Summary
פרוטוקול חזק מוצג כאן לבידוד גרגירי נוירומלנין מרקמות אנושיות שלאחר המוות nigra pars compacta באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. פרוטוקול מתוקן וממוטב זה ממזער באופן מסיבי את הזמן הנדרש לאיסוף הדגימה, מפחית את כמות הדגימה הנדרשת ומשפר את הזיהוי והכימות של חלבונים על ידי ניתוח LC-MS/MS.
Abstract
נוירומלנין הוא פיגמנט שחור-חום, הנמצא במה שמכונה גרגירי נוירומלנין (NMGs) בנוירונים דופמינרגיים של substantia nigra pars compacta. מלבד נוירומלנין, NMGs מכילים מגוון חלבונים, שומנים ומתכות. למרות שתאי עצב דופמינרגיים המכילים NMGs הולכים לאיבוד באופן מועדף במחלות נוירודגנרטיביות כמו מחלת פרקינסון ודמנציה עם גופי לוי, רק מעט ידוע על מנגנון היווצרות NMG ותפקידם של NMGs בבריאות ובמחלות. לפיכך, מחקר נוסף על האפיון המולקולרי של NMGs הוא חיוני. למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד חלבונים מבוססים על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות ולכן דורשים כמויות גבוהות של רקמה אנושית. לפיכך, מוקם כאן פרוטוקול אוטומטי מבוסס מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המאפשר איסוף של NMGs ורקמות סובסטנטיה ניגרה (SN) הסובבות אותה באמצעות כמויות מינימליות של רקמה באופן בלתי משוחד ואוטומטי. דגימות שנכרתו מנותחות לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסות כדי לפענח את הרכבן הפרוטאומי. בתהליך עבודה זה זוהו 2,079 חלבונים, מתוכם 514 חלבונים זוהו באופן בלעדי ב-NMGs ו-181 ב-SN. התוצאות הנוכחיות הושוו עם מחקר קודם שהשתמש בגישה דומה מבוססת LMD שהגיעה לחפיפה של 87.6% עבור שני הפרוטאומים, מה שמאמת את הישימות של הפרוטוקול המתוקן והממוטב המוצג כאן. כדי לאמת את הממצאים הנוכחיים, חלבונים בעלי עניין נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה ממוקדת, למשל, ניסויי ניטור תגובה מקבילים (PRM).
Introduction
כל רקמה מורכבת מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים שונים, אך הבידוד הספציפי של סוג תא אחד הוא לעתים קרובות הכרחי לאפיון מדויק יותר. מיקרודיסקציית לייזר (LMD), צימוד מיקרוסקופ עם יישום לייזר, היא כלי רב עוצמה לבידוד ספציפי של אזורי רקמות, תאים בודדים או תת-מבנים תאיים מתוך קומפלקס מורכב. היישום של LMD בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LMD-MS) כבר יושם בהצלחה עבור מספר שאלות מחקר, כולל בידוד של DNA1, RNA2 וחלבונים 3,4,5. בפרוטוקול זה מתואר פרוטוקול LMD-MS מתוקן וממוטב לניתוח פרוטאומי של רקמת מוח אנושית לאחר המוות ורכיבים תת-תאיים לפענוח פתומכניזמים חדשים של מחלת פרקינסון.
נוירומלנין הוא פיגמנט שחור, כמעט בלתי מסיס, המצוי בתאי העצב הקטכולמינרגיים, המייצרים דופמין, של ה-substantia nigra pars compacta6. יחד עם חלבונים ושומנים, הוא מצטבר בגרגירים דמויי אברונים המוקפים בקרום כפול, הנקרא גרגירי נוירומלנין (NMGs)7,8,9. NMGs ניתן לראות מגיל שלוש שנים בבני אדם עולה בכמות ובצפיפות במהלך תהליך ההזדקנות10,11. נכון להיום, אין השערה ברורה על היווצרות נוירומלנין, אבל הנחה אחת היא כי neuromelanin נוצר באמצעות חמצון של דופמין12. השערות אחרות מבוססות על ייצור אנזימטי של נוירומלנין (למשל, טירוזינאז)13. נוירומלנין עצמו נמצא כבעל זיקה גבוהה לשומנים, רעלנים, יוני מתכת וחומרי הדברה. בהתבסס על ממצאים אלה, ההנחה היא כי היווצרות NMGs מגינה על התא מפני הצטברות של חומרים רעילים וחמצוניים ומפני רעלנים סביבתיים14,15. מלבד פונקציה זו של הגנה על מערכת העצבים, קיימות עדויות לכך שנוירומלנין עשוי לגרום להשפעות ניווניות של מערכת העצבים, למשל על ידי רוויית ברזל ובעקבות זאת קטליזה של רדיקלים חופשיים16,17. יתר על כן, נוירומלנין המשתחרר במהלך תהליכים נוירודגנרטיביים יכול להתפרק על ידי מי חמצן, אשר יכול להאיץ נמק על ידי מתכות תגובתיות ותרכובות רעילות אחרות שנקשרו בעבר לנוירומלנין ועשוי לתרום לדלקת עצבית ולנזק תאי18. עם זאת, עד כה את התפקיד המדויק של NMGs בתהליכים נוירודגנרטיביים כמו במהלך מחלת פרקינסון אינו מובן בבירור. ובכל זאת, נראה כי NMGs מעורבים בפתוגנזה של מחלת פרקינסון והניתוח הספציפי שלהם הוא בעל חשיבות עליונה כדי לפענח את תפקידם בניוון עצבי. למרבה הצער, חיות מעבדה נפוצות (למשל, עכברים וחולדות) וקווי תאים חסרים NMGs19. לכן, חוקרים מסתמכים במיוחד על רקמת מוח לאחר המוות לצורך הניתוח שלהם. בעבר, בידוד NMG על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות הסתמך על הזמינות של כמויות גבוהות של רקמת סובסטנטיה ניגרה 20,21. כיום, LMD מציג כלי רב-תכליתי לבידוד ספציפי של NMGs מדגימות מוח אנושיות כדי לנתח אותם על ידי LC-MS/MS.
בפרוטוקול זה מוצגת גרסה משופרת ואוטומטית של פרוטוקול22 הקודם לבידוד NMGs והרקמות הסובבות אותם (SN), מה שמאפשר יצירת דגימה מהירה יותר, מספר גבוה יותר של חלבונים מזוהים ומכמתים, והפחתה חמורה של כמויות הרקמות הנדרשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ברקמת המוח האנושית אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת רוהר בוכום, גרמניה (תיק מספר 4760-13), על פי התקנות וההנחיות הגרמניות. פרוטוקול זה יושם על פרוסות רקמה של substantia nigra pars compacta שהושגו באופן מסחרי. סקירה גרפית של הפרוטוקול המוצג מוצגת באיור 1.
1. חיתוך רקמות
- מקדים את תא הקריוסטאט.
הערה: כל רקמה דורשת טמפרטורות cryostat שונות, אשר ניתן למצוא בפרוטוקול הספק המתאים. - נקו את סכין הנירוסטה עם 70% אתנול והתקינו אותה במחזיק הלהב.
- העבירו את הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לקריוסטט באמצעות ארגז קרח ותנו לה להסתגל לטמפרטורת תא הקריוסטאט למשך 15 דקות.
- באופן חד משמעי לסמן קרום מחליק באמצעות עיפרון.
הערה: שקופיות קרום PET/PEN נדרשות לאיסוף דגימות מבוסס LMD. טפל בהחלקות קרום PET/PEN בזהירות מכיוון שהן שבריריות במיוחד. - יש למרוח טיפה של מדיום חתך קפוא מסחרי על מחזיק הרקמה. לפני שהוא קפוא לחלוטין, הניחו את הרקמה על מדיום החתך הקפוא ותנו לו להתקשות, כך שהרקמה תהיה מחוברת למחזיק הרקמה.
- התקן את מחזיק הרקמה בתא cryostat והתאם את הכיוון שלו לפני שתתחיל לחתוך. אוריינטציה אופטימלית של המחזיק תלויה בכיוון הרקמה.
הערה: ייתכן שיהיה צורך לחתוך את הרקמה עד שיגיע למישור החתך הדרוש לפרוסות. - לפני ההגעה לאזור העניין ברקמה, התאם את הגדרת החיתוך לעובי הרקמה הרצוי.
הערה: 5 או 10 מיקרומטר הוא העובי המומלץ לפרוטוקול זה, שכן מקטעים בעובי 20 מיקרומטר נמצאו כלא תואמים לאוסף הדגימות מבוסס LMD22. - חותכים שני חלקים ומשליכים אותם.
- הניחו את צלחת האנטי-רול.
- חותכים קטע של הרקמה, פותחים בזהירות את צלחת האנטי-רול, לוקחים מגלשה של ממברנה ומונעים קיפול רקמות תוך הצבת מקטע הרקמה על מגלשת הממברנה.
הערה: אחסון הממברנה בטמפרטורת החדר לפני ההדבקה מאפשר חיבור דגימה מדויק. ניתן למקם מספר חלקים על אותה מגלשת ממברנה אך יש למנוע חפיפה בין רקמות. - אחסנו מקטעי רקמה המונחים על מגלשות ממברנה בקריוסטאט עד להשלמת החתך.
- אחסן את הרקמה המוקפדת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף או המשך ישיר בהליך שלהלן. יש לאחסן את מגלשות הרקמה החתוכות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
2. מיקרודיסקציה בלייזר וקטפולט לחץ
הערה: מכיוון שגרגירי נוירומלנין נראים לעין ללא כל כתמים בשל צבעם השחור-חום, אין צורך בכתמים עבור פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן לשלב הליכי צביעה שונים עם פרוטוקול זה במידת הצורך. זכור שהשימוש בפתרונות חסימה או נוגדנים ישפיע על ניתוחי LC-MS/MS.
- הפעל את מערכת MicroBeam ופתח את התוכנה המשויכת למחשב (ראה טבלת חומרים).
- הנח את מחליק קרום הרקמה ב-SlideHolder ב-RoboStage כשהרקמה פונה כלפי מעלה.
הערה: בהתאם להתקן LMD, ייתכן שיהיה צורך למקם את החלקת הממברנה כך שהרקמה פונה כלפי מטה. באופן כללי, איסוף הדגימה מתבצע בסביבה מבוקרת טמפרטורה כדי להבטיח תנאים אופטימליים וניתנים לשחזור. - הגדר את המיקרוסקופ להגדלה הרצויה (משמש כאן פי 50) לסריקות הסקירה.
- השתמש בפונקציית הסריקה, שניתן למצוא בחלון הנווט של ממשק התוכנה, כדי לרכוש סריקת סקירה כללית של מקטע הרקמות. חפש את הפינה השמאלית העליונה ואת הפינה הימנית התחתונה של אזור העניין ובחר אותם בממשק התוכנה. לאחר מכן, בחר סרוק את כל ה- ROIs כדי לבצע את הסריקות.
הערה: סריקות מבט כולל אינן חובה, אך הן מאפשרות כיוון טוב יותר בשקופית וניתן לשמור אותן לשימוש מאוחר יותר. - התאם את ההגדלה של המיקרוסקופ לרקמה המתאימה, שהיא פי 400 במקרה הנוכחי של גרגירי נוירומלנין.
- חפש אזור עם גרגירי נוירומלנין. בחר ניתוח שדה ראייה בממשק התוכנה, בחר הפוך תוצאה, וקבע את הסף לערוצי RGB כך שרק גרגירי נוירומלנין יסומנו באדום בחלון התצוגה המקדימה. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות המותאמות לשדה הראייה.
הערה: ייתכן שגם אובייקטים קטנים יותר בעלי צבע כהה ייבחרו. כדי להסביר זאת, יש להשליך את כל העצמים המכסים שטח קטן מ-100 מיקרומטר2 לפני בידוד גרגירי נוירומלנין. לשם כך, פתח את רשימת הרכיבים על-ידי לחיצה על הסמל בסרגל הכלים, בחר את השקופית תחת התחשבות וסדר רכיבים לפי אזור. בחר את אלה עם שטחים קטנים מ 100 μm2 ולמחוק אותם. - התאם את הגדרות הלייזר באמצעות אזור בשקופית המכוסה על-ידי הממברנה בלבד.
הערה: מומלץ להשתמש באשף כוונון הלייזר לחיתוך ולפעול לפי הוראות התוכנה. הגדרות הלייזר הנדרשות עשויות להיות שונות בין שקופיות שונות. עבור מקטעים של 5 מיקרומטר עם הגדלה של פי 400, ההגדרות האופייניות הן 32 אנרגיה ו-51 מיקוד לחיתוך, ו-28 אנרגיה ו-1- מיקוד עבור קטפולט פולסים בלייזר (LPC). - התאם את הגדרות המהירות למיקום וחיתוך כדי להבטיח בידוד תקין.
הערה: מהירות של 30% נמצאה כאופטימלית לבידוד NMG. - מלא את מכסה צינור איסוף הדגימות במים אולטרה-פוריים של 50 μL והכנס את המכסה לאספן של ה- RoboMover.
הערה: אספן הצינורות המשמש לניסויים קיימים יכול לשאת צינור איסוף דגימה אחד בכל פעם. - מקם את ה-RoboMover מעל ה-RoboStage II באמצעות ממשק התוכנה כדי להתחיל באיסוף הדגימות.
הערה: לשם כך, פתח את חלון RoboMover, המציג את האספן. לחץ על מכסה צינור איסוף הדגימות המוצג בחלון RoboMover כדי להעביר את המכסה לאזור העבודה. התאם את גובה התנועה והעבודה האופטימלי בחלון RoboMover. אחרת, המים במכסה עלולים ליפול על המגלשה או שהחפצים המגולגלים לא יגיעו למכסה. - הפעל את הלייזר. שלוט בהגדרות האנרגיה והמיקוד במהלך תהליך הלייזר והתאם את ההגדרות במידת הצורך. הקפידו על בידוד וקטפולטציה נאותים של החפצים המבודדים לתוך מכסה צינור איסוף הדגימות עבור לפחות עשרת האובייקטים הראשונים.
הערה: בידוד תקין ו catapulting צריך להיבדק חזותית. שניהם צריכים ליצור אזור נטול רקמות בגודל של האובייקט שנבחר מראש בפרוסת הרקמה (ראו איור 2C,D). התאם את הגדרות הלייזר אם האובייקט נשאר מחובר לפרוסת הרקמה לאחר חיתוך וקטפולטה. עבור catapulting, האפשרות CenterRoboLPC נמצא מתאים היטב לבידוד NMG. ניתן להתאים את הגדרות הקטפולטה לכל אובייקט שנבחר ברשימת הרכיבים. - לאחר השלמת הדגימה, נווט את ה- RoboMover למיקום ההתחלה שלו. הסר את צינור איסוף הדגימה.
הערה: כאשר מספר האובייקטים שנאספו נמוך למדי והעצמים גדולים מספיק, ניתן להבטיח איסוף דגימות על ידי לחיצה על Cap Check, אשר תמקם את מכסה צינור איסוף הדגימה מתחת למיקרוסקופ כך שניתן יהיה לספור את מספר העצמים בתוך המים במכסה (ראו איור 2H). - סובב את הדגימה באמצעות צנטריפוגה. ספינים קצרים של 5 שניות עם כוח צנטריפוגלי גובר עקב האצת הצנטריפוגה נמצאו מספיקים. בשלב זה, אחסן דגימות ב -80 °C, כמו כל הדגימות צריך להיות מעובד עוד יותר יחד.
הערה: לצורך השוואה של הפרופיל הפרוטאומי, הרקמה המקיפה את NMGs בודדה גם לאחר כריתתם. בידוד הרקמה הסובבת בוצע בהגדלה של פי 50. - יבשו את הדגימות ברכז ואקום. 1.5 שעות נמצאו מספיקות עבור 50 μL של מים.
- יש לבודד את הרקמה בחומצה פורמית בנפח 40 μL למשך 20 דקות (בטמפרטורת החדר).
- שפר את תזה הרקמה על ידי סוניקציה ב 45 kHz (קילוהרץ) במשך 5 דקות באמבט סוניקציה. מלאו את אמבט הסוניקציה בקרח כדי למנוע המסת צינורות. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80°C עד לעיבוד נוסף.
3. עיכול טריפטי
- יש להקפיא דגימות על קרח.
- יבש לחלוטין את הדגימות ברכז ואקום.
- מלא את הדגימה ב-50 μL של חיץ עיכול מתאים, למשל, אמוניום ביקרבונט של 50 mM.
- לאחר תוספת של 1.25 μL של 200 mM 1,4-dithiothreitol, לדגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס ו 300 סל"ד באמצעות thermomixer ולקרר אותם לטמפרטורת החדר (RT) לאחר מכן.
- לאחר מכן, דגירה דגימות ב- RT במשך 30 דקות בחושך לאחר תוספת של 1.36 μL 0.55 M יודואצטאמיד.
- הוסיפו כמות מתאימה של טריפסין לדגימות והגדירו את הדגימות למשך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור 1,000,000 μm2, 0.1 מיקרוגרם של טריפסין נמצא מספיק. - הוסף 2.6 μL של 10% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) לדגימות כדי לעצור את העיכול (ריכוז סופי של 0.5% TFA).
- ייבשו לחלוטין את הדגימות באמצעות רכז ואקום. לאחר מכן, מלא דגימות עד לאמצעי אחסון סופי מוגדר עם 0.1% TFA. דגימות NMG מולאו עד 20 μL, מתוכן 5 μL שימשו לניסוי ספקטרומטרי מסה (MS) אחד.
- יש לאחסן את הדוגמאות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף. קבע את ריכוז הפפטידים על ידי ניתוח חומצות אמינו או שיטת כימות מתאימה אחרת (למשל, זיהוי ישיר).
הערה: ייתכן שכמויות דגימה נמוכות לא יהיו ניתנות לכימות באמצעות הטכניקות שהוזכרו. כדי להבטיח העמסת דגימה זהה, כל דגימה צריכה להכיל את אותה כמות של רקמה מבודדת ויש להתייחס לכל דגימה באופן שווה.
4. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים וספקטרומטריית מסה
הערה: הניתוח הבא של ספקטרומטריית מסה (MS) של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) ממוטב עבור מערכת LC ספציפית עם התקן עמודת השמנה וספקטרומטר מסה המשמשים כאן (ראה טבלת חומרים). עבור מערכות LC ו- MS אחרות, מומלץ להתאים את הפרמטרים.
- באמצעות התוכנה Xcalibur, להתאים את הגדרות HPLC כדלקמן.
- עמודת השמנה: הגדר את הטמפרטורה ל-60°C, את קצב הזרימה ל-30 μL/min, את המאגר ל-0.1% חומצה טריפלואורואצטית.
- עמודה אנליטית C18 בפאזה הפוכה: הגדר את הטמפרטורה ל-60°C, קצב זרימה ל-30 μL/min, הפעלת מאגר A ל-0.1% חומצה טריפלואורואצטית, הפעלת מאגר B ל-84% אצטוניטריל, וגרדיאנט ל-5%-30% רץ במאגר B במשך 98 דקות.
הערה: הסתגלות של השיפוע עשויה להיות בלתי נמנעת ומומלצת מאוד בעת שימוש ברקמות או בתאים שונים. זמן השיפוע הכולל עשוי להשתנות עקב העמסת דגימה בתחילת השיפוע ושטיפת דגימה בסוף מעבר הצבע. השיפוע הכולל בפרוטוקול זה מורכב מטעינת דגימה של 7 דקות ושטיפת עמודים נוספת למשך 15 דקות וכתוצאה מכך זמן שיפוע כולל של 120 דקות.
- צור שיטת רכישה תלוית נתונים (DDA) באמצעות הגדרת המכשירים של XCalibur, אותה ניתן למצוא בתפריט מפת הדרכים של תוכנת HPLC.
- בכרטיסייה פרמטרים כלליים , הגדר את מצב העירוי כרומטוגרפיה נוזלית, את רוחב השיא הצפוי של LC (30 שניות) ואת מצב הטעינה המוגדר כברירת מחדל (2).
- המשך לכרטיסייה פרמטרים של סריקה והוסף את הסריקות והמסננים הבאים בסדר שהוזכר: MS OT, MIPS, עוצמה, מצב טעינה, אי הכללה דינמית ו - ddMS2 OT HCD.
הערה: ניתן למצוא את הגדרות הפרמטרים המפורטות עבור כל סריקה ומסנן בטבלה משלימה 1. הגדרות MS ו-DDA אופטימליות עשויות להשתנות עבור ספקטרומטר המסה הספציפי שבו נעשה שימוש, כמו גם עבור סוג הדגימה, ולכן יש להתאים אותן. - הכן דגימות על ידי המסת 200-400 ננוגרם של פפטידים לדוגמה בנפח מוגדר של 0.1% TFA בפתחי בקבוקוני זכוכית ספקטרומטריים בעלי מסה אינרטית. אם קביעת הריכוז אינה ישימה עקב כמות דגימה נמוכה, ודא טעינת דגימה זהה על-ידי השוואת זרם היונים הכולל (TIC).
הערה: לשם כך, פתח את הקובץ המתקבל של מדידת ספקטרומטרי מסה בתוכנה מתאימה, לדוגמה, FreeStyle, ובדוק את הכרומטוגרמה. העוצמות צריכות להיות דומות לכל הדגימות. TIC מייצג מוצג באיור 3. - לנתח את הנתונים הגולמיים המתקבלים באמצעות תוכנה מתאימה פרוטאומית, למשל, MaxQuant23, Progenesis QI עבור Proteomics, או Proteome Discoverer, ולבצע ניתוח נתונים סטטיסטיים המבוססים על שאלת המחקר.
5. ניתוח נתונים גולמיים פרוטאומיים באמצעות MaxQuant
הערה: מידע מפורט על הפרמטרים של MaxQuant מופיע בטבלה משלימה 2. הם מתוארים בקצרה להלן.
- טען קבצים גולמיים לתוכנת MaxQuant בכותרת הנתונים הגולמיים על-ידי לחיצה על טען.
- הקצה שמות לדוגמה על-ידי לחיצה על הגדר ניסוי.
- הגדר פרמטרים ספציפיים לקבוצה. ראשית, הוסף שינויים. עקב עיבוד הדגימה, בחר Deamidation (NQ), חמצון (M) ו - Carbamidomethylation (מונח N ) כשינויים משתנים, והוסף קרבמידומתילציה (C) כשינוי קבוע.
- בחר טריפסין כאנזים עיכול בכרטיסייה עיכול .
- הוסף את אפשרות הכימות ללא תוויות LFQ בכרטיסייה כימות ללא תוויות . אם יש לעבד יותר מ-10 קבצים, בחר באפשרות Fast LFQ כדי לקצר את זמן העיבוד. הוסף את אפשרות iBAQ כמדד לכימות חלבונים24.
- ודא שכל שאר הפרמטרים הספציפיים לקבוצה נשארים בהגדרות היצרן.
- המשך לכרטיסייה פרמטרים כלליים והוסף את קובץ FASTA הנגזר מ- uniprot.org בכרטיסייה רצפים . שנה את כלל המזהה בהתאם והוסף את מזהה הטקסונומיה, במקרה זה, 9606 עבור הומו ספיינס.
- לכימות חלבונים בחרו בפפטידים ייחודיים ותער .
- ודא שכל שאר הפרמטרים הגלובליים נשארים בהגדרות היצרן.
- לחץ על התחל ואחזור פלט .txt קבוצות חלבונים לאחר ניתוח MaxQuant לניתוח נוסף בפרסאוס.
6. ניתוח סטטיסטי באמצעות פרסאוס
- טען את קובץ .txt קבוצות החלבונים בפרסאוס, הוסף את ערכי ה- iBAQ כעמודות ראשיות ומיין את כל העמודות האחרות לפי סוגן.
- סנן תעתועים ומזהמים על-ידי סינון שורות בהתבסס על העמודה הקטגוריאלית.
- סינון תוצאות בהתבסס על ערכים חוקיים. במקרה הנוכחי, כאשר רק שתי דגימות נכללו בניתוח, נבחר מספר מינימלי של ערך חוקי אחד.
- ייצא את פלט פרסאוס בפורמט .txt לעיבוד נוסף, לדוגמה, ב- Excel, והערך את התוצאות בנוגע לשאלת המחקר.
7. ולידציה של חלבונים נבחרים
הערה: שיטות נפוצות לאימות נתוני טרשת נפוצה הן, לדוגמה, צביעה אימונולוגית או כתם מערבי. בשל הצבע הכהה ואת autofluorescence של neuromelanin, צביעה אימונולוגית של חלבונים בתוך גרגירי neuromelanin או עם חזרת peroxidase - או נוגדנים מצומדים פלואורופור אינם ישימים. עבור ניתוח כתם מערבי, כמויות גדולות מאוד של רקמות שלאחר המוות יהיה צורך. לכן, חלבונים נבחרים מאומתים על ידי ספקטרומטריית מסה ממוקדת, ובמקרה הנוכחי הוקמו ניסויי ניטור תגובה מקבילים (PRM).
- בחר חלבונים לאימות. בחרו פפטידים של חלבונים אלה שכבר זוהו בניסויי DDA. פפטידים לא צריכים להכיל מחשוף או שינויים שהוחמצו כדי להבטיח כימות אמין.
הערה: יכולות להיות מספר סיבות לאימות של חלבון ספציפי אחד, לדוגמה, שפע דיפרנציאלי בתנאים הנחקרים. לקבלת התוצאות המייצגות, נבחרה dynein 1 שרשרת כבדה 1, שנמצאה בשפע שווה בדגימות NMG ו- SN ולכן יכולה לשמש כהפניה כדי להבטיח העמסת דגימה שווה. - השתמש בפפטידים שנבחרו כדי להגדיר את הגרסה הראשונה של שיטת PRM באמצעות תוכנת HPLC. שמור את כל הגדרות הכרומטוגרפיה והפרמטרים הגלובליים משיטת DDA.
- הוסף MS OT ו - tMS2 OT HCD כסוגי סריקה. ודא שההגדרות עבור MS OT זהות להגדרות של שיטת DDA. הגדרות מפורטות עבור שיטת PRM ניתן למצוא בטבלה משלימה 1.
- עבור tMS2 OT HCD, הוסף פפטידים נבחרים כרשימת הכללה. לכן, הוסף את רצף חומצות האמינו ואת ערך m/z שנצפה במדידות DDA. עבור ניסוי PRM הראשון, אל תוסיף חלונות זמן שמירה ואל תגדיר t start ל- 0 ו- t stop ל- 120 (עבור מעבר צבע של 120 דקות).
- הערך את שיטת PRM לאחר המדידה באמצעות תוכנה מתאימה, לדוגמה, Skyline, וקבל את זמן השמירה של הפפטידים שנוספו לרשימת ההכללה. עבור פפטידים כלולים, בדוק כי פסגות דומות ניתנות לצפייה עבור לפחות שלושה יונים מבשרים בסריקות MS1 וחמישה יוני שבר בסריקות MS2 עם שגיאת מסה נמוכה (±5 עמודים לדקה).
- מקד את שיטת PRM, לדוגמה, על-ידי הגדלת הרזולוציה עבור סריקת tMS2 OT HCD והוספת חלונות זמן שמירה לרשימת ההכללה.
הערה: חלונות זמן שמירה של 3 דקות נמצאו מתאימים היטב בניסויים הנוכחיים (זמן השמירה שנצפה בניסוי PRM הראשון ± 1.5 דקות). - בשיטת PRM המעודנת, בצע כימות של פפטידים וחלבונים מעניינים בהתבסס על אזור השיא הן ברמות MS1 והן ברמות MS2 עם תוכנה מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבידוד הספציפי של NMGs ורקמת SN הוא הצעד החשוב ביותר ליישום מוצלח של פרוטוקול זה. באמצעות הפונקציה Field of View Analysis בתוכנה המסופקת על-ידי הספק של LMD, ניתן לבחור NMGs באופן אוטומטי באופן תלוי צבע. לכן, יש לזהות אזורי רקמה המכילים NMGs (איור 2A) ולבצע ניתוח שדה ראייה עם ספי צבע מותאמים, וכתוצאה מכך לתייג NMGs (איור 2B). לאחר סינון של עצמים המכסים שטח מתחת ל-100 מיקרומטר רבוע, רק NMGs צריכים להישאר מסומנים לבידוד (איור 2C). בידוד מדויק של ה-NMGs המסומנים מושג לאחר התאמת הגדרות הלייזר (איור 2D). לאחר בידוד של NMGs (איור 2E), ניתן לבחור רקמת SN בהגדלה של פי 50 (איור 2F) ולבודד אותה (איור 2G) לצורך השוואה של הפרופיל הפרוטאומי. עבור רקמת SN, ניתן לדמיין אובייקטים מבודדים באמצעות פונקציית Cap Check (איור 2H). עבור שני סוגי הדגימות, NMG ו-SN, נמצא כי בידוד של 500,000 מיקרומטר2 של רקמת המוח מספיק לפרוטוקול זה, ומאפשר מינימום של שלוש ריצות MS לכל דגימה.
דוגמה מייצגת לניסוי DDA בן 120 דקות מוצגת באיור 3 (כאשר העמודה הראשית נשטפת ב-15 הדקות האחרונות של המדידה, הכרומטוגרמה נחתכת מעט לפני 105 דקות). השיטה המיושמת אמורה לאפשר אלוטיזציה של דגימה על פני השיפוע השלם, תוך יצירת פסגות חדות ותמציתיות ועוצמת זרם היונים הכולל (TIC) צריכה להיות דומה בכל הדגימות.
יישום הפרוטוקול המוצג על דגימה אחת של 500,000 μm² של NMG ודגימה אחת של רקמת SN של 1,000,000 μm² עם נפחים מותאמים לדגימות MS (5 μL עבור NMG ו- 2.5 μL עבור SN) כדי להבטיח עומס פפטידי זהה, הביא לזיהוי של 1,898 קבוצות חלבונים (PGs) בדגימת NMG ו-1,565 PGs בדגימת SN. השוואה נוספת גילתה 1,384 PGs שזוהו בשתי הדגימות, בעוד ש-514 PGs זוהו באופן בלעדי ב-NMG ו-181 PGs ברקמת SN (איור 4). בסך הכל זוהו 2,079 PGs בניסוי מייצג זה. השוואה עם מערך נתוני ייחוס ממחקר קודם22 הראתה כי 87.6% מה- PGs שדווחו באותו מחקר יכולים להיות מזוהים גם על ידי הפרוטוקול המתוקן והאוטומטי הנוכחי, המוכיח את תחולתו. יתר על כן, ניתן לשפר את מספר ה-PGs שזוהו ב-1,143.
מכיוון שכמויות דגימה מינימליות אינן מאפשרות יישום של שיטות אימות קלאסיות כגון כתמים מערביים, אימות של חלבונים מעניינים יכול להיות מושג על ידי גישות ספקטרומטריות מסה ממוקדות, למשל, PRM. תוצאות מייצגות עבור הפפטיד ESPEVLLTLDILK של החלבון דינין ציטופלסמי 1 שרשרת כבדה 1 מוצגות באיור 5. ערך ה-iBAQ של חלבון זה נמצא מעט גבוה יותר ב-NMGs בהשוואה ל-SN במדידות ה-DDA, שניתן לאמת על ידי ניסויי PRM בהתבסס על אזור השיא ב-MS1 (איור 5A,B,E) וברמת MS2 (איור 5C,D,F).
איור 1: זרימת עבודה לאפיון פרוטאומי של גרגירי נוירומלנין (NMGs) והרקמות הסובבות אותם (SN). דגימות NMG ו-SN בודדו מפרוסות רקמה באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD). חלבונים בודדו ובוצע עיכול טריפטי בתמיסה. הפפטידים שהתקבלו נותחו באמצעות מדידות LC-MS/MS במצב רכישה תלוית נתונים (DDA). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנות MaxQuant ופרסאוס. ולידציה של חלבונים נבחרים בוצעה בניסויי ניטור תגובה מקבילים (PRM). נתוני PRM נותחו באמצעות תוכנת Skyline. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בחירה ובידוד מבוסס LMD של דגימות NMG ו-SN. בתחילה, אזור המכיל NMGs, הנראה ללא כתמים נוספים בהגדלה של פי 400, ממוקם מתחת למיקרוסקופ (A). לאחר ביצוע ניתוח שדה ראייה, NMGs ואזורים כהים אחרים נבחרים (B). רק NMGs נשארים נבחרים לאחר סינון (C) ומבודדים לאחר התאמת הגדרות לייזר (D). לאחר שכל NMGs מבודדים (E), רקמת SN נבחרת עם הגדלה של פי 50 (F) ומבודדת (G). מכיוון שאובייקטים מבודדים עבור דגימות SN הם גדולים למדי, ניתן לראות אותם במכסה איסוף הדגימות באמצעות הפונקציה Cap Check (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: זרם יונים כולל (TIC) של מדידת DDA של 120 דקות. הכרומטוגרמה מראה את השפע היחסי של היונים המתאימים לפפטידים המאמירים בטווח זמן ההחזקה מ-0 עד ~105 דקות. מכיוון שהעמודה הראשית נשטפת ביןהדקה ה-105 ל-120, הכרומטוגרמה נחתכת בדקהה-105. עוצמת השיא הגבוהה ביותר היא 2.86 x 108. המספרים מעל הפסגות מציינים את זמן השמירה ואת היון הנפוץ ביותר של אותה פסגה ספציפית (BP=base peak). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דיאגרמת Venn המציגה את ההתאמה של קבוצות חלבונים (PGs) שזוהו ב-NMGs וברקמת SN. בסך הכל זוהו 1,898 PGs ב-NMGs ו-1,565 PGs ברקמת SN, מתוכם 1,384 PGs זוהו בשני אזורי הרקמות. 514 PGs זוהו באופן בלעדי ברקמת NMG, בעוד 181 PGs זוהו באופן בלעדי ברקמת SN. הדיאגרמה נוצרה באמצעות הכלי המקוון Venny25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תוצאות של ניסויי PRM עבור הפפטיד ESPEVLLTLDILK (דינין ציטופלסמי 1 שרשרת כבדה 1, ++). כרומטוגרמות ברמת MS1- (A,B) ו-MS2 (C,D), כמו גם אזורי שיא ברמת MS1- (E) ו-MS2 (F), מוצגים עבור דגימה מופתית של NMGs ורקמת SN. צבעים שונים משמשים לציון מבשרים שונים (ברמת MS1) או יוני מוצר (ברמת MS2). הכרומטוגרמות מוצגות לאחר ביצוע החלקה של סביצקי-גולאי. העוצמות ואזורי השיא היו דומים ברמת MS1- (A,B,E) ו-MS2 (C,D,F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה משלימה 1: פרמטרים של ניסויי ספקטרומטריית המסות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 2: פרמטרים של ניתוח MaxQuant. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD היא טכניקה ישימה באופן נרחב לבידוד של אזורי רקמה ספציפיים, תאים בודדים או מבנים תת-תאיים. בפרוטוקול המתוקן והאוטומטי המוצג כאן, טכניקה זו מיושמת לבידוד ספציפי של גרגירי נוירומלנין (NMGs) ורקמות סביב NMG (SN). עד כה פורסמו שתי גישות שונות לבידוד NMGs מתוך רקמת המוח האנושית שלאחר המוות ונעשה בהן שימוש נרחב:
א) גרדיאנט סוכרוז רציף הצורכת 1 גרם של רקמת סובסטנטיה ניגרה 20. מכיוון שרקמת ניגרה אנושית לאחר המוות היא נדירה ובעלת עניין רב למספר שאלות מחקר, למרבה הצער זה די מאתגר להקים מחקר עוקבה גדול אם נדרשות כמויות גבוהות של רקמה לכל מטופל. לכן, גישה זו שופרה עוד יותר הפחתת כמות הרקמה הנדרשת ל 0.15 גרם לבידוד מספיק של NMGs26. עם זאת, עדיין, נדרשה לפחות מחצית מ-substantia nigra pars compacta מלאה.
ב) כריתה של NMGs באמצעות LMD. בשנת 2016, Plum et al הקימו פרוטוקול חדש המבוסס על כריתה מדויקת של NMGs באמצעות LMD. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן היה להפחית את כמות הדגימה הנדרשת לעשרה מקטעי רקמה של 10 מיקרומטר, וכתוצאה מכך להפחית באופן מרשים את דגימת הרקמה הנדרשת מ-150 מ"ג ל-16.6 מ"ג22.
הפרוטוקול האופטימלי והאוטומטי מבוסס LMD המוצג כאן דורש כמויות דגימה נמוכות עוד יותר מכיוון שהיה צורך להשתמש בכמויות דגימה דקות יותר (5 מיקרומטר לעומת 10 מיקרומטר) ופחות מקטעי רקמה (מקסימום 7 לעומת 8) ודורש פחות זמן ליצירת דגימה (4 שעות לדגימה בהשוואה ל-1-2 ימים) באמצעות זיהוי NMG אוטומטי. לפיכך, זמן איסוף הדגימות הנדרש קוצר באופן מסיבי וניתן היה לשפר באופן דרסטי את מספר ה- PGs שזוהו על ידי יישום שיטת LC-MS ממוטבת ומכשור חדיש. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לשאלות מחקר אחרות ורקמות.
לצורך התאמת הפרוטוקול המוצג בנוגע לשאלות מחקר המוגדרות על ידי המשתמש, מודגשים ההיבטים הבאים על סמך ניסיון:
א) בידוד של כמויות דגימה דומות: מכיוון שתפוקת הפפטידים הצפויה של פרוטוקול זה נמוכה למדי בהשוואה, למשל, לתרביות תאים או ליזטים ברקמה, ייתכן שקביעת ריכוז הפפטידים לא תהיה אפשרית. לכן, חיוני כי כמויות שוות של רקמה מבודדים באמצעות LMD, אשר ניתן להעריך על סמך אזור הרקמה של האובייקטים שנבחרו. במערך הנוכחי, שטחי רקמה של 500,000 מיקרומטר רבוע מספיקים ליצירת פפטידים לשלוש מדידות MS לפחות.
ב) עיכול טריפסין: משך העיכול וריכוז הטריפסין צריכים להיות דומים בין דגימות.
ג) התאמת פרמטרים לרקמות שונות: בהתאם לרקמה שיש לנתח, יש להתאים את כמות הרקמה שנאספה ובכך יש צורך להתאים גם את כמות הטריפסין הנוסף. יחס טריפסין לחלבון לא צריך להיות נמוך מ 1:40.
ד) הגבלת תהליך ה- LMD: עבור בידוד מבוסס LMD של אובייקטים בעלי עניין, קיימות מגבלות בכל הנוגע לגודל האובייקטים שנבחרו ולעובי הפרוסות. עקב אובדן רקמות במהלך חיתוך מבוסס לייזר של הרקמה, חפצים הקטנים מ-100 מיקרומטר רבוע נחשבו קטנים מדי לבידוד.
ה) התאמה של פרמטרים של LC ו-MS: בהתאם למערכות LC ו-MS שבהן נעשה שימוש, יש להגדיל את כמות הרקמה המבודדת (למשל, בעת הפעלה עם מערכת מיקרו-זרימה) ולהתאים פרמטרים של MS (למשל, בעת עבודה עם מערכת גלאים מבוססת מלכודת יונים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי דה. NBI, פרויקט של משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (מענק מספר FKZ 031 A 534A) ומענקי P.U.R.E. (יחידת מחקר חלבונים רוהר בתוך אירופה) והמרכז לאבחון חלבונים (ProDi), שניהם ממשרד החדשנות, המדע והמחקר של נורדריין וסטפאליה, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
