसके बाद कई शोध समूहों ने कई दिलचस्प जैविक सवालों के जवाब देने के लिए इसे लागू किया। आरएल के प्रोटोकॉल को पहले मैरियन रोस एट अल द्वारा विकासशील चिक अंग कली18 में हेरफेर करने के लिए एक मानक विधि के रूप में लंबाई में वर्णित किया गया है, जो अंडे को खिड़की देने और पूरे पंख या पैर के साथ आरएल करने के अन्य तरीकों की व्याख्या करता है और रीएग्रीगेटेड मेसोडर्म के साथ आरएल प्रदर्शन करता है। हालांकि, रोस के बीच कुछ भिन्नताएं। et al. प्रोटोकॉल और वर्तमान प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित पाया जा सकता है. उनके प्रोटोकॉल में, एक्टोडर्म दाताओं के रूप में भ्रूण से अंग कलियों को ~ 2 घंटे के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस में ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। एक्टोडर्म इनक्यूबेशन शुरू करने के बाद, उन्होंने तुरंत मेसोडर्म दाताओं के रूप में भ्रूण से अंग कलियों को प्राप्त किया, फिर अंग कलियों को खंडित किया, उन्हें पचाया, और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के बाद मेसोडर्मल गोली बनाने के लिए एक्टोडर्म को मैन्युअल रूप से हटा दिया। यहां, सबसे पहले, अंग कलियों को मेसोडर्मल दाताओं के रूप में उपयोग करने के लिए भ्रूण से प्राप्त किया गया था, जिसके बाद ट्रिप्सिन और कोलेजेनेस के साथ इनक्यूबेट करके पूरे अंग कली को पचाया जाता है। एक्टोडर्म्स को तब निस्पंदन द्वारा हटा दिया जाता है, और छर्रे को 1-1.5 घंटे के बीच ऊष्मायन किया जाता है। मेसोडर्मल गोली प्राप्त करने के लिए इस विधि का लाभ यह है कि ट्रिप्सिन के साथ उपचार मेसोडर्म से बरकरार एक्टोडर्म को अलग करता है जबकि कोलेजेनेस उपचार मेसोडर्मल कोशिकाओं को पचाता है। इसलिए, एक्टोडर्मल ऊतक को फ़िल्टर करना और इसे छोड़ना संभव है। दूसरी ओर, अधिक गोली इनक्यूबेशन समय इसे बेहतर कॉम्पैक्ट करने की अनुमति देता है, जो एक्टोडर्म्स को भरने में मदद करता है। दो प्रोटोकॉल के बीच एक और अंतर यह है कि रोस एट अल ने एक्टोडर्म्स को एक-एक करके छील दिया और उन्हें गोली युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित कर दिया। इसके विपरीत, सभी एक्टोडर्म्स को विच्छेदित किया जाता है और वर्तमान प्रोटोकॉल में एक पेट्री डिश में एकत्र किया जाता है। गोली को एक्टोडर्म्स को भरने के लिए पेट्री डिश में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस विधि का पालन करके, एक्टोडर्म्स को ग्राफ्टिंग के साथ एक साथ तैयार किया जा सकता है। कई अन्य प्रोटोकॉल के साथ, आरएल कैसे किए जाते हैं, यह अलग-अलग हो सकता है; हालांकि, दोनों प्रोटोकॉल में चरण पर्याप्त रूप से एक सफल हेरफेर का उत्पादन करने के लिए तकनीक के महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं।
पिछले काम ने प्रदर्शित किया है कि विघटित ध्रुवीकरण क्षेत्र कोशिकाएं आरएल 7,10 में मेसोडर्म के बीच बेतरतीब ढंग से बिखरे होने पर मॉर्फोजेनेसिस को रोकती हैं। इस प्रकार, मेसोडर्मल पैलेट बनाने से पहले जेडपीए से कोशिकाओं को खत्म करना वैकल्पिक है। बाद में, ZPA कोशिकाओं (या सोनिक हेजहोग एम्बेडेड मोतियों) का उपयोग आरएल को ए-पी ध्रुवीयता 8,9,19 विकसित करने के लिए प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है।
आरएल प्रयोगात्मक मॉडल विभिन्न परिदृश्यों के लिए अनुकूलनीय है। पुनर्संयोजन को विभिन्न विकासात्मक या परिपक्व (अग्र- या हिंदलिंब) चरणों से अंग कोशिकाओं के साथ लागू किया जा सकता है, तीन अंग अक्षों के साथ अन्य पदों, और अलग-अलग-reaggregated कोशिकाओं या अविभाजित-खंडित मेसोडर्म15 के साथ। दिलचस्प बात यह है कि पिछले अध्ययनों ने उत्परिवर्ती और जंगली-प्रकार के मेसोडर्म और एक्टोडर्म्स 13,14,20,21 के विभिन्न संयोजनों के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए आरएल मॉडल का उपयोग करने या इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं का उपयोग करने की सूचना दीहै।
यह देखते हुए कि अंग विकास एक विकासवादी रूप से संरक्षित प्रक्रिया है, एक्टोडर्म स्रोत चिकन, बटेर, बतख, माउस, या चूहे के एक्टोडर्म से भी भिन्न हो सकते हैं, एक ही वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए प्राप्त किया जा सकता है। एक और संभावना मेसोडर्मल को बदल रही है - या यहां तक कि अन्य सेल प्रकार या स्रोतों को अंतर-प्रजाति आरएल का उत्पादन करने के लिए।
अंत में, आरएल सेलुलर और आणविक स्तरों पर मॉर्फोजेनेसिस, पैटर्निंग, सेल-सेल इंटरैक्शन, सेल माइग्रेशन और सेल भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक अभूतपूर्व मॉडल है। क्योंकि आरएल की प्रक्रिया कई विविधताओं की अनुमति देती है, यह चिकन-अंग विकासात्मक जीव विज्ञान तक सीमित किए बिना कई जैविक प्रश्नों में संभावित अनुप्रयोगों की अनुमति देती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम चित्रा 2 में छवियों के लिए Estefania Garay-Pacheco और कलाकृति के लिए मारिया Valeria Chimal-Montes de Oca के लिए धन्यवाद. इस काम Dirección जनरल डी Asuntos del व्यक्तिगत Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [अनुदान संख्या IN211117 और IN213314] और Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [अनुदान संख्या 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] द्वारा समर्थित किया गया था, जो जेसी-एम को सम्मानित किया गया था। जेसी एम-एल Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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