Summary
Рекомбинантные конечности являются мощной экспериментальной моделью, позволяющей изучать процесс дифференцировки клеток и генерации паттернов под влиянием эмбриональных сигналов. Этот протокол представляет собой подробный метод генерации рекомбинантных конечностей с куриными конечностями-мезодермальными клетками, адаптируемыми к другим типам клеток, полученных от разных организмов.
Abstract
Клеточная дифференцировка - это тонко настроенный процесс клеточной приверженности, приводящий к образованию различных специализированных типов клеток во время создания развивающихся тканей и органов. Этот процесс активно поддерживается в зрелом возрасте. Дифференцировка клеток – это непрерывный процесс во время развития и гомеостаза органов. Понимание ранних этапов дифференцировки клеток имеет важное значение для знания других сложных процессов, таких как морфогенез. Таким образом, рекомбинантные куриные конечности являются экспериментальной моделью, позволяющей изучать дифференцировку клеток и генерацию паттернов по сигналам эмбрионального паттерна. Эта экспериментальная модель имитирует среду in vivo ; он собирает реагрегированные клетки в эктодермальную оболочку, полученную из раннего бутона конечности. Позже эктодермы переносятся и имплантируются в рецептор эмбриона цыпленка, чтобы обеспечить его развитие. Этот анализ в основном использовался для оценки клеток мезодермальных почек конечностей; однако он может быть применен к другим стволовым клеткам или клеткам-предшественникам других организмов.
Introduction
Конечность позвоночных является грозной моделью для изучения дифференцировки клеток, пролиферации клеток, гибели клеток, формирования паттернов и морфогенеза 1,2. Во время развития конечности возникают в виде выпуклостей из клеток, полученных из боковой пластинки мезодермы1. Почки конечностей состоят из центрального ядра мезодермальных клеток, покрытых эктодермой. Из этой ранней структуры возникает цельная и хорошо сформированная конечность. После возникновения бутона конечности распознаются три оси: (1) проксимо-дистальная ось ([PD] плечо к пальцам), (2) дорсо-вентральная ось ([DV] от тыльной стороны руки до ладони) и (3) передне-задняя ([AP] большой палец к пальцу). Проксимально-дистальная ось зависит от апикального эктодермального гребня (АЭР), специализированной эктодермы, расположенной на дистальном кончике бутона конечности. AER необходим для роста, поддержания выживаемости, пролиферации и недифференцированного состояния клеток, получающих сигналы 2,3. С другой стороны, зона поляризационной активности (ZPA) контролирует переднезаднюю картину4, в то время как дорсальная и эктодерма контролируют дорсовентральный паттерн 7,8. Интеграция трехмерного паттерна подразумевает сложные перекрестные помехи между этими тремя осями5. Несмотря на понимание молекулярного пути во время развития конечностей, открытые вопросы о механизмах, которые контролируют паттерн и правильный рост для формирования целой конечности, остаются без ответа.
Эдгар Цвиллинг разработал систему рекомбинантных конечностей (RL) в 1964 году для изучения взаимодействия между мезенхимальными клетками конечностей и эктодермой в развивающихся конечностях6. Система RL собирает диссоциированную-реагрегированную мезодерму почки конечности в эктодерму эмбриональной конечности, чтобы пересадить ее в дорсальную часть донорского эмбриона цыпленка. Сигналы, обеспечиваемые эктодермой, индуцируют экспрессию генов дифференцировки и генов паттернов пространственно-временным образом, тем самым вызывая формирование конечностной структуры, которая может повторять клеточные программы, возникающие во время развития конечностей 7,8,9.
Модель RL ценна для понимания свойств компонентов конечностей и взаимодействия между мезодермальными и эктодермальными клетками6. RL можно определить как конечноподобную структуру, созданную экспериментально собирающими или рекомбинирующими мезодермальными клетками почек конечностей внутри эктодермального покрова6. Морфогенез RL зависит от характеристик мезодермальных клеток (или других типов), которые будут реагировать на сигналы эктодермального паттерна. Одним из преимуществ этой экспериментальной системы является ее универсальность. Эта характеристика позволяет создавать множественные комбинации путем изменения источника мезодермальных клеток, таких как клетки с разных стадий развития, из разных положений вдоль конечности, или целые (недиссоциированные) или реагрегированные клетки 7,8,9,10. Другим примером является возможность получения эмбриональной эктодермы от видов, отличных от кур, например, черепахи11, перепела или мыши12.
В этом смысле метод RL помогает изучать развитие конечностей и взаимодействия между мезенхимальными и эктодермальными клетками конечностей с эволюционной точки зрения. Этот метод также имеет большой потенциал для анализа способности различных источников клеток-предшественников дифференцироваться в конечностную структуру, используя сигналы, предоставляемые эмбриональной эктодермой 12,13,14. В отличие от культур in vitro, RL позволяет оценивать дифференцировку и морфогенетический потенциал клеточной популяции путем интерпретации эмбриональных сигналов от развивающейся конечности 9,15.
В этом протоколе приведено пошаговое руководство по выполнению успешной РЛ с реагрегированными клетками мезодермальных почек конечностей, что открывает возможность адаптации этого протокола с различными источниками реагрегированных клеток или даже различными источниками эктодермы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом по уходу за лабораторными животными и их использованию Института биомедических исследований Национального автономного университета Мексики (УНАМ, Мехико, Мексика). Схематическая блок-схема общих шагов этого протокола показана на рисунке 1A.
1. Инкубация эмбрионов и определение жизнеспособности
- Инкубировать оплодотворенные куриные яйца при 38 °C и относительной влажности 60% в течение примерно трех с половиной дней, пока они не достигнут стадии 22 HH (согласно Hamilton and Hamburger, 1951)16.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеоплодотворенные куриные яйца можно хранить при температуре 15 °C до одной недели.- Чтобы высиживать оплодотворенные яйца, поместите яйца вертикально заостренной стороной вниз в увлажненный инкубатор. Вращайте яйца во время инкубации, так как это необходимо, чтобы не допустить прилипания развивающегося эмбриона к мембране скорлупы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оплодотворенные куриные яйца можно получить на местных фермах. Оплодотворенные куриные яйца White Leghorn обычно используются, чтобы избежать пигментации перьев у поздних эмбрионов. Рассмотрите возможность инкубации достаточного количества яйцеклеток отдельно для получения трех структур: (1) мезодермальных клеток конечностей, (2) эктодермы конечностей и (3) донорские эмбрионы для пересадки RL.
- Чтобы высиживать оплодотворенные яйца, поместите яйца вертикально заостренной стороной вниз в увлажненный инкубатор. Вращайте яйца во время инкубации, так как это необходимо, чтобы не допустить прилипания развивающегося эмбриона к мембране скорлупы.
- После трех с половиной дней инкубации вынуть яйца из инкубатора, тампон с 70% этанолом и дать высохнуть на воздухе.
- Определите развивающиеся эмбрионы, засахаривающие яйцеклетку, чтобы наблюдать за кровеносными сосудами и находить эмбрион. Выбросьте яйца, у которых нет эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе распределите яйцеклетки, чтобы получить мезодермальные клетки, эктодермы и хозяев для RL.
2. Получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом манипуляций настоятельно рекомендуется продезинфицировать рабочую зону, микроскопы и все инструментальное путем смазывания 70% раствором этанола.
- Постучите тупым концом яичной скорлупы концом тупыми щипцами, чтобы открыть окно и удалить около 1 см х 1 см скорлупы с помощью щипцов.
- Переложите яйца в пластиковый или картонный держатель и поместите их по одному под стереомикроскоп. Определите воздушную мембрану, а затем удалите ее, выбрав небольшое отверстие, где не найдено сосудов. Потяните эту область с помощью тонких хирургических щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушная мембрана может быть идентифицирована как белая и непрозрачная мембрана, наблюдаемая сразу после окна яйца.- Удалите любой маленький кусочек яичной скорлупы, который может вступить в контакт с эмбрионом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эмбрионы находятся на стадии 22 HH, прежде чем инициировать протокол. Эмбрионы на более ранних стадиях могут быть возвращены в инкубатор после запечатывания окна яичной скорлупы скотчем.
- Удалите любой маленький кусочек яичной скорлупы, который может вступить в контакт с эмбрионом.
- Полностью открыть амниотический мешок, разорвав амнион с помощью тонких хирургических щипцов (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Амнион можно идентифицировать как прозрачную мембрану, которая плотно покрывает эмбрион и заполнена амниотической жидкостью. - Осторожно извлеките эмбрион из яйцеклетки с помощью пары тупых щипцов, а затем перенесите в стерильную чашку Петри, содержащую ледяной фосфатно-буферный физиологический раствор (1x PBS). Повторите этот шаг для оставшихся яиц. Учтите, что только ~8-10 эмбрионов достаточно для получения мезодермальных клеток.
- Вымойте эмбрионы один раз в ледяном 1x PBS и с помощью стереомикроскопа (см. Таблицу материалов) извлеките все оставшиеся мембраны. Найдите почки задних конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Почки конечностей представляют собой округлые структуры, расположенные вдоль передне-задней оси эмбриона в виде выступов из бока. Задние конечности расположены более задними, чем передние конечности. - Поддерживайте эмбрионы в чистом 1x PBS и, используя пару тонких хирургических щипцов, срезайте каждую почку задней конечности продольно. Вырежьте бутон очень близко к боку эмбриона, чтобы рассекнуть все почки задних конечностей. Повторите этот шаг с оставшимися эмбрионами.
- Используйте пластиковую переносную пипетку для переноса почек конечностей в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить избыток 1x PBS и заменить PBS 500 мкл 0,5% раствора трипсина (см. Таблицу материалов). Высиживать почки конечностей в термоблоке в течение 7 мин при 37 °C.
- Удалить раствор трипсина и заменить его 500 мкл коллагеназы IV типа при 2 мг/мл в растворе сбалансированной соли Хэнкса (см. Таблицу материалов), затем инкубировать его в термоблоке при 37 °C в течение 8 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация трипсина слегка отделяет эктодермы, в то время как коллагеназа дезагрегирует мезодермальные клетки. - После инкубации удалите как можно больше коллагеназы и замените ее 1 мл холодной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) для инактивации ферментов. Пипетку смеси аккуратно ~10 раз.
- Фильтруйте суспензию, содержащую клетки, с помощью клеточного ситечка 70 мкм, чтобы оставить после себя эктодермы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация также удалит любые непереваренные почки конечностей, оставив после себя суспензию одиночных клеток. - После фильтрации пипеткой снова суспензию 5-10 раз и центрифугой при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, затем выбросьте надосадочное вещество.
- Используйте 1 мл DMEM-HG с добавлением 10% FBS для промывания избытка коллагеназы. Центрифугировать суспензию при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Осторожно выбрасывайте среду путем пипетирования, а затем замените ее 1 мл свежего DMEM-HG, дополненного 10% FBS, не нарушая клетки в нижней части трубки.
- Дайте клеткам сформировать компактную гранулу (реагрегацию) после инкубации их в течение 1-1,5 ч при 37 °C в термоблоке.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мезодермальные клетки образуют гранулу, удобно получать эктодермы конечностей.
3. Получение эктодерм конечностей
- Повторите шаги 1-6 из раздела 2 отдельно с другими 22 куриными эмбрионами HH, выбранными для получения эктодерм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество эмбрионов для этой цели пропорционально конечному количеству желаемого RL. Уместно соотношение эктодермы-РЛ 2:1. - После получения бутонов задних конечностей используйте пластиковую пипетку, чтобы перенести их в пустую микроцентрифужную трубку. Удалите избыток 1x PBS и замените его 500 мкл 0,5% трипсина в стерильном 1x PBS. Инкубировать смесь в течение 30 мин при 37 °C в термоблоке.
- После ферментативного пищеварения перенесите раствор трипсина, содержащий почки конечностей, в стерильную чашку Петри.
- Удалите избыток трипсина как можно больше с помощью микропипетки; залить чашку Петри ледяным 1x PBS, дополненным 10% FBS, пока все почки конечностей не будут покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: FBS можно заменить конской сывороткой. - Идентификация почек конечностей под стереомикроскопом; идентифицировать эктодерму как слегка отделенную прозрачную мембрану от мезодермальных клеток конечности (рисунок 1B).
- Удерживайте самый проксимальный конец бутона конечности с помощью тонких хирургических щипцов, при этом осторожно отделяйте и отделяйте слой эктодермы с помощью других щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение эктодерм может быть затруднено из-за слипания мезодермальных клеток и прикрепления к эктодермам, что приводит к тому, что они становятся липкими. Рекомендуется постоянно выбрасывать мезодермальные клетки, чтобы поддерживать в чашке Петри только эктодермы. - Поддерживают эктодермы в ледяном 1x PBS-10% растворе FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эктодермы могут храниться при 4 °C в случае, если реагрегированная мезодерма не готова. Однако предпочтительно согласовывать время инкубации гранулы с эктодермальным получением.
4. Сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальной оболочки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого необходимо иметь пустые эктодермы в чашке Петри со стерильным 1x PBS-10% раствором FBS, содержащим сформированную гранулу мезодермальных клеток.
- После того, как гранула сформирована (см. раздел 2), отбросьте ~600 мкл среды из трубы путем пипетки.
- Аккуратно отсоедините гранулу от дна с помощью наконечника пипетки и не разбивая и не разрушая ее.
- Когда гранула полностью отсоединится от нижней части трубки, переверните трубку вверх дном, чтобы перенести гранулу в чашку Петри, содержащую пустые эктодермы (рисунок 1C).
- Вырежьте небольшой кусочек гранулы с помощью пары тонких хирургических щипцов и поместите его как можно ближе к эктодерме.
- Как если бы это был мешок, откройте эктодерму хирургическими щипцами и поместите кусок гранулы как можно плотнее в эктодермальную оболочку. Повторите этот шаг для необходимого количества RL (рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте кусочки гранулы один за другим и заполните эктодермы для поддержания чистоты 1x PBS-10% раствором FBS. Размер гранулы должен соответствовать каждой эктодерме. - Дайте эктодерме и мезодерме зажить вместе в течение ~ 30 минут при комнатной температуре, а затем привите их хозяину эмбриона. Выбросьте неиспользованные эктодерму и мезодерму.
5. Трансплантация заполненной эктодермы эмбриону хозяина
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пересадкой эктодермы расположите два стереомикроскопа рядом друг с другом на столешнице, один для манипуляций с эмбрионами и трансплантации RL. Другой предназначен для поддержания заполненных эктодерм, готовых к переносу в эмбрион.
- Выберите количество желаемых яйцеклеток для пересадки заполненных эктодерм.
- Используя конец тупых щипцов, постучите по яичной скорлупе эмбрионов хозяина 22 HH, чтобы открыть окно. Определите воздушную мембрану и, используя пару тонких хирургических щипцов, удалите ее полностью.
- Откройте амниотический мешок возле передней конечности, чтобы обнажить правый фланг эмбриона. Открывайте только сумму, необходимую для выполнения процедуры.
- Ориентируясь в положение передней конечности, выполняют раневое расчесывание вольфрамовой иглой (см. Таблицу материалов) длиной 2-3 сомита, слегка повреждая мезодерму до тех пор, пока она не кровоточит.
- Индивидуально перенесите заполненную эктодерму (RL) в эмбрион цыпленка и поместите основание рекомбинантной конечности над раной сомита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Передача RL может быть выполнена с помощью пластиковой пипетки или с помощью наклонного щелевого ножа. - Правильно закрепите RL двумя кусками палладиевой проволоки диаметром 0,025 мм и длиной 0,5-1 мм (см. Таблицу материалов). Выровняйте основание RL с раной, чтобы гарантировать, что она будет прикреплена к боку эмбриона хозяина и васкуляризирована (рисунок 1E).
- Заклейте окно скотчем, и верните яйцо в инкубатор. Соберите эмбрионы в нужные моменты времени для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распознавание хорошо выполненной рекомбинантной конечности
После пересадки обработанные эмбрионы были возвращены в инкубатор, чтобы позволить RL развиваться. Время инкубации коррелировало с требованиями эксперимента. Тем не менее, RL можно легко отличить после 12 ч имплантации. Чтобы определить, была ли имплантация адекватной, RL наблюдали в виде выступа, который был надежно прикреплен к мезодермальной стенке донорского эмбриона (рисунок 2A). Напротив, независимо от того, была ли жизнеспособность клетки и/или трансплантат неисправны, RL отделялся от мезодермальной стенки или представлял собой грубую морфологию (рисунок 2B).
Морфологическое и картинное исследование рекомбинантных конечностей
Для морфологического исследования RL окрашивали алциановымсиним 17 для наблюдения за образованием скелетных элементов и их рисунком. Рекомендуется окрашивать весь ствол донорского эмбриона, чтобы избежать пропуска RL во время процедуры (рисунок 3A). Альтернативно, перед очисткой RL, изображения в растворе этанола были получены для наблюдения за морфологией RL или выполнения количественных измерений (фиг.3B). Окрашенный или незапятнанный RL нарезали для наблюдения за структурой ткани или идентификации типа клеток (рисунок 3C).
Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментального проектирования рекомбинантных конечностей (RL). (A) RL был выполнен путем сборки мезодермы почек конечностей от донора 22 HH эмбриона цыпленка внутри эктодермальной оболочки, полученной от другого донора эмбриона 22 HH цыплят. Эктодермы были плотно набиты мезодермальными клетками. После сборки чучела эктодерм переносили и фиксировали палладиевыми проводами поверх предыдущей раны сомита. (B) Почка конечности с отслоившейся эктодермой после обработки трипсином. (C) Гранулу получали после ее образования вблизи пустых эктодерм, готовых к заполнению. (D) Показан эктодермальный покров, заполненный мезодермальными клетками. (E) Фиксация RL в эмбрионе хозяина палладиевыми проводами. Обратите внимание, что RL был расположен на правом фланге эмбриона возле бутона передней конечности; p: гранулы. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Свежесобранные курино-куриные рекомбинантные конечности. (A) Показан 24-часовой RL, прикрепленный к стене мезодермы. (B) Показан неудачный 24-часовой RL. Обратите внимание, что палладиевая проволока не фиксирует RL; следовательно, RL отделился от мезодермальной стенки и представлял собой грубую морфологию. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфологический анализ рекомбинантных конечностей. (А) Алцианское синее окрашивание для демонстрации скелетных элементов в 6-дневном курино-курином RL. (B) Тот же RL был показан в (A) до очистки альцианского синего цвета. (C) Сагиттальный срез RL, окрашенный альциановым синим окрашиванием и гематоксилином и эозином. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В целом, протокол RL можно разделить на пять этапов: (1) инкубация эмбриона, (2) получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм, (3) получение эктодерм, (4) сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальных покровов и (5) трансплантация заполненных эктодерм в эмбрионы хозяина. Основным ограничением метода RL является длинный, подробный протокол, который имеет много критических моментов, требующих терпения для надлежащей работы. Для успешного завершения протокола необходимо определить критические моменты. Во время закупок мезодермальных клеток целостность и жизнеспособность клеток имеют важное значение. Гибель клеток будет препятствовать правильному развитию RL. В аналогичном ключе необходима правильная эктодерма, чтобы гарантировать взаимодействие между мезодермальными и эктодермальными клетками. Когда эктодермы напичканы, мезодермальные клетки должны быть как можно ближе к дистальной эктодерме под AER. Как для мезодермальной, так и для эктодермальной закупки стадия развития донорских эмбрионов также имеет решающее значение. Следует учитывать, что мезодермальные клетки будут реагировать дифференцированно в соответствии с их стадией развития. Однако стадия разработки может быть свободно выбрана в соответствии с экспериментальными требованиями. Тем не менее, стадия 22 HH должна поддерживаться, чтобы облегчить получение эктодерм, тем самым поддерживая клеточную целостность и передачу сигналов. Наконец, хорошая прививка и фиксация необходимы для обеспечения правильной интеграции RL в стенку эмбриона и его развития.
Эдгар Цвиллинг впервые сообщил о системе RL в 1964году 6, после чего многие исследовательские группы внедрили ее, чтобы ответить на несколько интересных биологических вопросов. Протокол RL был ранее подробно описан Марианом Росом и др. как стандартный метод манипулирования развивающейся почкой конечности цыпленка18, который объясняет другие способы окна яиц и выполнения RL целым крылом или ногой и выполнения RL с реагрегированной мезодермой. Однако некоторые вариации между Рос. и др. протокол и настоящий протокол, описанный здесь, можно найти. В их протоколе почки конечностей эмбрионов в качестве доноров эктодермы инкубируются с трипсином в ледяном PBS в течение ~ 2 ч. После начала инкубации эктодермы они сразу же получали почки конечностей от эмбрионов в качестве доноров мезодермы, затем фрагментировали почки конечностей, переваривали их и удаляли эктодерму вручную, чтобы сформировать мезодермальную гранулу после инкубации в течение 30 минут. Здесь, во-первых, из эмбрионов были получены почки конечностей для использования в качестве мезодермальных доноров, после чего весь почек конечности переваривается путем инкубации с трипсином и коллагеназой. Затем эктодермы удаляют путем фильтрации, и гранулу инкубируют между 1-1,5 ч. Преимущество этого метода для получения мезодермальной гранулы заключается в том, что лечение трипсином отделяет интактные эктодермы от мезодермы, в то время как лечение коллагеназой переваривает мезодермальные клетки. Поэтому можно фильтровать эктодермальную ткань и отбрасывать ее. С другой стороны, большее время инкубации гранул позволяет ему лучше уплотняться, что помогает при заполнении эктодерм. Еще одно различие между двумя протоколами заключается в том, что Ros et al. снимали эктодермы один за другим и переносили их в чашку Петри, содержащую гранулу. Напротив, все эктодермы препарированы и собраны в чашку Петри в настоящем протоколе. Гранула переносится в чашку Петри для заполнения эктодерм. Следуя этому методу, эктодермы можно приготовить одновременно с прививкой. Как и во многих других протоколах, способ выполнения RL может отличаться; однако этапы в обоих протоколах адекватно описывают критические этапы техники для получения успешной манипуляции.
Предыдущая работа показала, что клетки диссоциированной поляризационной зоны ингибируют морфогенез при случайном рассеянии среди мезодерм в RL 7,10. Таким образом, необязательно удалять клетки из ZPA перед формированием мезодермальной гранулы. Позже клетки ZPA (или встроенные шарики звукового ежа) могут быть использованы для индуцирования RL к развитию полярности A-P 8,9,19.
Экспериментальная модель RL адаптируется к различным сценариям. Рекомбинация может быть реализована с клетками конечностей из разных стадий развития или зрелой (передней или задней конечности), других положений вдоль трех осей конечностей, а также с диссоциально-реагрегированными клетками или недиссоциированно-фрагментированной мезодермой15. Интересно, что в предыдущих исследованиях сообщалось об использовании модели RL для изучения поведения различных комбинаций мезодерм мутантного и дикого типа и эктодерм 13,14,20,21 или с использованием электропорированных клеток 22.
Учитывая, что развитие конечностей является эволюционно сохраненным процессом, источники эктодермы также могут варьироваться от курицы, перепела, утки, мыши или крысы эктодермы, которые могут быть получены в соответствии с тем же описанным протоколом. Другой возможностью является изменение мезодермальных или даже других типов клеток или источников для получения межвидового RL.
В заключение, RL является феноменальной моделью для изучения морфогенеза, паттернов, клеточных взаимодействий, миграции клеток и дифференцировки клеток на клеточном и молекулярном уровнях. Поскольку процедура RL допускает несколько вариаций, она допускает потенциальное применение по многочисленным биологическим вопросам, не ограничиваясь биологией развития курицы-конечности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Эстефанию Гарай-Пачеко за изображения на рисунке 2 и Марию Валерию Чимал-Монтес де Ока за художественные работы. Эта работа была поддержана Генеральным обществом ассоциаций личной академии (DGAPA)-Национальным автономным университетом Мексики [номера грантов IN211117 и IN213314] и Национальным советом по вопросам науки и техники (CONACyT) [грант No 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia], присужденный JC-M. JC M-L был получателем постдокторской стипендии от Национального совета науки и техники (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
