Summary
الأطراف المؤتلفة هي نموذج تجريبي قوي يسمح بدراسة عملية تمايز الخلايا وتوليد الأنماط تحت تأثير الإشارات الجنينية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد أطراف مؤتلفة مع خلايا الجلد المتوسط لأطراف الدجاج ، قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى التي تم الحصول عليها من كائنات حية مختلفة.
Abstract
تمايز الخلايا هو عملية مضبوطة بدقة لالتزام الخلية مما يؤدي إلى تكوين أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة أثناء إنشاء الأنسجة والأعضاء النامية. يتم الحفاظ على هذه العملية بنشاط في مرحلة البلوغ. تمايز الخلايا هو عملية مستمرة أثناء تطوير وتوازن الأعضاء. إن فهم الخطوات المبكرة لتمايز الخلايا أمر ضروري لمعرفة العمليات المعقدة الأخرى مثل التشكل الشكلي. وبالتالي ، فإن أطراف الدجاج المؤتلفة هي نموذج تجريبي يسمح بدراسة تمايز الخلايا وتوليد النمط تحت إشارات النقش الجنينية. هذا النموذج التجريبي يقلد بيئة في الجسم الحي . يقوم بتجميع الخلايا المعاد تجميعها في غطاء الجلد الخارجي الذي تم الحصول عليه من برعم الأطراف المبكر. في وقت لاحق ، يتم نقل الأديم الخارجي وزرعه في مستقبل جنين الفرخ للسماح بتطوره. تم استخدام هذا الفحص بشكل رئيسي لتقييم خلايا برعم الأطراف في الجلد المتوسط. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه على الخلايا الجذعية أو السلفية الأخرى من الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
الطرف الفقاري هو نموذج هائل لدراسة تمايز الخلايا ، وانتشار الخلايا ، وموت الخلايا ، وتكوين النمط ، والتشكل 1,2. أثناء التطور ، تظهر الأطراف على شكل انتفاخات من الخلايا المشتقة من الأديم المتوسط للصفيحة الجانبية1. تتكون براعم الأطراف من نواة مركزية من خلايا الجلد المتوسط التي تغطيها الأديم الخارجي. من هذا الهيكل المبكر ، يظهر طرف كامل وجيد التشكيل. بعد ظهور برعم الطرف ، يتم التعرف على ثلاثة محاور: (1) المحور القريب البعيد ([PD] من الكتف إلى الأصابع) ، (2) المحور الظهري البطني ([DV] من الجزء الخلفي من اليد إلى راحة اليد) ، و (3) الأمامي الخلفي ([AP] الإبهام إلى الإصبع). يعتمد المحور القريب البعيد على حافة الجلد الخارجي القمي (AER) ، وهو الأديم الخارجي المتخصص الموجود في الطرف البعيد من برعم الأطراف. مطلوب AER للنمو ، والحفاظ على البقاء على قيد الحياة ، والانتشار ، والحالة غير المتمايزة للخلايا التي تتلقى إشارات 2,3. من ناحية أخرى ، تتحكم منطقة نشاط الاستقطاب (ZPA) في التنميط الأمامي الخلفي4 ، بينما تتحكم الأديم الظهري والأديم الخارجي في النقوش الظهرية البطنية 7,8. ينطوي تكامل النقوش ثلاثية الأبعاد على محادثة متقاطعة معقدة بين هذه المحاور الثلاثة5. على الرغم من فهم المسار الجزيئي أثناء تطور الأطراف ، إلا أن الأسئلة المفتوحة حول الآليات التي تتحكم في النمط والنمو السليم لتشكيل طرف كامل لا تزال دون إجابة.
طور إدغار زويلينغ نظام الأطراف المؤتلفة (RL) في عام 1964 لدراسة التفاعلات بين الخلايا الوسيطة للأطراف والأديم الخارجي في الأطراف النامية6. يقوم نظام RL بتجميع الأديم المتوسط لبرعم الأطراف المنفصل والمعاد تجميعه في الأديم الخارجي للطرف الجنيني لتطعيمه في الجزء الظهري من جنين الفرخ المتبرع به. تحفز الإشارات التي يوفرها الأديم الخارجي على التعبير عن جينات التمايز وجينات الأنماط بطريقة مكانية زمانية ، مما يؤدي إلى تكوين بنية تشبه الأطراف يمكنها تلخيص برامج الخلايا التي تحدث أثناء تطور الأطراف 7,8,9.
نموذج RL ذو قيمة لفهم خصائص مكونات الأطراف والتفاعل بين خلايا الجلد المتوسط وخلايا الجلد الخارجي6. يمكن تعريف RL على أنه بنية تشبه الأطراف تم إنشاؤها بواسطة تجميع أو إعادة دمج خلايا الجلد المتوسط في برعم الأطراف تجريبيا داخل غطاء الجلد الخارجي6. يعتمد تكوين RL على خصائص خلايا الجلد المتوسط (أو أنواع أخرى) التي ستستجيب لإشارات نمط الجلد الخارجي. واحدة من مزايا هذا النظام التجريبي هو تنوعه. تسمح هذه الخاصية بإنشاء مجموعات متعددة عن طريق تغيير مصدر خلايا الجلد المتوسط ، مثل الخلايا من مراحل النمو المختلفة ، من مواقع مختلفة على طول الطرف ، أو الخلايا الكاملة (غير المنفصلة) أو المعاد تجميعها7،8،9،10. مثال آخر هو القدرة على الحصول على الأديم الخارجي الجنيني من أنواع أخرى غير الدجاج ، على سبيل المثال ، السلحفاة11 أو السمان أو الفأر12.
وبهذا المعنى ، تساعد تقنية RL في دراسة تطور الأطراف والتفاعلات بين الخلايا الوسيطة وخلايا الجلد الخارجي من وجهة نظر تطورية. تتمتع هذه التقنية أيضا بإمكانات كبيرة لتحليل قدرة المصادر المختلفة للخلايا السلفية على التمايز إلى بنية تشبه الأطراف من خلال الاستفادة من الإشارات التي يوفرها الأديم الخارجي الجنيني 12،13،14. على النقيض من الثقافات المخبرية ، يسمح RL بتقييم التمايز والإمكانات المورفوجينية لمجموعة الخلايا من خلال تفسير الإشارات الجنينية من أحد الأطراف النامية 9,15.
في هذا البروتوكول ، يتم توفير دليل خطوة بخطوة لإجراء RL ناجح مع خلايا برعم الأطراف المتوسطة المعاد تجميعها ، مما يفتح إمكانية تكييف هذا البروتوكول مع مصادر مختلفة للخلايا المعاد تجميعها أو حتى مصادر مختلفة للأديم الخارجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة هذا البحث والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لرعاية واستخدام المختبر التابع لمعهد التحقيقات الطبية الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM ، مكسيكو سيتي ، المكسيك). ويبين الشكل 1 ألف مخططا انسيابيا تخطيطيا للخطوات العامة لهذا البروتوكول.
1. حضانة الأجنة وتحديد الجدوى
- احتضان بيض الدجاج المخصب عند 38 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60٪ لمدة ثلاثة أيام ونصف تقريبا حتى تصل إلى مرحلة 22 HH (وفقا لهاميلتون وهامبورغر ، 1951)16.
ملاحظة: يمكن تخزين بيض الدجاج المخصب الطازج على درجة حرارة 15 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.- لاحتضان البيض المخصب ، ضع البيض عموديا مع الجانب المدبب لأسفل في الحاضنة المرطبة. قم بتدوير البيض أثناء الحضانة لأنه من الضروري منع الجنين النامي من الالتصاق بغشاء القشرة.
ملاحظة: يمكن الحصول على بيض الدجاج المخصب من المزارع المحلية. يستخدم بيض دجاج Leghorn الأبيض المخصب بشكل عام لتجنب تصبغ الريش في الأجنة المتأخرة. فكر في احتضان ما يكفي من البويضات بشكل منفصل للحصول على ثلاثة هياكل: (1) خلايا الجلد المتوسط للأطراف، (2) الأديم الخارجي للأطراف، و(3) الأجنة المانحة لتطعيم RL.
- لاحتضان البيض المخصب ، ضع البيض عموديا مع الجانب المدبب لأسفل في الحاضنة المرطبة. قم بتدوير البيض أثناء الحضانة لأنه من الضروري منع الجنين النامي من الالتصاق بغشاء القشرة.
- بعد ثلاثة أيام ونصف من الحضانة ، قم بإزالة البيض من الحاضنة ، ومسحة مع 70 ٪ من الإيثانول ، والسماح لها بالجفاف في الهواء.
- تحديد الأجنة النامية التي تقوم بتغطية البويضة لمراقبة الأوعية الدموية وتحديد موقع الجنين. تخلص من البيض الذي ليس لديه جنين.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، قم بتوزيع البيض للحصول على خلايا الجلد المتوسط والأديم الخارجي والمضيفين ل RL.
2. الحصول على خلايا الجلد المتوسط الأطراف لملء الأديم الخارجي
ملاحظة: قبل البدء في التلاعب ، يوصى بشدة بتطهير منطقة العمل والمجاهر وجميع الأدوات عن طريق المسح بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪.
- اضغط على الطرف الحاد من قشر البيض مع نهاية ملقط حاد لفتح نافذة وإزالة حوالي 1 سم × 1 سم من القشرة باستخدام الملقط.
- انقل البيض إلى حامل بلاستيكي أو كرتوني وضعه واحدا تلو الآخر تحت المجهر المجسم. حدد غشاء الهواء ثم قم بإزالته عن طريق اختيار ثقب صغير حيث لا توجد أوعية. اسحب هذه المنطقة بمساعدة ملقط جراحي دقيق.
ملاحظة: يمكن تحديد غشاء الهواء على أنه الغشاء الأبيض وغير الشفاف الذي لوحظ مباشرة بعد نافذة البويضة.- قم بإزالة أي قطعة صغيرة من قشر البيض قد تتلامس مع الجنين.
ملاحظة: تحقق من أن الأجنة في مرحلة 22 HH قبل بدء البروتوكول. يمكن إعادة الأجنة في المراحل المبكرة إلى الحاضنة بعد إغلاق نافذة قشر البيض بشريط.
- قم بإزالة أي قطعة صغيرة من قشر البيض قد تتلامس مع الجنين.
- افتح الكيس الأمنيوسي تماما عن طريق تمزيق السلى باستخدام الملقط الجراحي الدقيق (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن تحديد السلى على أنه غشاء شفاف يغطي الجنين عن كثب ويمتلئ بالسائل الأمنيوسي. - قم بإزالة الجنين بعناية من البويضة باستخدام زوج من الملقط الحاد ثم انقله إلى طبق بتري معقم يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (1x PBS). كرر هذه الخطوة للبيض المتبقي. ضع في اعتبارك أن الأجنة ~ 8-10 فقط كافية للحصول على خلايا الجلد المتوسط.
- اغسل الأجنة مرة واحدة في 1x PBS الباردة ، وبمساعدة المجهر المجسم (انظر جدول المواد) ، اسحب أي أغشية متبقية. حدد موقع براعم الأطراف الخلفية.
ملاحظة: براعم الأطراف عبارة عن هياكل مستديرة تقع على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين كنتوءات من الجناح. تقع الأطراف الخلفية بشكل خلفي أكثر من الأطراف الأمامية. - الحفاظ على الأجنة في نظيفة 1x PBS ، وباستخدام زوج من الملقط الجراحي الدقيق ، قص كل برعم الطرف الخلفي طوليا. قطع برعم قريب جدا من جناح الجنين لتشريح براعم الأطراف الخلفية بأكملها. كرر هذه الخطوة مع الأجنة المتبقية.
- استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل براعم الأطراف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل.
- استخدم طرف ماصة لإزالة أي فائض من 1x PBS واستبدال PBS بمحلول التربسين 500 ميكرولتر بنسبة 0.5٪ (انظر جدول المواد). احتضان براعم الأطراف في كتلة حرارية لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة محلول التربسين واستبدله ب 500 ميكرولتر من الكولاجيناز من النوع الرابع عند 2 ملغم / مل في محلول الملح المتوازن هانكس (انظر جدول المواد) ، ثم احتضنه في كتلة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: حضانة التربسين تفصل قليلا الأديم الخارجي، في حين أن الكولاجيناز يصنف خلايا الجلد المتوسط. - بعد الحضانة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الكولاجيناز واستبدله ب 1 مل من وسط الجلوكوز المتوسط والعالي (DMEM-HG) المعدل من Dulbecco مع 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) لتعطيل الإنزيمات. ماصة الخليط بلطف ~ 10 مرات.
- قم بتصفية التعليق الذي يحتوي على الخلايا بمصفاة خلية تبلغ 70 ميكرومتر لتترك وراءها الأديم الظاهر.
ملاحظة: سيؤدي الترشيح أيضا إلى إزالة أي براعم أطراف غير مهضومة ، تاركا وراءه تعليقا للخلايا المفردة. - بعد التصفية ، ماصة التعليق مرة أخرى 5-10 مرات وأجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص من supernatant.
- استخدم 1 مل من DMEM-HG مع 10٪ FBS لغسل الكولاجيناز الزائد. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 200 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من الوسط بعناية عن طريق السحب ثم استبدله ب 1 مل من DMEM-HG الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS دون إزعاج الخلايا الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- اسمح للخلايا بتكوين حبيبة مدمجة (إعادة تجميع) بعد احتضانها لمدة 1-1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية.
ملاحظة: في حين أن خلايا الجلد المتوسط تشكل الكريات ، فمن الملائم الحصول على الأديم الخارجي للأطراف.
3. الحصول على الأديم الخارجي للأطراف
- كرر الخطوات من 1 إلى 6 من القسم 2 بشكل منفصل مع أجنة الدجاج HH ال 22 الأخرى التي تم اختيارها للحصول على الأديم الخارجي.
ملاحظة: يتناسب عدد الأجنة لهذا الغرض مع العدد النهائي ل RL المطلوب. نسبة 2: 1 من الأديم الخارجي-RL مناسبة. - بعد الحصول على براعم الأطراف الخلفية ، استخدم ماصة بلاستيكية لنقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ. قم بإزالة أي فائض 1x PBS واستبدله ب 500 ميكرولتر من 0.5٪ من التربسين في 1x PBS معقم. احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية.
- بعد الهضم الأنزيمي ، انقل محلول التربسين الذي يحتوي على براعم الأطراف إلى طبق بتري معقم.
- إزالة التربسين الزائد قدر الإمكان باستخدام ماصة دقيقة. قم بإغراق طبق بتري مع 1x PBS بارد مع استكمال 10٪ من FBS حتى يتم تغطية جميع براعم الأطراف.
ملاحظة: يمكن استبدال FBS بمصل الحصان. - تحديد براعم الأطراف تحت المجهر المجسم. تحديد الأديم الخارجي كغشاء شفاف منفصل قليلا عن خلايا الجلد المتوسط للأطراف (الشكل 1B).
- أمسك الطرف الأكثر قربا من برعم الأطراف بمساعدة ملقط جراحي دقيق أثناء فصل طبقة الأديم الخارجي بعناية وفصلها باستخدام الملقط الآخر.
ملاحظة: قد يكون الحصول على الأديم الخارجي صعبا بسبب تكتل خلايا الجلد المتوسط وارتباطها بالأديم الظاهر، مما يجعلها لزجة. يوصى بالتخلص باستمرار من خلايا الجلد المتوسط للحفاظ على الأديم الخارجي فقط في طبق Petri. - حافظ على الأديم الخارجي في محلول PBS-10٪ FBS البارد المثلج.
ملاحظة: يمكن تخزين الأديم الخارجي عند 4 درجات مئوية في حالة عدم جاهزية الأديم المتوسط المعاد تجميعه. ومع ذلك ، فمن الأفضل تنسيق وقت حضانة الكريات مع الحصول على الجلد الخارجي.
4. تجميع خلايا الجلد المتوسط داخل غطاء الجلد الخارجي
ملاحظة: لهذا ، من الضروري وجود الأديم الخارجي الفارغ في طبق بتري مع محلول معقم 1x PBS-10٪ FBS يحتوي على حبيبات مشكلة من خلايا الجلد المتوسط.
- بعد تشكيل الكريات (انظر القسم 2) ، تخلص من ~ 600 ميكرولتر من الوسط من الأنبوب عن طريق السحب.
- افصل الكريات بعناية عن الأسفل باستخدام طرف ماصة ودون تحطيمها أو تدميرها.
- عندما يتم فصل الكريات تماما عن الجزء السفلي من الأنبوب ، اقلب الأنبوب رأسا على عقب لنقل الكريات إلى طبق بتري الذي يحتوي على الأديم الخارجي الفارغ (الشكل 1C).
- قطع قطعة صغيرة من الكريات بمساعدة زوج من الملقط الجراحي الدقيق ووضعها في أقرب مكان ممكن من الأديم الخارجي.
- كما لو كانت كيسا ، افتح الأديم الخارجي باستخدام الملقط الجراحي ، وضع قطعة الكريات بإحكام قدر الإمكان في غطاء الجلد الخارجي. كرر هذه الخطوة لأكبر عدد ممكن من RLs حسب الرغبة (الشكل 1D).
ملاحظة: قطع قطع الكريات واحدة تلو الأخرى ، وملء الأديم الخارجي للحفاظ على نظافة محلول 1x PBS-10٪ FBS. يجب أن يتوافق حجم الكريات مع كل أدمة خارجية. - اسمح للأديم الخارجي والأديم المتوسط بالشفاء معا لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتطعيمهما في مضيف الجنين. تخلص من الأديم الخارجي والأديم المتوسط غير المستخدمين.
5. زرع الأديم الخارجي المملوء في جنين مضيف
ملاحظة: قبل زرع الأديم الخارجي، رتب مجهرين مجسمين بجانب بعضهما البعض على سطح مقعد، أحدهما للتلاعب بالأجنة وتطعيم RL. والآخر هو للحفاظ على الأديم الخارجي المملوء جاهزا للانتقال إلى الجنين.
- حدد عدد البيض المطلوب لتطعيم الأديم الخارجي المملوء.
- باستخدام نهاية ملقط حاد ، انقر فوق قشر البيض للأجنة المضيفة 22 HH لفتح نافذة. حدد غشاء الهواء ، وباستخدام زوج من الملقط الجراحي الدقيق ، قم بإزالته تماما.
- افتح الكيس الأمنيوسي بالقرب من الطرف الأمامي لكشف الجناح الأيمن للجنين. افتح فقط المبلغ اللازم لإنجاز الإجراء.
- مسترشدا بوضع الطرف الأمامي ، قم بإجراء خدش الجرح بإبرة التنغستن (انظر جدول المواد) بطول 2-3 سوميت ، مما يؤدي إلى إتلاف الأديم المتوسط قليلا حتى ينزف.
- قم بنقل الأديم الخارجي المملوء (RL) بشكل فردي إلى جنين الفرخ ووضع قاعدة الطرف المؤتلف فوق جرح السوميت.
ملاحظة: يمكن إجراء نقل RL باستخدام ماصة بلاستيكية أو بسكين شق بزاوية. - قم بإصلاح RL بشكل صحيح باستخدام قطعتين من سلك البلاديوم بقطر 0.025 مم وطول 0.5-1 مم (انظر جدول المواد). قم بمحاذاة قاعدة RL مع الجرح للتأكد من أنه سيتم تثبيته على جناح الجنين المضيف والأوعية الدموية (الشكل 1E).
- أغلق النافذة بشريط لاصق ، وأعد البيضة إلى الحاضنة. جمع الأجنة في النقاط الزمنية المطلوبة للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعرف على طرف مؤتلف جيد الأداء
بعد التطعيم ، تم إرجاع الأجنة التي تم التلاعب بها إلى الحاضنة للسماح ل RL بالتطور. ارتبط وقت الحضانة بمتطلبات التجربة. ومع ذلك ، يمكن تمييز RL بسهولة بعد 12 ساعة من الزرع. لتحديد ما إذا كانت عملية الزرع كافية، لوحظ أن RL هو نتوء مرتبط بشكل آمن بجدار الجلد المتوسط للجنين المتبرع (الشكل 2A). على العكس من ذلك ، سواء فشلت صلاحية الخلية و / أو الكسب غير المشروع ، تم فصل RL عن جدار الجلد المتوسط أو قدم مورفولوجيا خشنة (الشكل 2B).
الفحص المورفولوجي والنمطي للأطراف المؤتلفة
للفحص المورفولوجي ، تم تلطيخ RL باللون الأزرق الألسي17 لمراقبة تكوين العناصر الهيكلية وأنماطها. يوصى بتلطيخ جذع الجنين المتبرع بالكامل لتجنب فقدان RL أثناء الإجراء (الشكل 3A). بدلا من ذلك ، قبل مسح RL ، تم الحصول على صور في محلول الإيثانول لمراقبة مورفولوجيا RL أو إجراء قياسات كمية (الشكل 3B). تم تقطيع RL الملطخ أو غير الملطخ لمراقبة بنية الأنسجة أو تحديد نوع الخلية (الشكل 3C).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للتصميم التجريبي للأطراف المؤتلفة (RL). (A) تم إجراء RL عن طريق تجميع الأديم المتوسط برعم الأطراف من جنين فرخ 22 HH من متبرع داخل غطاء جلدي خارجي تم الحصول عليه من متبرع آخر بجنين الفرخ HH. كانت الأديم الخارجي محشوة بإحكام بخلايا الجلد المتوسط. بعد التجميع ، تم نقل الأديم الخارجي المحشو وتثبيته بأسلاك البلاديوم فوق جرح سوميت سابق. (ب) برعم الأطراف مع الأديم الخارجي المنفصل بعد علاج التربسين. (ج) تم الحصول على الكريات بعد تكوينها بالقرب من الأديم الخارجي الفارغ ، جاهزة للتعبئة. (د) يظهر غطاء للجلد الخارجي مملوء بخلايا الجلد المتوسط. (ه) تثبيت RL في الجنين المضيف بأسلاك البلاديوم. يرجى ملاحظة أن RL تم وضعه على الجناح الأيمن للجنين بالقرب من برعم الطرف الأمامي. ع: بيليه. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأطراف المؤتلفة الدجاج والدجاج التي تم الحصول عليها حديثا. (أ) يظهر RL 24 ساعة متصل بجدار الأديم المتوسط. (ب) يظهر RL 24 ساعة غير ناجح. يرجى ملاحظة أن سلك البلاديوم لا يقوم بإصلاح RL. وبالتالي ، انفصل RL عن جدار الجلد المتوسط وقدم مورفولوجيا خشنة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحليل المورفولوجي للأطراف المؤتلفة . (أ) تلطيخ أزرق ألسيان لإظهار عناصر الهيكل العظمي في RL الدجاج والدجاج لمدة 6 أيام. (ب) تم عرض نفس RL في (A) قبل إزالة اللون الأزرق السياني. (ج) شريحة القوس من RL ملطخة بتلطيخ أزرق ألسيان وبالهيماتوكسيلين والإيوزين. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكول RL إلى خمس خطوات: (1) حضانة الأجنة ، (2) الحصول على خلايا الأطراف المتوسطة لملء الأديم الخارجي ، (3) الحصول على الأديم الخارجي ، (4) تجميع خلايا الجلد المتوسط داخل أغطية الجلد الخارجي ، و (5) زرع الأديم الخارجي المملوء في الأجنة المضيفة. القيد الرئيسي لتقنية RL هو البروتوكول الطويل والمفصل ، والذي يحتوي على العديد من النقاط الحرجة التي تتطلب الصبر لأداء الأداء المناسب. لإكمال البروتوكول بنجاح ، يجب تحديد اللحظات الحرجة. أثناء شراء خلايا الجلد المتوسط ، تعد سلامة الخلايا وقابليتها للبقاء أمرا ضروريا. موت الخلايا سيمنع تطور RL السليم. في سياق مماثل ، يعد التلاعب الصحيح بالأديم الخارجي ضروريا لضمان التفاعل بين خلايا الجلد المتوسط والجلد الخارجي. عندما يتم حشو الأديم الخارجي ، يجب أن تكون خلايا الجلد المتوسط أقرب ما يمكن إلى الأديم الخارجي البعيد تحت AER. بالنسبة لكل من شراء الجلد المتوسط والجلد الخارجي ، فإن المرحلة التنموية للأجنة المانحة أمر بالغ الأهمية أيضا. يجب مراعاة أن خلايا الجلد المتوسط سوف تستجيب بشكل تفاضلي وفقا لمرحلة نموها. ومع ذلك ، يمكن اختيار المرحلة النامية بحرية وفقا للمتطلبات التجريبية. ومع ذلك ، يجب الحفاظ على مرحلة 22 HH لجعل الحصول على الأديم الخارجي أسهل ، وبالتالي الحفاظ على السلامة الخلوية والإشارات. وأخيرا، فإن التطعيم والتثبيت الجيدين ضروريان لضمان التكامل الصحيح ل RL مع جدار الجنين وتطوره.
أبلغ إدغار زويلينغ لأول مرة عن نظام RL في عام 19646 ، وبعد ذلك نفذته العديد من المجموعات البحثية للإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام. سبق وصف بروتوكول RL بالطول من قبل Marian Ros et al. كطريقة قياسية للتعامل مع برعم طرف الفرخ النامي18 ، والذي يشرح طرقا أخرى لنافذة البيض وأداء RL مع الجناح أو الساق بالكامل وأداء RL مع الأديم المتوسط المعاد تجميعه. ومع ذلك ، بعض الاختلافات بين Ros. ويمكن الاطلاع على البروتوكول والبروتوكول الحالي الموصوف هنا. في بروتوكولهم ، يتم احتضان براعم الأطراف من الأجنة كمتبرعين بالأديم الخارجي بالتريبسين في PBS البارد المثلج لمدة 2 ساعة تقريبا. بعد البدء في حضانة الأديم الخارجي ، حصلوا على الفور على براعم الأطراف من الأجنة كمتبرعين بالأديم المتوسط ، ثم قاموا بتفتيت براعم الأطراف ، وهضمها ، وإزالة الأديم الخارجي يدويا لتشكيل حبيبة الجلد المتوسط بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة. هنا ، أولا ، تم الحصول على براعم الأطراف من الأجنة لاستخدامها كمتبرعين بالجلد المتوسط ، وبعد ذلك يتم هضم برعم الطرف بأكمله عن طريق الحضانة بالتريبسين والكولاجيناز. ثم تتم إزالة الأديم الخارجي عن طريق الترشيح ، ويتم تحضين الكريات بين 1-1.5 ساعة. ميزة هذه الطريقة للحصول على بيليه الجلد المتوسط هي أن العلاج بالتريبسين يفصل الأديم الخارجي السليم عن الأديم المتوسط بينما يهضم علاج الكولاجيناز خلايا الجلد المتوسط. لذلك ، من الممكن تصفية الأنسجة الخارجية والتخلص منها. من ناحية أخرى ، فإن المزيد من وقت حضانة الكريات يسمح لها بالضغط بشكل أفضل ، مما يساعد عندما تمتلئ الأديم الخارجي. الفرق الآخر بين البروتوكولين هو أن روس وآخرون قاموا بتقشير الأديم الخارجي واحدا تلو الآخر ونقلهم إلى طبق بتري الذي يحتوي على الكريات. في المقابل ، يتم تشريح جميع الأديم الخارجي وجمعها في طبق بتري في هذا البروتوكول. يتم نقل الكريات إلى طبق بتري لملء الأديم الخارجي. باتباع هذه الطريقة ، يمكن تحضير الأديم الخارجي في وقت واحد مع التطعيم. وكما هو الحال مع العديد من البروتوكولات الأخرى، قد تختلف كيفية تنفيذ RLs؛ ومع ذلك ، فإن الخطوات الواردة في كلا البروتوكولين تصف بشكل كاف المراحل الحرجة للتقنية لإنتاج معالجة ناجحة.
وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن خلايا منطقة الاستقطاب المنفصلة تمنع التشكل عند تشتيتها عشوائيا بين الأديم المتوسط في RL 7,10. وبالتالي ، فمن الاختياري القضاء على الخلايا من ZPA قبل تشكيل بيليه الجلد المتوسط. في وقت لاحق ، يمكن استخدام خلايا ZPA (أو حبات القنفذ الصوتي المدمجة) لحث RL على تطوير قطبية A-P 8,9,19.
النموذج التجريبي RL قابل للتكيف مع مجموعة متنوعة من السيناريوهات. يمكن تنفيذ إعادة التركيب مع خلايا الأطراف من مراحل تنموية أو ناضجة مختلفة (أمامية أو خلفية) ، ومواقع أخرى على طول محاور الأطراف الثلاثة ، ومع خلايا معاد تجميعها منفصلة أو الأديم المتوسط غير المنفصل15. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات السابقة أفادت باستخدام نموذج RL لدراسة سلوك مجموعات مختلفة من الأديم المتوسط المتحور والبري والأديم الخارجي13،14،20،21 أو باستخدام الخلايا الكهربائية22.
بالنظر إلى أن تطور الأطراف هو عملية محفوظة تطوريا ، يمكن أن تختلف مصادر الأديم الخارجي أيضا عن الدجاج أو السمان أو البط أو الفأر أو الفئران التي يمكن الحصول عليها باتباع نفس البروتوكول الموصوف. هناك احتمال آخر هو تغيير الجلد المتوسط - أو حتى أنواع الخلايا أو المصادر الأخرى لإنتاج RL بين الأنواع.
في الختام ، RL هو نموذج هائل لدراسة التشكل ، والأنماط ، والتفاعلات بين الخلايا والخلايا ، وهجرة الخلايا ، وتمايز الخلايا على المستويين الخلوي والجزيئي. نظرا لأن إجراء RL يسمح باختلافات متعددة ، فإنه يسمح بالتطبيقات المحتملة عبر العديد من الأسئلة البيولوجية دون أن يقتصر على البيولوجيا التنموية لأطراف الدجاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر إستيفانيا غاراي باتشيكو على الصور في الشكل 2 وماريا فاليريا شيمال-مونتيس دي أوكا على الأعمال الفنية. وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA) - الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك [أرقام المنح IN211117 و IN213314] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) [رقم المنحة 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] الممنوحة ل JC-M. حصل JC M-L على زمالة ما بعد الدكتوراه من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
