Summary
組換え四肢は、細胞分化の過程と胚シグナルの影響下でのパターンの生成を研究することを可能にする強力な実験モデルである。このプロトコルは、異なる生物から得られた他の細胞型に適応可能なニワトリ四肢 - 中胚葉系細胞を有する組換え四肢を生成するための詳細な方法を提示する。
Abstract
細胞分化は、発達中の組織および器官の確立中に異なる特殊な細胞型の形成につながる細胞コミットメントの微調整されたプロセスである。このプロセスは成人期に積極的に維持されます。細胞分化は、器官の発生および恒常性維持の間の進行中のプロセスである。細胞分化の初期段階を理解することは、形態形成などの他の複雑なプロセスを知るために不可欠です。したがって、組換えニワトリ四肢は、胚パターニングシグナル下での細胞分化およびパターン生成の研究を可能にする実験モデルである。この実験モデルは 、in vivo 環境を模倣しています。それは初期の四肢の芽から得られた外胚葉性のカバーに再凝集した細胞を組み立てる。その後、外胚葉は、その発達を可能にするために、ひよこの胚受容体に移植および移植される。このアッセイは、主に中胚葉性四肢芽細胞を評価するために使用された。しかし、それは他の生物からの他の幹または前駆細胞に適用することができる。
Introduction
脊椎動物の四肢は、細胞分化、細胞増殖、細胞死、パターン形成、および形態形成を研究するための手ごわいモデルである1,2。発生中、四肢は側板中胚葉1に由来する細胞から膨らみとして出現する。四肢芽は、外胚葉で覆われた中胚葉系細胞の中心核からなる。この初期の構造から、丸ごと整った四肢が出現する。四肢の蕾が生じた後、(1)近位 - 遠位軸([PD]肩から指へ)、(2)背腹側軸([DV]手の甲から手のひらまで)、および(3)前後軸([AP]親指から指へ)の3つの軸が認識される。近位 - 遠位軸は、四肢芽の遠位先端に位置する特殊な外胚葉である頂端外胚葉隆起(AER)に依存する。AERは、伸長、生存維持、増殖、およびシグナル2,3を受け取る細胞の未分化状態に必要である。一方、偏光活性ゾーン(ZPA)は前後パターニング4を制御し、背側および外胚葉は背側腹部パターニング7、8を制御する。3次元パターニングの統合は、これら3つの軸5間の複雑なクロストークを意味する。四肢の発達中の分子経路を理解しているにもかかわらず、四肢全体を形成するためのパターニングと適切な伸長を制御するメカニズムに関する未解決の疑問は未解決のままである。
Edgar Zwilling は 1964 年に組換え四肢 (RL) システムを開発し、発達中の四肢における四肢間葉系細胞と外胚葉との相互作用を研究しました6.RLシステムは、解離・再凝集した四肢芽中胚葉を胚性四肢外胚葉に組み立て、ドナーの雛胚の背部に移植する。外胚葉によって提供されるシグナルは、時空間的に分化遺伝子およびパターニング遺伝子の発現を誘導し、したがって、四肢発生中に起こる細胞プログラムを反復することができる四肢様構造の形成を誘導する7,8,9。
RLモデルは、四肢成分の性質および中胚葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を理解するのに有用である6。RLは、外胚葉カバー6の内部で四肢芽中胚葉細胞を実験的に組み立てまたは再結合することによって作成された四肢様構造として定義することができる。RLの形態形成は、外胚葉系パターニングシグナルに応答する中胚葉系細胞(または他のタイプ)の特性に依存する。この実験システムの利点の1つは、その汎用性である。この特性は、異なる発生段階からの細胞、四肢に沿った異なる位置からの細胞、または全体(解離していない)または再凝集した細胞7、8、9、10などの中胚葉系細胞の供給源を変えることによって、複数の組み合わせの作成を可能にする。別の例は、ニワトリ以外の種、例えばカメ11、ウズラ、またはマウス12から胚性外胚葉を得る能力である。
この意味で、RL技術は、四肢の発達と四肢間葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を進化的観点から研究するのに役立ちます。この技術はまた、胚性外胚葉12、13、14によって提供されるシグナルを利用して四肢様構造に分化する前駆細胞の異なる供給源の能力を分析するための大きな可能性を秘めている。インビトロ培養とは対照的に、RLは、発達中の四肢からの胚性シグナルを解釈することによって、細胞集団の分化および形態形成能を評価することを可能にする9,15。
このプロトコルでは、再凝集した中胚葉性四肢芽細胞を用いてRLを成功させるためのステップバイステップガイドが提供され、したがって、このプロトコルを異なる再凝集細胞源または異なる外胚葉源と適合させる可能性を開く。
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Protocol
この研究は、メキシコ国立オートノーマ大学(UNAM、メキシコ、メキシコ)の実験動物の世話と使用のための治験審査委員会によってレビューされ、承認されました。このプロトコルの一般的なステップの概略フローチャートを 図1Aに示す。
1. 胚の孵化と生存率の決定
- 受精した鶏の卵を38°C、相対湿度60%で約3日半孵化させ、22HH段階に達するまで(Hamilton and Hamburger, 1951による)16。
注:受精したての鶏卵は、15°Cで最大1週間保存できます。- 受精卵を孵化させるには、尖った面を下にして卵を加湿インキュベーターに入れます。発達中の胚が卵殻膜に付着するのを防ぐために必要なので、孵卵中に卵を回転させる。
注:受精鶏の卵は地元の農場から入手することができます。受精したホワイトレグホーン鶏の卵は、一般的に後期胚の羽毛の色素沈着を避けるために使用されています。(1)四肢中胚葉細胞、(2)四肢外胚葉、および(3)RLを移植するドナー胚の3つの構造を得るために、十分な卵子を別々に孵化させることを検討してください。
- 受精卵を孵化させるには、尖った面を下にして卵を加湿インキュベーターに入れます。発達中の胚が卵殻膜に付着するのを防ぐために必要なので、孵卵中に卵を回転させる。
- 3日半のインキュベーションの後、インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールで綿棒で拭き取り、風乾させる。
- 血管を観察し、胚を見つけるために卵子を傾けている発達中の胚を特定する。胚を持たない卵子を捨てる。
注:この時点で、卵を分配して中胚葉系細胞、外胚葉、およびRLの宿主を取得します。
2.外胚葉を埋めるための四肢中胚葉細胞の取得
注:操作を開始する前に、作業領域、顕微鏡、およびすべての機器を70%エタノール溶液で拭き取って消毒することを強くお勧めします。
- 鈍い鉗子の端で卵殻の鈍い端をタップして窓を開き、鉗子を使って約1 cm x 1 cmの殻を取り除きます。
- 卵をプラスチックまたはカートンホルダーに移し、実体顕微鏡の下に1つずつ置きます。空気膜を特定し、容器が見つからない小さな穴を選んで取り除きます。細かい外科用鉗子の助けを借りてこの領域を引っ張ります。
注:空気膜は、卵を窓を開けた直後に観察された白くて不透明な膜として識別することができます。- 胚と接触する可能性のある卵殻の小片を取り除きます。
注: プロトコルを開始する前に、胚が 22 HH 段階にあることを確認してください。初期段階の胚は、卵殻窓をテープで密封した後、インキュベーターに戻すことができる。
- 胚と接触する可能性のある卵殻の小片を取り除きます。
- 細かい外科用鉗子を使用して羊膜を引き裂いて羊膜嚢を完全に開きます( 材料表を参照)。
注:羊膜は、胚を密接に覆い、羊水で満たされた透明な膜として識別することができる。 - 一対の鈍い鉗子を使用して卵から胚を慎重に取り出し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を含む滅菌ペトリ皿に移す。残りの卵についてこの手順を繰り返します。〜8〜10個の胚のみが中胚葉系細胞を得るのに十分であると考えてください。
- 胚を氷冷1x PBSで1回洗浄し、実体顕微鏡( 材料表を参照)の助けを借りて、残りの膜を撤回する。後肢の芽を見つけます。
注:四肢芽は、胚の前後軸に沿って側面からの突起として位置する丸みを帯びた構造である。後肢は前肢よりも後方に位置しています。 - 胚を清潔な1x PBSに維持し、一対の微細な外科用鉗子を用いて、各後肢の芽を縦方向に切り取る。胚の側面に非常に近い芽を切って、後肢の芽全体を解剖する。残りの胚でこの手順を繰り返します。
- プラスチック製の移送ピペットを使用して、四肢の芽を空の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- ピペットチップを使用して、過剰の1x PBSを除去し、PBSを500 μLの0.5%トリプシン溶液と交換します( 材料表を参照)。四肢の芽をサーモブロック中で37°Cで7分間インキュベートする。
- トリプシン溶液を取り出し、ハンクス平衡塩溶液中の2mg/mLで500μLのコラゲナーゼIV型と交換し( 材料表を参照)、37°Cのサーモブロック中で8分間インキュベートする。
注:トリプシンインキュベーションは外胚葉をわずかに剥離し、コラゲナーゼは中胚葉系細胞を分解する。 - インキュベーション後、できるだけ多くのコラゲナーゼを除去し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1mLの冷たいダルベッコの改変イーグル中高グルコース(DMEM-HG)培地と交換して酵素を失活させます。混合物を穏やかに〜10回ピペットする。
- 細胞を含む懸濁液を70μmのセルストレーナーでろ過し、外胚葉を残します。
注:ろ過はまた、未消化の四肢の芽を除去し、単一細胞の懸濁液を残す。 - 濾過後、懸濁液を再び5〜10回ピペットし、室温で200 x g で5分間遠心分離し、次いで上清を捨てる。
- 10%FBSを添加したDMEM-HG1mlを使用して、余分なコラゲナーゼを洗浄する。懸濁液を200 x g で室温で5分間遠心分離する。
- 培地をピで慎重に廃棄し、チューブの底部の細胞を乱すことなく、10%FBSを添加した1mLの新鮮なDMEM-HGと交換してください。
- 細胞をサーモブロック中で37°Cで1〜1.5時間インキュベートした後、細胞がコンパクトなペレット(再凝集)を形成するのを許す。
注:中胚葉系細胞がペレットを形成している間、四肢外胚葉を得るのが便利である。
3.四肢外胚葉の取得
- セクション2のステップ1〜6を、外胚葉を得るために選択された他の22個のHHニワトリ胚と別々に繰り返す。
注:この目的のための胚の数は、所望のRLの最終数に比例する。2:1の外胚葉-RLの比率が適切である。 - 後肢の芽を得た後、プラスチックピペットを使用して空の微量遠心チューブに移します。過剰の1x PBSを除去し、滅菌1x PBS中の500 μLの0.5%トリプシンと交換する。混合物をサーモブロック中で37°Cで30分間インキュベートする。
- 酵素消化後、四肢の芽を含むトリプシン溶液を滅菌ペトリ皿に移す。
- マイクロピペットを使用して余分なトリプシンをできるだけ除去する;すべての四肢の芽が覆われるまで、FBSの10%を補充した氷冷1x PBSでペトリ皿を浸します。
注:FBSは馬の血清の代わりにすることができます。 - 実体顕微鏡下で四肢の芽を同定する;外胚葉を四肢中胚葉系細胞からわずかに剥離した透明な膜として同定する(図1B)。
- 細かい外科的鉗子の助けを借りて四肢芽の最も近位端を保持し、他の鉗子を使用して外胚葉層を慎重に剥離および分離する。
注:外胚葉の入手は、中胚葉系の細胞が凝集して外胚葉に付着するため、粘着性になるため、困難な場合があります。ペトリ皿の外胚葉のみを維持するために、中胚葉系細胞を常に捨てることが推奨される。 - 外胚葉を氷冷1x PBS-10%FBS溶液で維持する。
注:外胚葉は、再凝集した中胚葉が準備ができていない場合に備えて、4°Cで保存することができます。ただし、ペレットのインキュベーション時間を外胚葉系で調整することが好ましい。
4. 外胚葉系カバー内の中胚葉系細胞の組み立て
注:このためには、中胚葉系細胞の形成されたペレットを含む滅菌1x PBS-10%FBS溶液を含むペトリ皿に空の外胚葉を有することが必要である。
- ペレットが形成された後(セクション2を参照)、ピによってチューブから約600μLの培地を捨てる。
- ペレットをピペットチップを使用して、粉砕または破壊することなく、慎重に底から取り外します。
- ペレットがチューブの底部から完全に剥離したら、チューブを逆さまにして、空の外胚葉を含むペトリ皿にペレットを移します(図1C)。
- 一対の細かい外科用鉗子の助けを借りてペレットの小片を切断し、それをできるだけ外胚葉の近くに置く。
- それが袋であるかのように、外胚葉を外科用鉗子で開き、ペレット片を外胚葉カバーにできるだけしっかりと入れます。必要な数のRLに対してこの手順を繰り返します(図1D)。
注:ペレットの小片を1つずつ切り、外胚葉を満たして1x PBS-10%FBS溶液を清潔に保ちます。ペレットのサイズは、各外胚葉に対応する必要があります。 - 外胚葉と中胚葉を室温で約30分間一緒に治癒させ、胚宿主に移植する。未使用の外胚葉および中胚葉を捨てる。
5. 充填された外胚葉の宿主胚への移植
注:外胚葉を移植する前に、2つの実体顕微鏡をベンチトップに隣り合わせに配置し、1つは胚操作とRL移植用です。もう一つは、充填された外胚葉を胚に移植する準備ができている状態を維持するためである。
- 充填された外胚葉を移植するために所望の卵の数を選択する。
- 鈍い鉗子の端を使って、22個のHH宿主胚の卵殻をタップして窓を開きます。空気膜を特定し、一対の微細な外科用鉗子を使用して、それを完全に除去する。
- 前肢近くの羊膜嚢を開き、胚の右脇腹を露出させる。手順を実行するために必要な金額のみを開きます。
- 前肢の位置に導かれて、タングステン針( 材料表を参照)で2〜3個のソマイトの長さまで創傷掻き傷を行い、出血するまで中胚葉をわずかに損傷する。
- 充填された外胚葉(RL)を雛胚に個別に移し、組換え四肢の基部をソマイト創傷の上に置く。
メモ:RL転送は、プラスチックピペットまたは斜めのスリットナイフで行うことができます。 - 直径0.025mm、長さ0.5~1mmのパラジウム線2本でRLを正しく固定します( 材料表を参照)。RLの基部を創傷に合わせ、RLが宿主胚の側面に付着し、血管化されることを確認する(図1E)。
- 窓をテープで密封し、卵をインキュベーターに戻します。分析のために所望の時点で胚を収集する。
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Representative Results
よくできた組換え四肢の認識
移植後、操作された胚をインキュベーターに戻し、RLが発達するようにした。インキュベーション時間は、実験の要件と相関していた。それにもかかわらず、RLは移植の12時間後に容易に区別することができる。移植が適切であったかどうかを決定するために、RLはドナー胚の中胚葉壁に確実に付着した隆起として観察された(図2A)。それどころか、細胞生存率および/または移植片のいずれかが失敗したかどうかにかかわらず、RLは中胚葉壁から剥離したか、または大まかな形態を示した(図2B)。
組換え四肢の形態学的およびパターニング検査
形態学的検査のために、RLをアルシアンブルー17 で染色し、骨格要素の形成およびそれらのパターニングを観察した。処置中にRLを逃さないようにドナー胚の体幹全体を染色することが推奨される(図3A)。あるいは、RLを透明化する前に、エタノール溶液中の画像が得られ、RLの形態を観察したり、定量測定を行ったりした(図3B)。染色または未染色のRLを薄切し、組織構造を観察したり、細胞型を同定したりした(図3C)。
(A)RLは、ドナー22HHニワトリ胚から得られた外胚葉カバーの内部にドナー22HHヒナミドから中胚葉の四肢芽を組み立てることによって実施した。外胚葉は中胚葉系細胞でしっかりと詰め込まれていた。組み立て後、ぬいぐるみの外胚葉を移し、前のソマイトの傷の上にパラジウム線で固定した。(B)トリプシン処理後に外胚葉が剥離した四肢の芽。(c)ペレットは、空の外胚葉の近くにその形成後に得られ、充填される準備ができていた。(d)中胚葉系細胞で満たされた外胚葉系カバーが示されている。(e)宿主胚中のRLをパラジウム線で固定する工程。RLは前肢の芽の近くの胚の右脇腹に位置していたことに注意してください。p:ペレット。スケール バー = 500 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新しく得られた鶏肉 - 鶏肉組換え四肢。 (a)中胚葉壁に付着した24時間RLを示す。(B) 失敗した 24 時間 RL が表示されます。パラジウム線はRLを固定していないことに注意してください。その結果、RLは中胚葉壁から剥離し、大まかな形態を示した。スケール バー = 500 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:組換え四肢の形態学的解析 (A)6日間のニワトリ-ニワトリRLにおける骨格要素を実証するためのアルシアンブルー染色。(B)アルシアンブルーをクリアする前に、同じRLを(A)に示しました。(c)アルシアンブルー染色およびヘマトキシリンおよびエオジンで染色されたRLの矢状スライス。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
一般に、RLプロトコルは、(1)胚のインキュベーション、(2)外胚葉を埋める四肢中胚葉細胞の取得、(3)外胚葉の取得、(4)外胚葉カバーの内部に中胚葉細胞を組み立てる、および(5)充填された外胚葉の宿主胚への移植の5つのステップに分けることができる。RL 手法の主な制限は、長くて詳細なプロトコルであり、適切に実行するために忍耐を必要とする多くの重要なポイントがあります。プロトコルを正常に完了するには、重要な瞬間を特定する必要があります。中胚葉系細胞の調達中、細胞の完全性および生存率は不可欠である。細胞死は適切なRL発達を妨げる。同様の静脈において、中胚葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を保証するために、正しい外胚葉操作が必要である。外胚葉が詰め込まれるとき、中胚葉系細胞はAERの下の遠位外胚葉にできるだけ近づかなければならない。中胚葉系および外胚葉系の両方の調達にとって、ドナー胚の発生段階も重要である。中胚葉系細胞は、その発達段階に応じて差次的に応答すると考える必要があります。ただし、現像段階は実験要件に応じて自由に選択することができる。それでも、外胚葉の取得を容易にし、細胞の完全性とシグナル伝達を維持するために、22HH期を維持する必要があります。最後に、良好な移植および固定は、胚壁への正しいRL統合およびその発達を確実にするために不可欠である。
Edgar Zwillingは19646年にRLシステムを初めて報告し、その後多くの研究グループがいくつかの興味深い生物学的質問に答えるためにそれを実装しました。RLのプロトコールは、発達中のひよこの四肢の芽を操作する標準的な方法として、Marian Rosらによって長さで以前に記載されており、卵を窓で囲い、翼または脚全体でRLを実行し、再凝集した中胚葉でRLを実行する他の方法を説明している。しかし、Rosの間にはいくつかのバリエーションがあります。らのプロトコルおよびここに記載される本プロトコルは、見出すことができる。それらのプロトコールでは、外胚葉ドナーとしての胚からの四肢芽を、氷冷PBS中でトリプシンと共に〜2時間インキュベートする。外胚葉インキュベーションを開始した後、彼らは直ちに中胚葉ドナーとして胚から四肢芽を取得し、次いで四肢芽を断片化してそれらを消化し、そして手動で外胚葉を除去し、30分間インキュベートした後に中胚葉ペレットを形成した。ここでは、まず、中胚葉系ドナーとして使用する胚から四肢芽を採取し、その後、トリプシン及びコラゲナーゼと共にインキュベートすることにより四肢芽全体を消化する。次いで、外胚葉を濾過によって除去し、ペレットを1〜1.5時間インキュベートする。中胚葉系ペレットを得るためのこの方法の利点は、トリプシンによる処理が無傷の外胚葉を中胚葉から剥離し、コラゲナーゼ処理が中胚葉系細胞を消化することである。したがって、外胚葉系組織を濾過して廃棄することができる。一方、より多くのペレットインキュベーション時間は、それがよりよく圧縮することを可能にし、それは外胚葉が満たされるときに役立つ。2つのプロトコルのもう1つの違いは、Rosらが外胚葉を1つずつ剥がし、ペレットを含むペトリ皿に移したことです。対照的に、すべての外胚葉は解剖され、本プロトコールではペトリ皿に集められる。ペレットをペトリ皿に移して外胚葉を満たす。この方法に従うことにより、外胚葉を移植と同時に調製することができる。他の多くのプロトコルと同様に、RL の実行方法は異なる場合があります。ただし、両方のプロトコルの手順では、操作を成功させるための手法の重要な段階を適切に説明しています。
以前の研究は、解離した偏光帯細胞がRL7、10において中胚葉間にランダムに分散すると形態形成を阻害することを実証した。したがって、中胚葉ペレットを形成する前にZPAから細胞を排除することは任意である。その後、ZPA細胞(またはソニックヘッジホッグ包埋ビーズ)を使用して、RLを誘導してA−P極性8、9、19を発達させることができる。
RL 実験モデルは、さまざまなシナリオに適応できます。組換えは、異なる発生段階または成熟段階(前肢または後肢)からの四肢細胞、3つの四肢軸に沿った他の位置、および解離−再凝集細胞または非解離−断片化中胚葉15を用いて実施することができる。興味深いことに、以前の研究は、RLモデルを用いて、変異型および野生型中胚葉および外胚葉の異なる組み合わせの挙動を研究する13、14、20、21、またはエレクトロポレーションド細胞22を用いて報告している。
四肢の発達が進化的に保存されたプロセスであることを考慮すると、外胚葉源はまた、ニワトリ、ウズラ、アヒル、マウス、またはラットの外胚葉とは異なる場合があり、同じ記載されたプロトコールに従って得ることができる。別の可能性は、種間RLを産生するために中胚葉系、あるいは他の細胞型または供給源さえも変えることである。
結論として、RLは、形態形成、パターニング、細胞間相互作用、細胞遊走、および細胞分化を細胞および分子レベルで研究するための驚異的なモデルである。RLの手順は複数のバリエーションを可能にするため、鶏肢の発生生物学に限定されることなく、多数の生物学的問題にわたる潜在的な適用を可能にします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
図2の画像についてはエステファニア・ガライ=パチェコに、アートワークについてはマリア・ヴァレリア・キマル=モンテス・デ・オカに感謝します。この研究は、JC-Mに授与されたメキシコ国立自治大学(DGAPA)と、JC-Mに授与されたConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [助成金番号1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]によって支援されました。JC M-Lは、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)からポスドクフェローシップを授与されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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