Summary
重组肢体是一种强大的实验模型，可以研究细胞分化过程和胚胎信号影响下的模式生成。该协议提出了一种详细的方法，用于生成具有鸡肢 - 中胚层细胞的重组肢体，可适应从不同生物体获得的其他细胞类型。
Abstract
细胞分化是细胞承诺的微调过程，导致在发育中的组织和器官的建立过程中形成不同的特化细胞类型。这个过程在成年期得到积极维持。细胞分化是器官发育和体内平衡过程中的一个持续过程。了解细胞分化的早期步骤对于了解其他复杂的过程（如形态发生）至关重要。因此，重组鸡肢是一种实验模型，允许在胚胎模式化信号下研究细胞分化和模式生成。该实验模型模仿 体内 环境;它将重新聚集的细胞组装成从早期肢体芽获得的外胚层覆盖物。之后，外胚层被移植并植入雏鸡胚胎受体中以允许其发育。该测定主要用于评估中胚层肢体芽细胞;然而，它可以应用于来自其他生物体的其他干细胞或祖细胞。
Introduction
脊椎动物肢体是研究细胞分化，细胞增殖，细胞死亡，模式形成和形态发生1，2的强大模型。在发育过程中，四肢从来自侧板中胚层1的细胞中以凸起的形式出现。肢体芽由被外胚层覆盖的中胚层细胞的中央核心组成。从这个早期结构中，出现了一个完整的、形状良好的肢体。肢体萌芽后，识别三个轴：（1）近轴远端轴（[PD]肩部到手指），（2）背腹轴（[DV]从手背到手掌），以及（3）前后轴（[AP]拇指到手指）。近端-远端轴取决于顶端外胚层脊 （AER），即位于肢体芽远端的特殊外胚层。AER是生长，存活维持，增殖和接收信号的细胞的未分化状态2，3所必需的。另一方面，极化活动区（ZPA）控制前后模式4，而背侧和外胚层控制背动脉模式7，8。三维图案化的集成意味着这三个轴之间的复杂串扰5.尽管了解肢体发育过程中的分子途径，但关于控制模式和适当生长以形成整个肢体的机制的悬而未决的问题仍未得到解答。
Edgar Zwilling于1964年开发了重组肢体（RL）系统，以研究肢体间充质细胞与发育中的肢体外胚层之间的相互作用6。RL系统将解离 - 重新聚集的肢体芽中胚层组装到胚胎肢体外胚层中，将其移植到供体雏鸡胚胎的背侧部分。外胚层提供的信号以时空方式诱导分化基因和图案化基因的表达，从而诱导肢体样结构的形成，该结构可以概括肢体发育过程中发生的细胞程序7，8，9。
RL模型对于理解肢体成分的性质以及中胚层和外胚层细胞之间的相互作用具有价值6。RL可以被定义为由实验组装或重组肢体芽芽中胚层细胞在外胚层盖6内产生的肢体样结构。RL的形态发生取决于对外胚层图案化信号作出反应的中胚层细胞（或其他类型的）的特征。该实验系统的优点之一是其多功能性。该特征允许通过改变中胚层细胞的来源来创建多种组合，例如来自不同发育阶段的细胞，来自沿肢体的不同位置的细胞，或整个（未解离的）或重新聚集的细胞7，8，9，10。另一个例子是从鸡以外的物种获得胚胎外胚层的能力，例如，11，鹌鹑或小鼠12。
从这个意义上说，RL技术有助于从进化的角度研究肢体发育以及肢体间充质细胞和外胚层细胞之间的相互作用。该技术还具有通过利用胚胎外胚层12，13，14提供的信号来分析祖细胞的不同来源分化成肢体样结构的能力的巨大潜力。与体外培养相反，RL允许通过解释来自发育中的肢体的胚胎信号来评估细胞群的分化和形态发生潜力9，15。
在该协议中，提供了使用重新聚集的中胚层肢体芽细胞成功进行RL的分步指南，从而开辟了将此方案与不同来源的重新聚集细胞甚至不同的外胚层来源相适应的可能性。
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Protocol
这项研究由墨西哥国立自治大学（墨西哥国立自治大学）生物医学研究所实验室动物护理和使用机构审查委员会（墨西哥国立自治大学）审查和批准。该协议的一般步骤的示意图如图 1A所示。
1. 胚胎孵化和活力测定
- 将受精鸡蛋在38°C和60%相对湿度下孵育约三天半，直到它们达到22 HH阶段（根据Hamilton和Hamburger，1951）16。
注意：新鲜受精的鸡蛋可以在15°C下储存长达一周。- 要孵化受精卵，请将受精卵垂直放置，尖头面朝下放入加湿的孵化器中。在孵化期间旋转卵子，因为有必要防止发育中的胚胎粘附在壳膜上。
注意：受精鸡蛋可以从当地农场获得。受精的白里窝燕子鸡蛋通常用于避免晚期胚胎中羽毛的色素沉着。考虑分别孵化足够的卵子以获得三种结构：（1）肢体中胚层细胞，（2）肢体外胚层，以及（3）供体胚胎以移植RL。
- 要孵化受精卵，请将受精卵垂直放置，尖头面朝下放入加湿的孵化器中。在孵化期间旋转卵子，因为有必要防止发育中的胚胎粘附在壳膜上。
- 孵化三天半后，从孵化器中取出种蛋，用70%乙醇拭子，然后风干。
- 识别发育中的胚胎，将卵子倒入，以观察血管并定位胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。
注意：此时，分配卵子以获得中胚层细胞，外胚层和RL的宿主。
2. 获取肢体中胚层细胞以填充外胚层
注意：在开始操作之前，强烈建议通过用70%乙醇溶液拭子对工作区域，显微镜和所有仪器进行消毒。
- 用钝镊子的末端轻敲蛋壳的钝端以打开窗户，并使用镊子取下约1 cm x 1 cm的蛋壳。
- 将鸡蛋转移到塑料或纸箱架上，并将它们逐个放置在立体显微镜下。识别空气膜，然后通过选择一个没有发现容器的小孔将其移除。借助精细的手术镊子拉动该区域。
注意：空气膜可以被识别为在打开鸡蛋后立即观察到的白色和不透明的膜。- 取出可能与胚胎接触的任何小块蛋壳。
注意：在启动方案之前，验证胚胎是否处于22 HH阶段。早期阶段的胚胎可以在用胶带密封蛋壳窗口后返回培养箱。
- 取出可能与胚胎接触的任何小块蛋壳。
- 使用精细的手术镊子撕开羊膜完全打开羊膜囊（ 参见材料表）。
注意：羊膜可以被识别为一个透明的膜，紧密覆盖胚胎并充满羊水。 - 使用一对钝镊子小心地将胚胎从卵子中取出，然后转移到含有冰冷的磷酸盐缓冲盐溶液（1x PBS）的无菌培养皿中。对剩余的卵子重复此步骤。考虑到只有〜8-10个胚胎足以获得中胚层细胞。
- 在冰冷的1x PBS中洗涤胚胎一次，并在立体显微镜的帮助下（参见 材料表），取出任何剩余的膜。找到后肢芽。
注意：肢体芽是沿着胚胎的前后轴作为侧翼突出的圆形结构。后肢比前肢更靠后。 - 将胚胎保持在干净的1x PBS中，并使用一对精细的手术镊子，纵向剪下每个后肢芽。将芽切得非常靠近胚胎的侧面，以解剖整个后肢芽。对剩余的胚胎重复此步骤。
- 使用塑料转印移液器将肢体芽转入空的1.5 mL微量离心管中。
- 使用移液器吸头去除任何过量的1x PBS，并用500μL0.5%胰蛋白酶溶液代替PBS（参见 材料表）。在37°C下在热块中孵育肢体芽7分钟。
- 除去胰蛋白酶溶液，并在Hanks平衡盐溶液中以2mg / mL的500μLIV型胶原酶代替它（参见 材料表），然后将其在37°C的热块中孵育8分钟。
注意：胰蛋白酶孵育会稍微分离外胚层，而胶原酶会分解中胚层细胞。 - 孵育后，取出尽可能多的胶原酶，并用1毫升冷Dulbecco的改良鹰中高葡萄糖（DMEM-HG）培养基代替，并补充10%胎牛血清（FBS）以灭活酶。轻轻移液混合物〜10次。
- 用70μm的细胞过滤器过滤含有细胞的悬浮液，以留下外胚层。
注意：过滤还将去除任何未消化的肢体芽，留下单个细胞的悬浮液。 - 过滤后，再次移液悬浮液5-10次，并在室温下以200× g 离心5分钟，然后弃去上清液。
- 使用1毫升补充10%FBS的DMEM-HG来洗涤多余的胶原酶。在室温下以200× g 离心悬浮液5分钟。
- 通过移液小心丢弃培养基，然后用1mL补充有10%FBS的新鲜DMEM-HG代替它，而不会干扰管底部的细胞。
- 让细胞在37°C的热块中孵育1-1.5小时后形成紧凑的沉淀（再聚集物）。
注意：当中胚层细胞形成沉淀时，获得肢体外胚层是方便的。
3. 获得肢体外胚层
- 从第2部分分别重复步骤1-6，选择其他22个HH鸡胚胎以获得外胚层。
注意：用于此目的的胚胎数量与所需RL的最终数量成正比。2：1的外胚层-RL的比例是合适的。 - 获得后肢芽后，使用塑料移液器将其转移到空的微量离心管中。除去任何多余的1x PBS，并用500μL0.5%胰蛋白酶代替无菌1x PBS。将混合物在37°C下在热块中孵育30分钟。
- 酶消化后，将含有肢体芽的胰蛋白酶溶液转移到无菌培养皿中。
- 使用微量移液管尽可能多地去除多余的胰蛋白酶;用冰冷的1x PBS填充培养皿，并补充10%的FBS，直到所有肢体芽都被覆盖。
注意：FBS可以代替马血清。 - 识别立体显微镜下的肢体芽;将外胚层识别为从肢体中胚层细胞中略微分离的透明膜（图1B）。
- 借助精细的手术镊子握住肢体芽的最近端，同时使用其他镊子小心地分离和分离外胚层。
注意：由于中胚层细胞聚集并附着在外胚层上，因此获得外胚层可能很困难，从而导致它们变得粘稠。建议不断丢弃中胚层细胞，以仅维持培养皿中的外胚层。 - 在冰冷的1x PBS-10%FBS溶液中维持外胚层。
注意：外胚层可以储存在4°C，以防重新聚集的中胚层尚未准备好。然而，优选将沉淀的孵育时间与获得外胚层的孵育时间协调。
4. 在外胚层覆盖层内组装中胚层细胞
注意：为此，有必要将空的外胚层放在培养皿中，其中含有无菌的1x PBS-10%FBS溶液，其中包含形成的中胚层细胞颗粒。
- 形成沉淀后（见第2节），通过移液从管中丢弃〜600μL培养基。
- 使用移液器吸头小心地将颗粒从底部分离，不要粉碎或破坏它。
- 当颗粒从管的底部完全分离时，将管子倒置以将颗粒转移到含有空外胚层的培养皿中（图1C）。
- 借助一对精细的手术镊子切下一小块颗粒，并将其尽可能靠近外胚层。
- 就好像它是一个袋子一样，用手术镊子打开外胚层，并将颗粒尽可能紧密地放入外胚层盖中。根据需要对任意数量的RL重复此步骤（图1D）。
注意：逐个切碎颗粒，并填充外胚层以保持1x PBS-10%FBS溶液的清洁。颗粒的大小需要对应于每个外胚层。 - 让外胚层和中胚层在室温下一起愈合约30分钟，然后将其移植到胚胎宿主中。丢弃未使用的外胚层和中胚层。
5.将填充的外胚层移植到宿主胚胎中
注意：在移植外胚层之前，在台式上布置两个相邻的立体显微镜，一个用于胚胎操作和RL移植。另一个是用于维持填充的外胚层准备转移到胚胎中。
- 选择所需的卵子数量以嫁接填充的外胚层。
- 使用钝镊子的末端，点击22个HH宿主胚胎的蛋壳以打开窗户。识别空气膜，并使用一对精细的手术镊子将其完全移除。
- 打开前肢附近的羊膜囊，露出胚胎的右侧。仅打开完成该过程所需的量。
- 在前肢位置的指导下，用钨针（见 材料表）进行缠绕刮擦，使其长度达到2-3个索米特，轻微损坏中胚层直至出血。
- 将填充的外胚层（RL）单独转移到雏鸡胚胎中，并将重组肢体的基部放在somite伤口上。
注意：RL转移可以使用塑料移液器或斜切刀完成。 - 用两根直径为0.025毫米，长度为0.5-1毫米的钯线正确固定RL（见 材料表）。将RL的基部与伤口对齐，以确保它将附着在宿主胚胎的侧面并血管化（图1E）。
- 用胶带密封窗户，然后将种蛋放回孵化器。在所需的时间点收集胚胎进行分析。
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Representative Results
识别表现良好的重组肢体
嫁接后，将操纵的胚胎返回到培养箱中以允许RL发育。孵育时间与实验的要求相关。然而，在植入12小时后可以很容易地区分RL。为了确定植入是否充分，观察到RL是牢固附着在供体胚胎的中胚层壁上的突起（图2A）。相反，无论细胞活力和/或移植物失败，RL都与中胚层壁分离或呈现粗糙的形态（图2B）。
重组肢体的形态学和图案学检查
对于形态学检查，用Alcian Blue17 染色RL以观察骨骼元素的形成及其图案化。建议染色供体胚胎的整个躯干，以避免在手术过程中错过RL（图3A）。或者，在清除RL之前，获得乙醇溶液中的图像以观察RL的形貌或进行定量测量（图3B）。将染色或未染色的RL切片以观察组织结构或识别细胞类型（图3C）。
图1：重组肢体（RL）实验设计的示意图 ，（A）RL是通过组装来自供体22 HH雏鸡胚胎的肢体芽中胚层在从另一个22 HH雏鸡胚胎供体获得的外胚层覆盖物内进行的。外胚层被中胚层细胞紧紧地塞满了。组装后，填充的外胚层被转移并用钯丝固定在先前的somite伤口上。（B）胰蛋白酶治疗后外胚层脱落的肢体芽。（C）颗粒是在靠近空外胚层附近形成后获得的，准备填充。（D）显示充满中胚层细胞的外胚层覆盖物。（E）用钯丝固定宿主胚胎中的RL。请注意，RL位于胚胎的右侧，靠近前肢芽;p：颗粒。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：新鲜获得的鸡鸡重组肢体。 （A）显示附着在中胚层壁上的24小时RL。（B）显示不成功的24小时RL。请注意，钯线没有固定RL;因此，RL从中胚层壁上脱落并呈现出粗糙的形态。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：重组肢体的形态学分析。 （A）Alcian蓝色染色，以证明6天鸡鸡RL中的骨骼元素。（B） 在清除 Alcian Blue 之前，（A） 中显示了相同的 RL。（C）用Alcian蓝色染色并用苏木精和曙红染色的RL的矢状切片。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
一般来说，RL方案可分为五个步骤：（1）胚胎孵育，（2）获得肢体中胚层细胞以填充外胚层，（3）获得外胚层，（4）组装外胚层覆盖物内的中胚层细胞，以及（5）将填充的外胚层移植到宿主胚胎中。RL技术的主要局限性是冗长，详细的协议，它具有许多需要耐心才能正确执行的关键点。要成功完成协议，需要确定关键时刻。在中胚层细胞采购过程中，细胞的完整性和活力至关重要。细胞死亡会阻止RL的正常发育。在类似的脉络中，正确的外胚层操作对于保证中胚层和外胚层细胞之间的相互作用是必要的。当外胚层被填充时，中胚层细胞必须尽可能靠近AER下方的远端外胚层。对于中胚层和外胚层获取，供体胚胎的发育阶段也至关重要。必须考虑到，中胚层细胞将根据其发育阶段做出差异性反应。但是，可以根据实验要求自由选择显影阶段。尽管如此，仍然需要维持22 HH阶段，以使获得外胚层更容易，从而保持细胞完整性和信号传导。最后，良好的移植和固定对于确保RL正确整合到胚胎壁及其发育中至关重要。
Edgar Zwilling于1964年首次报道了RL系统6，之后许多研究小组实施了它来回答几个有趣的生物学问题。RL的方案先前已被Marian Ros等人描述为操纵发育中的雏鸡肢芽18的标准方法，这解释了其他方法，以整个翅膀或腿部进行卵子和进行RL，并用重新聚集的中胚层进行RL。但是，Ros之间的一些变化。等.协议和本协议可在此找到。在他们的方案中，来自胚胎的肢体芽作为外胚层供体与胰蛋白酶在冰冷的PBS中孵育约2小时。在开始外胚层孵育后，他们立即从胚胎中获得肢体芽作为中胚层供体，然后将肢体芽碎片化，消化它们，并在孵育30分钟后手动去除外胚层以形成中胚层颗粒。首先，从胚胎中获得肢体芽以用作中胚层供体，然后通过与胰蛋白酶和胶原酶一起孵育整个肢体芽进行消化。然后通过过滤除去外胚层，并在1-1.5小时之间孵育沉淀。这种方法获得中胚层沉淀的优点是胰蛋白酶处理将完整的外胚层从中胚层中分离出来，而胶原酶处理消化中胚层细胞。因此，可以过滤外胚层组织并将其丢弃。另一方面，更多的颗粒孵育时间使其更好地压实，这有助于外胚层填充。这两种方案之间的另一个区别是Ros等人逐个剥下外胚层，并将它们转移到含有颗粒的培养皿中。相比之下，所有外胚层都被解剖并收集在本方案的培养皿中。将颗粒转移到培养皿中以填充外胚层。通过遵循这种方法，外胚层可以与嫁接同时制备。与许多其他协议一样，RL的执行方式可能会有所不同。然而，两种协议中的步骤都充分描述了该技术产生成功操作的关键阶段。
先前的工作已经证明，解离的极化区细胞在RL7，10中随机分散在中胚层中时会抑制形态发生。因此，在形成中胚层沉淀之前从ZPA中消除细胞是可选的。之后，ZPA细胞（或声波刺猬嵌入的珠子）可用于诱导RL产生A-P极性8，9，19。
RL实验模型适用于多种场景。重组可以与来自不同发育或成熟（前肢或后肢）阶段的肢体细胞，沿三个肢体轴的其他位置以及解离 - 重新聚集的细胞或未解离的中胚层15一起实现。有趣的是，以前的研究已经报道了使用RL模型来研究突变体和野生型中胚层和外胚层的不同组合13，14，20，21或使用电穿孔细胞22的行为。
考虑到肢体发育是一个进化保守的过程，外胚层的来源也可以从鸡，鹌鹑，鸭，小鼠或大鼠外胚层中变化，可以按照相同的描述方案获得。另一种可能性是改变中胚层 - 甚至其他细胞类型或来源以产生种间RL。
总之，RL是一个非凡的模型，用于研究细胞和分子水平的形态发生，图案化，细胞 - 细胞相互作用，细胞迁移和细胞分化。由于RL的程序允许多种变异，因此它允许在许多生物学问题中进行潜在应用，而不局限于鸡肢发育生物学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Estefania Garay-Pacheco 在图 2 中提供的图像，并感谢 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca 的艺术作品。这项工作得到了墨西哥国立自治大学（DGAPA）[拨款编号IN211117和IN213314]和授予JC-M的全国科学与技术大会（CONACyT）[授予1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]的支持。JC M-L是国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
