Summary
Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.
Abstract
Zelldifferenzierung ist der fein abgestimmte Prozess der Zellbindung, der zur Bildung verschiedener spezialisierter Zelltypen während der Etablierung von sich entwickelnden Geweben und Organen führt. Dieser Prozess wird im Erwachsenenalter aktiv aufrechterhalten. Die Zelldifferenzierung ist ein fortlaufender Prozess während der Entwicklung und Homöostase von Organen. Das Verständnis der frühen Schritte der Zelldifferenzierung ist unerlässlich, um andere komplexe Prozesse wie die Morphogenese zu kennen. Somit sind rekombinante Hühnergliedmaßen ein experimentelles Modell, das die Untersuchung der Zelldifferenzierung und Mustergenerierung unter embryonalen Mustersignalen ermöglicht. Dieses experimentelle Modell imitiert eine In-vivo-Umgebung ; Es setzt reaggregierte Zellen zu einer ektodermalen Hülle zusammen, die aus einer frühen Gliedmaßenknospe gewonnen wird. Später werden Ektoderme übertragen und in einen Kükenembryorezeptor implantiert, um seine Entwicklung zu ermöglichen. Dieser Assay wurde hauptsächlich verwendet, um mesodermale Gliedmaßenknospenzellen zu bewerten; Es kann jedoch auf andere Stamm- oder Vorläuferzellen aus anderen Organismen angewendet werden.
Introduction
Die Wirbeltierextremität ist ein beeindruckendes Modell zur Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation, des Zelltods, der Musterbildung und der Morphogenese 1,2. Während der Entwicklung treten Gliedmaßen als Ausbuchtungen aus den Zellen aus, die aus dem lateralen Plattenmesoderm1 stammen. Gliedmaßenknospen bestehen aus einem zentralen Kern mesodermaler Zellen, die von einem Ektoderm bedeckt sind. Aus dieser frühen Struktur entsteht ein ganzes und wohlgeformtes Gliedmaß. Nachdem die Gliedmaßenknospe entstanden ist, werden drei Achsen erkannt: (1) die proximo-distale Achse ([PD] Schulter zu den Fingern), (2) die dorso-ventrale Achse ([DV] vom Handrücken bis zur Handfläche) und (3) die vorder-hintere ([AP] Daumen zu Finger). Die proximale-distale Achse hängt vom apikalen ektodermalen Kamm (AER) ab, einem spezialisierten Ektoderm an der distalen Spitze der Gliedmaßenknospe. Die AER wird für das Auswachsen, die Überlebenserhaltung, die Proliferation und den undifferenzierten Zustand der Zellen, die Signale empfangen, benötigt 2,3. Auf der anderen Seite steuert die Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) die anteroposteriore Strukturierung4, während das dorsale und das Ektoderm die dorsoventrale Strukturierungsteuern 7,8. Die Integration dreidimensionaler Muster impliziert ein komplexes Übersprechen zwischen diesen drei Achsen5. Trotz des Verständnisses des molekularen Weges während der Gliedmaßenentwicklung bleiben offene Fragen über die Mechanismen, die die Musterung und das richtige Auswachsen steuern, um eine ganze Extremität zu bilden, unbeantwortet.
Edgar Zwilling entwickelte 1964 das System der rekombinanten Gliedmaßen (RL), um die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen Zellen der Gliedmaßen und dem Ektoderm bei der Entwicklung von Gliedmaßenzu untersuchen 6. Das RL-System setzt das dissoziiert-reaggregierte Gliedmaßenknospen-Mesoderm in das embryonale Gliedmaßen-Ektoderm zusammen, um es in den dorsalen Teil eines Spender-Küken-Embryos zu transplantieren. Die vom Ektoderm bereitgestellten Signale induzieren die Expression von Differenzierungsgenen und Mustergenen auf räumlich-zeitliche Weise und induzieren so die Bildung einer gliedmaßenartigen Struktur, die die Zellprogramme, die während der Gliedmaßenentwicklung auftreten, rekapitulieren kann 7,8,9.
Das RL-Modell ist wertvoll für das Verständnis der Eigenschaften von Gliedmaßenkomponenten und der Wechselwirkung zwischen mesodermalen und ektodermalen Zellen6. Eine RL kann als eine gliedmaßenartige Struktur definiert werden, die durch die experimentelle Zusammenstellung oder Rekombination von Mesodermalzellen der Gliedmaßenknospen innerhalb einer ektodermalen Hülleentsteht 6. Die Morphogenese des RL hängt von den Eigenschaften der mesodermalen Zellen (oder anderer Typen) ab, die auf die ektodermalen Mustersignale reagieren. Einer der Vorteile dieses experimentellen Systems ist seine Vielseitigkeit. Diese Eigenschaft ermöglicht die Bildung von Mehrfachkombinationen durch Variation der Quelle von mesodermalen Zellen, wie Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien, aus verschiedenen Positionen entlang der Extremität oder ganzen (undissoziierten) oder reaggregierten Zellen 7,8,9,10. Ein weiteres Beispiel ist die Fähigkeit, das embryonale Ektoderm von anderen Arten als Hühnern zu erhalten, zum Beispiel Schildkröte11, Wachtel oder Maus12.
In diesem Sinne hilft die RL-Technik, die Entwicklung der Gliedmaßen und die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Gliedmaßen aus evolutionärer Sicht zu untersuchen. Diese Technik hat auch ein großes Potenzial für die Analyse der Fähigkeit verschiedener Quellen von Vorläuferzellen, sich in eine gliedmaßenartige Struktur zu differenzieren, indem die Signale des embryonalen Ektoderms12,13,14 genutzt werden. Im Gegensatz zu In-vitro-Kulturen erlaubt die RL die Bewertung der Differenzierung und des morphogenetischen Potenzials einer Zellpopulation durch Interpretation embryonaler Signale von einem sich entwickelnden Glied 9,15.
In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung einer erfolgreichen RL mit reaggregierten mesodermalen Gliedmaßenknospenzellen bereitgestellt, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird, dieses Protokoll mit verschiedenen Quellen von reaggregierten Zellen oder sogar verschiedenen Ektodermquellen anzupassen.
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Protocol
Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt. Ein schematisches Flussdiagramm der allgemeinen Schritte dieses Protokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.
1. Inkubation von Embryonen und Bestimmung der Lebensfähigkeit
- Befruchtete Hühnereier bei 38 °C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit etwa dreieinhalb Tage lang bebrüten, bis sie das Stadium 22 HH erreichen (nach Hamilton und Hamburger, 1951)16.
HINWEIS: Frisch befruchtete Hühnereier können bis zu einer Woche bei 15 °C gelagert werden.- Um die befruchteten Eier zu bebrüten, legen Sie die Eier senkrecht mit der spitzen Seite nach unten in den befeuchteten Inkubator. Drehen Sie die Eier während der Inkubation, da dies notwendig ist, um zu verhindern, dass der sich entwickelnde Embryo an der Schalenmembran haftet.
HINWEIS: Befruchtete Hühnereier können von lokalen Bauernhöfen bezogen werden. Befruchtete Hühnereier aus Weißem Livorhorn werden im Allgemeinen verwendet, um eine Pigmentierung der Federn in späten Embryonen zu vermeiden. Erwägen Sie, genügend Eier separat zu inkubieren, um drei Strukturen zu erhalten: (1) Mesotermzellen der Gliedmaßen, (2) Ektoderme der Gliedmaßen und (3) Spenderembryonen, um die RL zu transplantieren.
- Um die befruchteten Eier zu bebrüten, legen Sie die Eier senkrecht mit der spitzen Seite nach unten in den befeuchteten Inkubator. Drehen Sie die Eier während der Inkubation, da dies notwendig ist, um zu verhindern, dass der sich entwickelnde Embryo an der Schalenmembran haftet.
- Nach dreieinhalb Tagen Inkubation Eier aus dem Inkubator nehmen, mit 70% Ethanol abtupfen und an der Luft trocknen lassen.
- Identifizieren Sie sich entwickelnde Embryonen, die das Ei verkleben, um die Blutgefäße zu beobachten und den Embryo zu lokalisieren. Verwerfen Sie Eier, die keinen Embryo haben.
HINWEIS: Verteilen Sie an dieser Stelle die Eier, um mesodermale Zellen, Ektoderme und die Wirte für die RL zu erhalten.
2. Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung von Ektodermen
HINWEIS: Bevor Sie mit den Manipulationen beginnen, wird dringend empfohlen, den Arbeitsbereich, die Mikroskope und alle Instrumente durch Abtupfen mit 70% iger Ethanollösung zu desinfizieren.
- Tippen Sie auf das stumpfe Ende der Eierschale mit dem Ende einer stumpfen Pinzette, um ein Fenster zu öffnen, und entfernen Sie etwa 1 cm x 1 cm der Schale mit der Pinzette.
- Eier in einen Plastik- oder Kartonhalter geben und nacheinander unter das Stereomikroskop legen. Identifizieren Sie die Luftmembran und entfernen Sie sie dann, indem Sie ein kleines Loch auswählen, in dem keine Gefäße gefunden werden. Ziehen Sie diesen Bereich mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette.
HINWEIS: Die Luftmembran kann als die weiße und undurchsichtige Membran identifiziert werden, die unmittelbar nach dem Fenstern des Eies beobachtet wurde.- Entfernen Sie jedes kleine Stück Eierschale, das mit dem Embryo in Berührung kommen könnte.
HINWEIS: Überprüfen Sie, ob sich die Embryonen im Stadium 22 HH befinden, bevor Sie das Protokoll einleiten. Embryonen in früheren Stadien können in den Inkubator zurückgebracht werden, nachdem das Eierschalenfenster mit Klebeband versiegelt wurde.
- Entfernen Sie jedes kleine Stück Eierschale, das mit dem Embryo in Berührung kommen könnte.
- Öffnen Sie den Fruchtsack vollständig, indem Sie das Fruchtfleisch mit der feinen chirurgischen Pinzette aufreißen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Amnion kann als transparente Membran identifiziert werden, die den Embryo eng bedeckt und mit Fruchtwasser gefüllt ist. - Entfernen Sie den Embryo vorsichtig aus dem Ei mit einer stumpfen Pinzette und geben Sie ihn dann in eine sterile Petrischale mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) ab. Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Eier. Bedenken Sie, dass nur ~ 8-10 Embryonen ausreichen, um die mesodermalen Zellen zu erhalten.
- Waschen Sie die Embryonen einmal in eiskaltem 1x PBS und ziehen Sie mit Hilfe eines Stereomikroskops (siehe Materialtabelle) alle verbleibenden Membranen zurück. Suchen Sie die Hinterbeinknospen.
HINWEIS: Gliedmaßenknospen sind abgerundete Strukturen, die sich entlang der vorder-hinteren Achse des Embryos als Vorsprünge aus der Flanke befinden. Die Hinterbeine befinden sich mehr posterior als die Vorderbeine. - Pflegen Sie die Embryonen in sauberem 1x PBS und schneiden Sie mit einem Paar feiner chirurgischer Pinzetten jede Hinterbeinknospen in Längsrichtung ab. Schneiden Sie die Knospe sehr nahe an der Flanke des Embryos ab, um die gesamten Hinterbeinknospen zu sezieren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden Embryonen.
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Gliedmaßenknospen in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
- Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um überschüssiges 1x PBS zu entfernen, und ersetzen Sie PBS durch 500 μL 0,5% ige Trypsinlösung (siehe Materialtabelle). Gliedmaßenknospen in einem Thermoblock für 7 min bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die Trypsinlösung und ersetzen Sie sie durch 500 μL Kollagenase Typ IV bei 2 mg/ml in Hanks Balanced Salt Solution (siehe Materialtabelle), dann inkubieren Sie sie in einem Thermoblock bei 37 °C für 8 min.
HINWEIS: Die Trypsinkubation löst die Ektoderme leicht, während Kollagenase mesodermale Zellen disagregiert. - Entfernen Sie nach der Inkubation so viel Kollagenase wie möglich und ersetzen Sie sie durch 1 ml kaltes Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), um die Enzyme zu inaktivieren. Die Mischung vorsichtig ~10 mal pipettieren.
- Filtern Sie die Suspension, die die Zellen enthält, mit einem Zellsieb von 70 μm, um die Ektoderme hinter sich zu lassen.
HINWEIS: Die Filtration entfernt auch alle unverdauten Gliedmaßenknospen und hinterlässt eine Suspension einzelner Zellen. - Nach dem Filtern die Suspension erneut 5-10 Mal pipettieren und bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, dann den Überstand entsorgen.
- Verwenden Sie 1 ml DMEM-HG, ergänzt mit 10% FBS, um die überschüssige Kollagenase zu waschen. Die Suspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Entsorgen Sie das Medium vorsichtig durch Pipettieren und ersetzen Sie es dann durch 1 ml frisches DMEM-HG, ergänzt mit 10% FBS, ohne die Zellen im Boden des Schlauches zu stören.
- Lassen Sie die Zellen ein kompaktes Pellet (Reaggregieren) bilden, nachdem sie für 1-1,5 h bei 37 ° C in einem Thermoblock inkubiert wurden.
HINWEIS: Während mesodermale Zellen das Pellet bilden, ist es bequem, die Ektoderme der Gliedmaßen zu erhalten.
3. Erhalt der Ektoderme der Gliedmaßen
- Wiederholen Sie die Schritte 1-6 aus Abschnitt 2 separat mit den anderen 22 HH-Hühnerembryonen, die ausgewählt wurden, um die Ektoderme zu erhalten.
HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen für diesen Zweck ist proportional zur endgültigen Anzahl der gewünschten RL. Ein Verhältnis von 2:1 Ektodermen-RL ist angemessen. - Nachdem Sie die Hinterbeinknospen erhalten haben, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um sie in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Entfernen Sie überschüssiges 1x PBS und ersetzen Sie es durch 500 μL 0,5% Trypsin in sterilem 1x PBS. Die Mischung für 30 min bei 37 °C in einem Thermoblock inkubieren.
- Nach der enzymatischen Verdauung die Trypsinlösung, die die Gliedmaßenknospen enthält, in eine sterile Petrischale überführen.
- Entfernen Sie das überschüssige Trypsin so weit wie möglich mit einer Mikropipette; Überfluten Sie die Petrischale mit eiskalten 1x PBS, ergänzt mit 10% FBS, bis alle Gliedmaßenknospen bedeckt sind.
HINWEIS: FBS kann durch Pferdeserum ersetzt werden. - Identifizieren Sie die Gliedmaßenknospen unter dem Stereomikroskop; Identifizieren Sie das Ektoderm als eine leicht abgelöste transparente Membran von den mesodermalen Zellen der Gliedmaßen (Abbildung 1B).
- Halten Sie das proximale Ende der Gliedmaßenknospe mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette fest, während Sie die Ektodermschicht vorsichtig mit der anderen Pinzette ablösen und trennen.
HINWEIS: Die Gewinnung der Ektoderme könnte schwierig sein, da mesodermale Zellen verklumpen und an Ektodermen anheften, wodurch sie klebrig werden. Es wird empfohlen, die mesodermalen Zellen ständig zu verwerfen, um nur die Ektoderme in der Petrischale zu erhalten. - Pflegen Sie die Ektoderme in eiskalter 1x PBS-10% FBS-Lösung.
HINWEIS: Ektoderme können bei 4 °C gelagert werden, falls das reaggregierte Mesoderm nicht bereit ist. Es ist jedoch vorzuziehen, die Inkubationszeit des Pellets mit der ektodermalen Gewinnung zu koordinieren.
4. Zusammenstellung mesodermaler Zellen innerhalb der ektodermalen Abdeckung
HINWEIS: Dazu ist es notwendig, die leeren Ektoderme in einer Petrischale mit steriler 1x PBS-10% FBS-Lösung zu haben, die ein gebildetes Pellet aus mesodermalen Zellen enthält.
- Nachdem das Pellet gebildet wurde (siehe Abschnitt 2), entsorgen Sie ~600 μL des Mediums durch Pipettieren aus dem Rohr.
- Lösen Sie das Pellet vorsichtig vom Boden mit einer Pipettenspitze und ohne es zu zerschlagen oder zu zerstören.
- Wenn sich das Pellet vollständig vom Boden des Rohres gelöst hat, drehen Sie das Rohr auf den Kopf, um das Pellet in die Petrischale mit den leeren Ektodermen zu übertragen (Abbildung 1C).
- Schneiden Sie ein kleines Stück des Pellets mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette ab und platzieren Sie es so nah wie möglich am Ektoderm.
- Als wäre es ein Beutel, öffnen Sie das Ektoderm mit der chirurgischen Pinzette und legen Sie das Stück Pellet so fest wie möglich in die ektodermale Abdeckung. Wiederholen Sie diesen Schritt für beliebig viele RLs (Abbildung 1D).
HINWEIS: Schneiden Sie die Stücke des Pellets nacheinander und füllen Sie die Ektoderme, um die 1x PBS-10% FBS-Lösung sauber zu halten. Die Größe des Pellets muss jedem Ektoderm entsprechen. - Lassen Sie das Ektoderm und das Mesoderm bei Raumtemperatur zusammen für ~ 30 Minuten heilen und transplantieren Sie sie dann in den Gedächtniswirt. Verwerfen Sie das nicht verwendete Ektoderm und Mesoderm.
5. Transplantation des gefüllten Ektoderms in einen Wirtsembryo
HINWEIS: Bevor Sie die Ektoderme transplantieren, ordnen Sie zwei Stereomikroskope nebeneinander auf einer Tischplatte an, eines für die Embryonenmanipulation und RL-Transplantation. Die andere ist für die Aufrechterhaltung der gefüllten Ektoderme bereit, in den Embryo zu übertragen.
- Wählen Sie die Anzahl der gewünschten Eier, um die gefüllten Ektoderme zu transplantieren.
- Tippen Sie mit dem Ende einer stumpfen Pinzette auf die Eierschale der 22 HH-Wirtsembryonen, um ein Fenster zu öffnen. Identifizieren Sie die Luftmembran und entfernen Sie sie mit einer feinen chirurgischen Pinzette vollständig.
- Öffnen Sie die Fruchtblase in der Nähe der Vorderbeine, um die rechte Flanke des Embryos freizulegen. Öffnen Sie nur den Betrag, der zum Ausführen des Vorgangs erforderlich ist.
- Führen Sie durch die Position der Vordergliedmaßen ein Wundkratzen mit einer Wolframnadel (siehe Materialtabelle) bis zur Länge von 2-3 Somiten durch und beschädigen Sie das Mesoderm leicht, bis es blutet.
- Übertragen Sie einzeln ein gefülltes Ektoderm (RL) in den Kükenembryo und legen Sie die Basis der rekombinanten Extremität über die Somitwunde.
HINWEIS: Der RL-Transfer kann mit einer Kunststoffpipette oder mit einem abgewinkelten Schlitzmesser erfolgen. - Befestigen Sie die RL korrekt mit zwei Stück Palladiumdraht mit einem Durchmesser von 0,025 mm und einer Länge von 0,5-1 mm (siehe Materialtabelle). Richten Sie die Basis des RL mit der Wunde aus, um sicherzustellen, dass sie an der Flanke des Wirtsembryos befestigt und vaskularisiert wird (Abbildung 1E).
- Versiegeln Sie das Fenster mit Klebeband und bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück. Sammeln Sie die Embryonen zu den gewünschten Zeitpunkten für die Analyse.
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Representative Results
Erkennen einer gut funktionierenden rekombinanten Extremität
Nach der Transplantation wurden die manipulierten Embryonen in den Inkubator zurückgebracht, damit sich die RL entwickeln konnte. Die Inkubationszeit korrelierte mit den Anforderungen des Experiments. Dennoch kann die RL nach 12 h Implantation leicht unterschieden werden. Um festzustellen, ob die Implantation ausreichend war, wurde die RL als Protuberanzung beobachtet, die sicher an der mesodermalen Wand des Spenderembryos befestigt war (Abbildung 2A). Im Gegenteil, unabhängig davon, ob entweder die Zelllebensfähigkeit und/oder das Transplantat versagten, löste sich die RL von der mesodermalen Wand oder zeigte eine grobe Morphologie (Abbildung 2B).
Morphologische und strukturierende Untersuchung rekombinanter Gliedmaßen
Zur morphologischen Untersuchung wurde RL mit Alcian Blue17 gefärbt, um die Bildung von Skelettelementen und deren Musterung zu beobachten. Es wird empfohlen, den gesamten Stamm des Spenderembryos zu färben, um zu vermeiden, dass die RL während des Eingriffs verpasst wird (Abbildung 3A). Alternativ wurden vor dem Löschen des RL Bilder in Ethanollösung erhalten, um die Morphologie des RL zu beobachten oder quantitative Messungen durchzuführen (Abbildung 3B). Gefärbte oder ungefärbte RL wurden geschnitten, um die Gewebestruktur zu beobachten oder den Zelltyp zu identifizieren (Abbildung 3C).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Designs rekombinanter Gliedmaßen (RL). (A) RL wurde durchgeführt, indem Gliedmaßenknospen-Mesoderm von einem Spender-22-HH-Kükenembryo in einer ektodermalen Abdeckung zusammengesetzt wurde, die von einem anderen 22-HH-Kükenembryo-Spender erhalten wurde. Ektoderme waren dicht mit mesodermalen Zellen gefüllt. Nach der Montage wurden ausgestopfte Ektoderme übertragen und mit Palladiumdrähten auf der Wunde eines früheren Somits fixiert. (B) Eine Gliedmaßenknospe mit ihrem Ektoderm, die nach der Behandlung mit Trypsin abgelöst wurde. (C) Das Pellet wurde nach seiner Bildung in der Nähe der leeren Ektoderme gewonnen und kann befüllt werden. (D) Es wird eine ektodermale Abdeckung gezeigt, die mit mesodermalen Zellen gefüllt ist. (E) Fixierung der RL im Wirtsembryo mit Palladiumdrähten. Bitte beachten Sie, dass die RL an der rechten Flanke des Embryos in der Nähe der Vorderbeinknospe positioniert war; P: Pellet. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Frisch gewonnene rekombinante Gliedmaßen Huhn-Huhn. (A) Es wird ein 24 h RL gezeigt, der an der Mesodermwand angebracht ist. (B) Es wird eine erfolglose 24 h RL angezeigt. Bitte beachten Sie, dass der Palladiumdraht die RL nicht fixiert; Folglich löste sich die RL von der mesodermalen Wand und zeigte eine grobe Morphologie. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Morphologische Analyse rekombinanter Gliedmaßen . (A) Alcian blaue Färbung zur Darstellung von Skelettelementen in einem 6-tägigen Hühner-Huhn-RL. (B) Die gleiche RL wurde in (A) gezeigt, bevor das Alcian-Blau gelöscht wurde. (C) Sagittale Scheibe eines RL, gefärbt mit Alcian-Blau-Färbung und mit Hämatoxylin und Eosin. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Im Allgemeinen kann das RL-Protokoll in fünf Schritte unterteilt werden: (1) Embryoneninkubation, (2) Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung der Ektoderme, (3) Gewinnung der Ektoderme, (4) Zusammenstellung mesodermaler Zellen in den ektodermalen Hüllen und (5) Transplantation der gefüllten Ektoderme in die Wirtsembryonen. Die Haupteinschränkung der RL-Technik ist das lange, detaillierte Protokoll, das viele kritische Punkte enthält, die Geduld erfordern, um angemessen zu funktionieren. Um das Protokoll erfolgreich abzuschließen, müssen kritische Momente identifiziert werden. Bei der Beschaffung mesodermaler Zellen sind die Integrität und Lebensfähigkeit der Zellen von entscheidender Bedeutung. Der Zelltod verhindert eine ordnungsgemäße RL-Entwicklung. In ähnlicher Weise ist eine korrekte Ektodermmanipulation notwendig, um die Interaktion zwischen mesodermalen und ektodermalen Zellen zu gewährleisten. Wenn Ektoderme ausgestopft sind, müssen mesodermale Zellen so nah wie möglich am distalen Ektoderm unterhalb der AER sein. Sowohl für die mesodermale als auch für die ektodermale Beschaffung ist auch das Entwicklungsstadium der Spenderembryonen von entscheidender Bedeutung. Es muss berücksichtigt werden, dass die mesodermalen Zellen entsprechend ihrem Entwicklungsstadium unterschiedlich reagieren. Der Entwicklungsstand kann jedoch nach den experimentellen Anforderungen frei gewählt werden. Dennoch muss die 22-HH-Stufe aufrechterhalten werden, um die Gewinnung von Ektodermen zu erleichtern und so die zelluläre Integrität und Signalgebung aufrechtzuerhalten. Schließlich sind eine gute Transplantation und Fixierung unerlässlich, um eine korrekte RL-Integration in die Embryonenwand und deren Entwicklung zu gewährleisten.
Edgar Zwilling berichtete erstmals 1964 über das RL-System6, woraufhin viele Forschungsgruppen es implementierten, um einige interessante biologische Fragen zu beantworten. Das Protokoll der RL wurde zuvor von Marian Ros et al. ausführlich als Standardmethode zur Manipulation der sich entwickelnden Kükengliedmaßenknospe18 beschrieben, die andere Möglichkeiten erklärt, die Eier zu fenstern und RL mit dem ganzen Flügel oder Bein durchzuführen und RL mit reaggregiertem Mesoderm durchzuführen. Allerdings gibt es einige Variationen zwischen den Ros. et al. Protokoll und das hier beschriebene vorliegende Protokoll finden Sie hier. In ihrem Protokoll werden Gliedmaßenknospen aus Embryonen als Ektodermspender mit Trypsin in eiskaltem PBS für ~ 2 h inkubiert. Nach Beginn der Ektoderm-Inkubation erhielten sie sofort Gliedmaßenknospen von Embryonen als Mesoderm-Spender, fragmentierten dann die Gliedmaßenknospen, verdauten sie und entfernten das Ektoderm manuell, um das mesodermale Pellet nach der Inkubation für 30 min zu bilden. Hier wurden zunächst die Gliedmaßenknospen aus Embryonen gewonnen, die als mesodermale Spender verwendet werden sollten, wonach die gesamte Gliedmaßenknospe durch Inkubation mit Trypsin und Kollagenase verdaut wird. Ektoderme werden dann durch Filtration entfernt, und das Pellet wird zwischen 1-1,5 h inkubiert. Der Vorteil dieser Methode zur Gewinnung des mesodermalen Pellets besteht darin, dass die Behandlung mit Trypsin die intakten Ektoderme vom Mesoderm löst, während die Kollagenasebehandlung mesodermale Zellen verdaut. Daher ist es möglich, das ektodermale Gewebe zu filtern und zu verwerfen. Auf der anderen Seite ermöglicht mehr Inkubationszeit des Pellets, dass es besser komprimiert werden kann, was hilft, wenn sich Ektoderme füllen. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Protokollen besteht darin, dass Ros et al. die Ektoderme nacheinander abzogen und in die Petrischale mit dem Pellet übertrugen. Im Gegensatz dazu werden im vorliegenden Protokoll alle Ektoderme seziert und in einer Petrischale gesammelt. Das Pellet wird in die Petrischale überführt, um die Ektoderme zu füllen. Nach dieser Methode können die Ektoderme gleichzeitig mit der Pfropfung hergestellt werden. Wie bei vielen anderen Protokollen kann die Art und Weise, wie RLs ausgeführt werden, variieren. Die Schritte in beiden Protokollen beschreiben jedoch angemessen die kritischen Phasen der Technik, um eine erfolgreiche Manipulation zu erzeugen.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass dissoziierte Polarisationszonenzellen die Morphogenese hemmen, wenn sie zufällig unter Mesoderm in RL 7,10 dispergiert werden. Daher ist es optional, Zellen aus dem ZPA zu eliminieren, bevor das mesodermale Pellet gebildet wird. Später können die ZPA-Zellen (oder in Sonic Hedgehog eingebetteten Perlen) verwendet werden, um die RL dazu zu bringen, eine A-P-Polarität 8,9,19 zu entwickeln.
Das experimentelle RL-Modell ist an eine Vielzahl von Szenarien anpassbar. Die Rekombination kann mit Gliedmaßenzellen aus verschiedenen Entwicklungs- oder reifen (Vorder- oder Hinterbein-) Phasen, anderen Positionen entlang der drei Gliedmaßenachsen und mit dissoziiert-reaggregierten Zellen oder undissoziiert-fragmentiertem Mesoderm15 durchgeführt werden. Interessanterweise haben frühere Studien berichtet, dass das RL-Modell verwendet wurde, um das Verhalten verschiedener Kombinationen von Mutanten- und Wildtyp-Mesoderm und Ektodermen13,14,20,21 oder unter Verwendung von elektropolierten Zellen 22 zu untersuchen.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Entwicklung der Gliedmaßen ein evolutionär konservierter Prozess ist, können die Ektodermquellen auch von den Hühner-, Wachtel-, Enten-, Maus- oder Rattenektodermen abweichen, die nach demselben beschriebenen Protokoll erhalten werden können. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die mesodermale - oder sogar andere Zelltypen oder Quellen - zu verändern, um Interspezies-RL zu erzeugen.
Zusammenfassend ist RL ein phänomenales Modell zur Untersuchung von Morphogenese, Strukturierung, Zell-Zell-Interaktionen, Zellmigration und Zelldifferenzierung auf zellulärer und molekularer Ebene. Da das Verfahren der RL mehrere Variationen zulässt, ermöglicht es potenzielle Anwendungen in zahlreichen biologischen Fragen, ohne auf die Entwicklungsbiologie der Hühnergliedmaßen beschränkt zu sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Estefania Garay-Pacheco für die Bilder in Abbildung 2 und Maria Valeria Chimal-Montes de Oca für das Kunstwerk. Diese Arbeit wurde von der Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [Fördernummern IN211117 und IN213314] und Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [Fördernummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] unterstützt, die JC-M verliehen wurden. JC M-L erhielt ein Postdoc-Stipendium des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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