Summary
Rekombinante lemmer er en kraftig eksperimentell modell som gjør det mulig å studere prosessen med celledifferensiering og generering av mønstre under påvirkning av embryonale signaler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for å generere rekombinante lemmer med kyllinglemmet-mesodermale celler, som kan tilpasses andre celletyper hentet fra forskjellige organismer.
Abstract
Celledifferensiering er den finjusterte prosessen med celleforpliktelse som fører til dannelse av forskjellige spesialiserte celletyper under etableringen av å utvikle vev og organer. Denne prosessen opprettholdes aktivt i voksen alder. Celledifferensiering er en pågående prosess under utvikling og homeostase av organer. Å forstå de tidlige trinnene i celledifferensiering er viktig for å kjenne andre komplekse prosesser som morfogenese. Dermed er rekombinante kylling lemmer en eksperimentell modell som tillater studiet av celledifferensiering og mønstergenerering under embryonale mønstersignaler. Denne eksperimentelle modellen etterligner et in vivo-miljø ; Den monterer reaggregated celler i et ektodermalt deksel hentet fra en tidlig lemknopp. Senere overføres ektodermer og implanteres i en kyllingembryoreseptor for å tillate utviklingen. Denne analysen ble hovedsakelig brukt til å evaluere mesodermale lemknoppceller; Det kan imidlertid brukes på andre stamceller eller stamceller fra andre organismer.
Introduction
Virveldyrlemmen er en formidabel modell for å studere celledifferensiering, celleproliferasjon, celledød, mønsterdannelse og morfogenese 1,2. Under utviklingen oppstår lemmer som buler fra cellene avledet fra lateral plate mesoderm1. Limb knopper består av en sentral kjerne av mesodermale celler dekket av et ektoderm. Fra denne tidlige strukturen dukker det opp en hel og velformet lem. Etter at lemknoppen oppstår, gjenkjennes tre akser: (1) den proximo-distale aksen ([PD] skulder ved fingre), (2) dorso-ventralaksen ([DV] fra baksiden av hånden til håndflaten), og (3) den fremre bakre ([AP] tommelen til fingeren). Den proksimale distale aksen avhenger av den apikale ektodermale ryggen (AER), spesialisert ektoderm som ligger på den distale spissen av lemknoppen. AER er nødvendig for utvekst, overlevelsesvedlikehold, spredning og den uavklarte tilstanden til celler som mottar signaler 2,3. På den annen side kontrollerer sonen for polariserende aktivitet (ZPA) anteroposterior mønster4, mens dorsal og ectoderm kontrollerer dorsoventral mønster 7,8. Integrering av tredimensjonal mønster innebærer kompleks krysstale mellom disse tre aksene5. Til tross for forståelse av den molekylære banen under lemutvikling, forblir åpne spørsmål om mekanismene som kontrollerer mønster og riktig utvekst for å danne en hel lem ubesvart.
Edgar Zwilling utviklet det rekombinante lemsystemet (RL) i 1964 for å studere samspillet mellom lemmesenchymale celler og ektodermet i utviklingen av lemmer6. RL-systemet samler det dissosierte lemknopp mesodermet inn i det embryonale lemekstodermet for å transplantere det inn i den dorsale delen av et donorkyllingembryo. Signalene fra ektodermet induserer uttrykket av differensieringsgener og mønstergener på en romlig-temporal måte, og induserer dermed dannelsen av en lemlignende struktur som kan rekapitulere celleprogrammene som oppstår under lemutvikling 7,8,9.
RL-modellen er verdifull for å forstå egenskapene til lemkomponenter og samspillet mellom mesodermale og ektodermale celler6. En RL kan defineres som en lemlignende struktur skapt av den eksperimentelt montering eller rekombinasjon av lemknopp mesodermale celler inne i et ektodermalt deksel6. Morfogenesen til RL avhenger av egenskapene til mesodermale celler (eller andre typer) som vil reagere på de ektodermale mønstersignalene. En av fordelene med dette eksperimentelle systemet er allsidigheten. Denne egenskapen tillater opprettelse av flere kombinasjoner ved å variere kilden til mesodermale celler, for eksempel celler fra forskjellige utviklingsstadier, fra forskjellige stillinger langs lemmen, eller hele (udisosierte) eller reaggregaterte celler 7,8,9,10. Et annet eksempel er evnen til å skaffe det embryonale ektodermet fra andre arter enn kylling, for eksempel skilpadde11, vaktel eller mus12.
I denne forstand bidrar RL-teknikken til å studere lemutvikling og samspillet mellom lemmesenchymale og ektodermale celler fra et evolusjonært synspunkt. Denne teknikken har også et stort potensial for å analysere evnen til forskjellige kilder til stamceller for å skille seg ut i en lemlignende struktur ved å dra nytte av signalene fra det embryonale ektodermet 12,13,14. I motsetning til in vitrokulturer tillater RL å evaluere differensierings- og morfogenetisk potensial for en cellepopulasjon ved å tolke embryonale signaler fra en utviklende lem 9,15.
I denne protokollen er det gitt en trinnvis guide til å utføre vellykket RL med reaggregated mesodermale lemknoppceller, og dermed åpne muligheten for å tilpasse denne protokollen med forskjellige kilder til reaggregated celler eller til og med forskjellige ectoderm kilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board for care and use of Laboratory Animals of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). Et skjematisk flytskjema over de generelle trinnene i denne protokollen vises i figur 1A.
1. Embryoinkubasjon og bestemmelse av levedyktighet
- Inkuber befruktede kyllingegg ved 38 °C og 60 % relativ fuktighet i omtrent tre og en halv dag til de når 22 HH-trinnet (ifølge Hamilton og Hamburger, 1951)16.
MERK: Nybefruktede kyllingegg kan oppbevares ved 15 °C i opptil en uke.- For å inkubere de befruktede eggene, plasser eggene vertikalt med den spisse siden ned i den fuktede inkubatoren. Roter eggene under inkubasjon, da det er nødvendig for å forhindre at det utviklende embryoet holder seg til skallmembranen.
MERK: Befruktede høneegg kan fås fra lokale gårder. Befruktede hvite leghorn kyllingegg brukes vanligvis for å unngå pigmentering av fjærene i sene embryoer. Vurder å inkubere nok egg separat for å oppnå tre strukturer: (1) lemmesodermale celler, (2) lemekstodermer og (3) donorembryoer for å transplantere RL.
- For å inkubere de befruktede eggene, plasser eggene vertikalt med den spisse siden ned i den fuktede inkubatoren. Roter eggene under inkubasjon, da det er nødvendig for å forhindre at det utviklende embryoet holder seg til skallmembranen.
- Etter tre og en halv dag med inkubasjon, fjern egg fra inkubatoren, vattpinne med 70% etanol, og la det lufttørke.
- Identifiser utviklende embryoer som kandling egget for å observere blodkarene og finne embryoet. Kast egg som ikke har et embryo.
MERK: På dette tidspunktet distribuerer du eggene for å få mesodermale celler, ektodermer og vertene for RL.
2. Oppnå lemmesodermale celler for å fylle ektodermer
MERK: Før man starter manipulasjonene, anbefales det på det sterkeste å desinfisere arbeidsområdet, mikroskopene og alt instrumentet ved å swabbing med 70% etanoloppløsning.
- Trykk på den stumpe enden av eggeskallet med enden av en stump tang for å åpne et vindu og fjern ca 1 cm x 1 cm av skallet ved hjelp av tangene.
- Overfør egg til en plast- eller kartongholder og legg dem en etter en under stereomikroskopet. Identifiser luftmembranen og fjern den deretter ved å velge et lite hull der ingen fartøy er funnet. Trekk dette området ved hjelp av fine kirurgiske tang.
MERK: Luftmembranen kan identifiseres som den hvite og ugjennomsiktige membranen som observeres umiddelbart etter at egget er ventilert.- Fjern et lite stykke eggeskall som kan komme i kontakt med embryoet.
MERK: Kontroller at embryoene er i 22 HH-fasen før du starter protokollen. Embryoer i tidligere stadier kan returneres til inkubatoren etter å ha forseglet eggeskallvinduet med tape.
- Fjern et lite stykke eggeskall som kan komme i kontakt med embryoet.
- Åpne fostersekken helt ved å rive opp fosteret ved hjelp av de fine kirurgiske tangene (se Materialfortegnelse).
MERK: Amnion kan identifiseres som en gjennomsiktig membran som tett dekker embryoet og er fylt med fostervann. - Fjern embryoet forsiktig fra egget ved hjelp av et par stumpe tang og overfør deretter til en steril Petri-tallerken som inneholder iskald fosfatbufret saltvannsoppløsning (1x PBS). Gjenta dette trinnet for de resterende eggene. Tenk på at bare ~ 8-10 embryoer er tilstrekkelig til å oppnå mesodermale celler.
- Vask embryoene en gang i iskald 1x PBS, og ved hjelp av et stereomikroskop (se Materialtabell), trekk ut eventuelle gjenværende membraner. Finn bakbensknoppene.
MERK: Lemknopper er avrundede strukturer som ligger langs embryoets fremre bakre akse som fremspring fra flanken. Bakbenene ligger mer bakre enn forbenene. - Oppretthold embryoene i ren 1x PBS, og bruk et par fine kirurgiske tang, klipp hver bakbensknopp langsgående. Klipp knoppen svært nær embryoets flanke for å dissekere ut hele bakbensknoppene. Gjenta dette trinnet med de resterende embryoene.
- Bruk en pipette for plastoverføring til å overføre lemknoppene til et tomt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Bruk en pipettespiss til å fjerne overflødig 1x PBS og erstatt PBS med 500 μL 0,5 % trypsinoppløsning (se materiallisten). Inkuber lemknopper i en termoblokk i 7 min ved 37 °C.
- Fjern trypsinoppløsningen og erstatt den med 500 μL kollagenalisse type IV ved 2 mg/ml i Hanks balansert saltoppløsning (se Materialtabell), og inkuber den deretter i en termoblokk ved 37 °C i 8 minutter.
MERK: Trypsin-inkubasjon løsner ektodermene litt, mens kollagenaliser disaggregaterer mesodermale celler. - Etter inkubasjon, fjern så mye kollagenase som mulig og erstatt det med 1 ml kaldt Dulbeccos Modified Eagle Medium-high glukose (DMEM-HG) medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) for å inaktivere enzymene. Pipette blandingen forsiktig ~ 10 ganger.
- Filtrer suspensjonen som inneholder cellene med en cellesil på 70 μm for å etterlate ektodermene.
MERK: Filtrering vil også fjerne eventuelle ufordøyde lemknopper, og etterlate en suspensjon av enkeltceller. - Etter filtrering, pipette suspensjonen igjen 5-10 ganger og sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur, og kast deretter supernatanten.
- Bruk 1 ml DMEM-HG supplert med 10% FBS for å vaske overflødig kollagenal. Sentrifuger suspensjonen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast mediet forsiktig ved pipettering og erstatt det deretter med 1 ml fersk DMEM-HG supplert med 10% FBS uten å forstyrre cellene i bunnen av røret.
- La cellene danne en kompakt pellets (reaggregate) etter å ha inkubert dem i 1-1,5 timer ved 37 °C i en termoblokk.
MERK: Mens mesodermale celler danner pelletsen, er det praktisk å skaffe lemekstodermer.
3. Få tak i lemekstodermene
- Gjenta trinn 1-6 fra avsnitt 2 separat med de andre 22 HH kyllingembryoene som er valgt for å oppnå ektodermene.
MERK: Antall embryoer til dette formålet er proporsjonalt med det endelige antallet av RL ønsket. Et forhold på 2: 1 ectoderms-RL er hensiktsmessig. - Etter å ha fått tak i bakklemmene, bruk en plastpipette for å overføre dem til et tomt mikrosenterrør. Fjern overflødig 1x PBS og erstatt den med 500 μL 0,5% trypsin i steril 1x PBS. Inkuber blandingen i 30 min ved 37 °C i en termoblokk.
- Etter den enzymatiske fordøyelsen, overfør trypsinoppløsningen som inneholder lemknoppene til en steril Petri-tallerken.
- Fjern overflødig trypsin så mye som mulig ved hjelp av en mikropipette; oversvømme Petri-retten med iskald 1x PBS supplert med 10% av FBS til alle lemknopper er dekket.
MERK: FBS kan erstattes med hesteserum. - Identifiser lemknoppene under stereomikroskopet; identifisere ektodermet som en litt frittliggende gjennomsiktig membran fra lemmens mesodermale celler (figur 1B).
- Hold den mest proksimale enden av lemknoppen ved hjelp av fine kirurgiske tang mens du forsiktig løsner og skiller ektoderlaget ved hjelp av de andre tangene.
MERK: Det kan være vanskelig å få tak i ektodermene på grunn av mesodermal cellekumping og festing til ektodermer, og dermed føre til at de blir klissete. Det anbefales å stadig kaste de mesodermale cellene for å opprettholde bare ektodermene i Petri-parabolen. - Vedlikehold ektodermene i iskald 1x PBS-10% FBS-løsning.
MERK: Ektodermer kan oppbevares ved 4 °C i tilfelle det reaggregaterte mesodermet ikke er klart. Det er imidlertid å foretrekke å koordinere inkubasjonstiden til pelletsen med ektodermal oppnåelse.
4. Montering av mesodermale celler inne i det ektodermale dekselet
MERK: For dette er det nødvendig å ha de tomme ektodermene i en Petri-tallerken med steril 1x PBS-10% FBS-løsning som inneholder en dannet pellet av mesodermale celler.
- Etter at pelletsen er dannet (se avsnitt 2), kast ~600 μL av mediet fra røret ved pipettering.
- Løsne pelletsen forsiktig fra bunnen ved hjelp av en pipettespiss og uten å knuse eller ødelegge den.
- Når pelletsen er helt løsrevet fra bunnen av røret, snu røret opp ned for å overføre pelletsen til Petri-parabolen som inneholder de tomme ektodermene (figur 1C).
- Klipp et lite stykke pellet ved hjelp av et par fine kirurgiske tang og plasser det så nært som mulig til ektodermet.
- Som om det var en pose, åpne ektodermet med kirurgiske tang, og legg pelletsstykket så tett som mulig inn i det ektodermale dekselet. Gjenta dette trinnet for så mange RLer som ønsket (figur 1D).
MERK: Klipp delene av pelletsen en etter en, og fyll ektodermene for å opprettholde den 1x PBS-10% FBS-løsningen. Størrelsen på pelletsen må tilsvare hvert ektoderm. - La ektodermet og mesodermen helbrede sammen i ~ 30 min ved romtemperatur og deretter transplantere dem inn i embryoverten. Kast ubrukt ectoderm og mesoderm.
5. Transplantasjon av fylt ektoderm til et vertsembryo
MERK: Før du transplanterer ektodermene, må du ordne to stereomikroskop ved siden av hverandre på en benkeplate, ett for embryomanipulering og RL-podning. Den andre er for å opprettholde de fylte ektodermene som er klare til å overføres til embryoet.
- Velg antall ønskede egg for å transplantere de fylte ektodermene.
- Bruk enden av en stump tang, trykk på eggeskallet til de 22 HH-vertsembryoene for å åpne et vindu. Identifiser luftmembranen, og bruk et par fine kirurgiske tang til å fjerne den helt.
- Åpne fostersekken nær forbenet for å eksponere embryoets høyre flanke. Åpne bare beløpet som trengs for å utføre prosedyren.
- Styrt av forbensposisjonen, utfør sårskraping med en wolframnål (se Materialbord) til lengden på 2-3 somitter, noe som skader mesodermen litt til den blør.
- Overfør individuelt et fylt ektoderm (RL) inn i kyllingembryoet og plasser basen av den rekombinante lemmen over det somite såret.
MERK: RL-overføring kan gjøres med en plastpipette eller med en vinklet spaltekniv. - Fest RL riktig med to stykker palladiumtråd på 0,025 mm diameter og 0,5-1 mm lengde (se Materialbord). Juster bunnen av RL etter såret for å sikre at det festes til flanken av vertsembryoet og vaskulært (figur 1E).
- Forsegle vinduet med tape, og returner egget til inkubatoren. Samle embryoene på ønsket tidspunkt for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjenkjenne en godt utført rekombinant lem
Etter podning ble de manipulerte embryoene returnert til inkubatoren for å tillate RL å utvikle seg. Inkubasjonstiden korrelerte med kravene til eksperimentet. Likevel kan RL lett skille seg ut etter 12 timers implantasjon. For å avgjøre om implantasjonen var tilstrekkelig, ble RL observert som et fremspring som var sikkert festet til donorembryoens mesodermale vegg (figur 2A). Tvert imot, enten enten celle levedyktighet og / eller graft mislyktes, ble RL løsnet fra den mesodermale veggen eller presentert en grov morfologi (figur 2B).
Morfologisk og mønsterundersøkelse av rekombinante lemmer
For morfologisk undersøkelse ble RL farget med Alcian blå17 for å observere dannelsen av skjelettelementer og deres mønster. Det anbefales å farge hele stammen av donorembryoet for å unngå å gå glipp av RL under prosedyren (figur 3A). Alternativt, før du tømmer RL, ble bilder i etanolløsning oppnådd for å observere morfologien til RL eller utføre kvantitative målinger (figur 3B). Farget eller ubegrunnet RL ble kuttet for å observere vevsstruktur eller identifisere celletype (figur 3C).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentell utforming av rekombinante lemmer (RL). (A) RL ble utført ved å montere lemknopp mesoderm fra en donor 22 HH chick embryo inne i et ektodermalt deksel hentet fra en annen 22 HH kylling embryo donor. Etodermer var tett fylt med mesodermale celler. Etter montering ble fylte ektodermer overført og festet med palladiumtråder på toppen av en tidligere somites sår. (B) En lemknopp med ektodermet løsnet etter trypsinbehandling. (C) Pellet ble oppnådd etter dannelsen nær de tomme ektodermene, klar til å fylles. (D) Et ektodermalt deksel fylt med mesodermale celler vises. (E) Feste RL i vertsembryoet med palladiumtråder. Vær oppmerksom på at RL ble plassert på embryoets høyre flanke nær forbensknoppen; p: pellets. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nyopprettede kyllingkylling-rekombinante lemmer. (A) En 24 h RL festet til mesodermveggen vises. (B) En mislykket 24 h RL vises. Vær oppmerksom på at palladiumtråden ikke fester RL; Følgelig løsnet RL fra den mesodermale veggen og presenterte en grov morfologi. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologisk analyse av rekombinante lemmer. (A) Alcian blå farging for å demonstrere skjelettelementer i en 6-dagers kyllingkylling RL. (B) Den samme RL ble vist i (A) før du fjerner alcianblått. (C) Sagittal skive av en RL farget med alcian blå farging og med hematoksylin og eosin. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt kan RL-protokollen deles inn i fem trinn: (1) embryoinkubasjon, (2) å skaffe lemmesodermale celler for å fylle ektodermene, (3) oppnå ektodermer, (4) montering av mesodermale celler inne i ektodermale deksler og (5) transplantasjon av de fylte ektodermene i vertsembryoene. Den største begrensningen i RL-teknikken er den lange, detaljerte protokollen, som har mange kritiske punkter som krever tålmodighet for å utføre riktig. Kritiske øyeblikk må identifiseres for å kunne fullføre protokollen. Under mesodermale celleinnkjøp er cellenes integritet og levedyktighet avgjørende. Celledød vil forhindre riktig RL-utvikling. I en lignende vene er riktig ektoderm manipulasjon nødvendig for å garantere samspillet mellom mesodermale og ektodermale celler. Når ektodermer er fylt, må mesodermale celler være så nært som mulig til det distale ektodermet under AER. For både mesodermale og ektodermale anskaffelser er utviklingsstadiet av donorembryoene også kritisk. Det må vurderes at de mesodermale cellene vil reagere differensialt i henhold til utviklingsstadiet. Utviklingsstadiet kan imidlertid fritt velges i henhold til de eksperimentelle kravene. Likevel må 22 HH-trinnet opprettholdes for å gjøre det enklere å oppnå ektodermer, og dermed opprettholde cellulær integritet og signalering. Til slutt er god podning og festing avgjørende for å sikre riktig RL-integrasjon til embryoveggen og dens utvikling.
Edgar Zwilling rapporterte først RL-systemet i 19646, hvoretter mange forskningsgrupper implementerte det for å svare på flere interessante biologiske spørsmål. Protokollen til RL har tidligere blitt beskrevet i lengden av Marian Ros et al. som en standard metode for å manipulere den utviklende kylling lem knopp18, som forklarer andre måter å vindus eggene og utføre RL med hele vinge eller ben og å utføre RL med reaggregated mesoderm. Noen variasjoner mellom Ros. protokoll og den nåværende protokollen som er beskrevet her, finner du. I deres protokoll inkuberes lemknopper fra embryoer som ectoderm-donorer med trypsin i iskald PBS i ~ 2 timer. Etter å ha startet ectoderm-inkubasjon, fikk de umiddelbart lemknopper fra embryoer som mesoderm donorer, deretter fragmenterte lemknoppene, fordøyde dem og fjernet ektodermet manuelt for å danne mesodermal pellet etter inkubering i 30 minutter. Her ble først lemknoppene hentet fra embryoer som skal brukes som mesodermale donorer, hvorpå hele lemknoppen fordøyes ved å inkubere med trypsin og kollagenal. Ektodermer fjernes deretter ved filtrering, og pellet inkuberes mellom 1-1,5 timer. Fordelen med denne metoden for å oppnå mesodermal pellet er at behandlingen med trypsin løsner de intakte ektodermene fra mesodermen mens kollagenal behandling fordøyer mesodermale celler. Derfor er det mulig å filtrere det ektodermale vevet og kaste det bort. På den annen side tillater mer pellet inkubasjonstid det å komprimere bedre, noe som hjelper når ektodermer fylles. En annen forskjell mellom de to protokollene er at Ros et al. skrelte av ektodermene en etter en og overførte dem til Petri-parabolen som inneholder pelletsen. I kontrast blir alle ektodermene dissekert og samlet i en Petri-tallerken i den nåværende protokollen. Pellet overføres til Petri-parabolen for å fylle ektodermene. Ved å følge denne metoden kan ektodermene tilberedes samtidig med podning. Som med mange andre protokoller, kan hvordan RLer utføres variere. Trinnene i begge protokollene beskriver imidlertid de kritiske stadiene av teknikken tilstrekkelig for å produsere en vellykket manipulering.
Tidligere arbeid har vist at dissosierte polariserende soneceller hemmer morfogenese når de tilfeldig spres blant mesoderm i RL 7,10. Dermed er det valgfritt å eliminere celler fra ZPA før du danner mesodermal pellet. Senere kan ZPA-cellene (eller soniske pinnsvin innebygde perler) brukes til å indusere RL til å utvikle A-P polaritet 8,9,19.
Den eksperimentelle RL-modellen kan tilpasses en rekke scenarier. Rekombinasjon kan implementeres med lemceller fra forskjellige utviklingsmessige eller modne (for- eller bakben) stadier, andre stillinger langs de tre lemaksene, og med dissosierte reaggregaterte celler eller udissosierte fragmenterte mesoderm15. Interessant nok har tidligere studier rapportert å bruke RL-modellen til å studere oppførselen til forskjellige kombinasjoner av mutant- og villtype mesoderm og ektodermer 13,14,20,21 eller bruke elektroporerte celler 22.
Tatt i betraktning at lemutvikling er en evolusjonært bevart prosess, kan ectoderm-kildene også variere fra kylling, vaktel, and, mus eller rotteekstodermer kan oppnås etter samme beskrevne protokoll. En annen mulighet er å endre mesodermal - eller til og med andre celletyper eller kilder for å produsere interspecies RL.
Til slutt er RL en fenomenal modell for å studere morfogenese, mønster, cellecelleinteraksjoner, cellemigrasjon og celledifferensiering på cellulære og molekylære nivåer. Fordi prosedyren for RL tillater flere variasjoner, tillater den potensielle anvendelser på tvers av mange biologiske spørsmål uten å være begrenset til kylling-lem utviklingsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Estefania Garay-Pacheco for bilder i figur 2 og maria Valeria Chimal-Montes de Oca for kunstverk. Dette arbeidet ble støttet av Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskuddsnumre IN211117 og IN213 og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskuddsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L mottok postdoktorstipend fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
