Summary
Rekombinante lemmer er en stærk eksperimentel model, der gør det muligt at studere processen med celledifferentiering og generering af mønstre under påvirkning af embryonale signaler. Denne protokol præsenterer en detaljeret metode til generering af rekombinante lemmer med mesodermale celler i kyllingelemmen, der kan tilpasses andre celletyper opnået fra forskellige organismer.
Abstract
Celledifferentiering er den finjusterede proces med celleengagement, der fører til dannelsen af forskellige specialiserede celletyper under etableringen af udvikling af væv og organer. Denne proces opretholdes aktivt i voksenalderen. Celledifferentiering er en løbende proces under udvikling og homeostase af organer. At forstå de tidlige trin i celledifferentiering er afgørende for at kende andre komplekse processer såsom morfogenese. Således er rekombinante kyllingelemmer en eksperimentel model, der gør det muligt at studere celledifferentiering og mønstergenerering under embryonale mønstersignaler. Denne eksperimentelle model efterligner et in vivo-miljø ; det samler reaggregerede celler i et ektodermalt dæksel opnået fra en tidlig lemknop. Senere overføres ektodermer og implanteres i en kyllingembryoreceptor for at muliggøre dens udvikling. Dette assay blev hovedsageligt brugt til at evaluere mesodermale lemmerknopceller; Det kan dog anvendes på andre stam- eller stamceller fra andre organismer.
Introduction
Hvirveldyrlemmen er en formidabel model til at studere celledifferentiering, celleproliferation, celledød, mønsterdannelse og morfogenese 1,2. Under udviklingen fremkommer lemmer som buler fra cellerne afledt af lateral plade mesoderm1. Limb knopper består af en central kerne af mesodermale celler dækket af en ektoderm. Fra denne tidlige struktur opstår et helt og velformet lem. Efter at lemknoppen er opstået, genkendes tre akser: (1) den proximo-distale akse ([PD] skulder mod fingre), (2) den dorso-ventrale akse ([DV] fra bagsiden af hånden til håndfladen) og (3) den forreste-bageste ([AP] tommelfinger til finger). Den proksimal-distale akse afhænger af den apikale ektodermale højderyg (AER), specialiseret ektoderm placeret ved den distale spids af lemknoppen. AER er nødvendig for udvækst, overlevelsesvedligeholdelse, spredning og den udifferentierede tilstand af celler, der modtager signaler 2,3. På den anden side styrer zonen for polariserende aktivitet (ZPA) anteroposterior mønster4, mens dorsal og ektoderm styrer dorsoventral mønster 7,8. Integration af tredimensionelt mønster indebærer kompleks krydstale mellem disse tre akser5. På trods af at man forstår den molekylære vej under lemmernes udvikling, forbliver åbne spørgsmål om de mekanismer, der styrer mønster og korrekt udvækst for at danne et helt lem, ubesvarede.
Edgar Zwilling udviklede det rekombinante lem (RL) system i 1964 for at studere interaktionerne mellem lemmer mesenkymale celler og ektoderm i udvikling af lemmer6. RL-systemet samler den dissocierede-reaggregerede lemknoppe mesoderm i den embryonale lem ektoderm for at pode den ind i den dorsale del af et donorkyllingembryo. Signalerne fra ektodermen inducerer ekspressionen af differentieringsgener og mønstrende gener på en rumlig-tidsmæssig måde, hvilket inducerer dannelsen af en lemlignende struktur, der kan rekapitulere de celleprogrammer, der opstår under lemmernes udvikling 7,8,9.
RL-modellen er værdifuld for at forstå egenskaberne af lemmernes komponenter og interaktionen mellem mesodermale og ektodermale celler6. En RL kan defineres som en lemlignende struktur skabt af de eksperimentelt samlende eller rekombinerende lemknopper mesodermale celler inde i et ektodermalt dæksel6. Morfogenesen af RL afhænger af egenskaberne ved de mesodermale celler (eller andre typer), der vil reagere på de ektodermale mønstersignaler. En af fordelene ved dette eksperimentelle system er dets alsidighed. Denne egenskab tillader oprettelse af flere kombinationer ved at variere kilden til mesodermale celler, såsom celler fra forskellige udviklingsstadier, fra forskellige positioner langs lemmet eller hele (undissocierede) eller reaggregerede celler 7,8,9,10. Et andet eksempel er evnen til at opnå den embryonale ektoderm fra andre arter end kylling, for eksempel skildpadde11, vagtel eller mus12.
I denne forstand hjælper RL-teknikken med at studere lemmernes udvikling og interaktionerne mellem lemmernes mesenkymale og ektodermale celler fra et evolutionært synspunkt. Denne teknik har også et stort potentiale til at analysere evnen hos forskellige kilder til stamceller til at differentiere sig til en lemlignende struktur ved at drage fordel af signalerne fra den embryonale ektoderm 12,13,14. I modsætning til in vitro-kulturer tillader RL at evaluere differentieringen og det morfogenetiske potentiale i en cellepopulation ved at fortolke embryonale signaler fra et udviklende lem 9,15.
I denne protokol gives en trinvis vejledning til udførelse af vellykket RL med reaggregerede mesodermale lemmerknopceller, hvilket åbner muligheden for at tilpasse denne protokol med forskellige kilder til reaggregerede celler eller endda forskellige ektodermkilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Board for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). Et skematisk rutediagram over de generelle trin i denne protokol er vist i figur 1A.
1. Embryoinkubation og bestemmelse af levedygtighed
- Inkuber befrugtede kyllingæg ved 38 ° C og 60% relativ luftfugtighed i ca. tre og en halv dag, indtil de når 22 HH-stadiet (ifølge Hamilton og Hamburger, 1951)16.
BEMÆRK: Frisk befrugtede kyllingæg kan opbevares ved 15 ° C i op til en uge.- For at inkubere de befrugtede æg skal du placere æggene lodret med den spidse side ned i den befugtede inkubator. Drej æggene under inkubation, da det er nødvendigt at forhindre, at det udviklende embryo klæber til skalmembranen.
BEMÆRK: Befrugtede høneæg kan fås fra lokale gårde. Befrugtede hvide leghorn kyllingæg bruges generelt til at undgå pigmentering af fjerene i sene embryoner. Overvej at inkubere nok æg separat for at opnå tre strukturer: (1) mesodermale celler i lemmer, (2) ektodermer af lemmer og (3) donorembryoner til podning af RL.
- For at inkubere de befrugtede æg skal du placere æggene lodret med den spidse side ned i den befugtede inkubator. Drej æggene under inkubation, da det er nødvendigt at forhindre, at det udviklende embryo klæber til skalmembranen.
- Efter tre og en halv dags inkubation skal du fjerne æg fra inkubatoren, vatpind med 70% ethanol og lade det lufttørre.
- Identificer udviklende embryoner, der kanter ægget for at observere blodkarrene og lokalisere embryoet. Kassér æg, der ikke har et embryo.
BEMÆRK: På dette tidspunkt fordeles æggene for at opnå mesodermale celler, ektodermer og værterne for RL.
2. Opnåelse af mesodermale celler i lemmer til at fylde ektodermer
BEMÆRK: Før manipulationerne påbegyndes, anbefales det stærkt at desinficere arbejdsområdet, mikroskoperne og alt det instrumentelle ved podning med 70% ethanolopløsning.
- Tryk på den stumpe ende af æggeskallen med enden af en stump tang for at åbne et vindue og fjern ca. 1 cm x 1 cm af skallen ved hjælp af tangen.
- Overfør æg til en plastik- eller kartonholder, og anbring dem en efter en under stereomikroskopet. Identificer luftmembranen, og fjern den derefter ved at vælge et lille hul, hvor der ikke findes nogen beholdere. Træk dette område ved hjælp af fine kirurgiske tang.
BEMÆRK: Luftmembranen kan identificeres som den hvide og uigennemsigtige membran, der observeres umiddelbart efter vinduesudkastning af ægget.- Fjern ethvert lille stykke æggeskal, der kan komme i kontakt med embryoet.
BEMÆRK: Kontroller, at embryonerne er i 22 HH-stadiet, inden protokollen påbegyndes. Embryoner i tidligere stadier kan returneres til inkubatoren efter forsegling af æggeskalsvinduet med tape.
- Fjern ethvert lille stykke æggeskal, der kan komme i kontakt med embryoet.
- Åbn fostersækken helt ved at rive amnionen op ved hjælp af den fine kirurgiske tang (se Materialetabel).
BEMÆRK: Amnion kan identificeres som en gennemsigtig membran, der tæt dækker embryoet og er fyldt med fostervand. - Fjern forsigtigt embryoet fra ægget ved hjælp af et par stumpe tang og overfør derefter til en steril petriskål indeholdende iskold fosfatbufret saltopløsning (1x PBS). Gentag dette trin for de resterende æg. Overvej at kun ~ 8-10 embryoner er tilstrækkelige til at opnå de mesodermale celler.
- Vask embryonerne én gang i iskold 1x PBS, og træk eventuelle resterende membraner ud ved hjælp af et stereomikroskop (se materialetabel). Find bagbensknopperne.
BEMÆRK: Limb knopper er afrundede strukturer placeret langs embryoets forreste bageste akse som fremspring fra flanken. Bagbenene er placeret mere bagud end forbenene. - Vedligehold embryonerne i ren 1x PBS, og brug et par fine kirurgiske tang til at klippe hver bagbenknopp i længderetningen. Skær knoppen meget tæt på embryoets flanke for at dissekere hele bagbensknopperne. Gentag dette trin med de resterende embryoner.
- Brug en plastoverførselspipette til at overføre lemknopperne til et tomt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Brug en pipettespids til at fjerne ethvert overskud på 1x PBS og udskift PBS med 500 μL 0,5% trypsinopløsning (se materialetabel). Inkuber lemknopper i en termoblok i 7 minutter ved 37 °C.
- Fjern trypsinopløsningen, og erstat den med 500 μL kollagenase type IV ved 2 mg/ml i Hanks Balanced Salt Solution (se Materialetabel), og inkuber den derefter i en termoblok ved 37 °C i 8 min.
BEMÆRK: Trypsin inkubation løsner lidt ektodermerne, mens kollagenase opdeler mesodermale celler. - Efter inkubation skal du fjerne så meget kollagenase som muligt og erstatte det med 1 ml koldt Dulbeccos Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) for at inaktivere enzymerne. Pipette blandingen forsigtigt ~ 10 gange.
- Filtrer suspensionen, der indeholder cellerne, med en cellesil på 70 μm for at efterlade ektodermerne.
BEMÆRK: Filtrering fjerner også eventuelle ufordøjede lemknopper og efterlader en suspension af enkeltceller. - Efter filtrering pipetteres suspensionen igen 5-10 gange og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og kasseres derefter supernatanten.
- Brug 1 ml DMEM-HG suppleret med 10% FBS til at vaske den overskydende kollagenase. Centrifugering af suspensionen ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér mediet forsigtigt ved pipettering, og udskift det derefter med 1 ml frisk DMEM-HG suppleret med 10% FBS uden at forstyrre cellerne i bunden af røret.
- Lad cellerne danne en kompakt pellet (reaggregering) efter inkubation af dem i 1-1,5 timer ved 37 °C i en termoblok.
BEMÆRK: Mens mesodermale celler danner pelleten, er det praktisk at opnå lemmerektodermer.
3. Opnåelse af lemmer ektodermer
- Trin 1-6 fra punkt 2 gentages separat med de øvrige 22 HH kyllingeembryoner, der er valgt til at opnå ektodermerne.
BEMÆRK: Antallet af embryoner til dette formål er proportionalt med det endelige antal af den ønskede RL. Et forhold på 2:1 ektodermer-RL er hensigtsmæssigt. - Når du har fået bagbensknopperne, skal du bruge en plastpipette til at overføre dem til et tomt mikrocentrifugerør. Fjern overskydende 1x PBS og erstat det med 500 μL 0,5% trypsin i steril 1x PBS. Inkuber blandingen i 30 minutter ved 37 °C i en termoblok.
- Efter den enzymatiske fordøjelse overføres trypsinopløsningen indeholdende lemknopperne til en steril petriskål.
- Fjern overskydende trypsin så meget som muligt ved hjælp af en mikropipette; oversvømme petriskålen med iskold 1x PBS suppleret med 10% FBS, indtil alle lemknopper er dækket.
BEMÆRK: FBS kan erstattes af hesteserum. - Identificer lemknopperne under stereomikroskopet; identificere ektodermen som en let løsrevet gennemsigtig membran fra lemmernes mesodermale celler (figur 1B).
- Hold den mest proksimale ende af lemknoppen ved hjælp af fine kirurgiske tang, mens du forsigtigt løsner og adskiller ektodermlaget ved hjælp af de andre tang.
BEMÆRK: Det kan være vanskeligt at opnå ektodermerne på grund af mesodermal celleklumpning og fastgørelse til ektodermer, hvilket får dem til at blive klæbrige. Det anbefales konstant at kassere de mesodermale celler for kun at opretholde ektodermerne i petriskålen. - Oprethold ektodermerne i iskold 1x PBS-10% FBS-opløsning.
BEMÆRK: Ektodermer kan opbevares ved 4 °C, hvis den reaggregerede mesoderm ikke er klar. Det foretrækkes imidlertid at koordinere inkubationstiden for pelleten med den ektodermale opnåelse.
4. Samling af mesodermale celler inde i det ektodermale dæksel
BEMÆRK: Til dette er det nødvendigt at have de tomme ektodermer i en petriskål med steril 1x PBS-10% FBS-opløsning indeholdende en dannet pellet af mesodermale celler.
- Når pillen er dannet (se punkt 2), kasseres ~600 μL af mediet fra røret ved pipettering.
- Fjern forsigtigt pillen fra bunden ved hjælp af en pipettespids og uden at smadre eller ødelægge den.
- Når pillen er helt løsnet fra bunden af røret, skal du vende røret på hovedet for at overføre pillen til petriskålen, der indeholder de tomme ektodermer (figur 1C).
- Skær et lille stykke af pillen ved hjælp af et par fine kirurgiske tang og læg det så tæt som muligt på ektodermen.
- Som om det var en pose, skal du åbne ektodermen med den kirurgiske tang og placere pelletsstykket så tæt som muligt i det ektodermale dæksel. Gentag dette trin for så mange RL'er som ønsket (figur 1D).
BEMÆRK: Skær stykkerne af pelleten en efter en, og fyld ektodermerne for at holde 1x PBS-10% FBS-opløsningen ren. Pelletens størrelse skal svare til hver ektoderm. - Lad ektodermen og mesodermen helbrede sammen i ~ 30 minutter ved stuetemperatur og pod dem derefter ind i embryoværten. Kassér den ubrugte ektoderm og mesoderm.
5. Transplantation af den fyldte ektoderm i et værtsembryo
BEMÆRK: Før du transplanterer ektodermerne, skal du arrangere to stereomikroskoper ved siden af hinanden på en bordplade, en til embryomanipulation og RL-podning. Den anden er til at opretholde de fyldte ektodermer klar til at overføre til embryoet.
- Vælg antallet af ønskede æg for at pode de fyldte ektodermer.
- Brug enden af en stump tang til at trykke på æggeskallen på de 22 HH værtsembryoner for at åbne et vindue. Identificer luftmembranen, og fjern den helt ved hjælp af et par fine kirurgiske tang.
- Åbn fostersækken nær forbenet for at udsætte embryoets højre flanke. Åbn kun det beløb, der er nødvendigt for at udføre proceduren.
- Styret af forbenspositionen skal du udføre sårridsning med en wolframnål (se Materialetabel) i længden af 2-3 somitter, hvilket beskadiger mesoderm lidt, indtil det bløder.
- Overfør individuelt en fyldt ektoderm (RL) ind i kyllingembryoet og læg bunden af det rekombinante lem over det somitsår.
BEMÆRK: RL-overførsel kan ske med en plastpipette eller med en vinklet slidskniv. - Fastgør RL korrekt med to stykker palladiumtråd med en diameter på 0,025 mm og en længde på 0,5-1 mm (se Materialetabel). Juster bunden af RL med såret for at sikre, at det vil blive fastgjort til flanken af værtsembryoet og vaskulariseret (figur 1E).
- Forsegl vinduet med tape, og returner ægget til inkubatoren. Saml embryonerne på de ønskede tidspunkter til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anerkendelse af et veludført rekombinant lem
Efter podning blev de manipulerede embryoner returneret til inkubatoren for at give RL mulighed for at udvikle sig. Inkubationstiden korrelerede med eksperimentets krav. Ikke desto mindre kan RL let skelnes efter 12 timers implantation. For at afgøre, om implantationen var tilstrækkelig, blev RL observeret som en fremspring, der var sikkert fastgjort til donorembryoets mesodermale væg (figur 2A). Tværtimod, uanset om enten cellelevedygtighed og / eller transplantatet mislykkedes, blev RL løsnet fra den mesodermale væg eller præsenteret en grov morfologi (figur 2B).
Morfologisk og mønsterundersøgelse af rekombinante lemmer
Til morfologisk undersøgelse blev RL farvet med Alcian blue17 for at observere dannelsen af skeletelementer og deres mønster. Det anbefales at plette hele stammen af donorembryoet for at undgå at gå glip af RL under proceduren (figur 3A). Alternativt, før rydning af RL, blev der opnået billeder i ethanolopløsning for at observere RL's morfologi eller udføre kvantitative målinger (figur 3B). Farvet eller ufarvet RL blev skåret i skiver for at observere vævsstruktur eller identificere celletype (figur 3C).
Figur 1: Skematisk gengivelse af det eksperimentelle design af rekombinante lemmer (RL). (A) RL blev udført ved at samle lemknoppemesoderm fra et donor 22 HH-kyllingembryo inde i et ektodermalt dæksel opnået fra en anden 22 HH-kyllingembryodonor. Ektodermer var tæt fyldt med mesodermale celler. Efter montering blev fyldte ektodermer overført og fastgjort med palladiumtråde oven på en tidligere somites sår. (B) En lemknop med sin ektoderm løsrevet efter trypsinbehandling. (C) Pelleten blev opnået efter dens dannelse tæt på de tomme ektodermer, klar til at blive fyldt. (D) Der vises et ektodermalt dæksel fyldt med mesodermale celler. (E) Fastgørelse af RL i værtsembryoet med palladiumtråde. Bemærk, at RL var placeret på embryoets højre flanke nær forbensknoppen; p: pellet. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Friskopnåede kylling-kylling rekombinante lemmer. (A) Der vises en 24 timers RL, der er fastgjort til mesodermvæggen. (B) Der vises en mislykket 24 timers RL. Bemærk, at palladiumtråden ikke fastgør RL; følgelig løsrev RL sig fra den mesodermale væg og præsenterede en grov morfologi. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologisk analyse af rekombinante lemmer. (A) Alcian blå farvning for at demonstrere skeletelementer i en 6-dages kylling-kylling RL. (B) Den samme RL blev vist i (A), før den alciske blå blev ryddet. (C) Sagittal skive af en RL farvet med Alcian blå farvning og med hæmatoxylin og eosin. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt kan RL-protokollen opdeles i fem trin: (1) embryoinkubation, (2) opnåelse af mesodermale celler fra lemmer til at fylde ektodermerne, (3) opnåelse af ektodermerne, (4) samling af mesodermale celler inde i de ektodermale dæksler og (5) transplantation af de fyldte ektodermer i værtsembryonerne. Den største begrænsning af RL-teknikken er den lange, detaljerede protokol, som har mange kritiske punkter, der kræver tålmodighed for at udføre korrekt. For at fuldføre protokollen skal kritiske øjeblikke identificeres. Under mesodermal celleindkøb er cellernes integritet og levedygtighed afgørende. Celledød forhindrer korrekt RL-udvikling. På samme måde er korrekt ektodermmanipulation nødvendig for at garantere interaktionen mellem mesodermale og ektodermale celler. Når ektodermer er fyldt, skal mesodermale celler være så tæt som muligt på den distale ektoderm under AER. For både mesodermal og ektodermal indkøb er donorembryonernes udviklingsstadium også kritisk. Det skal overvejes, at de mesodermale celler vil reagere forskelligt i henhold til deres udviklingsstadium. Udviklingsfasen kan dog frit vælges i henhold til forsøgskravene. Alligevel skal 22 HH-trinnet opretholdes for at gøre det lettere at opnå ektodermer og dermed opretholde cellulær integritet og signalering. Endelig er god podning og fastgørelse afgørende for at sikre korrekt RL-integration til embryovæggen og dens udvikling.
Edgar Zwilling rapporterede først RL-systemet i 19646, hvorefter mange forskergrupper implementerede det for at besvare flere interessante biologiske spørgsmål. Protokollen for RL er tidligere blevet beskrevet i længden af Marian Ros et al. som en standardmetode til at manipulere den udviklende chick limb bud18, som forklarer andre måder at vindue æggene og udføre RL med hele vinge eller ben og at udføre RL med reaggregeret mesoderm. Dog nogle variationer mellem Ros. et al. protokol og den nuværende protokol beskrevet her kan findes. I deres protokol inkuberes lemmer knopper fra embryoner som ektoderm donorer med trypsin i iskold PBS i ~ 2 timer. Efter at have indledt ektoderminkubation opnåede de straks lemknopper fra embryoner som mesodermdonorer, fragmenterede derefter lemknopperne, fordøjede dem og fjernede ektodermen manuelt for at danne den mesodermale pellet efter inkubation i 30 minutter. Her blev for det første lemknopperne opnået fra embryoner, der skulle anvendes som mesodermale donorer, hvorefter hele lemknoppen fordøjes ved at inkubere med trypsin og kollagenase. Ektodermer fjernes derefter ved filtrering, og pelleten inkuberes mellem 1-1,5 timer. Fordelen ved denne metode til opnåelse af mesodermal pellet er, at behandlingen med trypsin løsner de intakte ektodermer fra mesodermen, mens collagenasebehandlingen fordøjer mesodermale celler. Derfor er det muligt at filtrere det ektodermale væv og kassere det. På den anden side giver mere pelletsinkubationstid det mulighed for at komprimere bedre, hvilket hjælper, når ektodermer fyldes. En anden forskel mellem de to protokoller er, at Ros et al. skrællede ektodermerne af en efter en og overførte dem til petriskålen, der indeholdt pelleten. I modsætning hertil dissekeres alle ektodermerne og samles i en petriskål i den nuværende protokol. Pelleten overføres til petriskålen for at fylde ektodermerne. Ved at følge denne metode kan ektodermerne fremstilles samtidig med podning. Som med mange andre protokoller kan det variere, hvordan RL'er udføres; Trinene i begge protokoller beskriver imidlertid tilstrækkeligt de kritiske faser af teknikken for at producere en vellykket manipulation.
Tidligere arbejde har vist, at dissocierede polariserende zoneceller hæmmer morfogenese, når de tilfældigt spredes blandt mesoderm i RL 7,10. Det er således valgfrit at fjerne celler fra ZPA, før de danner den mesodermale pellet. Senere kan ZPA-cellerne (eller soniske pindsvinindlejrede perler) bruges til at inducere RL til at udvikle A-P-polaritet 8,9,19.
RL-forsøgsmodellen kan tilpasses til en række forskellige scenarier. Rekombination kan implementeres med lemmerceller fra forskellige udviklingsmæssige eller modne (for- eller bagben) stadier, andre positioner langs de tre lemakser og med dissocierede-reaggregerede celler eller undissocieret-fragmenteret mesoderm15. Interessant nok har tidligere undersøgelser rapporteret at bruge RL-modellen til at studere adfærden af forskellige kombinationer af mutant og vildtype mesoderm og ektodermer 13,14,20,21 eller ved hjælp af elektroporated celler 22.
I betragtning af at lemudvikling er en evolutionært bevaret proces, kan ektodermkilderne også variere fra kylling, vagtel, and, mus eller rotte ektodermer kan opnås efter den samme beskrevne protokol. En anden mulighed er at ændre den mesodermale - eller endda andre celletyper eller kilder til at producere interspecies RL.
Afslutningsvis er RL en fænomenal model til at studere morfogenese, mønster, celle-celleinteraktioner, cellemigration og celledifferentiering på cellulært og molekylært niveau. Fordi proceduren for RL tillader flere variationer, tillader den potentielle anvendelser på tværs af adskillige biologiske spørgsmål uden at være begrænset til kylling-lem udviklingsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Estefania Garay-Pacheco for billeder i figur 2 og Maria Valeria Chimal-Montes de Oca for kunstværker. Dette arbejde blev støttet af Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskudsnumre IN211117 og IN213314] og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskudsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L modtog et postdoc-stipendium fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
