Summary
Rekombinanta lemmar är en kraftfull experimentell modell som gör det möjligt att studera processen för celldifferentiering och generering av mönster som påverkas av embryonala signaler. Detta protokoll presenterar en detaljerad metod för att generera rekombinanta lemmar med kycklingben-mesodermala celler, anpassningsbara till andra celltyper erhållna från olika organismer.
Abstract
Celldifferentiering är den finjusterade processen för cellengagemang som leder till bildandet av olika specialiserade celltyper under upprättandet av utvecklande vävnader och organ. Denna process upprätthålls aktivt i vuxen ålder. Celldifferentiering är en pågående process under organens utveckling och homeostas. Att förstå de tidiga stegen i celldifferentiering är viktigt för att känna till andra komplexa processer som morfogenes. Således är rekombinanta kycklinglemmar en experimentell modell som möjliggör studier av celldifferentiering och mönstergenerering under embryonala mönstersignaler. Denna experimentella modell imiterar en in vivo-miljö ; den monterar reaggregerade celler i ett ektodermalt lock erhållet från en tidig lemknopp. Senare överförs ektodermer och implanteras i en kycklingembryoreceptor för att möjliggöra dess utveckling. Denna analys användes huvudsakligen för att utvärdera mesodermala lemmar knoppceller; Det kan emellertid appliceras på andra stam- eller stamceller från andra organismer.
Introduction
Ryggradsdjurens lem är en formidabel modell för att studera celldifferentiering, cellproliferation, celldöd, mönsterbildning och morfogenes 1,2. Under utvecklingen framträder lemmar som utbuktningar från cellerna härledda från lateral platta mesoderm1. Limb knoppar består av en central kärna av mesodermala celler täckta av en ectoderm. Från denna tidiga struktur framträder en hel och välformad lem. Efter att lemknoppen uppstår känns tre axlar igen: (1) den proximo-distala axeln ([PD] axel till fingrar), (2) den dorso-ventrala axeln ([DV] från baksidan av handen till handflatan) och (3) den främre-bakre ([AP] tummen till fingret). Den proximala-distala axeln beror på den apikala ektodermala åsen (AER), specialiserad ektoderm belägen vid den distala spetsen av lemknoppen. AER krävs för utväxt, överlevnadsunderhåll, proliferation och det odifferentierade tillståndet hos celler som tar emot signaler 2,3. Å andra sidan kontrollerar zonen för polariserande aktivitet (ZPA) anteroposterior mönstran4, medan dorsal och ektoderm kontrollerar dorsoventral mönstran 7,8. Integration av tredimensionell mönstrade innebär komplex överhörning mellan dessa tre axlar5. Trots att man förstår den molekylära vägen under lemutveckling förblir öppna frågor om mekanismerna som styr mönstrande och korrekt utväxt för att bilda en hel lem obesvarade.
Edgar Zwilling utvecklade det rekombinanta lemsystemet (RL) 1964 för att studera interaktionerna mellan mesenkymala celler i lemmar och ektodermen vid utveckling av lemmar6. RL-systemet monterar den dissocierade-reaggregerade lemknoppen mesoderm i embryonal extremitet ectoderm för att ympa den i dorsala delen av ett donatorchickembryo. Signalerna från ektodermen inducerar uttrycket av differentieringsgener och mönstrande gener på ett spatio-temporalt sätt, vilket inducerar bildandet av en lemliknande struktur som kan rekapitulera cellprogrammen som uppstår under lemutveckling 7,8,9.
RL-modellen är värdefull för att förstå egenskaperna hos extremitetskomponenter och interaktionen mellan mesodermala och ectodermala celler6. En RL kan definieras som en lemliknande struktur som skapas genom att experimentellt montera eller rekombinera extremitetsknoppens mesodermala celler inuti ett ectodermalt lock6. RL: s morfogenes beror på egenskaperna hos de mesodermala cellerna (eller andra typer) som kommer att svara på de ectodermala mönstrade signalerna. En av fördelarna med detta experimentella system är dess mångsidighet. Denna egenskap möjliggör skapandet av flera kombinationer genom att variera källan till mesodermala celler, såsom celler från olika utvecklingsstadier, från olika positioner längs lemmen eller hela (odissocierade) eller reaggregerade celler 7,8,9,10. Ett annat exempel är förmågan att erhålla embryonal ektoderm från andra arter än kyckling, till exempel sköldpadda11, vaktel eller mus12.
I den meningen hjälper RL-tekniken till att studera lemutveckling och interaktionerna mellan lemmar mesenkymala och ektodermala celler ur evolutionär synvinkel. Denna teknik har också stor potential för att analysera förmågan hos olika källor till stamceller att differentiera sig till en lemliknande struktur genom att dra nytta av signalerna från den embryonala ektodermen 12,13,14. I motsats till in vitro-kulturer tillåter RL att utvärdera differentieringen och morfogenetiska potentialen hos en cellpopulation genom att tolka embryonala signaler från en utvecklande lem 9,15.
I detta protokoll tillhandahålls en steg-för-steg-guide för att utföra framgångsrik RL med reaggregerade mesodermala lemknoppceller, vilket öppnar möjligheten att anpassa detta protokoll med olika källor till reaggregerade celler eller till och med olika ektodermkällor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning granskades och godkändes av Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals vid Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexiko). Ett schematiskt flödesschema över de allmänna stegen i detta protokoll visas i figur 1A.
1. Embryoinkubation och bestämning av livskraft
- Inkubera befruktade kycklingägg vid 38 ° C och 60% relativ fuktighet i cirka tre och en halv dag tills de når 22 HH-scenen (enligt Hamilton och Hamburger, 1951)16.
OBS: Nygödslade kycklingägg kan förvaras vid 15 °C i upp till en vecka.- För att inkubera de befruktade äggen, placera äggen vertikalt med den spetsiga sidan ner i den fuktiga inkubatorn. Rotera ägget under inkubation eftersom det är nödvändigt att förhindra att det utvecklande embryot fäster vid skalmembranet.
OBS: Befruktade hönsägg kan erhållas från lokala gårdar. Befruktade vita leghorn kycklingägg används vanligtvis för att undvika pigmentering av fjädrarna i sena embryon. Överväg att inkubera tillräckligt med ägg separat för att erhålla tre strukturer: (1) extremitetsmesemoderla celler, (2) extremitetsektodermer och (3) donatorembryon för att ympa RL.
- För att inkubera de befruktade äggen, placera äggen vertikalt med den spetsiga sidan ner i den fuktiga inkubatorn. Rotera ägget under inkubation eftersom det är nödvändigt att förhindra att det utvecklande embryot fäster vid skalmembranet.
- Efter tre och en halv dagars inkubation, ta bort ägg från inkubatorn, vattpinne med 70% etanol och låt lufttorka.
- Identifiera utvecklande embryon som candling ägget för att observera blodkärlen och lokalisera embryot. Kassera ägg som inte har ett embryo.
OBS: Vid denna tidpunkt distribuera äggen för att erhålla mesodermala celler, ektodermer och värdarna för RL.
2. Erhålla lemmar mesodermala celler för att fylla ektodermer
OBS: Innan manipuleringarna påbörjas rekommenderas det starkt att desinficera arbetsområdet, mikroskopen och allt instrumentellt genom att svabba med 70% etanollösning.
- Knacka på den trubbiga änden av äggskalet med änden av en trubbig pincett för att öppna ett fönster och ta bort ca 1 cm x 1 cm av skalet med hjälp av tången.
- Överför ägg till en plast- eller kartonghållare och placera dem en efter en under stereomikroskopet. Identifiera luftmembranet och ta sedan bort det genom att plocka ett litet hål där inga kärl hittas. Dra detta område med hjälp av fina kirurgiska pincett.
OBS: Luftmembranet kan identifieras som det vita och ogenomskinliga membranet som observeras omedelbart efter att ägget har fönster.- Ta bort någon liten bit äggskal som kan komma i kontakt med embryot.
OBS: Kontrollera att embryona är i 22 HH-stadiet innan du påbörjar protokollet. Embryon i tidigare skeden kan återföras till inkubatorn efter tätning av äggskalfönstret med tejp.
- Ta bort någon liten bit äggskal som kan komma i kontakt med embryot.
- Öppna fostersäcken helt genom att riva upp amnionen med hjälp av de fina kirurgiska tångarna (se Materialtabell).
OBS: Amnion kan identifieras som ett transparent membran som nära täcker embryot och är fyllt med fostervatten. - Ta försiktigt bort embryot från ägget med ett par trubbiga pincett och överför sedan till en steril petriskål som innehåller iskall fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS). Upprepa detta steg för de återstående äggen. Tänk på att endast ~ 8-10 embryon är tillräckliga för att erhålla de mesodermala cellerna.
- Tvätta embryona en gång i iskall 1x PBS, och med hjälp av ett stereomikroskop (se Materialtabell), dra tillbaka eventuella återstående membran. Leta reda på bakbensknopparna.
OBS: Extremitetsknoppar är rundade strukturer belägna längs embryots främre-bakre axel som utsprång från flanken. Bakbenen ligger mer bakom än frambenen. - Håll embryon i ren 1x PBS, och använd ett par fina kirurgiska pincett, klipp varje bakbensknopp i längdriktningen. Skär knoppen mycket nära embryonets flank för att dissekera ut hela bakbensknopparna. Upprepa detta steg med de återstående embryon.
- Använd en plastöverföringspipett för att överföra lemknopparna till ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Använd en pipettspets för att ta bort eventuellt överskott av 1x PBS och ersätt PBS med 500 μL 0,5% trypsinlösning (se Materialtabell). Inkubera lemknoppar i ett termoblock i 7 min vid 37 ° C.
- Ta bort trypsinlösningen och ersätt den med 500 μL kollagenas typ IV vid 2 mg/ml i Hanks Balanced Salt Solution (se materialtabellen) och inkubera den sedan i ett termoblock vid 37 °C i 8 min.
OBS: Trypsininkubation lossnar något ektoderdermerna, medan kollagenas disaggregerar mesodermala celler. - Efter inkubation, ta bort så mycket kollagenas som möjligt och ersätt det med 1 ml kallt Dulbeccos Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) medium kompletterat med 10% fetal bovint serum (FBS) för att inaktivera enzymerna. Pipettera blandningen försiktigt ~ 10 gånger.
- Filtrera suspensionen som innehåller cellerna med en cellsil på 70 μm för att lämna ektodermerna bakom sig.
OBS: Filtrering kommer också att ta bort eventuella osmälta lemknoppar och lämna efter sig en suspension av enstaka celler. - Efter filtrering pipetterar du suspensionen igen 5-10 gånger och centrifugerar vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och kasserar sedan supernatanten.
- Använd 1 ml DMEM-HG kompletterat med 10% FBS för att tvätta överskott av kollagenas. Centrifugera suspensionen vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Kassera mediet försiktigt genom pipettering och ersätt det sedan med 1 ml färsk DMEM-HG kompletterad med 10% FBS utan att störa cellerna i botten av röret.
- Låt cellerna bilda en kompakt pellets (reaggregat) efter inkubation av dem i 1-1,5 h vid 37 °C i ett termoblock.
OBS: Medan mesodermala celler bildar pelletsen är det lämpligt att erhålla lemmarna ektoderdermer.
3. Erhållande av lemmarna ektoderms
- Upprepa steg 1-6 från avsnitt 2 separat med de andra 22 HH-kycklingembryon som valts för att erhålla ektodermerna.
OBS: Antalet embryon för detta ändamål är proportionellt mot det slutliga antalet önskade RL. Ett förhållande på 2:1 ektodermer-RL är lämpligt. - Efter att ha fått bakbensknopparna, använd en plastpipett för att överföra dem till ett tomt mikrocentrifugrör. Ta bort eventuellt överskott av 1x PBS och ersätt det med 500 μL 0,5% trypsin i steril 1x PBS. Inkubera blandningen i 30 min vid 37 °C i ett termoblock.
- Efter den enzymatiska matsmältningen, överför trypsinlösningen som innehåller lemknopparna till en steril petriskål.
- Ta bort överflödigt trypsin så mycket som möjligt med en mikropipett; översvämma petriskålen med iskall 1x PBS kompletterad med 10% FBS tills alla lemknoppar är täckta.
OBS: FBS kan ersättas med hästserum. - Identifiera lemknopparna under stereomikroskopet; identifiera ektodermen som ett något fristående transparent membran från extremitetsmesoderla celler (Figur 1B).
- Håll den mest proximala änden av lemknoppen med hjälp av fina kirurgiska pincett medan du försiktigt lossar och separerar ektodermskiktet med hjälp av de andra pincetterna.
OBS: Att erhålla ektoderdermerna kan vara svårt på grund av mesodermal cellklumpning och fästning vid ektodermer, vilket gör att de blir klibbiga. Det rekommenderas att ständigt kassera de mesodermala cellerna för att endast bibehålla ektoderdermerna i petriskålen. - Behåll ektoderdermerna i iskall 1x PBS-10% FBS-lösning.
OBS: Ektodermer kan förvaras vid 4 °C om den reaggregerade mesodermen inte är klar. Det är emellertid att föredra att samordna pellets inkubationstid med den ectodermala erhållandet.
4. Montering av mesodermala celler inuti det ektodermala locket
OBS: För detta är det nödvändigt att ha de tomma ektodermerna i en petriskål med steril 1x PBS-10% FBS-lösning innehållande en bildad pellets av mesodermala celler.
- Efter att pelletsen har bildats (se avsnitt 2), kassera ~ 600 μL av mediet från röret genom pipettering.
- Lossa försiktigt pelletsen från botten med en pipettspets och utan att krossa eller förstöra den.
- När pelletsen är helt lossnad från botten av röret, vrid röret upp och ner för att överföra pelletsen till petriskålen som innehåller de tomma ektodermerna (Figur 1C).
- Skär en liten bit av pelletsen med hjälp av ett par fina kirurgiska pincett och placera den så nära ektodermen som möjligt.
- Som om det vore en påse, öppna ektodermen med de kirurgiska tångarna och placera pelletsbiten så tätt som möjligt i det ektodermala locket. Upprepa det här steget för så många RLs som önskas (Figur 1D).
OBS: Skär bitarna av pelletsen en efter en och fyll ektoderdermerna för att hålla rent 1x PBS-10% FBS-lösningen. Pelletsens storlek måste motsvara varje ektoderm. - Låt ektodermen och mesodermen läka tillsammans i ~ 30 minuter vid rumstemperatur och ympa dem sedan in i embryovärden. Kassera den oanvända ektodermen och mesodermen.
5. Transplantation av den fyllda ektodermen till ett värdembryo
OBS: Innan du transplanterar ektodermerna, ordna två stereomikroskop bredvid varandra på en bänkskiva, en för embryomanipulation och RL-ympning. Den andra är för att upprätthålla de fyllda ektoderdermerna redo att överföras till embryot.
- Välj antalet önskade ägg för att ympa de fyllda ektoderdermerna.
- Använd änden av en trubbig tång och knacka på äggskalet på de 22 HH-värdembryon för att öppna ett fönster. Identifiera luftmembranet och ta bort det helt med ett par fina kirurgiska pincett.
- Öppna fostersäcken nära frambenet för att exponera embryonets högra flank. Öppna endast det belopp som behövs för att utföra proceduren.
- Styrd av frambenspositionen, utför sårskrapning med en volframnål (se Materialtabell) till längden 2-3 somiter, vilket skadar mesodermen något tills den blöder.
- Överför individuellt en fylld ektoderm (RL) till kycklingembryot och placera basen av den rekombinanta lemmen över somitsåret.
OBS: RL-överföring kan göras med en plastpipett eller med en vinklad slitskniv. - Fäst RL korrekt med två stycken palladiumtråd med en diameter på 0,025 mm och en längd på 0,5-1 mm (se Materialtabell). Rikta in basen av RL med såret för att säkerställa att det kommer att fästas på värdembryots flank och vaskulariseras (Figur 1E).
- Försegla fönstret med tejp och sätt tillbaka ägget till inkubatorn. Samla embryon vid önskade tidpunkter för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Känner igen en väl utförd rekombinant lem
Efter ympning återfördes de manipulerade embryona till inkubatorn för att tillåta RL att utvecklas. Inkubationstiden korrelerade med experimentets krav. Ändå kan RL lätt särskiljas efter 12 timmars implantation. För att avgöra om implantationen var tillräcklig observerades RL som en utskjutning som var säkert fäst vid donatorembryots mesodermala vägg (figur 2A). Tvärtom, oavsett om antingen cellviabiliteten och / eller transplantatet misslyckades, lossnade RL från mesodermalväggen eller presenterade en grov morfologi (figur 2B).
Morfologisk och mönstrande undersökning av rekombinanta lemmar
För morfologisk undersökning färgades RL med Alcian blue17 för att observera bildandet av skelettelement och deras mönstrade. Det rekommenderas att fläcka hela stammen på donatorembryot för att undvika att missa RL under proceduren (Figur 3A). Alternativt, innan RL rensades, erhölls bilder i etanollösning för att observera RL: s morfologi eller utföra kvantitativa mätningar (figur 3B). Färgad eller ofärgad RL skivades för att observera vävnadsstruktur eller identifiera celltyp (figur 3C).
Figur 1: Schematisk representation av den experimentella utformningen av rekombinanta lemmar (RL). (A) RL utfördes genom att montera lemknoppmesoderm från en donator 22 HH kycklingembryo inuti ett ectodermalt lock erhållet från en annan 22 HH chick embryodonator. Ektodermer var tätt fyllda med mesodermala celler. Efter montering överfördes fyllda ektodermer och fixerades med palladiumtrådar ovanpå en tidigare somits sår. (B) En lemknopp med sin ektoderm lossnad efter trypsinbehandling. (C) Pelleten erhölls efter dess bildning nära de tomma ektoderdermerna, redo att fyllas. (D) Ett ectodermalt lock fyllt med mesodermala celler visas. (E) Fixering av RL i värdembryot med palladiumtrådar. Observera att RL placerades på embryots högra flank nära frambensknoppen; p: pellets. Skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Nyfångade kyckling-kycklingrekombinanta lemmar. (A) En 24 h RL fäst vid mesodermväggen visas. (B) En misslyckad 24 h RL visas. Observera att palladiumtråden inte fixerar RL; följaktligen lossnade RL från den mesodermala väggen och presenterade en grov morfologi. Skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Morfologisk analys av rekombinanta lemmar. (A) Alcian blå färgning för att visa skelettelement i en 6-dagars kyckling-kyckling RL. (B) Samma RL visades i (A) innan alcianblått rensades. (C) Sagittal skiva av en RL färgad med Alcian blå färgning och med hematoxylin och eosin. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I allmänhet kan RL-protokollet delas in i fem steg: (1) embryoinkubation, (2) erhållande av extremitetsmesodermala celler för att fylla ektoderdermerna, (3) erhållande av ektodermerna, (4) montering av mesodermala celler inuti ektodermala lock och (5) transplantation av de fyllda ektoderdermerna i värdembryon. Den största begränsningen av RL-tekniken är det långa, detaljerade protokollet, som har många kritiska punkter som kräver tålamod för att fungera på lämpligt sätt. För att framgångsrikt slutföra protokollet måste kritiska stunder identifieras. Under mesodermal cellupphandling är cellernas integritet och livskraft avgörande. Celldöd kommer att förhindra korrekt RL-utveckling. I en liknande ven är korrekt ektodermmanipulation nödvändig för att garantera interaktionen mellan mesodermala och ektodermala celler. När ektodermer fylls måste mesodermala celler vara så nära den distala ektodermen under AER som möjligt. För både mesodermal och ektodermal upphandling är utvecklingsstadiet hos donatorembryon också kritiskt. Det måste beaktas att de mesodermala cellerna kommer att reagera differentiellt beroende på deras utvecklingsstadium. Utvecklingsstadiet kan dock fritt väljas enligt de experimentella kraven. Ändå måste 22 HH-steget bibehållas för att göra det lättare att erhålla ektodermer, vilket bibehåller cellulär integritet och signalering. Slutligen är god ympning och fixering avgörande för att säkerställa korrekt RL-integration till embryoväggen och dess utveckling.
Edgar Zwilling rapporterade först RL-systemet 19646, varefter många forskargrupper implementerade det för att svara på flera intressanta biologiska frågor. Protokollet för RL har tidigare beskrivits i längd av Marian Ros et al. som en standardmetod för att manipulera den utvecklande kycklingbenknoppen18, vilket förklarar andra sätt att fönsterera äggen och utföra RL med hela vingen eller benet och att utföra RL med reaggregerad mesoderm. Vissa variationer mellan Ros. et al. protokoll och det nuvarande protokollet som beskrivs här kan hittas. I deras protokoll inkuberas lemknoppar från embryon som ektodermdonatorer med trypsin i iskall PBS i ~ 2 timmar. Efter att ha initierat ektoderminkubation erhöll de omedelbart lemknoppar från embryon som mesodermdonatorer, fragmenterade sedan lemknopparna, smälte dem och avlägsnade ektodermen manuellt för att bilda den mesodermala pelleten efter inkubation i 30 min. Här erhölls först lemknopparna från embryon som skulle användas som mesodermala givare, varefter hela lemknoppen smälts genom inkubation med trypsin och kollagenas. Ektodermer avlägsnas sedan genom filtrering och pelletsen inkuberas mellan 1-1,5 timmar. Fördelen med denna metod för att erhålla mesodermal pellet är att behandlingen med trypsin lossnar de intakta ektodermerna från mesodermen medan kollagenasbehandlingen smälter mesodermala celler. Därför är det möjligt att filtrera den ektodermala vävnaden och kassera den. Å andra sidan tillåter mer pelletsinkubationstid att komprimera bättre, vilket hjälper till när ektodermer fylls. En annan skillnad mellan de två protokollen är att Ros et al. skalade av ektoderdermerna en efter en och överförde dem till petriskålen som innehöll pelletsen. Däremot dissekeras alla ektodermer och samlas i en petriskål i det nuvarande protokollet. Pelletsen överförs till petriskålen för att fylla ektodermen. Genom att följa denna metod kan ektoderdermerna framställas samtidigt med ympning. Som med många andra protokoll kan hur RLs utförs variera; Stegen i båda protokollen beskriver emellertid på ett adekvat sätt de kritiska stadierna i tekniken för att producera en framgångsrik manipulation.
Tidigare arbete har visat att dissocierade polariserande zonceller hämmar morfogenes när de slumpmässigt sprids bland mesoderm i RL 7,10. Således är det valfritt att eliminera celler från ZPA innan de bildar mesodermal pellet. Senare kan ZPA-cellerna (eller soniska igelkottinbäddade pärlor) användas för att inducera RL att utveckla A-P-polaritet 8,9,19.
Den experimentella RL-modellen kan anpassas till en mängd olika scenarier. Rekombination kan implementeras med lemceller från olika utvecklings- eller mogna (fram- eller bakbens) stadier, andra positioner längs de tre extremitetsaxlarna och med dissocierade reaggregerade celler eller odissocierad fragmenterad mesoderm15. Intressant nog har tidigare studier rapporterat att man använt RL-modellen för att studera beteendet hos olika kombinationer av mutant och vildtyp mesoderm och ektodermer 13,14,20,21 eller med hjälp av elektroporated celler 22.
Med tanke på att lemutveckling är en evolutionärt bevarad process kan ektodermkällorna också variera från kyckling,vaktel, anka, mus eller råtta ectoderms kan erhållas enligt samma beskrivna protokoll. En annan möjlighet är att ändra mesodermal - eller till och med andra celltyper eller källor för att producera interspecies RL.
Sammanfattningsvis är RL en fenomenal modell för att studera morfogenes, mönster, cell-cellinteraktioner, cellmigration och celldifferentiering på cellulär och molekylär nivå. Eftersom förfarandet för RL tillåter flera variationer, tillåter det potentiella tillämpningar över många biologiska frågor utan att vara begränsad till kyckling-lem utvecklingsbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Estefania Garay-Pacheco för bilder i figur 2 och Maria Valeria Chimal-Montes de Oca för konstverk. Detta arbete stöddes av Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [bidragsnummer IN211117 och IN213314] och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [bidragsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] som tilldelades JC-M. JC M-L var mottagare av ett postdoktoralt stipendium från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
