Summary
Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.
Abstract
A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.
Introduction
O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese 1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral1. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte de trás da mão para a palma) e (3) o anterior-posterior ([AP] polegar para dedo). O eixo proximal-distal depende da crista ectodérmica apical (AER), ectodermia especializada localizada na ponta distal do broto do membro. O AER é necessário para o crescimento, manutenção de sobrevivência, proliferação e o estado indiferenciado das células que recebem sinais 2,3. Por outro lado, a zona de atividade polarizadora (ZPA) controla a padronização anteroposterior4, enquanto a dorsal e o ectoderme controlam a padronização dorsoventral 7,8. A integração da padronização tridimensional implica um cruzamento complexo entre esses três eixos5. Apesar de entender a via molecular durante o desenvolvimento dos membros, perguntas abertas sobre os mecanismos que controlam a padronização e o crescimento adequado para formar um membro inteiro permanecem sem resposta.
Edgar Zwilling desenvolveu o sistema de membro recombinante (RL) em 1964 para estudar as interações entre as células mesenquimais dos membros e o ectoderme no desenvolvimento dos membros6. O sistema RL monta o mesoderm de broto de membro dissociado-reaggregado no ectoderm do membro embrionário para enxertá-lo na parte dorsal de um embrião de filhote de doador. Os sinais fornecidos pelo ectoderme induzem a expressão de genes de diferenciação e genes padronizadores de forma espátula-temporal, induzindo assim a formação de uma estrutura semelhante a um membro que pode recapitular os programas celulares que ocorrem durante o desenvolvimento dos membros 7,8,9.
O modelo RL é valioso para entender as propriedades dos componentes dos membros e a interação entre células mesodérmicas e ectodérmicas6. Uma RL pode ser definida como uma estrutura semelhante a membros criada pela montagem experimental ou recombinação de células mesodérmicas de botões de membro dentro de uma cobertura ectodérmica6. A morfogênese da RL depende das características das células mesodérmicas (ou outros tipos) que responderão aos sinais de padronização ectodérmica. Uma das vantagens deste sistema experimental é sua versatilidade. Essa característica permite a criação de múltiplas combinações variando a fonte de células mesodérmicas, como células de diferentes estágios de desenvolvimento, de diferentes posições ao longo do membro, ou inteiras (não dissocidas) ou células reaggregadas 7,8,9,10. Outro exemplo é a capacidade de obter o ectoderm embrionário de espécies diferentes do frango, por exemplo, tartaruga11, codorna ou rato12.
Nesse sentido, a técnica de RL ajuda a estudar o desenvolvimento dos membros e as interações entre células mesenquimais e ectodérmicas de membros do ponto de vista evolutivo. Essa técnica também tem grande potencial para analisar a capacidade de diferentes fontes de células progenitoras de se diferenciar em uma estrutura semelhante a membros, aproveitando os sinais fornecidos pelo ectoderme embrionário 12,13,14. Em contraste com as culturas in vitro, a RL permite avaliar a diferenciação e o potencial morfogenético de uma população celular, interpretando sinais embrionários a partir de um membro em desenvolvimento 9,15.
Neste protocolo, é fornecido um guia passo-a-passo para a realização de RL bem-sucedida com células de botões mesodérmicos reaggregados, abrindo assim a possibilidade de adaptar este protocolo com diferentes fontes de células reaggregadas ou mesmo diferentes fontes de ectoderme.
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Protocol
Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México). Um fluxograma esquemático das etapas gerais deste protocolo é mostrado na Figura 1A.
1. Incubação de embriões e determinação da viabilidade
- Incubar ovos de galinha fertilizados a 38 °C e 60% de umidade relativa por cerca de três dias e meio até atingirem a etapa de 22 HH (de acordo com Hamilton e Hamburger, 1951)16.
NOTA: Ovos de galinha recém-fertilizados podem ser armazenados a 15 °C por até uma semana.- Para incubar os óvulos fertilizados, coloque os ovos verticalmente com o lado pontudo para baixo na incubadora umidificada. Gire os ovos durante a incubação, pois é necessário evitar que o embrião em desenvolvimento adusca na membrana da casca.
NOTA: Ovos de galinha fertilizados podem ser obtidos em fazendas locais. Ovos de galinha Leghorn Branco Fertilizado são geralmente usados para evitar a pigmentação das penas em embriões tardios. Considere incubar ovos suficientes separadamente para obter três estruturas: (1) células mesodérmicas de membros, (2) ectodermias de membros e (3) embriões doadores para enxertar a RL.
- Para incubar os óvulos fertilizados, coloque os ovos verticalmente com o lado pontudo para baixo na incubadora umidificada. Gire os ovos durante a incubação, pois é necessário evitar que o embrião em desenvolvimento adusca na membrana da casca.
- Após três dias e meio de incubação, retire os ovos da incubadora, cotonete com 70% de etanol e deixe secar o ar.
- Identificar embriões em desenvolvimento candling o ovo para observar os vasos sanguíneos e localizar o embrião. Descarte ovos que não tenham um embrião.
NOTA: Neste ponto, distribua os ovos para obter células mesodérmicas, ectodermias e os hospedeiros para a RL.
2. Obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher ectodermes
NOTA: Antes de iniciar as manipulações, é altamente recomendável desinfetar a área de trabalho, os microscópios e todo o instrumental, limpando com 70% de solução de etanol.
- Bata na extremidade contundente da casca de ovo com a extremidade de um fórceps contundente para abrir uma janela e remova cerca de 1 cm x 1 cm da casca usando os fórceps.
- Transfira os ovos para um suporte de plástico ou caixa e coloquei-os um a um sob o estereóscópio. Identifique a membrana de ar e remova-a escolhendo um pequeno buraco onde não são encontrados vasos. Puxe esta área com o auxílio de fórceps cirúrgicos finos.
NOTA: A membrana de ar pode ser identificada como a membrana branca e opaca observada imediatamente após a janela do ovo.- Remova qualquer pequeno pedaço de casca de ovo que possa entrar em contato com o embrião.
NOTA: Verifique se os embriões estão no estágio de 22 HH antes de iniciar o protocolo. Embriões em estágios anteriores podem ser devolvidos à incubadora após selar a janela da casca de ovo com fita adesiva.
- Remova qualquer pequeno pedaço de casca de ovo que possa entrar em contato com o embrião.
- Abra completamente o saco amniótico rasgando o amnion usando os fórceps cirúrgicos finos (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Amnion pode ser identificado como uma membrana transparente que cobre de perto o embrião e é preenchida com fluido amniótico. - Remova cuidadosamente o embrião do ovo usando um par de fórceps contundentes e, em seguida, transfira para uma placa de Petri estéril contendo solução salina tamponada com fosfato gelado (1x PBS). Repita este passo para os ovos restantes. Considere que apenas ~8-10 embriões são suficientes para obter as células mesodérmicas.
- Lave os embriões uma vez no 1x PBS gelado, e com o auxílio de um estereoscópio (ver Tabela de Materiais), retire quaisquer membranas restantes. Localize os botões de subida.
NOTA: Os botões dos membros são estruturas arredondadas situadas ao longo do eixo anterior-posterior do embrião como saliências do flanco. Os blocos traseiros estão localizados mais posteriormente do que os membros dianteiros. - Mantenha os embriões em 1x PBS limpos, e usando um par de fórceps cirúrgicos finos, corte cada broto de pênpeco traseiro longitudinalmente. Corte o botão bem perto do flanco do embrião para dissecar todos os botões de subida. Repita esta etapa com os demais embriões.
- Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir os botões do membro para um tubo vazio de microcentrifuuge de 1,5 mL.
- Use uma ponta de pipeta para remover qualquer excesso de PBS 1x e substitua o PBS por 500 μL de solução de trippsina de 0,5% (ver Tabela de Materiais). Incubar botões de membro em um termbloco por 7 min a 37 °C.
- Remova a solução de trippsina e substitua-a por 500 μL de colagenase tipo IV a 2 mg/mL em Hanks Balanced Salt Solution (ver Tabela de Materiais), em seguida, incuba-a em um termbloco a 37 °C por 8 min.
NOTA: A incubação de trippsina destaca ligeiramente os ectodermes, enquanto a colagenase desagrega células mesodérmicas. - Após a incubação, remova o máximo de colagem possível e substitua-a por 1 mL de média de glicose média-alta de Águia Modificada (DMEM-HG) de Dulbecco, suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) para inativar as enzimas. Pipeta a mistura suavemente ~10 vezes.
- Filtre a suspensão contendo as células com um coador de células de 70 μm para deixar para trás os ectodermes.
NOTA: A filtragem também removerá quaisquer botões de membro não digdigestos, deixando para trás uma suspensão de células únicas. - Após a filtragem, pipete a suspensão novamente 5-10 vezes e centrífuga a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente, em seguida, descarte o sobrenatante.
- Use 1 ml de DMEM-HG complementado com 10% de FBS para lavar o excesso de colagemnase. Centrifugar a suspensão a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Descarte o meio cuidadosamente por pipetação e substitua-o por 1 mL de DMEM-HG fresco complementado com 10% de FBS sem perturbar as células na parte inferior do tubo.
- Deixe as células formarem uma pelota compacta (reagregar) depois de incuba-las por 1-1,5 h a 37 °C em um termbloco.
NOTA: Enquanto as células mesodérmicas estão formando a pelota, é conveniente obter os ectodermes dos membros.
3. Obtenção dos ectodermes dos membros
- Repita as etapas 1-6 da seção 2 separadamente com os outros 22 embriões de frango HH escolhidos para obter os ectodermes.
NOTA: O número de embriões para este fim é proporcional ao número final da RL desejada. Uma razão de 2:1 ectodermes-RL é apropriada. - Depois de obter os botões de subida traseira, use uma pipeta de plástico para transferi-los para um tubo de microcentrifuuge vazio. Remova qualquer excesso de 1x PBS e substitua-o por 500 μL de trippsina de 0,5% em PBS estéril. Incubar a mistura por 30 min a 37 °C em um termbloco.
- Após a digestão enzimática, transfira a solução de trippsina contendo os botões dos membros em uma placa de Petri estéril.
- Remova o excesso de trippsina o máximo possível usando uma micropipette; inundar a placa de Petri com 1x PBS gelado suplementado com 10% de FBS até que todos os botões de membros estejam cobertos.
NOTA: A FBS pode ser substituída por soro de cavalo. - Identificar os botões do membro sob o estereóscópio; identificar o ectoderme como uma membrana transparente ligeiramente separada das células mesodérmicas do membro (Figura 1B).
- Segure a extremidade mais proximal do broto do membro com o auxílio de fórceps cirúrgicos finos enquanto se desprende cuidadosamente e separe cuidadosamente a camada de ectoderm usando os outros fórceps.
NOTA: A obtenção dos ectodermes pode ser difícil devido ao agrupamento de células mesodérmicas e anexação a ectodermias, fazendo com que elas se tornem pegajosas. Recomenda-se descartar constantemente as células mesodérmicas para manter apenas os ectodermes na placa de Petri. - Mantenha os ectodermes na solução de 1x PBS-10% FBS gelada.
NOTA: Os ectodermes podem ser armazenados a 4 °C caso o mesoderm reaggregado não esteja pronto. No entanto, é preferível coordenar o tempo de incubação da pelota com a obtenção ectodérmica.
4. Montagem de células mesodérmicas dentro da cobertura ectodérmica
NOTA: Para isso, é necessário ter os ectodermes vazios em uma placa de Petri com solução estéril 1x PBS-10% FBS contendo uma pelota formada de células mesodérmicas.
- Depois que a pelota for formada (ver seção 2), descarte ~600 μL do meio do tubo por pipetação.
- Retire cuidadosamente a pelota do fundo usando uma ponta de pipeta e sem esmagá-la ou destruí-la.
- Quando a pelota estiver completamente separada da parte inferior do tubo, gire o tubo de cabeça para baixo para transferir a pelota para a placa de Petri contendo os ectodermes vazios (Figura 1C).
- Corte um pequeno pedaço da pelota com o auxílio de um par de fórceps cirúrgicos finos e coloque-o o mais próximo possível do ectoderm.
- Como se fosse um saco, abra o ectoderm com os fórceps cirúrgicos, e coloque o pedaço de pelota o mais firmemente possível na tampa ectodérmica. Repita esta etapa para quantas RLs desejarem (Figura 1D).
NOTA: Corte as peças da pelota uma a uma e encha os ectodermes para manter limpa a solução 1x PBS-10% FBS. O tamanho da pelota precisa corresponder a cada ectoderm. - Permita que o ectoderm e o mesoderm se curem juntos por ~30 min à temperatura ambiente e depois enxergá-los no hospedeiro do embrião. Descarte o ectoderm e o mesoderm não-ued.
5. Transplante do ectoderm preenchido em um embrião hospedeiro
NOTA: Antes de transplantar os ectodermes, organize dois estereómicros próximos um do outro em um banco, um para manipulação de embriões e enxerto de RL. A outra é para manter os ectodermes preenchidos prontos para transferência para o embrião.
- Selecione o número de ovos desejados para enxertar os ectodermes preenchidos.
- Usando a ponta de um fórceps contundente, bata na casca de ovo dos embriões hospedeiros de 22 HH para abrir uma janela. Identifique a membrana de ar e, usando um par de fórceps cirúrgicos finos, remova-a completamente.
- Abra o saco amniótico perto do membro dianteiro para expor o flanco direito do embrião. Abra apenas a quantidade necessária para realizar o procedimento.
- Guiado pela posição do membro dianteiro, realize arranhões de ferida com uma agulha de tungstênio (ver Tabela de Materiais) até o comprimento de 2-3 somites, danificando ligeiramente o mesoderm até sangrar.
- Transfira individualmente um ectoderm preenchido (RL) para o embrião do filhote e coloque a base do membro recombinante sobre a ferida de somite.
NOTA: A transferência de RL pode ser feita com uma pipeta de plástico ou com uma faca de fenda angular. - Fixar corretamente o RL com duas peças de fio de paládio de 0,025 mm de diâmetro e 0,5-1 mm de comprimento (ver Tabela de Materiais). Alinhe a base da RL com a ferida para garantir que ela seja anexada ao flanco do embrião hospedeiro e vascularizada (Figura 1E).
- Sele a janela com fita adesiva e devolva o ovo para a incubadora. Colete os embriões nos pontos de tempo desejados para análise.
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Representative Results
Reconhecendo um membro recombinante bem executado
Após o enxerto, os embriões manipulados foram devolvidos à incubadora para permitir que a RL se desenvolvesse. O tempo de incubação correlaciona-se com os requisitos do experimento. No entanto, a RL pode ser facilmente distinguida após 12 horas de implantação. Para determinar se a implantação era adequada, a RL foi observada como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador (Figura 2A). Pelo contrário, seja viabilidade celular e/ou o enxerto falhou, a RL foi separada da parede mesodérmica ou apresentou uma morfologia áspera (Figura 2B).
Exame morfológico e padronizado de membros recombinantes
Para o exame morfológico, a RL foi manchada com azul alciano17 para observar a formação de elementos esqueléticos e sua padronização. Recomenda-se manchar todo o tronco do embrião doador para evitar a falta do RL durante o procedimento (Figura 3A). Alternativamente, antes de limpar a RL, foram obtidas imagens na solução de etanol para observar a morfologia da RL ou realizar medições quantitativas (Figura 3B). RL manchada ou não manchada foi fatiada para observar a estrutura tecidual ou identificar o tipo celular (Figura 3C).
Figura 1: A representação esquemática do desenho experimental de membros recombinantes (RL). (A) RL foi realizada pela montagem do mesodermia do broto de membro de um embrião de pintinho de 22 HH dentro de uma cobertura ectodérmica obtida de outro doador de embrião de 22 HH. Os ectodermes estavam bem recheados com células mesodérmicas. Após a montagem, ectodermes recheados foram transferidos e fixados com fios de paládio em cima da ferida de um somite anterior. (B) Um broto de membro com seu ectoderm destacado após o tratamento de trippsina. (C) A pelota foi obtida após sua formação perto dos ectodermes vazios, prontas para serem preenchidas. (D) Uma capa ectodérmica cheia de células mesodérmicas é mostrada. (E) Fixação do RL no embrião hospedeiro com fios de paládio. Observe que a RL foi posicionada no flanco direito do embrião perto do broto de membro dianteiro; p: pelota. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Membros recombinantes de frango-frango recém-obtidos. (A) É mostrado um RL de 24 horas preso à parede de mesoderm. (B) É mostrado um RL de 24 horas sem sucesso. Observe que o fio paládio não está consertando o RL; consequentemente, a RL se desprendeu da parede mesodérmica e apresentou uma morfologia áspera. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise morfológica de membros recombinantes. (A) Coloração azul alciana para demonstrar elementos esqueléticos em um RL de frango-frango de 6 dias. (B) A mesma RL foi mostrada em (A) antes de limpar o azul alciano. (C) Fatia sagital de uma RL manchada com coloração azul alciana e com hematoxilina e eosina. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucesso o protocolo, momentos críticos precisam ser identificados. Durante a aquisição de células mesodérmicas, a integridade e a viabilidade das células são essenciais. A morte celular impedirá o desenvolvimento adequado da RL. Em uma veia semelhante, a manipulação correta do ectoderme é necessária para garantir a interação entre células mesodérmicas e ectodérmicas. Quando os ectodermes são recheados, as células mesodérmicas devem estar o mais próximas possível do ectoderme distal abaixo do AER. Tanto para a aquisição mesodérmica quanto ectodérmica, o estágio de desenvolvimento dos embriões doadores também é crítico. Deve-se considerar que as células mesodérmicas responderão diferencialmente de acordo com seu estágio de desenvolvimento. No entanto, o estágio em desenvolvimento pode ser livremente selecionado de acordo com os requisitos experimentais. Ainda assim, a etapa de 22 HH precisa ser mantida para facilitar a obtenção de ectodermes, mantendo assim a integridade celular e a sinalização. Finalmente, um bom enxerto e fixação são essenciais para garantir a integração correta da RL à parede do embrião e ao seu desenvolvimento.
Edgar Zwilling relatou pela primeira vez o sistema RL em 19646, após o qual muitos grupos de pesquisa o implementaram para responder a várias perguntas biológicas interessantes. O protocolo da RL foi descrito anteriormente em comprimento por Marian Ros et al. como um método padrão para manipular o broto de membro de pintinhoem desenvolvimento 18, o que explica outras maneiras de janelar os ovos e realizar RL com asa ou perna inteiras e realizar RL com mesodermia reaggregada. No entanto, algumas variações entre os Ros. et al. protocolo e o presente protocolo descrito aqui podem ser encontrados. Em seu protocolo, os botões de membros de embriões como doadores de ectoderm são incubados com trippsina em PBS gelado por ~2 h. Depois de iniciar a incubação do ectoderme, eles imediatamente obtiveram botões de membros de embriões como doadores de mesoderme, depois fragmentaram os botões dos membros, digeriram-nos e removeram o ectoderme manualmente para formar a pelota mesodérmica após a incubação por 30 minutos. Aqui, primeiro, os botões de membros foram obtidos de embriões para serem usados como doadores mesodérmicos, após o qual todo o broto do membro é digerido incubando com trippsina e colagemnase. Os ectodermes são então removidos por filtragem, e a pelota é incubada entre 1-1,5 h. A vantagem deste método para obter a pelota mesodérmica é que o tratamento com trippsina desprende os ectodermes intactos do mesoderme enquanto o tratamento de colagenase digere células mesodérmicas. Portanto, é possível filtrar o tecido ectodérmico e descartá-lo. Por outro lado, mais tempo de incubação de pelotas permite que ele compactua melhor, o que ajuda quando os ectodermes enchem. Outra diferença entre os dois protocolos é que Ros et al. descascaram os ectodermes um a um e os transferiram para a placa de Petri contendo a pelota. Em contrapartida, todos os ectodermes são dissecados e coletados em uma placa de Petri no presente protocolo. A pelota é transferida para a placa de Petri para encher os ectodermes. Seguindo este método, os ectodermes podem ser preparados simultaneamente com enxerto. Como acontece com muitos outros protocolos, a forma como as RLs são realizadas pode variar; no entanto, os passos em ambos os protocolos descrevem adequadamente os estágios críticos da técnica para produzir uma manipulação bem sucedida.
Trabalhos anteriores demonstraram que células da zona de polarização dissociadas inibem a morfogênese quando dispersadas aleatoriamente entre o mesoderme na RL 7,10. Assim, é opcional eliminar células do ZPA antes de formar a pelota mesodérmica. Posteriormente, as células ZPA (ou contas incorporadas de ouriço sônico) podem ser usadas para induzir o RL a desenvolver polaridade A-P 8,9,19.
O modelo experimental RL é adaptável a uma variedade de cenários. A recombinação pode ser implementada com células de membros de diferentes estágios de desenvolvimento ou maduro (pré ou retrocesso), outras posições ao longo dos três eixos de membros, e com células dissociadas-reaggregadas ou mesoderme fragmentado não dissociado15. Curiosamente, estudos anteriores relataram usar o modelo RL para estudar o comportamento de diferentes combinações de mesoderme mutante e selvagem e ectodermias 13,14,20,21 ou usando células eletroporadas 22.
Considerando que o desenvolvimento de membros é um processo evolutivamente conservado, as fontes de ectodermia também podem variar de frango, codorna, pato, rato ou ectodermias de ratos podem ser obtidas seguindo o mesmo protocolo descrito. Outra possibilidade é mudar o mesodérmico - ou mesmo outros tipos de células ou fontes para produzir rl interespécies.
Em conclusão, a RL é um modelo fenomenal para estudar morfogênese, padronização, interações célula-células, migração celular e diferenciação celular nos níveis celular e molecular. Como o procedimento de RL permite múltiplas variações, permite aplicações potenciais em inúmeras questões biológicas sem se restringir à biologia do desenvolvimento de membros de galinha.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Estefania Garay-Pacheco pelas imagens da Figura 2 e de Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pela obra de arte. Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L foi o beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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