Summary
재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.
Abstract
세포 분화는 조직 및 장기 발달 동안 다양한 특수 세포 유형의 형성으로 이어지는 세포 투입의 미세 조정 과정입니다. 이 과정은 성인기에 적극적으로 유지됩니다. 세포 분화는 장기의 발달 및 항상성 동안 진행중인 과정입니다. 세포 분화의 초기 단계를 이해하는 것은 형태 형성과 같은 다른 복잡한 과정을 아는 데 필수적입니다. 따라서, 재조합 닭 팔다리는 배아 패터닝 신호 하에서 세포 분화 및 패턴 생성의 연구를 허용하는 실험 모델이다. 이 실험 모델은 생체내 환경을 모방하고; 그것은 초기 사지 새싹에서 얻은 외배엽 덮개로 재결합 된 세포를 조립합니다. 나중에, 외배엽은 병아리 배아 수용체에 옮겨지고 이식되어 발달을 허용합니다. 이 분석은 주로 중배엽 사지 새싹 세포를 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 전구 세포에 적용될 수 있다.
Introduction
척추동물 사지는 세포 분화, 세포 증식, 세포 사멸, 패턴 형성 및 형태형성 1,2를 연구하기 위한 강력한 모델이다. 발달 동안, 팔다리는 측방 플레이트 중배엽1에서 유래 된 세포로부터 팽창으로 나타난다. 사지 새싹은 외배엽으로 덮인 중배엽 세포의 중심 코어로 구성됩니다. 이 초기 구조에서 전체적으로 잘 형성된 팔다리가 나타납니다. 사지 새싹이 발생한 후, (1) 근위 원위 축 ([PD] 어깨에서 손가락까지), (2) 등 - 복부 축 ([DV]손등에서 손바닥까지), (3) 전방 - 후부 ([AP] 엄지 손가락에서 손가락까지)의 세 축이 인식됩니다. 근위 - 원위 축은 사지 새싹의 원위 끝에 위치한 정점 외배엽 능선 (AER)에 달려 있습니다. AER은 신호2,3을 수신하는 세포의 성장, 생존 유지, 증식 및 미분화 상태에 요구된다. 한편, 편광 활동 영역(ZPA)은 전후 패터닝(4)을 제어하고, 등쪽 및 외배엽은 등쪽 패터닝(7,8)을 제어한다. 입체 패터닝의 통합은 이 세 축 사이의 복잡한 누화를 의미한다5. 사지 발달 중 분자 경로를 이해했음에도 불구하고, 전체 사지를 형성하기 위해 패턴화와 적절한 성장을 조절하는 메커니즘에 대한 열린 질문은 여전히 답이 없습니다.
Edgar Zwilling 는 1964 년에 재조합 사지 (RL) 시스템을 개발하여 사지 중간엽 세포와 외배엽 사이의 상호 작용을 연구했습니다6. RL 시스템은 해리된 재응집된 사지 새싹 중배엽을 배아 사지 외배엽으로 조립하여 공여체 병아리 배아의 등쪽 부분으로 이식한다. 외배엽에 의해 제공되는 신호는 시공간 방식으로 분화 유전자 및 패터닝 유전자의 발현을 유도하고, 따라서 사지 발달 동안 발생하는 세포 프로그램을 재편성할 수 있는 사지 유사 구조의 형성을 유도한다 7,8,9.
RL 모델은 사지 성분의 특성과 중배엽 및 외배엽 세포 사이의 상호작용을 이해하는데가치가 있다6. RL은 외배엽 커버(6) 내부의 사지 새싹 중배엽 세포를 실험적으로 조립 또는 재결합함으로써 생성된 사지 유사 구조로서 정의될 수 있다. RL의 형태형성은 외배엽 패터닝 신호에 반응할 중배엽 세포(또는 다른 유형)의 특성에 의존한다. 이 실험 시스템의 장점 중 하나는 다재다능하다는 것입니다. 이 특성은 중배엽 세포의 공급원, 예를 들어 다른 발달 단계의 세포, 사지를 따라 다른 위치에서, 또는 전체 (해리되지 않은) 또는 재응집 된 세포 7,8,9,10을 변화시킴으로써 다중 조합의 생성을 허용한다. 또 다른 예는 닭 이외의 종, 예를 들어, 거북이11, 메추라기, 또는 마우스12로부터 배아 외배엽을 수득하는 능력이다.
이러한 의미에서, RL 기술은 진화론적 관점에서 사지 발달과 사지 중간엽과 외배엽 세포 사이의 상호작용을 연구하는 데 도움이 된다. 이 기술은 또한 배아 외배엽12,13,14에 의해 제공된 신호를 이용함으로써 사지 유사 구조로 분화하는 선조 세포의 상이한 공급원의 능력을 분석하는 데 큰 잠재력을 갖는다. 시험관내 배양과는 달리, RL은 발달하는 사지(9,15)로부터의 배아 신호를 해석함으로써 세포 집단의 분화 및 형태형성 잠재력을 평가할 수 있게 한다.
이 프로토콜에서, 재응집된 중배엽 사지 새싹 세포와 함께 성공적인 RL을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공되고, 따라서 재응집된 세포의 상이한 공급원 또는 심지어 상이한 외배엽 공급원과 함께 이 프로토콜을 적응시킬 수 있는 가능성을 열어준다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 프로토콜의 일반적인 단계에 대한 개략적인 순서도가 그림 1A에 나와 있습니다.
1. 배아 배양 및 생존력 결정
- 수정 된 닭 알을 22 HH 단계에 도달 할 때까지 약 38 ° C 및 60 % 상대 습도에서 약 3 일 반 동안 배양하십시오 (Hamilton and Hamburger, 1951에 따르면)16.
참고 : 갓 수정 된 닭고기 달걀은 최대 일주일 동안 15 ° C에서 보관할 수 있습니다.- 수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다.
참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭 알은 일반적으로 후기 배아에서 깃털의 색소 침착을 피하기 위해 사용됩니다. (1) 사지 중배엽 세포, (2) 사지 외배엽 및 (3) RL을 이식하기 위해 공여체 배아의 세 가지 구조를 얻기 위해 충분한 난자를 별도로 배양하는 것을 고려하십시오.
- 수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다.
- 배양 후 삼 일 반 후에 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉하고 공기 건조시킵니다.
- 발달중인 배아가 난자를 움켜쥐고 혈관을 관찰하고 배아를 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오.
참고 :이 시점에서 알을 분배하여 중배엽 세포, 외배엽 및 RL에 대한 숙주를 얻습니다.
2. 외배엽을 채우기 위해 사지 중배엽 세포 얻기
참고 : 조작을 시작하기 전에 작업 영역, 현미경 및 모든 도구를 70 % 에탄올 용액으로 면도하여 소독하는 것이 좋습니다.
- 무딘 포셉의 끝으로 달걀 껍질의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 포셉을 사용하여 약 1cm x 1cm의 껍질을 제거하십시오.
- 계란을 플라스틱 또는 판지 홀더로 옮기고 스테레오 현미경 아래에 하나씩 놓습니다. 공기 막을 확인한 다음 혈관이 발견되지 않는 작은 구멍을 선택하여 제거하십시오. 미세한 수술 포셉의 도움으로이 부위를 당기십시오.
참고 : 공기 막은 달걀을 창으로 만든 직후에 관찰 된 흰색과 불투명 한 막으로 식별 할 수 있습니다.- 배아와 접촉 할 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하십시오.
참고: 프로토콜을 시작하기 전에 배아가 22 HH 단계에 있는지 확인하십시오. 초기 단계의 배아는 달걀 껍질 창을 테이프로 밀봉 한 후 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다.
- 배아와 접촉 할 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하십시오.
- 미세한 수술 포셉을 사용하여 양수를 찢어서 양수 낭을 완전히 엽니 다( 자료 표 참조).
참고 : 양수는 배아를 밀접하게 덮고 양수로 채워진 투명한 막으로 식별 될 수 있습니다. - 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 난자로부터 배아를 조심스럽게 제거한 다음 빙냉 인산염 완충 식염수 용액 (1x PBS)이 들어있는 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 나머지 계란에 대해이 단계를 반복하십시오. ~ 8-10 개의 배아 만이 중배엽 세포를 얻기에 충분하다고 생각하십시오.
- 배아를 빙냉 1x PBS로 한 번 세척하고, 입체 현미경 ( 표 참조)의 도움으로 남아있는 막을 철회하십시오. 뒷다리 새싹을 찾으십시오.
참고 : 사지 새싹은 옆구리에서 돌출부로 배아의 전후 축을 따라 위치한 둥근 구조입니다. 뒷다리는 앞다리보다 뒤쪽에 더 많이 위치합니다. - 배아를 깨끗한 1x PBS로 유지하고, 한 쌍의 미세한 수술 포셉을 사용하여, 각 뒷다리 새싹을 세로로 저격한다. 배아의 옆구리에 매우 가깝게 새싹을 잘라 전체 뒷다리 새싹을 해부하십시오. 나머지 배아와 함께이 단계를 반복하십시오.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 사지 새싹을 빈 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 피펫 팁을 사용하여 1x PBS의 과량을 제거하고 PBS를 500 μL의 0.5% 트립신 용액으로 대체 한다(표 참조). 사지 새싹을 37°C에서 7분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.
- 트립신 용액을 제거하고 행크스 밸런스드 소금 용액 ( 재료 표 참조)에서 2 mg / mL의 콜라게나제 유형 IV 500 μL로 교체 한 다음 37 °C의 온도 블록에서 8 분 동안 배양하십시오.
참고: 트립신 인큐베이션은 외배엽을 약간 분리하는 반면, 콜라게나제는 중배엽 세포를 분해합니다. - 배양 후, 가능한 한 많은 콜라게나제를 제거하고 10% 우태아 혈청(FBS)이 보충된 차가운 둘베코 변형 이글 배지(DMEM-HG) 배지 1mL로 교체하여 효소를 불활성화시킨다. 혼합물을 부드럽게 ~ 10 번 피펫하십시오.
- 세포를 함유하는 현탁액을 70 μm의 세포 스트레이너로 여과하여 외배엽을 남긴다.
참고 : 여과는 소화되지 않은 사지 새싹을 제거하여 단일 세포의 현탁액을 남깁니다. - 여과 후, 현탁액을 다시 5-10회 피펫하고, 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.
- 10% FBS가 보충된 DMEM-HG 1ml를 사용하여 과량의 콜라게나제를 세척하십시오. 현탁액을 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
- 피펫팅으로 배지를 조심스럽게 버린 다음 튜브 바닥의 세포를 방해하지 않고 10% FBS가 보충된 신선한 DMEM-HG 1mL로 교체합니다.
- 세포가 열블록 중에서 37°C에서 1-1.5시간 동안 인큐베이션한 후 조밀한 펠릿(재응집)을 형성하도록 허용한다.
참고 : 중배엽 세포가 펠렛을 형성하는 동안, 사지 외배엽을 얻는 것이 편리합니다.
3. 사지 외배엽 얻기
- 외배엽을 얻기 위해 선택된 다른 22개의 HH 닭 배아와 별도로 섹션 2의 1-6단계를 반복한다.
참고: 이 목적을 위한 배아의 수는 원하는 RL의 최종 수에 비례합니다. 2:1 외배엽-RL의 비율이 적절하다. - 뒷다리 새싹을 얻은 후 플라스틱 피펫을 사용하여 빈 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 임의의 과량의 1x PBS를 제거하고 멸균된 1x PBS 중의 0.5% 트립신 500 μL로 교체한다. 상기 혼합물을 37°C에서 30분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.
- 효소 소화 후, 사지 새싹이 들어있는 트립신 용액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 과량의 트립신을 가능한 한 많이 제거하고; 모든 사지 새싹이 덮일 때까지 FBS의 10 %가 보충 된 얼음처럼 차가운 1x PBS로 페트리 접시에 홍수를 일으 킵니다.
참고 : FBS는 말 혈청을 대체 할 수 있습니다. - 입체 현미경으로 사지 새싹을 확인; 외배엽을 사지 중배엽 세포로부터 약간 분리된 투명한 막으로 확인한다(도 1B).
- 미세한 수술 포셉의 도움으로 사지 새싹의 가장 근위 끝을 잡고 조심스럽게 다른 포셉을 사용하여 외배엽 층을 분리하고 분리하십시오.
참고 : 외배엽을 얻는 것은 중배엽 세포가 뭉쳐서 외배엽에 부착되어 끈적 거리기 때문에 어려울 수 있습니다. 페트리 접시의 외배엽 만 유지하기 위해 중배엽 세포를 지속적으로 버리는 것이 좋습니다. - 외배엽을 얼음처럼 차가운 1x PBS-10% FBS 용액으로 유지하십시오.
참고: 외배엽은 재응집된 중배엽이 준비되지 않은 경우 4°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나, 펠렛의 인큐베이션 시간을 외배엽 수득과 함께 조정하는 것이 바람직하다.
4. 외배엽 덮개 안쪽에 중배엽 세포 조립
참고 : 이를 위해서는 중배엽 세포의 형성된 펠렛을 포함하는 멸균 된 1x PBS-10 % FBS 용액이있는 페트리 접시에 빈 외배엽이 있어야합니다.
- 펠렛이 형성된 후(섹션 2 참조), 피펫팅에 의해 튜브로부터 ∼600 μL의 배지를 버린다.
- 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 바닥에서 조심스럽게 분리하고 부수거나 파괴하지 마십시오.
- 펠릿이 튜브 바닥에서 완전히 분리되면 튜브를 거꾸로 돌려 펠렛을 빈 외배엽이 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다 (그림 1C).
- 한 쌍의 미세 수술 포셉의 도움으로 펠렛의 작은 조각을 자르고 외배엽에 가능한 한 가깝게 놓습니다.
- 가방 인 것처럼 외과 용 포셉으로 외배엽을 열고 펠릿 조각을 외피 덮개에 가능한 한 단단히 넣으십시오. 원하는 만큼 많은 RL에 대해 이 단계를 반복합니다(그림 1D).
참고: 펠렛의 조각을 하나씩 자르고, 외배엽을 채워 1x PBS-10% FBS 용액을 깨끗하게 유지한다. 펠릿의 크기는 각 외배엽에 해당해야합니다. - 외배엽과 중배엽이 실온에서 ~ 30 분 동안 함께 치유되도록 한 다음 배아 숙주에 이식하십시오. 사용하지 않은 외배엽과 중배엽은 버리십시오.
5. 채워진 외배엽을 숙주 배아에 이식
참고 : 외배엽을 이식하기 전에 벤치 탑에서 서로 옆에 두 개의 입체 현미경을 배치하십시오.이 현미경은 배아 조작 및 RL 이식을위한 것입니다. 다른 하나는 채워진 외배엽을 배아로 옮길 준비가되어있는 상태로 유지하기위한 것입니다.
- 채워진 외배엽을 이식하기 위해 원하는 알의 수를 선택하십시오.
- 무딘 포셉의 끝을 사용하여 22 HH 숙주 배아의 달걀 껍질을 탭하여 창을 엽니 다. 공기 막을 확인하고 한 쌍의 미세 수술 포셉을 사용하여 완전히 제거하십시오.
- 앞다리 근처의 양수 낭을 열어 배아의 오른쪽 측면을 노출시킵니다. 절차를 수행하는 데 필요한 금액 만 엽니 다.
- 앞다리 위치에 따라 텅스텐 바늘 ( 재료 표 참조)으로 상처를 긁어 내고 2-3 개의 somites의 길이로 상처를 긁어 내고 출혈이 생길 때까지 중배엽을 약간 손상시킵니다.
- 채워진 외배엽 (RL)을 병아리 배아 내로 개별적으로 옮기고 재조합 사지의 기저부를 소마이트 상처 위에 놓습니다.
참고 : RL 전송은 플라스틱 피펫 또는 각진 슬릿 나이프로 수행 할 수 있습니다. - 직경 0.025mm와 길이 0.5-1mm의 팔라듐 와이어 두 개로 RL을 올바르게 고정 합니다(재료 표 참조). RL의 기저부를 상처와 정렬하여 숙주 배아의 옆구리에 부착되고 혈관화되도록 한다(도 1E).
- 창문을 테이프로 봉인하고 계란을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 분석을 위해 원하는 시점에서 배아를 수집하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
잘 수행 된 재조합 사지를 인식
이식 후, 조작된 배아를 인큐베이터로 복귀시켜 RL이 발달할 수 있도록 하였다. 배양 시간은 실험의 요구 사항과 상관 관계가 있습니다. 그럼에도 불구하고, RL은 이식 12시간 후에 쉽게 구별될 수 있다. 이식이 적절한지 여부를 결정하기 위해, RL을 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착시킨 돌출부로서 관찰하였다(도 2A). 반대로, 세포 생존성 및/또는 이식편이 실패하였든, RL은 중배엽 벽으로부터 분리되거나 거친 형태를 나타내었다(도 2B).
재조합 팔다리의 형태 학적 및 패턴 검사
형태학적 검사를 위해, RL을 Alcian blue17 로 염색하여 골격 요소의 형성과 이들의 패터닝을 관찰하였다. 절차 중에 RL이 누락되지 않도록 기증자 배아의 전체 트렁크를 염색하는 것이 좋습니다 (그림 3A). 대안적으로, RL을 클리어링하기 전에, RL의 형태를 관찰하거나 정량적 측정을 수행하기 위해 에탄올 용액 중의 이미지를 수득하였다(도 3B). 염색되거나 염색되지 않은 RL을 슬라이스하여 조직 구조를 관찰하거나 세포 유형을 확인하였다(도 3C).
도 1: 재조합 사지 (RL)의 실험 설계의 개략적인 표현. (A) RL은 다른 22 HH 병아리 배아 공여체로부터 얻은 외배엽 덮개 내부에 22 HH 병아리 배아 공여체로부터 사지 새싹 중배엽을 조립함으로써 수행되었다. 외배엽은 중배엽 세포로 단단히 채워졌다. 조립 후, 박제 된 외배엽을 옮기고 이전 소마이트의 상처 위에 팔라듐 와이어로 고정했습니다. (B) 트립신 치료 후 외배엽이 분리 된 사지 새싹. (c) 펠렛은 빈 외배엽에 가까운 그의 형성 후에, 충전될 준비가 된 후에 수득되었다. (d) 중배엽 세포로 채워진 외배엽 표지가 도시되어 있다. (e) 팔라듐 와이어로 숙주 배아에 RL을 고정시킨다. RL은 앞다리 새싹 근처의 배아의 오른쪽 측면에 위치했습니다. p: 펠릿. 배율 막대 = 500μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 갓 얻은 닭 - 닭 재조합 팔다리. (a) 중배엽 벽에 부착된 24시간 RL이 도시되어 있다. (b) 실패한 24시간 RL이 표시됩니다. 팔라듐 와이어는 RL을 고정하지 않습니다. 결과적으로, RL은 중배엽 벽으로부터 분리되어 거친 형태를 제시했다. 배율 막대 = 500μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 재조합 사지의 형태학적 분석 . (A) 6일째 닭-닭 RL에서 골격 요소를 입증하는 알시안 블루 염색. (B) 알시안 블루를 클리어하기 전에 동일한 RL이 (A)에 표시되었다. (c) RL의 궁수 슬라이스는 알시안 블루 염색 및 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
일반적으로, RL 프로토콜은 다섯 단계로 나눌 수 있다: (1) 배아 배양, (2) 외배엽을 채우기 위한 사지 중배엽 세포 획득, (3) 외배엽을 얻는 것, (4) 외배엽 덮개 내부에 중배엽 세포를 조립하는 것, 및 (5) 채워진 외배엽을 숙주 배아로 이식하는 것. RL 기술의 주요 한계는 길고 상세한 프로토콜이며, 이는 적절하게 수행하기 위해 인내심이 필요한 많은 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 프로토콜을 성공적으로 완료하려면 중요한 순간을 식별해야 합니다. 중배엽 세포 조달 동안, 세포의 완전성과 생존 가능성은 필수적입니다. 세포 사멸은 적절한 RL 발달을 방해할 것이다. 비슷한 맥락에서 중배엽과 외배엽 세포 간의 상호 작용을 보장하기 위해 올바른 외배엽 조작이 필요합니다. 외배엽이 채워질 때, 중배엽 세포는 AER 아래의 원위 외배엽에 가능한 한 가까이 있어야 한다. 중배엽 및 외배엽 조달을 위해서는 기증자 배아의 발달 단계도 중요합니다. 중배엽 세포는 발달 단계에 따라 차별적으로 반응 할 것이라고 생각해야합니다. 그러나 개발 단계는 실험 요구 사항에 따라 자유롭게 선택할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 외배엽을 쉽게 얻을 수 있도록 22 HH 단계를 유지해야하므로 세포 무결성과 신호 전달을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 좋은 접목 및 고정은 배아 벽과 그 발달에 대한 올바른 RL 통합을 보장하는 데 필수적입니다.
Edgar Zwilling 는 1964년 6 년에 RL 시스템을 처음 보고했으며, 그 후 많은 연구 그룹이 몇 가지 흥미로운 생물학적 질문에 답하기 위해이를 구현했습니다. RL의 프로토콜은 이전에 Marian Ros et al.에 의해 병아리 사지 새싹(18)을 조작하기 위한 표준 방법으로서 길이로 기술되었으며, 이는 알을 윈도우링하고 전체 날개 또는 다리로 RL을 수행하고 재응집된 중배엽으로 RL을 수행하는 다른 방법을 설명한다. 그러나 Ros 사이의 일부 변형. et al. 여기에 기재된 프로토콜 및 본 프로토콜이 발견될 수 있다. 그들의 프로토콜에서, 외배엽 기증자로서의 배아로부터의 사지 새싹은 ~ 2 시간 동안 얼음처럼 차가운 PBS에서 트립신과 함께 배양된다. 외배엽 배양을 시작한 후, 그들은 즉시 중배엽 기증자로서 배아로부터 사지 새싹을 얻은 다음, 사지 새싹을 단편화하고, 소화하고, 외배엽을 수동으로 제거하여 30 분 동안 배양 한 후 중배엽 펠렛을 형성했습니다. 여기서, 먼저, 중배엽 기증자로 사용되는 배아로부터 사지 새싹을 수득하였고, 그 후에 전체 사지 새싹은 트립신 및 콜라게나제와 함께 인큐베이션함으로써 소화된다. 외배엽은 여과에 의해 제거되고, 펠릿은 1-1.5 h 사이에서 인큐베이션된다. 중배엽 펠릿을 수득하기 위한 이 방법의 장점은 트립신으로 처리하면 중배엽으로부터 무손상 외배엽을 분리하는 반면, 콜라게나제 처리는 중배엽 세포를 소화한다는 것이다. 따라서 외피 조직을 필터링하고 버릴 수 있습니다. 반면에, 더 많은 펠릿 배양 시간은 외배엽이 채워질 때 도움이되는 더 나은 콤팩트를 허용합니다. 두 프로토콜의 또 다른 차이점은 Ros et al.이 외배엽을 하나씩 벗겨 내고 펠렛이 들어있는 페트리 접시로 옮겼다는 것입니다. 대조적으로, 모든 외배엽은 해부되고 본 프로토콜의 페트리 접시에 수집됩니다. 펠릿은 외배엽을 채우기 위해 Petri 접시로 옮겨집니다. 이 방법에 따라, 외배엽은 이식과 동시에 제조될 수 있다. 다른 많은 프로토콜과 마찬가지로 RL이 수행되는 방법은 다를 수 있습니다. 그러나 두 프로토콜의 단계는 성공적인 조작을 생성하는 기술의 중요한 단계를 적절하게 설명합니다.
이전의 연구는 해리된 편광 구역 세포가 RL 7,10에서 중배엽 사이에 무작위로 분산될 때 형태형성을 억제한다는 것을 입증하였다. 따라서, 중배엽 펠릿을 형성하기 전에 ZPA로부터 세포를 제거하는 것은 선택적이다. 이후, ZPA 세포(또는 소닉 헤지호그 포매된 비드)는 RL을 유도하여 A-P 극성 8,9,19를 개발하도록 유도할 수 있다.
RL 실험 모델은 다양한 시나리오에 적용할 수 있습니다. 재조합은 상이한 발달 또는 성숙 (fore- 또는 hindlimb) 단계로부터의 사지 세포, 세 개의 사지 축을 따른 다른 위치들, 및 해리된-재응집된 세포 또는 해리되지 않은-단편화된 중배엽(15)과 함께 구현될 수 있다. 흥미롭게도, 이전의 연구들은 RL 모델을 사용하여 돌연변이체 및 야생형 중배엽 및 외배엽13,14,20,21의 상이한 조합의 거동을 연구하거나 전기천공된 세포(22)를 사용하는 것을 보고하였다.
사지 발달이 진화적으로 보존된 과정이라는 것을 고려하면, 외배엽 공급원은 또한 닭, 메추라기, 오리, 마우스 또는 래트 외배엽으로부터 다양할 수 있고, 동일한 기술된 프로토콜에 따라 수득될 수 있다. 또 다른 가능성은 중배엽-또는 심지어 다른 세포 유형 또는 공급원을 종간 RL을 생산하도록 변경하는 것이다.
결론적으로, RL은 세포 및 분자 수준에서 형태 형성, 패터닝, 세포 - 세포 상호 작용, 세포 이동 및 세포 분화를 연구하는 경이로운 모델입니다. RL의 절차는 여러 변형을 허용하기 때문에 닭 - 사지 발달 생물학에 국한되지 않고 수많은 생물학적 질문에 잠재적 인 적용을 허용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
그림 2의 이미지를 주신 Estefania Garay-Pacheco와 작품에 대한 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca에게 감사드립니다. 이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
