Summary
גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.
Abstract
התמיינות תאים היא תהליך מכוונן היטב של מחויבות תאים המוביל להיווצרותם של סוגי תאים מיוחדים שונים במהלך הקמת רקמות ואיברים מתפתחים. תהליך זה נשמר באופן פעיל בבגרותו. התמיינות תאים היא תהליך מתמשך במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס של איברים. הבנת השלבים המוקדמים של התמיינות תאים חיונית כדי לדעת תהליכים מורכבים אחרים כגון מורפוגנזה. לפיכך, גפי עוף רקומביננטיות הן מודל ניסיוני המאפשר לחקור התמיינות תאים ויצירת תבניות תחת אותות דפוס עובריים. מודל ניסיוני זה מחקה סביבת in vivo ; הוא מרכיב תאים צבורים מחדש לתוך כיסוי אקטודרמלי המתקבל מניצן גפיים מוקדם. מאוחר יותר, אקטודרמים מועברים ומושתלים בקולטן עובר אפרוח כדי לאפשר את התפתחותו. בדיקה זו שימשה בעיקר להערכת תאי ניצן גפיים מזודרמליים; עם זאת, ניתן ליישם אותו על תאי גזע או אב אחרים מאורגניזמים אחרים.
Introduction
איבר בעלי החוליות הוא מודל אימתני לחקר התמיינות תאים, התפשטות תאים, מוות של תאים, היווצרות תבניות ומורפוגנזה 1,2. במהלך ההתפתחות, הגפיים מגיחות כבליטות מהתאים שמקורם במזודרם צלחת צידית1. ניצני הגפיים מורכבים מליבה מרכזית של תאים מזודרמליים המכוסים על ידי אקטודרם. מהמבנה המוקדם הזה מגיח איבר שלם ומעוצב היטב. לאחר הופעת ניצן הגפיים, מזהים שלושה צירים: (1) הציר הפרוקסימו-דיסטלי ([PD] כתף לאצבעות), (2) ציר הגב-גחון ([DV] מגב היד לכף היד), ו-(3) האגודל הקדמי-אחורי ([AP] אגודל לאצבע). הציר הפרוקסימלי-דיסטלי תלוי ברכס האקטודרמלי האפי (AER), אקטודרם מיוחד הממוקם בקצה הדיסטלי של ניצן הגפיים. ה-AER נדרש לצמיחה החוצה, לתחזוקת הישרדות, להתרבות ולמצב הלא מובחן של תאים הקולטים אותות 2,3. מצד שני, אזור הפעילות המקטבת (ZPA) שולט בתבנית האנטרופוסטריורית4, בעוד שהגב והאקטודרם שולטים בתבנית הגבית והאקטודרמית 7,8. אינטגרציה של דפוסים תלת-ממדיים מרמזת על הצלבה מורכבת בין שלושת הצירים הללו5. למרות הבנת המסלול המולקולרי במהלך התפתחות הגפיים, שאלות פתוחות על המנגנונים השולטים בדפוסים ובצמיחה נכונה ליצירת גפה שלמה נותרות ללא מענה.
אדגר צווילינג פיתח את מערכת הגפיים הרקומביננטיות (RL) בשנת 1964 כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים מזנכימליים של הגפיים לבין האקטודרם בפיתוח גפיים6. מערכת ה-RL מרכיבה את מזודרם ניצני הגפיים המנותק לתוך האקטודרם העוברי של הגפיים כדי להשתיל אותו בחלק הגבי של עובר האפרוח התורם. האותות המסופקים על ידי האקטודרם משרים ביטוי של גנים של התמיינות וגנים דפוסים באופן מרחבי-טמפורלי, ובכך גורמים להיווצרות מבנה דמוי גפיים שיכול לשחזר את תוכניות התאים המתרחשות במהלך התפתחות הגפיים 7,8,9.
מודל RL הוא בעל ערך להבנת התכונות של רכיבי הגפיים והאינטראקציה בין תאים מזודרמליים ואקטודרמליים6. ניתן להגדיר RL כמבנה דמוי גפיים שנוצר על ידי התאים המזודרמליים של ניצני הגפיים המורכבים או רקומבינציה בתוך כיסוי אקטודרמלי6. המורפוגנזה של ה-RL תלויה במאפיינים של התאים המזודרמליים (או סוגים אחרים) שיגיבו לאותות התבנית האקטודרמלית. אחד היתרונות של מערכת ניסיונית זו הוא הרבגוניות שלה. מאפיין זה מאפשר יצירת שילובים מרובים על ידי שינוי המקור של תאים מזודרמליים, כגון תאים משלבי התפתחות שונים, ממיקומים שונים לאורך הגפה, או תאים שלמים (לא מובחנים) או מצטברים מחדש 7,8,9,10. דוגמה נוספת היא היכולת להשיג את האקטודרם העוברי ממינים שאינם עוף, למשל, צב11, שליו או עכבר12.
במובן זה, טכניקת RL מסייעת לחקור את התפתחות הגפיים ואת האינטראקציות בין תאים מזנכימליים ואקטודרמליים של הגפיים מנקודת מבט אבולוציונית. לטכניקה זו יש גם פוטנציאל גדול לניתוח היכולת של מקורות שונים של תאי אב להתמיין למבנה דמוי גפיים על ידי ניצול האותות המסופקים על ידי האקטודרם העוברי 12,13,14. בניגוד לתרביות במבחנה, ה-RL מאפשר להעריך את ההתמיינות והפוטנציאל המורפוגנטי של אוכלוסיית התאים על ידי פירוש אותות עובריים מאיברמתפתח 9,15.
בפרוטוקול זה, מדריך שלב אחר שלב לביצוע RL מוצלח עם תאי ניצן גפיים מזודרמליים מצטברים מחדש מסופק, ובכך פותח את האפשרות של התאמת פרוטוקול זה עם מקורות שונים של תאים מצטברים מחדש או אפילו מקורות אקטודרם שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה נסקר ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון לביומדיקה של המכון לביומדיקה של Investigaciones, אוניברסיטת נסיונל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM, מקסיקו סיטי, מקסיקו). תרשים זרימה סכמטי של השלבים הכלליים של פרוטוקול זה מוצג באיור 1A.
1. דגירה עוברית וקביעת כדאיות
- דגירה של ביצי עוף מופרות בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של כ-60% במשך כשלושה וחצי ימים עד שהגיעו לשלב 22 HH (על פי המילטון והמבורגר, 1951)16.
הערה: ניתן לאחסן ביצי עוף מופרות טריות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.- כדי לדגום את הביציות המופריות, מניחים את הביצים בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה לתוך האינקובטור הלח. סובבו את הביציות במהלך הדגירה כפי שנדרש כדי למנוע מהעובר המתפתח להיצמד לקרום הקליפה.
הערה: ניתן להשיג ביצי תרנגולות מופרות מחוות מקומיות. ביצי תרנגולת מופרות של הלגהורן הלבן משמשות בדרך כלל למניעת פיגמנטציה של הנוצות בעוברים מאוחרים. שקול לדוגר מספיק ביציות בנפרד כדי לקבל שלושה מבנים: (1) תאים מזודרמליים של הגפיים, (2) אקטודרמים של הגפיים, ו-(3) עוברים תורמים כדי להשתיל את ה-RL.
- כדי לדגום את הביציות המופריות, מניחים את הביצים בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה לתוך האינקובטור הלח. סובבו את הביציות במהלך הדגירה כפי שנדרש כדי למנוע מהעובר המתפתח להיצמד לקרום הקליפה.
- לאחר שלושה וחצי ימים של דגירה, מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מבשלים עם 70% אתנול, ומאפשרים ייבוש באוויר.
- זהה עוברים מתפתחים המנקים את הביצית כדי לתצפת על כלי הדם ולאתר את העובר. השליכו ביציות שאין להן עובר.
הערה: בשלב זה, להפיץ את הביצים כדי להשיג תאים מזודרמליים, אקטודרמים, ואת המארחים עבור RL.
2. השגת תאים מזודרמליים של הגפיים למילוי אקטודרמים
הערה: לפני תחילת המניפולציות, מומלץ מאוד לחטא את אזור העבודה, את המיקרוסקופים, ואת כל האינסטרופלקסים על ידי סחיטת תמיסת אתנול 70%.
- הקש על הקצה הקהה של קליפת הביצה עם קצה מלקחיים קהים כדי לפתוח חלון ולהסיר כ -1 ס"מ על 1 ס"מ של הקליפה באמצעות המלקחיים.
- העבירו ביצים למחזיק פלסטיק או קרטון והניחו אותן בזו אחר זו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. זהה את קרום האוויר ולאחר מכן הסר אותו על ידי בחירת חור קטן שבו לא נמצאים כלי דם. משוך אזור זה בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים.
הערה: ניתן לזהות את קרום האוויר כממברנה הלבנה והאטומה שנצפתה מיד לאחר חלון הביצה.- יש להסיר כל חתיכה קטנה של קליפת ביצה שעלולה לבוא במגע עם העובר.
הערה: ודא שהעוברים נמצאים בשלב של 22 HH לפני תחילת הפרוטוקול. ניתן להחזיר עוברים בשלבים מוקדמים יותר לחממה לאחר איטום חלון קליפת הביצה בנייר דבק.
- יש להסיר כל חתיכה קטנה של קליפת ביצה שעלולה לבוא במגע עם העובר.
- פתחו את שק מי השפיר לחלוטין על ידי קריעת השפיר באמצעות מלקחיים כירורגיים עדינים (ראו טבלת חומרים).
הערה: ניתן לזהות את אמניון כממברנה שקופה המכסה מקרוב את העובר ומלאה במי שפיר. - מוציאים בזהירות את העובר מהביצית באמצעות זוג מלקחיים קהים ולאחר מכן מעבירים לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה תמיסת מלח דחוסה בפוספט קר כקרח (1x PBS). חזור על שלב זה עבור הביצים הנותרות. קחו בחשבון שרק כ-8-10 עוברים מספיקים כדי להשיג את התאים המזודרמליים.
- שטפו את העוברים פעם אחת ב-1x PBS קר כקרח, ובעזרת סטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים), משכו את כל הממברנות הנותרות. אתרו את הניצנים האחוריים.
הערה: ניצני גפיים הם מבנים מעוגלים הממוקמים לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר כבליטות מהאגף. האחוריים ממוקמים באופן אחורי יותר מאשר הקדמיים. - שמרו על העוברים ב-PBS נקי 1x, ובאמצעות זוג מלקחיים כירורגיים עדינים, צלפו כל ניצן אחורי לאורך. חותכים את הניצן קרוב מאוד לאגף העובר כדי לנתח את כל הניצנים האחוריים. חזור על שלב זה עם העוברים הנותרים.
- השתמש בפיפטת העברת פלסטיק כדי להעביר את ניצני הגפיים לצינור מיקרוצנטריפוג' ריק של 1.5 מ"ל.
- השתמש בקצה פיפטה כדי להסיר כל עודף של 1x PBS ולהחליף PBS ב- 500 μL של תמיסת טריפסין של 0.5% (ראה טבלת חומרים). דגירה של ניצני גפיים בחסימה תרמית למשך 7 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את תמיסת הטריפסין והחלף אותה ב- 500 μL של קולגן מסוג IV ב- 2 מ"ג / מ"ל בתמיסת מלח מאוזנת של Hanks (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן דגירה אותו במחסום תרמי בטמפרטורה של 37 °C (37 °C ) למשך 8 דקות.
הערה: הדגירה של טריפסין מנתקת מעט את האקטודרמים, בעוד שקולגן מפרק תאים מזודרמליים. - לאחר הדגירה, יש להסיר כמה שיותר קולגן ולהחליף אותו ב-1 מ"ל של מדיום הגלוקוז הבינוני-גבוה (DMEM-HG) של Dulbecco עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי להשבית את האנזימים. פיפטה את התערובת בעדינות ~ 10 פעמים.
- סנן את ההשעיה המכילה את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להשאיר מאחור את האקטודרמים.
הערה: סינון יסיר גם את כל ניצני הגפיים הלא מעוכלים, וישאיר אחריהם השעיה של תאים בודדים. - לאחר הסינון, פיפט את המתלים שוב 5-10 פעמים וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- השתמשו ב-1 מ"ל של DMEM-HG בתוספת 10% FBS כדי לשטוף את עודפי הקולגן. צנטריפוגה את המתלים ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש להשליך את המדיום בזהירות על ידי צנרת ולאחר מכן להחליף אותו ב-1 מ"ל של DMEM-HG טרי בתוספת 10% FBS מבלי להפריע לתאים בתחתית הצינור.
- אפשר לתאים ליצור גלולה קומפקטית (regregate) לאחר דגירה שלהם במשך 1-1.5 שעות ב 37 °C במחסום thermoblock.
הערה: בעוד שתאים מזודרמליים יוצרים את הכדור, נוח להשיג את האקטודרמים של הגפיים.
3. קבלת האקטודרמים של הגפיים
- חזור על שלבים 1-6 מסעיף 2 בנפרד עם 22 העוברים האחרים של עוף HH שנבחרו כדי לקבל את האקטודרמים.
הערה: מספר העוברים למטרה זו פרופורציונלי למספר הסופי של ה- RL הרצוי. יחס של 2:1 אקטודרמס-RL מתאים. - לאחר השגת ניצני הניצנים האחוריים, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר אותם לצינור מיקרו-סנטריפוג' ריק. הסר כל עודף 1x PBS והחלף אותו ב- 500 μL של 0.5% טריפסין ב- PBS סטרילי 1x. דגירה של התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במחסום תרמי.
- לאחר העיכול האנזימטי, מעבירים את תמיסת הטריפסין המכילה את ניצני הגפיים לצלחת פטרי סטרילית.
- הסר את הטריפסין העודף ככל האפשר באמצעות מיקרופיפט; להציף את צלחת פטרי עם 1x PBS קר כקרח בתוספת 10% של FBS עד שכל ניצני הגפיים מכוסים.
הערה: ניתן להחליף את FBS בסרום לסוסים. - זהה את ניצני הגפיים מתחת לסטריאומיקרוסקופ; לזהות את האקטודרם כממברנה שקופה מנותקת מעט מהתאים המזודרמליים של הגפיים (איור 1B).
- יש להחזיק את הקצה הפרוקסימלי ביותר של ניצן הגפיים בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים תוך ניתוק והפרדה זהירים של שכבת האקטודרם באמצעות המלקחיים האחרים.
הערה: השגת האקטודרמים עלולה להיות קשה עקב התגוששות של תאים מזודרמליים והצמדתם לאקטודרמים, ובכך לגרום להם להפוך לדביקים. מומלץ להשליך כל הזמן את התאים המזודרמליים כדי לשמור רק על האקטודרמים בצלחת פטרי. - שמור על האקטודרמים בתמיסת 1x PBS-10% FBS קר כקרח.
הערה: ניתן לאחסן אקטודרמים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרה שהמזודרם הצבור מחדש אינו מוכן. עם זאת, עדיף לתאם את זמן הדגירה של הכדור עם קבלת ectodermal.
4. הרכבת תאים מזודרמליים בתוך הכיסוי האקטודרמלי
הערה: לשם כך, יש צורך באקטודרמים ריקים בצלחת פטרי עם תמיסת PBS-10% FBS סטרילית המכילה כדור שנוצר של תאים מזודרמליים.
- לאחר יצירת הכדור (ראה סעיף 2), יש להשליך ~600 μL של המדיום מהצינור על ידי צנרת.
- נתקו בזהירות את הכדור מלמטה באמצעות קצה פיפטה ומבלי לרסק או להרוס אותו.
- כאשר הכדור מנותק לחלוטין מתחתית הצינור, סובבו את הצינור הפוך כדי להעביר את הכדור לתוך צלחת הפטרי המכילה את האקטודרמים הריקים (איור 1C).
- חותכים חתיכה קטנה מהכדור בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים עדינים ומניחים אותה קרוב ככל האפשר לאקטודרם.
- כאילו מדובר בשקית, פתחו את האקטודרם עם המלקחיים הכירורגיים, והניחו את פיסת הכדור בצורה הדוקה ככל האפשר לתוך הכיסוי האקטודרמלי. חזור על שלב זה לקבלת RLs רבים ככל הרצוי (איור 1D).
הערה: חתכו את החלקים של הכדור אחד אחד, ומלאו את האקטודרמים כדי לשמור על ניקיון תמיסת 1x PBS-10% FBS. גודל הכדור צריך להתאים לכל אקטודרם. - אפשרו לאקטודרם ולמזודרם להחלים יחד למשך כ-30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשתיל אותם בעובר המארח. השליכו את האקטודרם והמזודרם שאינם בשימוש.
5. השתלת האקטודרם הממולא לעובר מארח
הערה: לפני השתלת האקטודרמים, ארגנו שני סטריאומיקרוסקופים זה ליד זה על ספסל, אחד למניפולציה של עוברים והשתלת RL. השני הוא לשמירה על האקטודרמים המלאים מוכנים להעברה לעובר.
- בחר את מספר הביצים הרצויות כדי להשתיל את האקטודרמים המלאים.
- באמצעות קצה של מלקחיים קהים, הקש על קליפת הביצה של 22 העוברים המארחים HH כדי לפתוח חלון. זהה את קרום האוויר, באמצעות זוג מלקחיים כירורגיים עדינים, הסר אותו לחלוטין.
- פתחו את שק מי השפיר ליד הפתח הקדמי כדי לחשוף את האגף הימני של העובר. פתח רק את הסכום הדרוש לביצוע ההליך.
- מונחה על ידי תנוחת הפורמלימב, בצע גירוד פצע עם מחט טונגסטן (ראה טבלת חומרים) לאורך 2-3 סומיטים, תוך פגיעה קלה במזודרם עד שהוא מדמם.
- מעבירים בנפרד אקטודרם מלא (RL) לתוך עובר האפרוח ומניחים את בסיס הגפה הרקומביננטית מעל הפצע הסומיט.
הערה: העברת RL יכולה להיעשות עם פיפטה מפלסטיק או עם סכין חריץ זוויתית. - תקן את ה-RL בצורה נכונה עם שתי חתיכות של חוט פלדיום בקוטר 0.025 מ"מ ובאורך 0.5-1 מ"מ (ראה טבלת חומרים). יישרו את הבסיס של ה-RL עם הפצע כדי להבטיח שהוא יהיה מחובר לאגף של העובר המארח וייצור כלי דם (איור 1E).
- אטמו את החלון בנייר דבק, והחזירו את הביצה לחממה. לאסוף את העוברים בנקודות הזמן הרצויות לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי איבר רקומביננטי בעל ביצועים טובים
לאחר ההשתלה, העוברים שעברו מניפולציה הוחזרו לחממה כדי לאפשר ל-RL להתפתח. זמן הדגירה תואם את דרישות הניסוי. עם זאת, ניתן להבחין בקלות בין RL לאחר 12 שעות של השתלה. כדי לקבוע אם ההשתלה הייתה מספקת, ה-RL נצפתה כבליטה שהייתה מחוברת היטב לדופן המזודרמלית של העובר התורם (איור 2A). להיפך, בין אם הכדאיות של התא ו/או השתל נכשלו, ה-RL נותק מהדופן המזודרמלית או הציג מורפולוגיה גסה (איור 2B).
בדיקה מורפולוגית ותבניתית של גפיים רקומביננטיות
לצורך בדיקה מורפולוגית, RL הוכתם בכחול אלקיאני17 כדי לבחון את היווצרותם של יסודות השלד ואת דפוסם. מומלץ להכתים את כל תא המטען של העובר התורם כדי לא לפספס את ה-RL במהלך ההליך (איור 3A). לחלופין, לפני ניקוי ה-RL, התקבלו תמונות בתמיסת אתנול כדי לבחון את המורפולוגיה של ה-RL או לבצע מדידות כמותיות (איור 3B). RL מוכתם או לא מוכתם נפרס כדי לבחון את מבנה הרקמה או לזהות את סוג התא (איור 3C).
איור 1: ייצוג סכמטי של התכנון הניסויי של גפיים רקומביננטיות (RL). (A) RL בוצע על ידי הרכבת מזודרם ניצני גפיים מעובר אפרוח תורם 22 HH בתוך כיסוי אקטודרמלי שהתקבל מתורם אחר של 22 עוברי אפרוח HH. אקטודרמים היו ממולאים היטב בתאים מזודרמליים. לאחר ההרכבה, אקטודרמים ממולאים הועברו ותוקנו עם חוטי פלדיום על גבי פצע של סומיט קודם. (B) ניצן איבר עם אקטודרם מנותק לאחר טיפול טריפסין. (C) הכדור הושג לאחר היווצרותו ליד האקטודרמים הריקים, מוכן למילוי. (D) מוצג כיסוי אקטודרמלי מלא בתאים מזודרמליים. (E) תיקון ה-RL בעובר המארח באמצעות חוטי פלדיום. שימו לב כי ה-RL הונחה על האגף הימני של העובר ליד ניצן הקדמי; p: כדור. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: גפיים רקומביננטיות של עוף-עוף שזה עתה התקבלו. (A) מוצג RL של 24 שעות המחובר לדופן המזודרם. (B) מוצג RL של 24 שעות שלא צלח. שים לב כי חוט הפלדיום אינו מתקן את ה- RL; כתוצאה מכך, ה-RL התנתק מהדופן המזודרמלית והציג מורפולוגיה גסה. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח מורפולוגי של גפיים רקומביננטיות. (B) אותו RL הוצג ב-(A) לפני ניקוי הכחול האלקי. (C) פרוסת Sagittal של RL מוכתמת בכתמים כחולים אלקיים ועם המטוקסילין ואוזין. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באופן כללי, ניתן לחלק את פרוטוקול RL לחמישה שלבים: (1) דגירה של עוברים, (2) השגת תאים מזודרמליים של הגפיים כדי למלא את האקטודרמים, (3) קבלת האקטודרמים, (4) הרכבת תאים מזודרמליים בתוך הכיסויים האקטודרמליים, ו-(5) השתלת האקטודרמים המלאים בעוברים המארחים. המגבלה העיקרית של טכניקת RL היא הפרוטוקול הארוך והמפורט, שיש בו נקודות קריטיות רבות הדורשות סבלנות כדי לבצע כראוי. כדי להשלים את הפרוטוקול בהצלחה, יש לזהות רגעים קריטיים. במהלך רכישת תאים מזודרמליים, השלמות והכדאיות של התאים הן חיוניות. מוות תאי ימנע התפתחות תקינה של RL. ברוח דומה, יש צורך במניפולציה נכונה של אקטודרם כדי להבטיח את האינטראקציה בין תאים מזודרמליים ואקטודרמליים. כאשר אקטודרמים ממולאים, תאים מזודרמליים חייבים להיות קרובים ככל האפשר לאקטודרם הדיסטלי שמתחת ל-AER. הן עבור רכש מזודרמלי והן עבור רכש אקטודרמלי, גם השלב ההתפתחותי של העוברים התורמים הוא קריטי. יש לקחת בחשבון כי התאים המזודרמליים יגיבו באופן דיפרנציאלי בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם. עם זאת, ניתן לבחור את שלב הפיתוח באופן חופשי בהתאם לדרישות הניסוי. ובכל זאת, יש לשמור על שלב 22 HH כדי להקל על השגת אקטודרמים, ובכך לשמור על שלמות ואיתות תאיים. לבסוף, השתלה ותיקון טובים חיוניים להבטחת שילוב RL נכון בדופן העובר ובהתפתחותו.
אדגר צווילינג דיווח לראשונה על מערכת RL בשנת 19646, ולאחר מכן קבוצות מחקר רבות יישמו אותה כדי לענות על מספר שאלות ביולוגיות מעניינות. הפרוטוקול של ה- RL תואר בעבר באורך על ידי מריאן רוס ואחרים כשיטה סטנדרטית לתמרן את ניצן איבר האפרוח המתפתח18, מה שמסביר דרכים אחרות לחלון הביצים ולבצע RL עם כנף או רגל שלמה ולבצע RL עם מזודרם מצטבר מחדש. עם זאת, כמה וריאציות בין הרוז. et al. ניתן למצוא את הפרוטוקול ואת הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן. בפרוטוקול שלהם, ניצני גפיים מעוברים כתורמי אקטודרם מודגרים עם טריפסין ב-PBS קר כקרח למשך כ-2 שעות. לאחר שיזמו דגירה של אקטודרם, הם השיגו מיד ניצני גפיים מעוברים כתורמי מזודרם, ואז קיצרו את ניצני הגפיים, עיכלו אותם והסירו את האקטודרם באופן ידני כדי ליצור את הכדור המזודרמלי לאחר הדגירה במשך 30 דקות. כאן, ראשית, ניצני הגפיים התקבלו מעוברים שישמשו כתורמים מזודרמליים, ולאחר מכן כל ניצן הגפיים מתעכל על ידי דגירה עם טריפסין וקולגןאז. לאחר מכן מוציאים אקטודרמים על ידי סינון, והכדור מודגר בין 1-1.5 שעות. היתרון של שיטה זו כדי לקבל את הכדור mesodermal הוא כי הטיפול עם טריפסין מנתק את ectoderms שלם מן mesoderm בעוד טיפול קולגן מעכל תאים מזודרמליים. לכן, ניתן לסנן את הרקמה האקטודרמלית ולהשליך אותה. מצד שני, יותר זמן דגירה של כדורים מאפשר לו להידחס טוב יותר, מה שעוזר כאשר אקטודרמים מתמלאים. הבדל נוסף בין שני הפרוטוקולים הוא ש-Ros et al. קילפו את האקטודרמים בזה אחר זה והעבירו אותם לצלחת פטרי שהכילה את הכדור. לעומת זאת, כל האקטודרמים מנותחים ונאספים בצלחת פטרי בפרוטוקול הנוכחי. הכדור מועבר לצלחת פטרי כדי למלא את האקטודרמים. על ידי ביצוע שיטה זו, ectoderms ניתן להכין בו זמנית עם השתלה. כמו בפרוטוקולים רבים אחרים, אופן ביצוע ה-RLs עשוי להשתנות; עם זאת, השלבים בשני הפרוטוקולים מתארים כראוי את השלבים הקריטיים של הטכניקה כדי לייצר מניפולציה מוצלחת.
עבודות קודמות הראו כי תאי אזור קיטוב מנותקים מעכבים מורפוגנזה כאשר הם מפוזרים באופן אקראי בין מזודרם ב-RL 7,10. לכן, זה אופציונלי לחסל תאים מן ZPA לפני יצירת גלולה mesodermal. מאוחר יותר, ניתן להשתמש בתאי ZPA (או חרוזים משובצים בקיפוד קולי) כדי לגרום ל-RL לפתח קוטביות A-P 8,9,19.
המודל הניסיוני של RL ניתן להתאמה למגוון תרחישים. רקומבינציה יכולה להיות מיושמת עם תאי גפיים משלבים התפתחותיים או בוגרים שונים (קדמיים או אחוריים), תנוחות אחרות לאורך שלושת צירי הגפיים, ועם תאים מנותקים-צבירה או מזודרם15 ללא הפרדה. באופן מעניין, מחקרים קודמים דיווחו על שימוש במודל RL כדי לחקור את ההתנהגות של שילובים שונים של מזודרם מוטנטי ואקודרמים מסוג פראי 13,14,20,21 או באמצעות תאים אלקטרופורים22.
בהתחשב בכך שהתפתחות הגפיים היא תהליך שנשמר מבחינה אבולוציונית, ניתן גם לשנות את מקורות האקטודרם של העוף, השליו, הברווז, העכבר או החולדה לאחר אותו פרוטוקול שתואר. אפשרות נוספת היא לשנות את המזודרמלי - או אפילו סוגי תאים אחרים או מקורות אחרים כדי לייצר RL בין-מיני.
לסיכום, RL הוא מודל פנומנלי לחקר מורפוגנזה, דפוסים, אינטראקציות בין תאים, נדידת תאים והתמיינות תאים ברמה התאית והמולקולרית. מכיוון שההליך של RL מאפשר וריאציות מרובות, הוא מאפשר יישומים פוטנציאליים על פני שאלות ביולוגיות רבות מבלי להיות מוגבל לביולוגיה התפתחותית של גפיים עוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לאסטפניה גאראי-פצ'קו על התמונות באיור 2 ולמריה ולריה צ'ימאל-מונטס דה אוקה על יצירות האמנות. עבודה זו נתמכה על ידי ה-Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [מספרי מענקים IN211117 ו-IN213314] ו-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [מענק מספר 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] שהוענק ל-JC-M. JC M-L זכה במלגת פוסט-דוקטורט מטעם Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
