Summary
레이저 미세 해부를 통해 인간 사후 흑질 관절 조직으로부터 뉴멜라닌 과립을 분리하기 위한 강력한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 이 개정 및 최적화된 프로토콜은 샘플 수집에 필요한 시간을 크게 최소화하고 필요한 샘플 양을 줄이며 LC-MS/MS 분석을 통해 단백질의 식별 및 정량을 향상시킵니다.
Abstract
뉴로멜라닌은 흑질의 도파민성 뉴런에 있는 소위 뉴로멜라닌 과립(NMG)에 존재하는 흑갈색 색소입니다. 뉴로멜라닌 외에도 NMG에는 다양한 단백질, 지질 및 금속이 포함되어 있습니다. NMG 함유 도파민 성 뉴런은 파킨슨 병 및 Lewy 시체가있는 치매와 같은 신경 퇴행성 질환에서 우선적으로 손실되지만 NMG 형성 메커니즘과 건강 및 질병에서 NMG의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 NMG의 분자 특성화에 대한 추가 연구가 필수적입니다. 불행하게도, 단백질 분리를 위한 표준 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리를 기반으로 하므로 많은 양의 인간 조직이 필요합니다. 따라서 자동 레이저 미세 해부 (LMD) 기반 프로토콜이 여기에 설정되어 편향되지 않고 자동화 된 방식으로 최소량의 조직을 사용하여 NMG 및 주변 흑질 (SN) 조직을 수집 할 수 있습니다. 절제된 샘플은 이후 질량분석법으로 분석하여 단백질체 구성을 해독합니다. 이 워크플로우를 통해 2,079개의 단백질이 확인되었으며 그 중 514개의 단백질이 NMG에서, 181개의 단백질이 SN에서 독점적으로 확인되었습니다. 현재 결과는 두 프로테옴에 대해 87.6%의 중복에 도달하는 유사한 LMD 기반 접근 방식을 사용한 이전 연구와 비교하여 여기에 제시된 수정 및 최적화된 프로토콜의 적용 가능성을 검증했습니다. 현재 결과를 검증하기 위해 관심 단백질을 표적 질량 분석법(예: 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험)으로 분석했습니다.
Introduction
모든 조직은 서로 다른 세포 유형의 이질적인 혼합물로 구성되지만 한 세포 유형의 특정 분리는 종종 보다 정확한 특성 분석을 위해 필수적입니다. 현미경과 레이저 응용 분야를 결합하는 레이저 미세 해부(LMD)는 복잡한 복합재에서 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 하부 구조를 특이적으로 분리하기 위한 강력한 도구입니다. 질량분석법(LMD-MS)과 LMD의 조합의 적용은 DNA1, RNA2 및 단백질 3,4,5의 분리를 포함한 여러 연구 질문에 대해 이미 성공적으로 구현되었습니다. 이 프로토콜에서는 파킨슨병의 새로운 병리 메커니즘을 해독하기 위해 인간 사후 뇌 조직 및 세포 하위 구성 요소의 단백질체 분석을 위해 수정되고 최적화된 LMD-MS 프로토콜에 대해 설명합니다.
뉴로멜라닌은 흑질의 카테콜아민성, 도파민 생성 뉴런에서 발견되는 거의 녹지 않는 검은색 색소입니다. 단백질 및 지질과 함께 신경 멜라닌 과립 (NMG)이라고하는 이중 막으로 둘러싸인 세포 기관 유사 과립에 축적됩니다.7,8,9. NMG는 노화 과정 동안 양과 밀도가 증가하는 인간에서 3 세부터 관찰 할 수 있습니다10,11. 현재까지 뉴로멜라닌 형성에 대한 명확한 가설은 없지만, 한 가지 가정은 뉴로멜라닌이 도파민12의 산화를 통해 형성된다는 것입니다. 다른 가설은 뉴로멜라닌(예: 티로시나제)의 효소적 생산을 기반으로 합니다.13. 뉴로멜라닌 자체는 지질, 독소, 금속 이온 및 살충제에 대한 높은 결합 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 발견을 바탕으로, NMGs의 형성은 독성 및 산화 물질의 축적 및 환경 독소(14,15)로부터 세포를 보호하는 것으로 가정된다. 이러한 신경 보호 기능 외에도, 뉴멜라닌이 예를 들어, 철 포화 및 자유 라디칼의 후속 촉매 작용에 의해 신경퇴행성 효과를 일으킬 수 있다는 증거가 있다16,17. 또한, 신경 퇴행성 과정에서 방출 된 신경 멜라닌은 과산화수소에 의해 분해 될 수 있으며, 이는 이전에 신경 멜라닌에 결합 된 반응성 금속 및 기타 독성 화합물에 의한 괴사를 가속화 할 수 있으며 신경 염증 및 세포 손상에 기여할 수 있습니다18. 그러나 지금까지 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 과정에서 NMG의 정확한 역할은 명확하게 이해되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 NMG는 파킨슨 병의 발병 기전에 관여하는 것으로 보이며 신경 퇴행에서 NMG의 역할을 밝히기 위해서는 구체적인 분석이 가장 중요합니다. 불행하게도, 일반적인 실험실 동물 (예를 들어, 마우스 및 래트) 및 세포주에는 NMGs19가 부족합니다. 따라서 연구자들은 특히 분석을 위해 사후 뇌 조직에 의존합니다. 과거에, 밀도 구배 원심분리에 의한 NMG 분리는 다량의 흑질질 조직20,21의 가용성에 의존하였다. 오늘날 LMD는 인간의 뇌 샘플에서 NMG를 구체적으로 분리한 다음 LC-MS/MS로 분석하는 다목적 도구를 제공합니다.
이 프로토콜에서, NMG 및 주변 조직(SN)의 분리를 위해 이전 프로토콜(22 )의 개선되고 자동화된 버전이 제시되어, 더 빠른 샘플 생성, 더 많은 수의 확인 및 정량화된 단백질, 및 필요한 조직 양의 심각한 감소를 가능하게 한다.
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Protocol
인간의 뇌 조직의 사용은 독일 규정 및 지침에 따라 독일 보훔 루르 대학교 윤리위원회 (파일 번호 4760-13)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 상업적으로 입수된 흑질의 파스콤팩타 조직 절편에 적용되었다. 제시된 프로토콜의 그래픽 개요가 그림 1에 나와 있습니다.
1. 조직 절편
- 저온 유지 챔버를 미리 냉각하십시오.
알림: 모든 조직에는 서로 다른 저온 유지 온도가 필요하며 이는 해당 공급업체 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. - 스테인리스 스틸 나이프를 70% 에탄올로 청소하고 블레이드 홀더에 설치합니다.
- 아이스박스를 사용하여 -80°C 냉동고에서 저온유지장치로 티슈트를 옮기고 15분 동안 저온유지 챔버 온도에 맞게 조정합니다.
- 연필을 사용하여 멤브레인 슬라이드에 명확하게 레이블을 지정합니다.
참고: LMD 기반 시료 수집에는 PET/PEN 멤브레인 슬라이드가 필요합니다. PET/PEN 멤브레인 슬라이드는 매우 깨지기 쉬우므로 주의해서 다루십시오. - 티슈 홀더에 상업용 냉동 섹션 배지 한 방울을 바릅니다. 완전히 얼기 전에 티슈를 얼린 단면 배지에 놓고 굳혀 조직이 티슈 홀더와 연결되도록 합니다.
- 저온 유지 장치 챔버에 티슈 홀더를 설치하고 절단을 시작하기 전에 방향을 조정하십시오. 최적의 홀더 방향은 조직의 방향에 따라 다릅니다.
참고: 슬라이스에 필요한 단면에 도달할 때까지 조직을 다듬어야 할 수도 있습니다. - 관심 조직 영역에 도달하기 전에 절단 설정을 원하는 조직 두께로 조정합니다.
참고: 20μm 두께의 섹션이 LMD 기반 샘플 수집(22)과 호환되지 않는 것으로 밝혀졌기 때문에 5 또는 10μm는 이 프로토콜에 대해 제안된 두께입니다. - 두 섹션을 잘라 버립니다.
- 안티롤 플레이트를 내려놓습니다.
- 조직의 한 부분을 자르고 안티롤 플레이트를 조심스럽게 열고 멤브레인 슬라이드를 찍고 멤브레인 슬라이드에 티슈 섹션을 배치하면서 조직이 접히는 것을 방지합니다.
알림: 접착하기 전에 멤브레인 슬라이드를 실온에서 보관하면 정확한 샘플 부착이 가능합니다. 여러 섹션을 동일한 멤브레인 슬라이드에 놓을 수 있지만 조직이 겹치는 것을 방지해야 합니다. - 멤브레인 슬라이드에 놓인 조직 절편을 절편이 완료될 때까지 저온 유지 장치에 보관하십시오.
- 추가 처리가 될 때까지 냉동 조직을 -20 ° C에서 보관하거나 아래 절차를 직접 진행하십시오. 절편화된 조직 슬라이드를 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 보관한다.
2. 레이저 미세 해부 및 압력 투석
참고: 뉴로멜라닌 과립은 흑갈색으로 인해 염색 없이 볼 수 있으므로 이 프로토콜에는 염색이 필요하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 필요한 경우 다른 염색 절차를 이 프로토콜과 결합할 수 있습니다. 차단 용액 또는 항체의 사용은 LC-MS/MS 분석에 영향을 미친다는 점을 명심하십시오.
- MicroBeam 시스템을 켜고 컴퓨터에서 관련 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
- 조직이 위를 향하도록 RoboStage의 슬라이드 홀더에 조직막 슬라이드를 놓습니다.
참고: LMD 장치에 따라 조직이 아래를 향하도록 멤브레인 슬라이드를 배치해야 할 수도 있습니다. 일반적으로 샘플 수집은 최적의 재현 가능한 조건을 보장하기 위해 온도 제어 환경에서 수행됩니다. - 현미경을 원하는 배율로 설정하십시오 (여기서는 50 배가 사용됨).
- 소프트웨어 인터페이스의 네비게이터 창에서 찾을 수 있는 스캔 기능을 사용하여 조직 섹션의 개요 스캔을 획득합니다. 관심 영역의 왼쪽 상단 모서리와 오른쪽 하단 모서리를 검색하고 소프트웨어 인터페이스에서 선택합니다. 그런 다음 모든 ROI 스캔을 선택하여 스캔 을 수행합니다.
참고: 개요 스캔은 필수는 아니지만 슬라이드에서 더 나은 방향을 사용할 수 있으며 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. - 적절한 조직에 대한 현미경의 배율을 조정하는데, 이는 현재 뉴로멜라닌 과립의 경우 400배입니다.
- 신경 멜라닌 과립이있는 영역을 검색하십시오. 소프트웨어 인터페이스에서 시야 분석을 선택하고 결과 반전을 선택한 다음 미리보기 창에서 뉴로멜라닌 과립만 빨간색으로 강조 표시되도록 RGB 채널에 대한 임계값을 설정합니다. 확인을 클릭하여 시야에 대해 조정된 설정을 사용합니다.
참고: 어두운 색상의 작은 개체도 선택될 수 있습니다. 이를 고려하기 위해, 뉴로멜라닌 과립을 분리하기 전에 100μm2보다 작은 영역을 덮는 모든 물체를 폐기하십시오. 이렇게하려면 도구 모음에서 아이콘을 클릭하여 요소 목록을 열고 고려중인 슬라이드를 선택하고 영역별로 요소를 정렬하십시오. 면적이 100μm2보다 작은 것을 선택하고 삭제하십시오. - 멤브레인으로 덮인 슬라이드 영역만 사용하여 레이저 설정을 조정합니다.
알림: 절단 레이저 조정 마법사를 사용하고 소프트웨어의 지침을 따르는 것이 좋습니다. 필요한 레이저 설정은 슬라이드마다 다를 수 있습니다. 400배 배율의 5μm 섹션의 경우 일반적인 설정은 절단용 에너지 32개 및 초점 51개, 레이저 펄스 투석(LPC)용 에너지 28개 및 -1 초점입니다. - 적절한 절연을 보장하기 위해 위치 지정 및 절단 에 대한 속도 설정을 조정하십시오.
참고 : 30 % 속도는 NMG 격리에 최적 인 것으로 나타났습니다. - 샘플 수집 튜브 캡에 50μL 초순수를 채우고 캡을 RoboMover의 집진기에 삽입합니다.
알림: 현재 실험에 사용되는 튜브 수집기는 한 번에 하나의 샘플 수집 튜브를 운반할 수 있습니다. - 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 RoboMover를 RoboStage II 위에 배치하여 샘플 수집을 시작합니다.
참고: 이렇게 하려면 수집기를 표시하는 RoboMover 창을 엽니다. RoboMover 창에 표시된 샘플 수집 튜브 캡을 클릭하여 캡을 작업 영역으로 이동합니다. RoboMover 창에서 최적의 이동 및 작업 높이를 조정합니다. 그렇지 않으면 캡의 물이 슬라이드에 떨어지거나 투석된 물체가 캡에 닿지 않을 수 있습니다. - 레이저를 시작하십시오. 레이저 공정 중에 에너지 및 초점 설정을 제어하고 필요한 경우 설정을 조정합니다. 격리된 물체를 최소한 처음 10개의 물체에 대해 샘플 수집 튜브 캡으로 적절하게 분리하고 투석하도록 합니다.
알림: 적절한 격리 및 투석은 육안으로 확인해야 합니다. 둘 다 조직 절편에서 미리 선택된 물체 크기의 조직이 없는 영역을 생성해야 합니다( 그림 2C, D 참조). 절단 및 투석 후 물체가 조직 슬라이스에 부착된 상태로 유지되는 경우 레이저 설정을 조정합니다. 투석의 경우 CenterRoboLPC 옵션은 NMG 격리에 매우 적합한 것으로 나타났습니다. 요소 리스트에서 선택한 각 객체에 대해 투석점 설정을 조정할 수 있습니다. - 샘플링이 완료되면 RoboMover를 시작 위치로 이동합니다. 샘플 수집 튜브를 제거합니다.
알림: 수집된 물체의 수가 다소 적고 물체가 충분히 큰 경우 Cap Check를 클릭하여 샘플 수집을 보장할 수 있으며, 이 경우 샘플 수집 튜브 캡을 현미경 아래에 배치하여 캡의 물 안에 있는 물체의 수를 계산할 수 있습니다( 그림 2H 참조). - 원심분리기를 사용하여 샘플을 회전시킵니다. 원심분리기의 가속으로 인해 증가하는 원심력과 함께 5초의 짧은 스핀이 충분한 것으로 밝혀졌습니다. 이 시점에서 모든 샘플은 함께 추가 처리되어야 하므로 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 단백질체 프로파일의 비교를 위해, NMG를 둘러싼 조직도 절제 후 분리되었다. 주변 조직의 분리는 50배 배율로 수행하였다. - 진공 농축기에서 샘플을 건조시킵니다. 1.5 h는 50 μL의 물에 충분한 것으로 밝혀졌다.
- 조직을 40μL 포름산에 20분(실온) 동안 용해하고 용해시킵니다.
- 초음파 처리 욕조에서 5 분 동안 45 kHz (킬로 헤르츠)에서 초음파 처리에 의한 조직 용해를 향상시킵니다. 튜브가 녹지 않도록 초음파 처리 욕조를 얼음으로 채 웁니다. 추가 처리가 있을 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
3. 트립신 소화
- 얼음에서 샘플을 동결하십시오.
- 진공 농축기에서 샘플을 완전히 건조시킵니다.
- 샘플을 50μL의 적절한 분해 완충액, 예를 들어 50mM 중탄산암모늄으로 채웁니다.
- 1.25 μL의 200 mM 1,4-디티오트레이톨을 첨가한 후, 샘플을 열혼합기를 사용하여 60°C 및 300rpm에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이후 실온(RT)으로 냉각시킨다.
- 이어서, 샘플을 1.36 μL 0.55 M 요오도아세트아미드를 첨가한 후 암실에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션한다.
- 적절한 양의 트립신을 샘플에 추가하고 샘플을 37 ° C에서 밤새 (~ 16 시간) 배양합니다.
참고: 1,000,000μm2의 경우, 0.1μg의 트립신이 충분한 것으로 밝혀졌다. - 2.6 μL의 10 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)을 샘플에 추가하여 소화를 중지합니다 (0.5 % TFA의 최종 농도).
- 진공 농축기를 사용하여 샘플을 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 정의된 최종 부피까지 샘플을 0.1% TFA로 채웁니다. NMG 샘플은 최대 20μL까지 채워졌으며 그 중 5μL는 하나의 질량 분석(MS) 실험에 사용되었습니다.
- 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오. 아미노산 분석 또는 다른 적절한 정량 방법(예: Direct Detect)으로 펩타이드 농도를 결정합니다.
알림: 적은 양의 샘플은 언급된 기술을 사용하여 정량화하지 못할 수 있습니다. 동일한 시료 로딩을 보장하기 위해 각 시료에는 동일한 양의 분리된 조직이 포함되어야 하며 모든 시료는 동일하게 취급되어야 합니다.
4. 고성능 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석법
참고: 다음 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 질량분석(MS) 분석은 여기에 사용된 트래핑 컬럼 장치 및 질량분석기를 사용하여 특정 LC 시스템에 최적화되어 있습니다( 재료 표 참조). 다른 LC 및 MS 시스템의 경우 매개 변수를 조정하는 것이 좋습니다.
- 소프트웨어 Xcalibur를 사용하여 HPLC 설정을 다음과 같이 조정합니다.
- 트랩 컬럼: 온도를 60°C로, 유속을 30μL/min으로 설정하고, 완충액을 0.1% 트리플루오로아세트산으로 실행합니다.
- 분석 C18 역상 컬럼: 온도를 60°C로, 유속을 30μL/분으로 설정하고, 완충액 A를 0.1% 트리플루오로아세트산으로, 완충액 B를 84% 아세토니트릴로, 98분 동안 5%-30% 실행 완충액 B로 기울기를 설정합니다.
알림: 그라디언트의 적응은 불가피한 것일 수 있으며 다른 조직이나 세포를 사용할 때 강력히 권장됩니다. 총 그래디언트 시간은 그래디언트 시작 부분의 샘플 로딩과 그래디언트 끝의 샘플 세척으로 인해 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜의 총 그래디언트는 7분의 샘플 로딩과 15분 동안의 추가 컬럼 세척으로 구성되어 총 그래디언트 시간은 120분입니다.
- HPLC 소프트웨어 로드맵 메뉴에서 찾을 수 있는 XCalibur 기기 설정을 사용하여 데이터 종속 수집(DDA) 분석법을 생성합니다.
- 전역 매개변수 탭에서 주입 모드 액체 크로마토그래피, 예상 LC 피크 폭(30초) 및 기본 충전 상태(2)를 정의합니다.
- 스캔 매개 변수 탭으로 이동하여 MS OT, MIPS, 강도, 충전 상태, 동적 제외 및 ddMS2 OT HCD 순서대로 다음 스캔 및 필터를 추가합니다.
참고: 각 스캔 및 필터에 대한 자세한 매개변수 설정은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 최적의 MS 및 DDA 설정은 사용되는 특정 질량분석기와 샘플 유형에 따라 다를 수 있으므로 조정해야 합니다. - 불활성 질량 분석 유리 바이알 입구에서 정의된 부피의 0.1% TFA에 200-400ng의 샘플 펩타이드를 용해시켜 샘플을 준비합니다. 낮은 시료량으로 인해 농도 측정이 적용되지 않는 경우 총 이온 전류(TIC)를 비교하여 동일한 시료 로딩을 확인하십시오.
참고: 이렇게 하려면 적절한 소프트웨어(예: FreeStyle)에서 질량 분석 측정 결과 파일을 열고 크로마토그램을 확인하십시오. 강도는 모든 샘플에 대해 비슷해야 합니다. 대표적인 TIC가 그림 3에 나와 있습니다. - 단백질체학에 적합한 소프트웨어, 예를 들어, MaxQuant23, Proteomics를 위한 Progenesis QI, 또는 Proteome Discoverer를 사용하여 수득된 원시 데이터를 분석하고, 연구 질문에 기초하여 통계 데이터 분석을 수행한다.
5. MaxQuant를 이용한 단백질체 원시 데이터 분석
참고: MaxQuant 매개변수에 대한 자세한 정보는 보충 표 2에 나와 있습니다. 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
- 로드를 클릭하여 원시 데이터 헤더의 MaxQuant 소프트웨어에 원시 파일을 로드합니다.
- 실험 설정을 클릭하여 샘플 이름을 할당합니다.
- 그룹별 매개 변수를 정의합니다. 먼저 수정 사항을 추가합니다. 시료 처리로 인해 탈아미드화(NQ), 산화(M) 및 카르바미도메틸화(N-용어)를 가변 수정으로 선택하고 카바미도메틸화(C)를 고정 수정으로 추가합니다.
- 소화 탭에서 소화 효소로 트립신을 선택하십시오.
- 라벨 없는 정량화 옵션 LFQ 를 라벨 없는 정량화 탭에 추가합니다. 10개 이상의 파일을 처리해야 하는 경우 빠른 LFQ 옵션을 선택하여 처리 시간을 단축합니다. 단백질 정량을 위한 척도로 iBAQ 옵션 추가24.
- 다른 모든 그룹별 매개변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인합니다.
- 전역 매개변수 탭으로 이동하여 시퀀스 탭에 uniprot.org 에서 파생된 FASTA 파일을 추가합니다. 그에 따라 식별자 규칙을 수정하고 분류 ID(이 경우 호모 사피엔스의 경우 9606)를 추가합니다.
- 단백질 정량화를 위해서는 Unique 및 Razor 펩타이드를 선택하십시오.
- 다른 모든 전역 매개변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인합니다.
- 시작을 클릭하고 페르세우스에서 추가 분석을 위해 MaxQuant 분석 후 단백질 그룹의 출력을 .txt 검색합니다.
6. 페르세우스를 이용한 통계 분석
- Perseus에서 단백질 그룹 .txt 파일을 로드하고, iBAQ 값을 기본 열로 추가하고, 유형에 따라 다른 모든 열을 정렬합니다.
- 범주형 열을 기준으로 행을 필터링하여 미끼와 오염 물질을 필터링합니다.
- 유효한 값을 기준으로 결과를 필터링합니다. 현재의 경우 분석에 두 개의 샘플만 포함된 상태에서 최소 개수의 유효한 값이 선택되었습니다.
- 예를 들어 Excel에서 추가 처리를 위해 Perseus 출력을 .txt 형식으로 내보내고 연구 질문과 관련된 결과를 평가합니다.
7. 선택된 단백질의 검증
참고: MS 데이터의 검증을 위해 일반적으로 사용되는 방법은 예를 들어 면역학적 염색 또는 웨스턴 블롯입니다. 어두운 색과 뉴로멜라닌의 자가형광으로 인해 양고추냉이 과산화효소 또는 형광단 접합 항체를 사용한 뉴로멜라닌 과립 내부의 단백질의 면역학적 염색은 적용할 수 없습니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해서는 매우 많은 양의 사후 조직이 필요합니다. 따라서 선별된 단백질은 표적 질량분석법에 의해 검증되며, 현재의 경우 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험이 설정되었습니다.
- 검증할 단백질을 선택합니다. DDA 실험에서 이미 검출된 이들 단백질의 펩티드를 선택한다. 펩타이드는 신뢰할 수 있는 정량화를 보장하기 위해 누락된 절단 또는 변형을 포함하지 않아야 합니다.
참고: 하나의 특정 단백질의 검증에는 몇 가지 이유가 있을 수 있습니다(예: 조사된 조건의 차등 존재비). 대표적인 결과를 위해, 세포질 다인 1 중쇄 1이 선택되었으며, 이는 NMG 및 SN 샘플에서 동등하게 풍부한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 동일한 샘플 로딩을 보장하기 위한 기준으로서 사용될 수 있었다. - 선택한 펩타이드를 사용하여 HPLC 소프트웨어를 사용하여 PRM 방법의 첫 번째 버전을 설정합니다. DDA 분석법의 모든 크로마토그래피 및 전역 파라미터 설정을 유지합니다.
- MS OT 및 tMS2 OT HCD를 스캔 유형으로 추가합니다. MS OT에 대한 설정이 DDA 방법의 설정과 동일한지 확인합니다. PRM 방법에 대한 자세한 설정은 보충 표 1에서 확인할 수 있습니다.
- tMS2 OT HCD의 경우, 선택된 펩티드를 포접 리스트로서 추가한다. 따라서 DDA 측정에서 관찰된 아미노산 서열과 m/z 값을 추가합니다. 첫 번째 PRM 실험의 경우 머무름 시간 창을 추가하거나 t start를 0으로, t stop을 120으로 설정하지 마십시오(120분 그래디언트의 경우).
- 적합한 소프트웨어, 예를 들어 Skyline을 사용하여 측정 후에 PRM 방법을 평가하고, 첨가된 펩티드의 머무름 시간을 포접 리스트에 구한다. 포함된 펩타이드의 경우, MS1 스캔에서 최소 3개의 전구체 이온과 낮은 질량 오차(±5ppm)로 MS2 스캔에서 5개의 단편 이온에 대해 비교 가능한 피크가 관찰 가능한지 확인합니다.
- 예를 들어 tMS2 OT HCD 스캔의 해상도를 높이고 포함 목록에 머무름 시간 창을 추가하여 PRM 방법을 구체화합니다.
참고: 3분의 머무름 시간 창은 본 실험에 적합한 것으로 확인되었습니다(첫 번째 PRM 실험에서 관찰된 머무름 시간은 1.5분±). - 정제된 PRM 분석법을 사용하면 적절한 소프트웨어를 사용하여 MS1 및 MS2 수준의 피크 면적을 기반으로 관심 펩타이드 및 단백질의 정량화를 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
NMG와 SN 조직의 특이적 분리는 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 가장 중요한 단계입니다. LMD의 공급업체 제공 소프트웨어에서 시야 분석 기능을 사용하면 NMG를 색상에 따라 자동으로 선택할 수 있습니다. 따라서 NMG가 포함 된 조직 영역 (그림 2A)을 식별하고 조정 된 색상 임계 값으로 시야 분석을 수행해야하므로 NMG (그림 2B)가 표시됩니다. 100μm² 미만의 영역을 덮는 물체를 필터링한 후에는 NMG만 격리를 위해 레이블이 지정된 상태로 유지해야 합니다(그림 2C). 라벨링된 NMG의 정밀한 분리는 레이저 설정을 조정한 후에 달성됩니다(그림 2D). NMG의 분리 (그림 2E) 후, SN 조직은 단백질체 프로파일의 비교를 위해 50 배 배율 (그림 2F) 및 분리 (그림 2G)로 선택 될 수 있습니다. SN 조직의 경우 Cap Check 기능을 사용하여 분리된 물체를 시각화할 수 있습니다(그림 2H). NMG 및 SN 두 샘플 유형 모두에 대해, 500,000μm2의 뇌 조직의 분리가 이 프로토콜에 충분한 것으로 밝혀졌으며, 샘플 당 최소 3개의 MS 실행을 가능하게 했습니다.
120분 DDA 실험의 대표적인 예가 그림 3 에 나와 있습니다(측정의 마지막 15분 동안 주 컬럼을 세척함에 따라 크로마토그램은 105분 직전에 잘림). 적용된 방법은 전체 그래디언트에 걸쳐 샘플 용리를 허용하여 선명하고 간결한 피크를 생성해야 하며 총 이온 전류(TIC)의 강도는 모든 샘플에서 비교할 수 있어야 합니다.
동일한 펩타이드 부하를 보장하기 위해 MS 샘플(NMG의 경우 5μL 및 SN의 경우 2.5μL)에 대해 조정된 부피를 갖는 500,000μm²의 NMG 샘플 1개 및 1,000,000μm² SN 조직의 샘플 1개에 제시된 프로토콜을 적용한 결과, NMG 샘플에서 1,898개의 단백질 그룹(PG)과 SN 샘플에서 1,565개의 PG를 식별할 수 있었습니다. 추가 비교를 통해 두 샘플 모두에서 1,384개의 PG가 확인된 반면 NMG에서는 514개의 PG가 독점적으로 확인되었고 SN 조직에서는 181개의 PG가 확인되었습니다(그림 4). 이 대표적인 실험에서 총 2,079개의 PG가 확인되었습니다. 이전 연구22 의 참조 데이터 세트와 비교하면 해당 연구에서보고 된 PG의 87.6 %가 현재의 개정 및 자동화 된 프로토콜로도 식별 될 수 있으며 적용 가능성을 입증 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한 식별된 PG의 수는 1,143개까지 개선될 수 있습니다.
최소한의 샘플 양으로는 Western Blots와 같은 고전적인 검증 방법을 적용할 수 없기 때문에 PRM과 같은 표적 질량 분석 접근 방식으로 관심 단백질의 검증을 달성할 수 있습니다. 세포질 다인 1 중쇄 1의 펩티드 ESPEVLLTLDILK 단백질에 대한 대표적인 결과를 도 5에 나타내었다. 이 단백질의 iBAQ 값은 DDA 측정에서 SN에 비해 NMG에서 약간 더 높은 것으로 나타 났으며, 이는 MS1- (그림 5A, B, E) 및 MS2 수준 (그림 5C, D, F)의 피크 영역을 기반으로 한 PRM 실험으로 확인할 수 있습니다.
그림 1: 뉴로멜라닌 과립(NMG) 및 주변 조직(SN)의 단백질체학적 특성 분석을 위한 워크플로우. NMG 및 SN 샘플은 레이저 미세 해부 (LMD) 를 통해 조직 절편으로부터 분리되었다. 단백질을 분리하고 트립신 용액 내 소화를 수행하였다. 생성된 펩타이드는 데이터 의존적 획득(DDA) 모드에서 LC-MS/MS 측정을 통해 분석되었습니다. 데이터 분석은 MaxQuant 및 Perseus 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 선택된 단백질의 검증은 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험으로 수행되었습니다. PRM-데이터는 스카이라인 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: NMG 및 SN 샘플의 선택 및 LMD 기반 분리. 처음에는 400 배 배율로 더 이상 염색하지 않고 볼 수있는 NMG가 포함 된 영역을 현미경 아래에 놓습니다 (A). 시야 분석을 수행한 후 NMG 및 기타 어두운 영역이 선택됩니다(B). NMG만 필터링(C) 후에 선택된 상태로 유지되고 레이저 설정이 조정된 후(D) 분리됩니다. 모든 NMG가 단리된 후(E), SN 조직은 50배 배율(F) 및 단리(G)로 선택된다. SN 샘플에 대해 분리된 물체는 상당히 크기 때문에 Cap Check 기능(H)을 사용하여 샘플 수집 캡에서 관찰할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 120분 DDA 측정의 총 이온 전류(TIC). 크로마토그램은 0분에서 ~105분의 머무름 시간 범위 동안 용리 펩타이드에 해당하는 이온의 상대적 풍부도를 보여줍니다. 메인 컬럼이 105 분에서 120분 사이에 세척되면 크로마토 그램이 105분에서 잘립니다. 최고 피크의 강도는 2.86 x 108입니다. 피크 위의 숫자는 머무름 시간과 특정 피크의 가장 풍부한 이온(BP=base peak)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NMG와 SN 조직에서 확인된 단백질 그룹(PG)의 대응성을 보여주는 벤 다이어그램. 전체적으로 NMG에서 1,898개의 PG가 확인되었고 SN 조직에서 1,565개의 PG가 확인되었으며, 그 중 1,384개의 PG가 두 조직 영역 모두에서 확인되었습니다. 514 PG는 NMG 조직에서 독점적으로 확인된 반면, 181 PG는 SN 조직에서 독점적으로 확인되었습니다. 다이어그램은 온라인 도구 Venny25를 사용하여 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 펩티드 ESPEVLLTLDILK (세포질 다인 1 중쇄 1, ++)에 대한 PRM 실험 결과. MS1-(A,B) 및 MS2-수준(C,D)의 크로마토그램과 MS1-(E) 및 MS2-수준(F)의 피크 영역이 NMG 및 SN 조직의 예시적인 샘플에 대해 표시됩니다. 다른 색상은 다른 전구체 (MS1 수준) 또는 생성물 이온 (MS2 수준)을 나타내는 데 사용됩니다. 크로마토그램은 Savitzky-Golay 스무딩이 수행된 후에 표시됩니다. 강도와 피크 영역은 MS1- (A, B, E) 및 MS2 수준 (C, D, F)에서 비슷했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 질량 분석 실험의 파라미터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: MaxQuant 분석의 매개변수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
LMD는 특정 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 내 구조의 분리에 널리 적용 가능한 기술입니다. 여기에 제시된 개정되고 자동화 된 프로토콜에서이 기술은 신경 멜라닌 과립 (NMG) 및 NMG 주변 조직 (SN)의 특정 분리에 적용됩니다. 지금까지 인간 사후 뇌 조직에서 NMG를 분리하기위한 두 가지 접근법이 발표되어 널리 사용되었습니다.
a) 흑질 질 조직 1g을 소비하는 불연속 자당 구배20. 인간 사후 흑질 조직은 드물고 여러 연구 질문에 대한 관심이 높기 때문에 불행히도 환자 당 많은 양의 조직이 필요한 경우 대규모 코호트 연구를 설정하는 것이 매우 어렵습니다. 따라서, 이러한 접근법은 NMGs26의 충분한 단리를 위해 필요한 조직 양을 0.15 g으로 감소시키는 것을 더욱 개선하였다. 그러나 여전히 완전한 실질적 흑질 의 절반 이상이 필요했습니다.
b) LMD를 사용한 NMG의 절제. 2016 년 Plum 등은 LMD를 통한 NMG의 정확한 절제를 기반으로 새로운 프로토콜을 수립했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 필요한 샘플 양을 10 개의 10 μm 조직 절편으로 줄일 수 있으므로 필요한 조직 샘플을 150mg에서 16.6mg22로 크게 줄일 수 있습니다.
여기에 제시된 최적화되고 자동화된 LMD 기반 프로토콜은 더 얇고(10μm에 비해 5μm) 더 적은 조직 절편(8개에 비해 최대 7개)을 사용해야 하고 자동화된 NMG 검출을 사용하여 샘플 생성에 더 적은 시간(1-2일에 비해 샘플당 4시간)이 필요하기 때문에 훨씬 더 적은 샘플 양을 필요로 합니다. 따라서 필요한 샘플 수집 시간이 크게 단축되었으며 최적화된 LC-MS 방법과 최첨단 기기를 적용하여 식별된 PG의 수를 크게 늘릴 수 있었습니다. 이 프로토콜은 다른 연구 질문 및 조직에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
사용자 정의 연구 질문에 관한 제시된 프로토콜의 적응을 위해 경험을 바탕으로 다음 측면이 강조됩니다.
a) 비교 가능한 샘플 양의 분리: 이 프로토콜의 예상 펩타이드 수율이 예를 들어 세포 배양 또는 조직 용해물에 비해 다소 낮기 때문에 펩타이드 농도를 결정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 따라서 LMD를 통해 동일한 양의 조직을 분리하는 것이 중요하며, 이는 선택된 개체의 조직 면적을 기반으로 추정할 수 있습니다. 현재 설정에서 500,000μm²의 조직 영역은 최소 3개의 MS 측정을 위한 펩타이드 생성에 충분합니다.
b) 트립신 소화 : 소화 기간과 트립신 농도는 샘플간에 비슷해야합니다.
c) 다른 조직에 대한 매개 변수의 적응 : 분석 할 조직에 따라 수집 된 조직의 양을 조정해야하므로 추가 된 트립신의 양도 조정해야합니다. 트립신 대 단백질 비율은 1:40보다 낮아서는 안됩니다.
d) LMD 프로세스의 한계: 관심 객체의 LMD 기반 격리의 경우 선택한 객체의 크기와 슬라이스의 두께에 제한이 있습니다. 조직의 레이저 기반 절단 중 조직 손실로 인해 100μm²보다 작은 물체는 분리하기에는 너무 작은 것으로 간주되었습니다.
e) LC 및 MS 파라미터의 적응: 사용된 LC 및 MS 시스템에 따라 분리된 조직의 양을 늘려야 하고(예: 마이크로플로우 시스템으로 작동할 때) MS 파라미터를 조정해야 합니다(예: 이온 트랩 기반 검출기 시스템으로 작업할 때).
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 de에 의해 지원되었습니다. NBI, 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (보조금 번호 FKZ 031 A 534A) 및 P.U.R.E. (유럽 내 단백질 연구 단위 Ruhr) 및 단백질 진단 센터 (ProDi) 보조금, 둘 다 독일 노르트라인 베스트팔렌의 혁신, 과학 및 연구부.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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