Summary
Rekombinant uzuvlar, hücre farklılaşma sürecini ve embriyonik sinyallerin etkisi altında kalıpların üretilmesini incelemeye izin veren güçlü bir deneysel modeldir. Bu protokol, farklı organizmalardan elde edilen diğer hücre tiplerine uyarlanabilen, tavuk ekstremite-mezodermal hücrelere sahip rekombinant uzuvlar üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Abstract
Hücre farklılaşması, gelişmekte olan doku ve organların kurulması sırasında farklı uzmanlaşmış hücre tiplerinin oluşumuna yol açan ince ayarlı hücre bağlılığı sürecidir. Bu süreç yetişkinlikte aktif olarak sürdürülür. Hücre farklılaşması, organların gelişimi ve homeostazı sırasında devam eden bir süreçtir. Hücre farklılaşmasının erken adımlarını anlamak, morfogenez gibi diğer karmaşık süreçleri bilmek için gereklidir. Bu nedenle, rekombinant tavuk uzuvları, embriyonik modelleme sinyalleri altında hücre farklılaşması ve desen üretiminin incelenmesine izin veren deneysel bir modeldir. Bu deneysel model in vivo bir ortamı taklit eder; yeniden toplanmış hücreleri, erken bir ekstremite tomurcuğundan elde edilen ektodermal bir örtüye birleştirir. Daha sonra, ektodermler, gelişimine izin vermek için bir civciv embriyo reseptörüne transfer edilir ve implante edilir. Bu tahlil esas olarak mezodermal ekstremite tomurcuk hücrelerini değerlendirmek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, diğer organizmalardan diğer kök veya progenitör hücrelere uygulanabilir.
Introduction
Omurgalı uzuv, hücre farklılaşmasını, hücre çoğalmasını, hücre ölümünü, desen oluşumunu ve morfogeneziincelemek için zorlu bir modeldir 1,2. Gelişim sırasında, uzuvlar lateral plaka mezoderm1'den türetilen hücrelerden şişkinlikler olarak ortaya çıkar. Ekstremite tomurcukları, bir ektoderm tarafından kaplanmış mezodermal hücrelerin merkezi bir çekirdeğinden oluşur. Bu erken yapıdan, bütün ve iyi biçimlendirilmiş bir uzuv ortaya çıkar. Ekstremite tomurcuğu ortaya çıktıktan sonra, üç eksen tanınır: (1) proksimo-distal eksen ([PD] omuzdan parmaklara), (2) dorso-ventral eksen ([DV] elin arkasından avuç içine kadar) ve (3) anterior-posterior ([AP] başparmak parmağına). Proksimal distal eksen, ekstremite tomurcuğunun distal ucunda bulunan apikal ektodermal sırta (AER), uzmanlaşmış ektoderme bağlıdır. AER, büyüme, hayatta kalma bakımı, proliferasyon ve sinyal alan hücrelerin farklılaşmamış durumuiçin gereklidir 2,3. Öte yandan, polarize edici aktivite bölgesi (ZPA) anteroposterior paternleme4'ü kontrol ederken, dorsal ve ektoderm dorsoventral desenleme 7,8'i kontrol eder. Üç boyutlu modellemenin entegrasyonu, bu üç eksen arasındaki karmaşık çapraz konuşmayı ima eder5. Uzuv gelişimi sırasında moleküler yolun anlaşılmasına rağmen, bütün bir uzuv oluşturmak için modellemeyi ve uygun büyümeyi kontrol eden mekanizmalar hakkındaki açık sorular cevapsız kalmaktadır.
Edgar Zwilling, gelişmekte olan uzuvlarda ekstremite mezenkimal hücreleri ve ektoderm arasındaki etkileşimleri incelemek için 1964 yılında rekombinant uzuv (RL) sistemini geliştirdi6. RL sistemi, ayrışmış-yeniden agregaye edilmiş ekstremite tomurcuk mezodermini embriyonik ekstremite ektodermine monte ederek donör civciv embriyosunun dorsal kısmına greft eder. Ektoderm tarafından sağlanan sinyaller, farklılaşma genlerinin ve modelleme genlerinin uzay-zamansal bir şekilde ekspresyonunu indükler, böylece uzuv gelişimi sırasında meydana gelen hücre programlarını özetleyebilen uzuv benzeri bir yapının oluşumunu indükler 7,8,9.
RL modeli, ekstremite bileşenlerinin özelliklerini ve mezodermal ve ektodermal hücreler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir6. Bir RL, ekstremite tomurcuk mezodermal hücrelerinin ektodermalbir örtü 6 içinde deneysel olarak birleştirilmesi veya yeniden birleştirilmesiyle oluşturulan uzuv benzeri bir yapı olarak tanımlanabilir. RL'nin morfogenezi, ektodermal modelleme sinyallerine cevap verecek mezodermal hücrelerin (veya diğer tiplerin) özelliklerine bağlıdır. Bu deneysel sistemin avantajlarından biri çok yönlülüğüdür. Bu özellik, farklı gelişim aşamalarından hücreler, uzuv boyunca farklı konumlardan veya bütün (ayrışmamış) veya yeniden toplanmış hücreler 7,8,9,10 gibi mezodermal hücrelerin kaynağını değiştirerek çoklu kombinasyonların oluşturulmasına izin verir. Başka bir örnek, embriyonik ektodermi tavuk dışındaki türlerden, örneğin kaplumbağa11, bıldırcın veya fare12'den elde etme yeteneğidir.
Bu anlamda, RL tekniği uzuv gelişimini ve uzuv mezenkimal ve ektodermal hücreleri arasındaki etkileşimleri evrimsel bir bakış açısıyla incelemeye yardımcı olur. Bu teknik aynı zamanda farklı progenitör hücre kaynaklarının, embriyonik ektoderm12,13,14 tarafından sağlanan sinyallerden yararlanarak uzuv benzeri bir yapıya farklılaşma yeteneğini analiz etmek için büyük bir potansiyele sahiptir. İn vitro kültürlerin aksine, RL, gelişmekte olan bir uzuvdan gelen embriyonik sinyalleri yorumlayarak bir hücre popülasyonunun farklılaşmasını ve morfogenetik potansiyelini değerlendirmeye izin verir 9,15.
Bu protokolde, yeniden toplanmış mezodermal ekstremite tomurcuk hücreleri ile başarılı RL gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlanmıştır, böylece bu protokolü farklı yeniden topaklanmış hücre kaynakları veya hatta farklı ektoderm kaynakları ile uyarlama imkanı açılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México'nun (UNAM, Mexico City, Meksika) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolün genel adımlarının şematik bir akış şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
1. Embriyo inkübasyonu ve canlılığın belirlenmesi
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 ° C'de ve% 60 bağıl nemde, 22 HH aşamasına ulaşana kadar yaklaşık üç buçuk gün boyunca inkübe edin (Hamilton ve Hamburger, 1951'e göre)16.
NOT: Taze döllenmiş tavuk yumurtası 15 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.- Döllenmiş yumurtaları inkübe etmek için, yumurtaları sivri uçlu tarafı aşağı doğru nemlendirilmiş inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Kuluçka sırasında yumurtaları döndürün, çünkü gelişmekte olan embriyonun kabuk zarına yapışmasını önlemek için gereklidir.
NOT: Döllenmiş tavuk yumurtaları yerel çiftliklerden elde edilebilir. Döllenmiş Beyaz Leghorn tavuk yumurtası genellikle geç embriyolarda tüylerin pigmentasyonunu önlemek için kullanılır. Üç yapı elde etmek için yeterli yumurtayı ayrı ayrı inkübe etmeyi düşünün: (1) uzuv mezodermal hücreleri, (2) uzuv ektodermleri ve (3) RL'yi aşılamak için donör embriyolar.
- Döllenmiş yumurtaları inkübe etmek için, yumurtaları sivri uçlu tarafı aşağı doğru nemlendirilmiş inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Kuluçka sırasında yumurtaları döndürün, çünkü gelişmekte olan embriyonun kabuk zarına yapışmasını önlemek için gereklidir.
- Üç buçuk günlük inkübasyondan sonra, kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın,% 70 etanol ile silin ve havanın kurumasına izin verin.
- Kan damarlarını gözlemlemek ve embriyoyu bulmak için yumurtayı konserve eden gelişmekte olan embriyoları tanımlayın. Embriyosu olmayan yumurtaları atın.
NOT: Bu noktada, mezodermal hücreler, ektodermler ve RL için konakçılar elde etmek için yumurtaları dağıtın.
2. Ektodermleri doldurmak için ekstremite mezodermal hücrelerinin elde edilmesi
NOT: Manipülasyonları başlatmadan önce, çalışma alanının, mikroskopların ve tüm enstrümantallerin% 70 etanol çözeltisi ile süpürülerek dezenfekte edilmesi şiddetle tavsiye edilir.
- Bir pencere açmak için yumurta kabuğunun künt ucuna künt forseps ucu ile dokunun ve forsepsleri kullanarak kabuğun yaklaşık 1 cm x 1 cm'sini çıkarın.
- Yumurtaları plastik veya karton bir tutucuya aktarın ve stereomikroskop altında birer birer yerleştirin. Hava membranını tanımlayın ve ardından hiçbir damarın bulunmadığı küçük bir delik açarak çıkarın. Bu bölgeyi ince cerrahi forseps yardımıyla çekin.
NOT: Hava membranı, yumurtanın pencerelenmesinden hemen sonra gözlenen beyaz ve opak membran olarak tanımlanabilir.- Embriyo ile temas edebilecek küçük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın.
NOT: Protokolü başlatmadan önce embriyoların 22 HH aşamasında olduğunu doğrulayın. Daha erken aşamalardaki embriyolar, yumurta kabuğu penceresini bantla kapattıktan sonra inkübatöre geri gönderilebilir.
- Embriyo ile temas edebilecek küçük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın.
- İnce cerrahi forseps kullanarak amniyonun yırtılarak açılmasını sağlayarak amniyotik kesesi tamamen açın (bkz.
NOT: Amniyon, embriyoyu yakından kaplayan ve amniyotik sıvı ile doldurulmuş şeffaf bir zar olarak tanımlanabilir. - Bir çift künt forseps kullanarak embriyoyu yumurtadan dikkatlice çıkarın ve daha sonra buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin çözeltisi (1x PBS) içeren steril bir Petri kabına aktarın. Kalan yumurtalar için bu adımı tekrarlayın. Mezodermal hücreleri elde etmek için sadece ~ 8-10 embriyonun yeterli olduğunu düşünün.
- Embriyoları buz gibi soğuk 1x PBS'de bir kez yıkayın ve bir stereomikroskop yardımıyla ( Malzeme Tablosuna bakınız), kalan zarları geri çekin. Arka bacak tomurcuklarını bulun.
NOT: Ekstremite tomurcukları, embriyonun ön-arka ekseni boyunca kanattan çıkıntılar halinde yer alan yuvarlak yapılardır. Arka bacaklarda ön ayaklardan daha posterioral olarak bulunur. - Embriyoları temiz 1x PBS'de tutun ve bir çift ince cerrahi forseps kullanarak, her bir arka bacak tomurcuğu uzunlamasına kesin. Tüm arka bacak tomurcuklarını incelemek için tomurcuğu embriyonun yanına çok yakın kesin. Bu adımı kalan embriyolarla tekrarlayın.
- Uzuv tomurcuklarını boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın.
- 1x PBS'nin fazlalığını gidermek için bir pipet ucu kullanın ve PBS'yi 500 μL'lik %0,5 tripsin çözeltisi ile değiştirin (bkz. Uzuv tomurcuklarını bir termoblokta 37 ° C'de 7 dakika boyunca inkübe edin.
- Tripsin çözeltisini çıkarın ve Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde 2 mg / mL'de 500 μL kollajenaz tip IV ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından 8 dakika boyunca 37 ° C'de bir termoblokta inkübe edin.
NOT: Tripsin inkübasyonu ektodermleri hafifçe ayırırken, kollajenaz mezodermal hücreleri ayrıştırır. - Kuluçkadan sonra, mümkün olduğunca fazla kollajenaz çıkarın ve enzimleri inaktive etmek için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta-yüksek glikoz (DMEM-HG) ortamı ile değiştirin. Karışımı hafifçe ~ 10 kez pipetleyin.
- Hücreleri içeren süspansiyonu, ektodermleri geride bırakmak için 70 μm'lik bir hücre süzgeci ile filtreleyin.
NOT: Filtreleme ayrıca sindirilmemiş uzuv tomurcuklarını da giderecek ve arkasında tek hücrelerin süspansiyonunu bırakacaktır. - Filtrelemeden sonra, süspansiyonu tekrar 5-10 kez pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yapın, ardından süpernatanı atın.
- Fazla kollajenazı yıkamak için% 10 FBS ile desteklenmiş 1 ml DMEM-HG kullanın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
- Pipetleme ile ortamı dikkatlice atın ve daha sonra tüpün altındaki hücreleri rahatsız etmeden% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL taze DMEM-HG ile değiştirin.
- Hücrelerin bir termoblokta 37 ° C'de 1-1.5 saat boyunca inkübe edildikten sonra kompakt bir pelet (yeniden agrega) oluşturmasına izin verin.
NOT: Mezodermal hücreler peleti oluştururken, ekstremite ektodermlerinin elde edilmesi uygundur.
3. Ekstremite ektodermlerinin elde edilmesi
- Bölüm 2'deki 1-6 arasındaki adımları, ektodermleri elde etmek için seçilen diğer 22 HH tavuk embriyosu ile ayrı ayrı tekrarlayın.
NOT: Bu amaçla embriyo sayısı, istenen RL'nin son sayısı ile orantılıdır. 2:1 ektoderm-RL oranı uygundur. - Arka bacak tomurcuklarını elde ettikten sonra, bunları boş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Fazla 1x PBS'yi çıkarın ve steril 1x PBS'de 500 μL% 0,5 tripsin ile değiştirin. Karışımı bir termoblok içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Enzimatik sindirimden sonra, uzuv tomurcuklarını içeren tripsin çözeltisini steril bir Petri kabına aktarın.
- Fazla tripsini bir mikropipet kullanarak mümkün olduğunca çıkarın; Petri kabını, tüm uzuv tomurcukları kaplanana kadar FBS'nin% 10'u ile desteklenmiş buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurun.
NOT: FBS, at serumu ile değiştirilebilir. - Stereomikroskop altında uzuv tomurcuklarını tanımlayın; ektodermi, ekstremite mezodermal hücrelerinden hafifçe ayrılmış şeffaf bir membran olarak tanımlayın (Şekil 1B).
- Ekstremite tomurcuğunun en proksimal ucunu ince cerrahi forseps yardımıyla tutarken, diğer forsepsleri kullanarak ektoderm tabakasını dikkatlice ayırın ve ayırın.
NOT: Ektodermlerin elde edilmesi, mezodermal hücre kümelenmesi ve ektodermlere bağlanması nedeniyle zor olabilir, böylece yapışkan hale gelmelerine neden olabilir. Petri kabındaki sadece ektodermleri korumak için mezodermal hücrelerin sürekli olarak atılması önerilir. - Ektodermleri buz gibi soğuk 1x PBS-%10 FBS çözeltisinde tutun.
NOT: Ektodermler, yeniden toplanan mezodermin hazır olmaması durumunda 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, peletin kuluçka süresini ektodermal elde etme ile koordine etmek tercih edilir.
4. Mezodermal hücrelerin ektodermal kapak içine monte edilmesi
NOT: Bunun için, boş ektodermlerin, oluşturulmuş bir mezodermal hücre peleti içeren steril 1x PBS-% 10 FBS çözeltisi içeren bir Petri kabında bulunması gerekir.
- Pelet oluşturulduktan sonra (bakınız bölüm 2), pipetle pipetle ortamın ~600 μL'sini tüpten atın.
- Pelet'i bir pipet ucu kullanarak ve parçalamadan veya tahrip etmeden alttan dikkatlice ayırın.
- Pelet tüpün dibinden tamamen ayrıldığında, peleti boş ektodermleri içeren Petri kabına aktarmak için tüpü baş aşağı çevirin (Şekil 1C).
- Bir çift ince cerrahi forseps yardımıyla peletin küçük bir parçasını kesin ve ektoderme mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
- Bir torbaymış gibi, ektodermi cerrahi forsepslerle açın ve pelet parçasını ektodermal kapağa mümkün olduğunca sıkı bir şekilde yerleştirin. Bu adımı istediğiniz kadar RL için yineleyin (Şekil 1D).
NOT: Pelet parçalarını birer birer kesin ve 1x PBS-%10 FBS çözeltisini temiz tutmak için ektodermleri doldurun. Peletin büyüklüğünün her ektoderme karşılık gelmesi gerekir. - Ektoderm ve mezodermin oda sıcaklığında ~ 30 dakika boyunca birlikte iyileşmesine izin verin ve daha sonra embriyo konağına greftleyin. Kullanılmayan ektoderm ve mezodermi atın.
5. Doldurulmuş ektodermin konakçı embriyoya nakli
NOT: Ektodermleri nakletmeden önce, biri embriyo manipülasyonu ve RL aşılaması için olmak üzere bir tezgah üzerinde yan yana iki stereomikroskop yerleştirin. Diğeri ise doldurulmuş ektodermleri embriyoya transfer edilmeye hazır tutmak içindir.
- Doldurulmuş ektodermleri aşılamak için istenen yumurta sayısını seçin.
- Künt forsepslerin ucunu kullanarak, bir pencere açmak için 22 HH konakçı embriyonun yumurta kabuğuna dokunun. Hava zarını tanımlayın ve bir çift ince cerrahi forseps kullanarak tamamen çıkarın.
- Embriyonun sağ kanadını ortaya çıkarmak için ön ayağın yakınındaki amniyotik kesesi açın. Yalnızca prosedürü gerçekleştirmek için gereken miktarı açın.
- Ön ayak pozisyonu tarafından yönlendirilerek, bir tungsten iğne ile yara tırmalama yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2-3 somit uzunluğunda, kanayana kadar mezoderme hafifçe zarar verin.
- Bireysel olarak doldurulmuş bir ektodermi (RL) civciv embriyosuna aktarın ve rekombinant ekstremitenin tabanını somit yarasının üzerine yerleştirin.
NOT: RL transferi plastik pipetle veya açılı yarık bıçakla yapılabilir. - RL'yi 0,025 mm çapında ve 0,5-1 mm uzunluğunda iki parça paladyum tel ile doğru şekilde sabitleyin (bkz. Konakçı embriyonun kanadına tutturulmasını ve vaskülarize edilmesini sağlamak için RL'nin tabanını yara ile hizalayın (Şekil 1E).
- Pencereyi bantla kapatın ve yumurtayı inkübatöre geri koyun. Embriyoları analiz için istenen zaman noktalarında toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İyi performans gösteren bir rekombinant uzuvun tanınması
Aşılamadan sonra, manipüle edilen embriyolar, RL'nin gelişmesine izin vermek için inkübatöre geri gönderildi. Kuluçka süresi, deneyin gereklilikleri ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, RL implantasyonun 12 saatinden sonra kolayca ayırt edilebilir. İmplantasyonun yeterli olup olmadığını belirlemek için RL, donör embriyonun mezodermal duvarına güvenli bir şekilde tutturulmuş bir çıkıntı olarak gözlendi (Şekil 2A). Aksine, hücre canlılığı ve/veya greft başarısız olsa da, RL mezodermal duvardan ayrıldı veya kaba bir morfoloji sundu (Şekil 2B).
Rekombinant ekstremitelerin morfolojik ve desenleme incelemesi
Morfolojik inceleme için RL, iskelet elemanlarının oluşumunu ve desenlerini gözlemlemek için Alcian mavisi17 ile boyandı. İşlem sırasında RL'nin kaçırılmaması için donör embriyonun tüm gövdesinin boyanması önerilir (Şekil 3A). Alternatif olarak, RL'yi temizlemeden önce, RL'nin morfolojisini gözlemlemek veya nicel ölçümler yapmak için etanol çözeltisindeki görüntüler elde edildi (Şekil 3B). Lekeli veya lekesiz RL, doku yapısını gözlemlemek veya hücre tipini tanımlamak için dilimlendi (Şekil 3C).
Şekil 1: Rekombinant uzuvların (RL) deneysel tasarımının şematik gösterimi. (A) RL, başka bir 22 HH civciv embriyosu donöründen elde edilen bir ektodermal örtü içinde bir donör 22 HH civciv embriyosundan uzuv tomurcuk mezoderminin birleştirilmesiyle gerçekleştirildi. Ektodermler mezodermal hücrelerle sıkıca dolduruldu. Montajdan sonra, doldurulmuş ektodermler transfer edildi ve önceki bir somit yarasının üzerine paladyum telleri ile sabitlendi. (B) Tripsin tedavisinden sonra ektodermi ayrılan bir uzuv tomurcuğu. (C) Pelet, doldurulmaya hazır boş ektodermlere yakın bir yerde oluştuktan sonra elde edilmiştir. (D) Mezodermal hücrelerle dolu ektodermal bir örtü gösterilmiştir. (E) Konakçı embriyodaki RL'nin paladyum telleri ile sabitlenmesi. RL'nin embriyonun sağ kanadında, ön ayak tomurcuğunun yakınında konumlandırıldığını lütfen unutmayın; p: pelet. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Taze elde edilmiş tavuk-tavuk rekombinant uzuvları. (A) Mezoderm duvarına tutturulmuş 24 saatlik bir RL gösterilir. (B) Başarısız bir 24 saat RL gösterilir. Paladyum telinin RL'yi sabitlemediğini lütfen unutmayın; Sonuç olarak, RL mezodermal duvardan ayrıldı ve kaba bir morfoloji sundu. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Rekombinant uzuvların morfolojik analizi . (A) 6 günlük tavuk-tavuk RL'sinde iskelet elemanlarını göstermek için Alcian mavisi boyama. (B) Aynı RL, Alcian mavisini temizlemeden önce (A) da gösterilmiştir. (C) Alcian mavisi boyaması ve hematoksilin ve eozin ile boyanmış bir RL'nin Sagital dilimi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genel olarak, RL protokolü beş adıma ayrılabilir: (1) embriyo inkübasyonu, (2) ektodermleri doldurmak için uzuv mezodermal hücrelerinin elde edilmesi, (3) ektodermlerin elde edilmesi, (4) mezodermal hücrelerin ektodermal kapakların içine monte edilmesi ve (5) doldurulmuş ektodermlerin konakçı embriyolara nakli. RL tekniğinin en büyük sınırlaması, uygun şekilde performans göstermek için sabır gerektiren birçok kritik noktaya sahip olan uzun, ayrıntılı protokoldür. Protokolü başarıyla tamamlamak için kritik anların belirlenmesi gerekir. Mezodermal hücre temini sırasında, hücrelerin bütünlüğü ve canlılığı esastır. Hücre ölümü uygun RL gelişimini önleyecektir. Benzer bir damarda, mezodermal ve ektodermal hücreler arasındaki etkileşimi garanti etmek için doğru ektoderm manipülasyonu gereklidir. Ektodermler doldurulduğunda, mezodermal hücreler AER'nin altındaki distal ektoderme mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Hem mezodermal hem de ektodermal tedarik için, donör embriyoların gelişim aşaması da kritiktir. Mezodermal hücrelerin gelişim evrelerine göre farklı tepki vereceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, gelişim aşaması deneysel gereksinimlere göre serbestçe seçilebilir. Yine de, ektodermlerin elde edilmesini kolaylaştırmak için 22 HH aşamasının sürdürülmesi gerekir, böylece hücresel bütünlüğü ve sinyalizasyonu korur. Son olarak, embriyo duvarına doğru RL entegrasyonunu ve gelişimini sağlamak için iyi aşılama ve sabitleme şarttır.
Edgar Zwilling, RL sistemini ilk olarak 19646'da bildirdi, daha sonra birçok araştırma grubu birkaç ilginç biyolojik soruyu cevaplamak için uyguladı. RL protokolü daha önce Marian Ros ve ark. tarafından gelişmekte olan civciv uzuv tomurcuğu18'i manipüle etmek için standart bir yöntem olarak tanımlanmıştır; bu, yumurtaları pencerelemenin ve RL'yi tüm kanat veya bacakla gerçekleştirmenin ve yeniden toplanmış mezoderm ile RL gerçekleştirmenin diğer yollarını açıklar. Ancak, Ros arasındaki bazı farklılıklar. vd. protokol ve burada açıklanan mevcut protokol bulunabilir. Protokollerinde, ektoderm donörleri olarak embriyolardan uzuv tomurcukları, buz gibi soğuk PBS'de ~ 2 saat boyunca tripsin ile inkübe edilir. Ektoderm inkübasyonunu başlattıktan sonra, hemen mezoderm donörleri olarak embriyolardan uzuv tomurcukları elde ettiler, daha sonra uzuv tomurcuklarını parçaladılar, sindirdiler ve 30 dakika boyunca inkübe ettikten sonra mezodermal peleti oluşturmak için ektodermi manuel olarak çıkardılar. Burada, ilk olarak, uzuv tomurcukları mezodermal donör olarak kullanılacak embriyolardan elde edildi, daha sonra tüm ekstremite tomurcuğu tripsin ve kollajenaz ile inkübe edilerek sindirildi. Ektodermler daha sonra filtrasyon ile çıkarılır ve pelet 1-1.5 saat arasında inkübe edilir. Bu yöntemin mezodermal peleti elde etmedeki avantajı, tripsin ile yapılan tedavinin sağlam ektodermleri mezodermden ayırırken, kollajenaz tedavisinin mezodermal hücreleri sindirmesidir. Bu nedenle, ektodermal dokuyu filtrelemek ve atmak mümkündür. Öte yandan, daha fazla pelet inkübasyon süresi, ektodermlerin dolmasına yardımcı olan daha iyi kompaktasyonunu sağlar. İki protokol arasındaki bir diğer fark, Ros ve ark.'nın ektodermleri birer birer soyup peleti içeren Petri kabına aktarmasıdır. Buna karşılık, tüm ektodermler disseke edilir ve mevcut protokolde bir Petri kabında toplanır. Pelet, ektodermleri doldurmak için Petri kabına aktarılır. Bu yöntem izlenerek ektodermler aşılama ile eş zamanlı olarak hazırlanabilir. Diğer birçok protokolde olduğu gibi, RL'lerin nasıl gerçekleştirildiği değişebilir; Bununla birlikte, her iki protokoldeki adımlar, başarılı bir manipülasyon üretmek için tekniğin kritik aşamalarını yeterince tanımlamaktadır.
Önceki çalışmalar, ayrışmış polarize bölge hücrelerinin, RL 7,10'da mezoderm arasında rastgele dağıldığında morfogenezi inhibe ettiğini göstermiştir. Bu nedenle, mezodermal peleti oluşturmadan önce ZPA'dan hücreleri ortadan kaldırmak isteğe bağlıdır. Daha sonra, ZPA hücreleri (veya sonik kirpi gömülü boncuklar), RL'yi A-P polaritesi 8,9,19 geliştirmeye teşvik etmek için kullanılabilir.
RL deneysel modeli çeşitli senaryolara uyarlanabilir. Rekombinasyon, farklı gelişimsel veya olgun (ön veya arka bacak) aşamalardan uzuv hücreleri, üç uzuv ekseni boyunca diğer pozisyonlar ve ayrışmış-yeniden toplanmış hücreler veya ayrışmamış-parçalanmış mezoderm15 ile uygulanabilir. İlginçtir ki, önceki çalışmalar, mutant ve vahşi tip mezoderm ve ektodermlerin farklı kombinasyonlarının davranışını incelemek için RL modelini kullandığını bildirmiştir 13,14,20,21 veya elektroporated hücreler 22.
Uzuv gelişiminin evrimsel olarak korunmuş bir süreç olduğu göz önüne alındığında, ektoderm kaynakları da tavuk, bıldırcın, ördek, fare veya sıçan ektodermlerinden farklı olarak değişebilir. Başka bir olasılık, mezodermalin veya hatta diğer hücre tiplerinin veya kaynaklarının türler arası RL üretmek için değiştirilmesidir.
Sonuç olarak, RL, morfogenez, desenleme, hücre-hücre etkileşimleri, hücre göçü ve hücresel ve moleküler seviyelerde hücre farklılaşmasını incelemek için olağanüstü bir modeldir. RL prosedürü çoklu varyasyonlara izin verdiğinden, tavuk-uzuv gelişim biyolojisi ile sınırlı kalmadan çok sayıda biyolojik soruda potansiyel uygulamalara izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Şekil 2'deki görüntüler için Estefania Garay-Pacheco'ya ve sanat eseri için Maria Valeria Chimal-Montes de Oca'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, JC-M'ye verilen Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [hibe numaraları IN211117 ve IN213314] ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [hibe numarası 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tarafından desteklenmiştir. JC M-L, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'dan (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) doktora sonrası burs aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M.
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, Wiley-Liss Div John Wiley & Sons Inc. 605 Third Ave, New York, Ny. 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
