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Neuroscience

न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल्स के प्रोटिओमिक प्रोफाइल के एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन-आधारित प्रोटोकॉल

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63289
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 5, 1,2, *1,2, *1,2
1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg
* These authors contributed equally

Summary

लेजर माइक्रोडिसेक्शन के माध्यम से मानव पोस्टमार्टम से न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल को अलग करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। यह संशोधित और अनुकूलित प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर नमूना संग्रह के लिए आवश्यक समय को कम करता है, आवश्यक नमूना राशि को कम करता है, और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण द्वारा प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण को बढ़ाता है।

Abstract

न्यूरोमेलेनिन एक काला-भूरा वर्णक है, जो तथाकथित न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल्स (एनएमजी) में मौजूद होता है। न्यूरोमेलेनिन के अलावा, एनएमजी में विभिन्न प्रकार के प्रोटीन, लिपिड और धातु होते हैं। यद्यपि एनएमजी युक्त डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स अधिमानतः पार्किंसंस रोग और लेवी निकायों के साथ मनोभ्रंश जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में खो जाते हैं, एनएमजी गठन के तंत्र और स्वास्थ्य और बीमारी में एनएमजी की भूमिका के बारे में केवल बहुत कम जानकारी है। इस प्रकार, एनएमजी के आणविक लक्षण वर्णन पर आगे का शोध आवश्यक है। दुर्भाग्य से, प्रोटीन के अलगाव के लिए मानक प्रोटोकॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पर आधारित होते हैं और इसलिए उच्च मात्रा में मानव ऊतक की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, एक स्वचालित लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) -आधारित प्रोटोकॉल यहां स्थापित किया गया है जो निष्पक्ष, स्वचालित तरीके से ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके एनएमजी और आसपास के ठोस निग्रा (एसएन) ऊतक के संग्रह की अनुमति देता है। उत्पादित नमूनों को बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनकी प्रोटिओमिक संरचना को समझने के लिए विश्लेषण किया जाता है। इस वर्कफ़्लो के साथ, 2,079 प्रोटीन की पहचान की गई थी, जिनमें से 514 प्रोटीन विशेष रूप से एनएमजी में और 181 एसएन में पहचाने गए थे। वर्तमान परिणामों की तुलना पिछले अध्ययन के साथ की गई है, जिसमें एक समान एलएमडी-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है, जो दोनों प्रोटिओम के लिए 87.6% के ओवरलैप तक पहुंचता है, जो यहां प्रस्तुत संशोधित और अनुकूलित प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता को सत्यापित करता है। वर्तमान निष्कर्षों को मान्य करने के लिए, रुचि के प्रोटीन का विश्लेषण लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया गया था, उदाहरण के लिए, समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (पीआरएम)-प्रयोग।

Introduction

प्रत्येक ऊतक में विभिन्न सेल प्रकारों का एक विषम मिश्रण होता है, लेकिन एक सेल प्रकार का विशिष्ट अलगाव अक्सर अधिक सटीक लक्षण वर्णन के लिए अपरिहार्य होता है। लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी), एक लेजर अनुप्रयोग के साथ एक माइक्रोस्कोप को युग्मित करना, एक जटिल समग्र से ऊतक क्षेत्रों, एकल कोशिकाओं या सेलुलर उपसंरचनाओं के विशिष्ट अलगाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलएमडी-एमएस) के साथ संयोजन में एलएमडी का अनुप्रयोग पहले से ही डीएनए1, आरएनए2 और प्रोटीन 3,4,5 के अलगाव सहित कई शोध प्रश्नों के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, पार्किंसंस रोग के नए पैथोमैकेनिज्म को समझने के लिए मानव पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक और उप-सेलुलर घटकों के प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक संशोधित और अनुकूलित एलएमडी-एमएस प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

न्यूरोमेलेनिन एक काला, लगभग अघुलनशील वर्णक है जो कैटेकोलामाइनर्जिक, डोपामाइन-उत्पादक न्यूरॉन्स में पाया जाताहै। प्रोटीन और लिपिड के साथ, यह एक डबल झिल्ली से घिरे ऑर्गेनेल जैसे कणिकाओं में जमा होता है, जिसे न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल (एनएमजी) 7,8,9 कहा जाता है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया10,11 के दौरान मात्रा और घनत्व में वृद्धि करने वाले मनुष्यों में तीन साल की उम्र से एनएमजी देखा जा सकता है। आज तक, न्यूरोमेलेनिन गठन पर कोई निश्चित परिकल्पना नहीं है, लेकिन एक धारणा यह है कि न्यूरोमेलेनिन डोपामाइन12 के ऑक्सीकरण के माध्यम से बनता है। अन्य परिकल्पनाएं न्यूरोमेलेनिन (जैसे, टायरोसिनेस) के एंजाइमेटिक उत्पादन पर आधारित हैं। न्यूरोमेलेनिन को लिपिड, विषाक्त पदार्थों, धातु आयनों और कीटनाशकों के लिए एक उच्च बाध्यकारी संबंध पाया गया था। इन निष्कर्षों के आधार पर, एनएमजी का गठन सेल को विषाक्त और ऑक्सीडेटिव पदार्थों के संचय और पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों से बचाने के लिए माना जाता है। इस न्यूरोप्रोटेक्टिव फ़ंक्शन के अलावा, इस बात के सबूत हैं कि न्यूरोमेलेनिन न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रभाव पैदा कर सकता है, उदाहरण के लिए, लोहे की संतृप्ति और मुक्त कणों के बाद के उत्प्रेरण16,17। इसके अलावा, न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं के दौरान जारी न्यूरोमेलेनिन को हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा विघटित किया जा सकता है, जो प्रतिक्रियाशील धातुओं और अन्य विषाक्त यौगिकों द्वारा नेक्रोसिस में तेजी ला सकता है जो पहले न्यूरोमेलेनिन से बंधे थे और न्यूरोइन्फ्लेमेशन और सेलुलर क्षति में योगदान कर सकतेहैं। हालांकि, अब तक पार्किंसंस रोग के दौरान न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं में एनएमजी की सटीक भूमिका स्पष्ट रूप से समझ में नहीं आई है। फिर भी, एनएमजी पार्किंसंस रोग के रोगजनन में शामिल प्रतीत होते हैं और न्यूरोडीजेनेरेशन में उनकी भूमिका को उजागर करने के लिए उनका विशिष्ट विश्लेषण अत्यंत महत्वपूर्ण है। दुर्भाग्य से, आम प्रयोगशाला जानवरों (जैसे, चूहों और चूहों) और सेल लाइनों में एनएमजी19 की कमी होती है। इसलिए, शोधकर्ता विशेष रूप से अपने विश्लेषण के लिए पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों पर भरोसा करते हैं। अतीत में, घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एनएमजी अलगाव उच्च मात्रा में ठोस निग्रा ऊतक20,21 की उपलब्धता पर निर्भर करता था। आज, एलएमडी विशेष रूप से मानव मस्तिष्क के नमूनों से एनएमजी को अलग करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रस्तुत करता है ताकि एलसी-एमएस / एमएस द्वारा उनका विश्लेषण किया जा सके।

इस प्रोटोकॉल में, एनएमजी और आसपास के ऊतक (एसएन) के अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल22 का एक बेहतर और स्वचालित संस्करण प्रस्तुत किया गया है, जो तेजी से नमूना उत्पादन, पहचाने गए और परिमाणित प्रोटीन की उच्च संख्या और आवश्यक ऊतक मात्रा में गंभीर कमी को सक्षम करता है।

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Protocol

जर्मन नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार, मानव मस्तिष्क के ऊतकों के उपयोग को रुहर-यूनिवर्सिटी बोचम, जर्मनी (फाइल नंबर 4760-13) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से प्राप्त ठोस निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा ऊतक स्लाइस पर लागू किया गया है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है।

1. ऊतक विभाजन

  1. क्रायोस्टेट कक्ष को प्रीकूल करें।
    नोट: प्रत्येक ऊतक को अलग-अलग क्रायोस्टेट तापमान की आवश्यकता होती है, जो संबंधित विक्रेता प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है।
  2. स्टेनलेस स्टील चाकू को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें और इसे ब्लेड धारक में स्थापित करें।
  3. ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से क्रायोस्टैट में एक आइसबॉक्स का उपयोग करके स्थानांतरित करें और इसे 15 मिनट के लिए क्रायोस्टेट कक्ष तापमान में समायोजित करें।
  4. स्पष्ट रूप से एक पेंसिल का उपयोग करके झिल्ली स्लाइड लेबल करें।
    नोट: एलएमडी-आधारित नमूना संग्रह के लिए पीईटी / पेन झिल्ली स्लाइड की आवश्यकता होती है। पीईटी / पेन झिल्ली स्लाइड को देखभाल के साथ संभालें क्योंकि वे बेहद नाजुक हैं।
  5. ऊतक धारक पर वाणिज्यिक जमे हुए अनुभाग माध्यम की एक बूंद लागू करें। इससे पहले कि यह पूरी तरह से जमे हुए हो, ऊतक को जमे हुए खंड माध्यम पर रखें और इसे कठोर होने दें, ताकि ऊतक ऊतक धारक से जुड़ा हो।
  6. क्रायोस्टेट कक्ष में ऊतक धारक स्थापित करें और सेक्शनिंग शुरू करने से पहले इसके अभिविन्यास को समायोजित करें। इष्टतम धारक अभिविन्यास ऊतक के अभिविन्यास पर निर्भर करता है।
    नोट: जब तक स्लाइस के लिए आवश्यक अनुभाग विमान तक नहीं पहुंच जाता है तब तक ऊतक को ट्रिम करना आवश्यक हो सकता है।
  7. रुचि के ऊतक क्षेत्र तक पहुंचने से पहले, काटने की सेटिंग को वांछित ऊतक मोटाई में समायोजित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए 5 या 10 μm की मोटाई सुझाई गई है क्योंकि 20 μm मोटे खंडों को LMD-आधारित नमूना संग्रह22 के साथ असंगत पाया गया था।
  8. दो खंडों को काटें और उन्हें छोड़ दें।
  9. एंटी-रोल प्लेट को नीचे रखें।
  10. ऊतक के एक खंड को काटें, एंटी-रोल प्लेट को सावधानी से खोलें, एक झिल्ली स्लाइड लें, और झिल्ली स्लाइड पर ऊतक अनुभाग रखते समय ऊतक को मोड़ने से रोकें।
    नोट: आसंजन से पहले कमरे के तापमान पर झिल्ली स्लाइड को संग्रहीत करना सटीक नमूना लगाव को सक्षम बनाता है। एक ही झिल्ली स्लाइड पर कई खंड रखे जा सकते हैं लेकिन ऊतक ओवरलैपिंग को रोका जाना चाहिए।
  11. सेक्शनिंग पूरी होने तक क्रायोस्टैट में झिल्ली स्लाइड पर रखे गए ऊतक वर्गों को स्टोर करें।
  12. क्रायोसंक्रमित ऊतक को आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे नीचे दी गई प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागित ऊतक स्लाइड स्टोर करें।

2. लेजर माइक्रोडिसेक्शन और प्रेशर कैटेपलिंग

नोट: चूंकि न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल अपने काले-भूरे रंग के कारण किसी भी धुंधलापन के बिना दिखाई देते हैं, इस प्रोटोकॉल के लिए कोई धुंधलापन आवश्यक नहीं है। फिर भी, यदि आवश्यक हो तो विभिन्न धुंधला प्रक्रियाओं को इस प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है। ध्यान रखें कि ब्लॉकिंग समाधान या एंटीबॉडी का उपयोग एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण को प्रभावित करेगा।

  1. MicroBeam सिस्टम पर स्विच करें और कंप्यूटर पर संबंधित सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. ऊतक को रोबोस्टेज पर स्लाइडहोल्डर में ऊतक झिल्ली स्लाइड रखें जिसमें ऊतक ऊपर की ओर हो।
    नोट: एलएमडी डिवाइस के आधार पर, झिल्ली स्लाइड को इस तरह रखना आवश्यक हो सकता है कि ऊतक नीचे की ओर है। सामान्य तौर पर, नमूना संग्रह इष्टतम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए तापमान-नियंत्रित वातावरण में किया जाता है।
  3. अवलोकन स्कैन के लिए माइक्रोस्कोप को वांछित आवर्धन (यहां 50 गुना उपयोग किया जाता है) पर सेट करें।
  4. ऊतक अनुभाग का अवलोकन स्कैन प्राप्त करने के लिए स्कैन फ़ंक्शन का उपयोग करें, जो सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस के नेविगेटर विंडो में पाया जा सकता है। रुचि के क्षेत्र के ऊपरी-बाएँ कोने और निचले-दाएँ कोने की खोज करें और उन्हें सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में चुनें। फिर, स्कैन करने के लिए सभी ROIs स्कैन करें का चयन करें।
    नोट: अवलोकन स्कैन अनिवार्य नहीं हैं, लेकिन वे स्लाइड में बेहतर अभिविन्यास सक्षम करते हैं और बाद में उपयोग के लिए सहेजे जा सकते हैं।
  5. उपयुक्त ऊतक के लिए माइक्रोस्कोप के आवर्धन को समायोजित करें, जो न्यूरोमेलेनिन कणिकाओं के वर्तमान मामले में 400 गुना है।
  6. न्यूरोमेलेनिन कणिकाओं के साथ एक क्षेत्र की खोज करें। सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में दृश्य विश्लेषण के क्षेत्र का चयन करें, इनवर्ट परिणाम का चयन करें, और आरजीबी चैनलों के लिए दहलीज सेट करें ताकि पूर्वावलोकन विंडो में केवल न्यूरोमेलेनिन कणिकाओं को लाल रंग में हाइलाइट किया जा सके। दृश्य क्षेत्र के लिए समायोजित सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए ठीक पर क्लिक करें।
    नोट: ऐसा हो सकता है कि गहरे रंग वाली छोटी वस्तुओं को भी चुना जाता है। इसके लिए, न्यूरोमेलेनिन कणिकाओं को अलग करने से पहले 100 μm2 से छोटे क्षेत्र को कवर करने वाली सभी वस्तुओं को छोड़ दें। ऐसा करने के लिए, टूलबार में आइकन पर क्लिक करके तत्व सूची खोलें, विचाराधीन स्लाइड का चयन करें और क्षेत्र के अनुसार तत्वों को क्रम दें। 100 μm2 से छोटे क्षेत्रों वाले क्षेत्रों का चयन करें और उन्हें हटा दें।
  7. स्लाइड के एक क्षेत्र का उपयोग करके लेजर सेटिंग्स समायोजित करें जो केवल झिल्ली द्वारा कवर किया गया है।
    नोट: कट लेजर समायोजन विज़ार्ड का उपयोग करने और सॉफ़्टवेयर के निर्देशों का पालन करने का सुझाव दिया जाता है। आवश्यक लेजर सेटिंग्स विभिन्न स्लाइडों के बीच भिन्न हो सकती हैं। 400 गुना आवर्धन के साथ 5 μm खंडों के लिए, विशिष्ट सेटिंग्स 32 ऊर्जा और काटने के लिए 51 फोकस हैं, और लेजर पल्स कैटापुल्टिंग (LPC) के लिए 28 ऊर्जा और -1 फोकस हैं।
  8. उचित अलगाव सुनिश्चित करने के लिए स्थिति और काटने के लिए गति सेटिंग्स समायोजित करें।
    नोट: एनएमजी अलगाव के लिए 30% गति इष्टतम पाई गई।
  9. नमूना संग्रह ट्यूब कैप को 50 μL अल्ट्राप्योर पानी से भरें और टोपी को रोबोमवर के कलेक्टर में डालें।
    नोट: वर्तमान प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूब कलेक्टर एक समय में एक नमूना संग्रह ट्यूब ले जा सकते हैं।
  10. नमूना संग्रह शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग करके रोबोस्टेज II के ऊपर रोबोमवर रखें।
    नोट: ऐसा करने के लिए, RoboMover विंडो खोलें, जो कलेक्टर प्रदर्शित करता है। कैप को कार्य क्षेत्र में ले जाने के लिए रोबोमओवर विंडो में प्रदर्शित नमूना संग्रह ट्यूब कैप पर क्लिक करें। रोबोमओवर विंडो में इष्टतम चलती और काम करने की ऊंचाई समायोजित करें। अन्यथा, टोपी में पानी स्लाइड पर गिर सकता है या गुले हुए ऑब्जेक्ट कैप तक नहीं पहुंचेंगे।
  11. लेजर शुरू करें। लेजर प्रक्रिया के दौरान ऊर्जा और फोकस सेटिंग्स को नियंत्रित करें और यदि आवश्यक हो तो सेटिंग्स को समायोजित करें। कम से कम पहले दस वस्तुओं के लिए नमूना संग्रह ट्यूब कैप में पृथक वस्तुओं का उचित अलगाव और कैटलिंग सुनिश्चित करें।
    नोट: उचित अलगाव और कैटलपिंग को नेत्रहीन रूप से जांचना होगा। दोनों के परिणामस्वरूप ऊतक स्लाइस में पूर्व-चयनित वस्तु के आकार का ऊतक-मुक्त क्षेत्र होना चाहिए ( चित्रा 2 सी, डी देखें)। लेजर सेटिंग्स को समायोजित करें यदि वस्तु काटने और गुलेलने के बाद ऊतक स्लाइस से जुड़ी रहती है। कैटल्टिंग के लिए, सेंटररोबोएलपीसी विकल्प एनएमजी अलगाव के लिए अच्छी तरह से अनुकूल पाया गया है। तत्व सूची में प्रत्येक चयनित ऑब्जेक्ट के लिए कैटलपिंग सेटिंग्स समायोजित की जा सकती हैं।
  12. जब नमूनाकरण पूरा हो जाता है, तो रोबोमोवर को इसकी प्रारंभिक स्थिति में नेविगेट करें। नमूना संग्रह ट्यूब निकालें।
    नोट: जब एकत्रित वस्तुओं की संख्या कम होती है और वस्तुएं काफी बड़ी होती हैं, तो कैप चेक पर क्लिक करके नमूना संग्रह सुनिश्चित किया जा सकता है, जो नमूना संग्रह ट्यूब कैप को माइक्रोस्कोप के नीचे रखेगा ताकि टोपी में पानी के अंदर वस्तुओं की संख्या की गणना की जा सके ( चित्रा 2 एच देखें)।
  13. सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके नमूने को स्पिन करें। सेंट्रीफ्यूज के त्वरण के कारण बढ़ते केन्द्रापसारक बल के साथ 5 सेकंड के छोटे स्पिन पर्याप्त पाए गए। इस बिंदु पर, -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें, क्योंकि सभी नमूनों को एक साथ संसाधित किया जाना चाहिए।
    नोट: प्रोटिओमिक प्रोफाइल की तुलना के लिए, एनएमजी के आसपास के ऊतक को भी उनके छांटने के बाद अलग किया गया था। आसपास के ऊतक का अलगाव 50 गुना आवर्धन पर किया गया था।
  14. नमूनों को वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाएं। 1.5 घंटे 50 μL पानी के लिए पर्याप्त पाए गए।
  15. ऊतक को 20 मिनट (कमरे के तापमान) के लिए 40 μL फॉर्मिक एसिड में घुलनशील और लाइस करें।
  16. सोनिकेशन स्नान में 5 मिनट के लिए 45 kHz (किलोहर्ट्ज़) पर सोनिकेशन द्वारा ऊतक लाइसिस को बढ़ाएं। ट्यूबों को पिघलने से रोकने के लिए बर्फ के साथ सोनिकेशन स्नान भरें। आगे की प्रक्रिया तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. ट्राइप्टिक पाचन

  1. बर्फ पर नमूने डीफ्रीज करें।
  2. वैक्यूम कंसंट्रेटर में नमूनों को पूरी तरह से सुखाएं।
  3. नमूने को एक उपयुक्त पाचन बफर के 50 μL के साथ भरें, उदाहरण के लिए, 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट।
  4. 200 mM 1,4-dithiothreitol के 1.25 μL के अतिरिक्त, नमूनों को थर्मोमिक्सर का उपयोग करके 60 डिग्री सेल्सियस और 300 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और बाद में उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा करें।
  5. फिर, 1.36 μL 0.55 M iodoacetamide के अतिरिक्त अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी पर नमूने इनक्यूबेट करें।
  6. नमूनों में ट्रिप्सिन की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (~ 16 घंटे) नमूने को इनक्यूबेट करें।
    नोट: 1,000,000 μm2 के लिए, ट्रिप्सिन का 0.1 μg पर्याप्त पाया गया था।
  7. पाचन को रोकने के लिए नमूनों में 10% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए) का 2.6 μL जोड़ें (0.5% टीएफए की अंतिम एकाग्रता)।
  8. वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके नमूनों को पूरी तरह से सुखाएं। फिर, 0.1% टीएफए के साथ एक परिभाषित अंतिम मात्रा तक नमूने भरें। एनएमजी नमूने 20 μL तक भरे गए थे, जिनमें से 5 μL का उपयोग एक मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) प्रयोग के लिए किया गया था।
  9. आगे के उपयोग तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अमीनो एसिड विश्लेषण या किसी अन्य उपयुक्त परिमाणीकरण विधि (जैसे, प्रत्यक्ष पता लगाने) द्वारा पेप्टाइड एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: उल्लिखित तकनीकों का उपयोग करके कम नमूना मात्रा मात्रात्मक नहीं हो सकती है। समान नमूना लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक नमूने में पृथक ऊतक की समान मात्रा होनी चाहिए और प्रत्येक नमूने को समान रूप से इलाज किया जाना चाहिए।

4. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री

नोट: निम्नलिखित उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) विश्लेषण यहां उपयोग किए जाने वाले ट्रैपिंग कॉलम डिवाइस और मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ विशिष्ट एलसी सिस्टम के लिए अनुकूलित हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य एलसी और एमएस सिस्टम के लिए, मापदंडों के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है।

  1. सॉफ्टवेयर Xcalibur का उपयोग करके, HPLC सेटिंग्स को निम्नानुसार समायोजित करें।
    1. ट्रैप कॉलम: तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, प्रवाह दर को 30 μL / min पर सेट करें, बफर को 0.1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड पर चलाएं।
    2. विश्लेषणात्मक सी 18 रिवर्स-फेज कॉलम: तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, प्रवाह दर को 30 μL / min तक सेट करें, बफर ए को 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड चलाएं, बफर बी को 84% एसिटोनिट्राइल तक चलाएं, और 98 मिनट में बफर बी को 5% -30% तक चलाने के लिए ढाल दें।
      नोट: ढाल का अनुकूलन अपरिहार्य हो सकता है और विभिन्न ऊतकों या कोशिकाओं का उपयोग करते समय दृढ़ता से अनुशंसित किया जाता है। ढाल की शुरुआत में नमूना लोडिंग और ढाल के अंत में नमूना धोने के कारण कुल ढाल समय भिन्न हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में कुल ढाल में 7 मिनट नमूना लोडिंग और 15 मिनट के लिए अतिरिक्त कॉलम वॉश होता है जिसके परिणामस्वरूप 120 मिनट का कुल ढाल समय होता है।
  2. एक्सकैलिबर इंस्ट्रूमेंट सेटअप का उपयोग करके एक डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विधि बनाएं, जिसे एचपीएलसी सॉफ्टवेयर रोडमैप मेनू में पाया जा सकता है।
  3. ग्लोबल पैरामीटर टैब में, इन्फ्यूजन मोड लिक्विड क्रोमैटोग्राफी, अपेक्षित एलसी पीक चौड़ाई (30 एस), और डिफ़ॉल्ट चार्ज स्थिति (2) को परिभाषित करें।
  4. स्कैन पैरामीटर टैब पर आगे बढ़ें और उल्लिखित क्रम में निम्नलिखित स्कैन और फिल्टर जोड़ें: एमएस ओटी, एमआईपीएस, तीव्रता, चार्ज स्टेट, डायनेमिक बहिष्करण, और डीडीएमएस 2 ओटी एचसीडी।
    नोट: प्रत्येक स्कैन और फ़िल्टर के लिए विस्तृत पैरामीटर सेटिंग्स पूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है। इष्टतम एमएस और डीडीए सेटिंग्स उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ-साथ नमूना प्रकार के लिए भिन्न हो सकती हैं और इसलिए, अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  5. अक्रिय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक ग्लास शीशी इनलेट्स में 0.1% टीएफए की परिभाषित मात्रा में नमूना पेप्टाइड्स के 200-400 एनजी को भंग करके नमूने तैयार करें। यदि कम नमूना राशि के कारण एकाग्रता निर्धारण लागू नहीं होता है, तो कुल आयन धारा (टीआईसी) की तुलना करके समान नमूना लोडिंग को सत्यापित करें।
    नोट: ऐसा करने के लिए, एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर में मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक माप की परिणामी फ़ाइल खोलें, उदाहरण के लिए, फ्रीस्टाइल, और क्रोमैटोग्राम की जांच करें। तीव्रता सभी नमूनों के लिए तुलनीय होनी चाहिए। एक प्रतिनिधि टीआईसी चित्रा 3 में दिखाया गया है।
  6. एक प्रोटिओमिक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त कच्चे डेटा का विश्लेषण करें, उदाहरण के लिए, मैक्सक्वांट23, प्रोटिओमिक्स के लिए प्रोजेनेसिस क्यूआई, या प्रोटिओम डिस्कवर, और शोध प्रश्न के आधार पर एक सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण करें।

5. मैक्सक्वांट का उपयोग करप्रोटिओमिक कच्चे डेटा का विश्लेषण

नोट: मैक्सक्वांट मापदंडों पर एक विस्तृत जानकारी पूरक तालिका 2 में प्रदान की गई है। वे संक्षेप में नीचे वर्णित हैं।

  1. लोड क्लिक करके कच्चे डेटा हेडर में मैक्सक्वांट सॉफ़्टवेयर में कच्ची फ़ाइलों को लोड करें।
  2. प्रयोग सेट पर क्लिक करके नमूना नाम असाइन करें.
  3. समूह-विशिष्ट पैरामीटर निर्धारित करें. सबसे पहले, संशोधन जोड़ें। नमूना प्रसंस्करण के कारण, परिवर्तनीय संशोधनों के रूप में डीमिडेशन (एनक्यू), ऑक्सीकरण (एम), और कार्बामिडोमिथाइलेशन (एन-टर्म) चुनें, और निश्चित संशोधन के रूप में कार्बामिडोमिथाइलेशन (सी) जोड़ें।
  4. पाचन टैब में पाचन एंजाइम के रूप में ट्रिप्सिन चुनें।
  5. लेबल मुक्त परिमाणीकरण टैब में लेबल मुक्त परिमाणीकरण विकल्प LFQ जोड़ें। यदि 10 से अधिक फ़ाइलों को संसाधित किया जाना है, तो प्रसंस्करण समय को छोटा करने के लिए फास्ट एलएफक्यू विकल्प चुनें। प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए एक उपाय के रूप में iBAQ विकल्प जोड़ें24.
  6. सुनिश्चित करें कि अन्य सभी समूह-विशिष्ट पैरामीटर फ़ैक्टरी सेटिंग्स में रहते हैं।
  7. ग्लोबल पैरामीटर टैब पर आगे बढ़ें और अनुक्रम टैब में uniprot.org से प्राप्त FASTA फ़ाइल जोड़ें। तदनुसार पहचानकर्ता नियम को संशोधित करें और होमो सेपियन्स के लिए इस मामले में, 9606 टैक्सोनॉमी आईडी जोड़ें।
  8. प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए अद्वितीय और रेज़र पेप्टाइड्स चुनें।
  9. सुनिश्चित करें कि अन्य सभी वैश्विक पैरामीटर फ़ैक्टरी सेटिंग्स में रहते हैं।
  10. प्रारंभ पर क्लिक करें और पर्सियस में आगे के विश्लेषण के लिए मैक्सक्वांट विश्लेषण के बाद प्रोटीनग्रुप.txt आउटपुट को पुनः प्राप्त करें।

6. पर्सियस का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. पर्सियस में प्रोटीनग्रुप.txt फ़ाइल लोड करें, आईबीएक्यू मानों को मुख्य कॉलम के रूप में जोड़ें, और अन्य सभी कॉलम को उनके प्रकार के अनुसार सॉर्ट करें।
  2. श्रेणीबद्ध स्तंभ के आधार पर पंक्तियों को फ़िल्टर करके डिकॉय और संदूषकों को फ़िल्टर करें.
  3. मान्य मानों के आधार पर परिणाम फ़िल्टर करें. वर्तमान मामले में, विश्लेषण में शामिल केवल दो नमूनों के साथ, एक वैध मूल्य की न्यूनतम संख्या चुनी गई थी।
  4. पर्सियस आउटपुट को आगे की प्रक्रिया के लिए .txt प्रारूप में निर्यात करें, उदाहरण के लिए, एक्सेल में, और शोध प्रश्न के बारे में परिणामों का मूल्यांकन करें।

7. चयनित प्रोटीन का सत्यापन

नोट: एमएस डेटा के सत्यापन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके हैं, उदाहरण के लिए, इम्यूनोलॉजिकल स्टेनिंग या वेस्टर्न ब्लोट। गहरे रंग और न्यूरोमेलेनिन के ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण, न्यूरोमेलेनिन कणिकाओं के अंदर प्रोटीन का इम्यूनोलॉजिकल धुंधलापन या तो हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज- या फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लागू नहीं होता है। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए, पोस्टमार्टम ऊतक की बहुत बड़ी मात्रा आवश्यक होगी। इसलिए, चयनित प्रोटीन को लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मान्य किया जाता है, और वर्तमान मामले में, समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (पीआरएम) -प्रयोग स्थापित किए गए थे।

  1. सत्यापन के लिए प्रोटीन का चयन करें। डीडीए प्रयोगों में पहले से ही पाए गए इन प्रोटीनों के पेप्टाइड्स चुनें। पेप्टाइड्स में विश्वसनीय परिमाणीकरण सुनिश्चित करने के लिए कोई छूटी हुई दरार या संशोधन नहीं होना चाहिए।
    नोट: एक विशिष्ट प्रोटीन के सत्यापन के कई कारण हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, जांच की गई स्थितियों में अंतर बहुतायत। प्रतिनिधि परिणामों के लिए, साइटोप्लाज्मिक डायनिन 1 भारी श्रृंखला 1 का चयन किया गया है, जो एनएमजी और एसएन नमूनों में समान रूप से प्रचुर मात्रा में पाया गया था और इसलिए समान नमूना लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. एचपीएलसी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पीआरएम-विधि का पहला संस्करण सेट करने के लिए चयनित पेप्टाइड्स का उपयोग करें। डीडीए विधि से सभी क्रोमैटोग्राफी और वैश्विक पैरामीटर सेटिंग्स रखें।
  3. स्कैन प्रकारों के रूप में एमएस ओटी और टीएमएस2 ओटी एचसीडी जोड़ें। सुनिश्चित करें कि एमएस ओटी के लिए सेटिंग्स डीडीए विधि के समान हैं। पीआरएम विधि के लिए विस्तृत सेटिंग्स पूरक तालिका 1 में पाई जा सकती हैं।
  4. टीएमएस2 ओटी एचसीडी के लिए, चयनित पेप्टाइड्स को समावेश सूची के रूप में जोड़ें। इसलिए, डीडीए माप में देखे गए एमिनो एसिड अनुक्रम और एम / जेड मान जोड़ें। पहले पीआरएम प्रयोग के लिए, अवधारण समय विंडो न जोड़ें या टी स्टार्ट से 0 और टी स्टॉप को 120 (120 मिनट ढाल के लिए) सेट न करें।
  5. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके माप के बाद पीआरएम विधि का मूल्यांकन करें, उदाहरण के लिए, स्काईलाइन, और समावेश सूची में जोड़े गए पेप्टाइड्स के प्रतिधारण समय को प्राप्त करें। शामिल पेप्टाइड्स के लिए, जांचें कि तुलनीय चोटियां एमएस 1 स्कैन में कम से कम तीन अग्रदूत आयनों और एमएस 2 स्कैन में पांच टुकड़े आयनों के लिए कम द्रव्यमान त्रुटि (±5 पीपीएम) के साथ देखने योग्य हैं।
  6. उदाहरण के लिए, टीएमएस2 ओटी एचसीडी स्कैन के लिए रिज़ॉल्यूशन बढ़ाकर और समावेश सूची में अवधारण समय विंडो जोड़कर पीआरएम विधि को परिष्कृत करें।
    नोट: 3 मिनट की अवधारण समय खिड़कियां वर्तमान प्रयोगों में अच्छी तरह से अनुकूल पाई गईं (पहले पीआरएम प्रयोग में प्रतिधारण समय 1.5 मिनट ± देखा गया)।
  7. परिष्कृत पीआरएम-विधि के साथ, उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ एमएस 1 और एमएस 2 दोनों स्तरों पर चरम क्षेत्र के आधार पर पेप्टाइड्स और प्रोटीन की मात्रा का परिमाणीकरण करें।

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Representative Results

एनएमजी और एसएन ऊतक का विशिष्ट अलगाव इस प्रोटोकॉल के सफल अनुप्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। एलएमडी के विक्रेता-प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर में फील्ड ऑफ व्यू एनालिसिस फ़ंक्शन का उपयोग करके, एनएमजी को स्वचालित रूप से रंग-निर्भर तरीके से चुना जा सकता है। इसलिए, एनएमजी (चित्रा 2 ए) वाले ऊतक क्षेत्रों की पहचान की जानी चाहिए और समायोजित रंग थ्रेसहोल्ड के साथ एक फील्ड ऑफ व्यू एनालिसिस किया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप एनएमजी (चित्रा 2 बी) की लेबलिंग होती है। 100 μm² से नीचे के क्षेत्र को कवर करने वाली वस्तुओं को फ़िल्टर करने के बाद, केवल NMG को अलगाव के लिए लेबल किया जाना चाहिए (चित्रा 2C)। लेबल किए गए एनएमजी का सटीक अलगाव लेजर सेटिंग्स को समायोजित करने के बाद प्राप्त किया जाता है (चित्रा 2 डी)। एनएमजी (चित्रा 2 ई) के अलगाव के बाद, एसएन ऊतक को प्रोटिओमिक प्रोफाइल की तुलना के लिए 50 गुना आवर्धन (चित्रा 2 एफ) और पृथक (चित्रा 2 जी) के साथ चुना जा सकता है। एसएन ऊतक के लिए, अलग-थलग वस्तुओं को कैप चेक फ़ंक्शन (चित्रा 2 एच) का उपयोग करके देखा जा सकता है। दोनों नमूना प्रकारों, एनएमजी और एसएन के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों के 500,000 μm2 का अलगाव इस प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त पाया गया, जिससे प्रति नमूना न्यूनतम तीन एमएस रन सक्षम हुए।

120 मिनट डीडीए प्रयोग का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया है (चूंकि मुख्य स्तंभ माप के अंतिम 15 मिनट में धोया जाता है, क्रोमैटोग्राम को 105 मिनट से ठीक पहले क्रॉप किया जाता है)। लागू विधि को पूर्ण ढाल पर एक नमूना क्षालन की अनुमति देनी चाहिए, तेज और संक्षिप्त चोटियों का निर्माण करना चाहिए और कुल आयन धारा (टीआईसी) की तीव्रता सभी नमूनों में तुलनीय होनी चाहिए।

एनएमजी के 500,000 μm² के एक नमूने पर प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग और MS नमूनों के लिए समायोजित मात्रा के साथ 1,000,000 μm² SN ऊतक के एक नमूने (NMG के लिए 5 μL और SN के लिए 2.5 μL) के परिणामस्वरूप NMG नमूने में 1,898 प्रोटीन समूहों (PGs) और SN नमूने में 1,565 PGs की पहचान हुई। आगे की तुलना से पता चला कि दोनों नमूनों में 1,384 पीजी की पहचान की गई थी, जबकि 514 पीजी को विशेष रूप से एनएमजी में और 181 पीजी को एसएन ऊतक में पहचाना गया था (चित्रा 4)। कुल मिलाकर, इस प्रतिनिधि प्रयोग में 2,079 पीजी की पहचान की गई थी। एक पूर्व अध्ययन22 के संदर्भ डेटासेट के साथ तुलना से पता चला है कि उस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए 87.6% पीजी को वर्तमान संशोधित और स्वचालित प्रोटोकॉल द्वारा भी पहचाना जा सकता है, जो इसकी प्रयोज्यता साबित करता है। इसके अलावा, पहचाने गए पीजी की संख्या में 1,143 तक सुधार किया जा सकता है।

चूंकि न्यूनतम नमूना मात्रा वेस्टर्न ब्लोट्स जैसे क्लासिक सत्यापन विधियों के आवेदन की अनुमति नहीं देती है, इसलिए रुचि के प्रोटीन का सत्यापन लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक दृष्टिकोण, जैसे, पीआरएम द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक डायनिन 1 भारी श्रृंखला 1 के पेप्टाइड ESPEVLLTLDILK के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5 में दिखाए गए हैं। इस प्रोटीन का आईबीएक्यू मूल्य डीडीए माप में एसएन की तुलना में एनएमजी में थोड़ा अधिक पाया गया, जिसे एमएस 1- (चित्रा 5 ए, बी, ई) और एमएस 2-स्तर (चित्रा 5 सी, डी, एफ) पर शिखर क्षेत्र के आधार पर पीआरएम-प्रयोगों द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल्स (एनएमजी) और आसपास के ऊतक (एसएन) के प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए वर्कफ़्लो। एनएमजी और एसएन नमूने लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) के माध्यम से ऊतक स्लाइस से अलग किए गए थे। प्रोटीन को अलग किया गया और ट्राइप्टिक इन-सॉल्यूशन पाचन किया गया। परिणामी पेप्टाइड्स का विश्लेषण डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड में एलसी-एमएस / एमएस माप के माध्यम से किया गया था। डेटा विश्लेषण मैक्सक्वांट और पर्सियस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। चयनित प्रोटीन का सत्यापन समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (पीआरएम) प्रयोगों के साथ किया गया था। स्काईलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पीआरएम-डेटा का विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एनएमजी और एसएन नमूनों का चयन और एलएमडी-आधारित अलगाव। सबसे पहले, एनएमजी युक्त एक क्षेत्र, जो 400 गुना आवर्धन पर आगे धुंधला किए बिना दिखाई देता है, माइक्रोस्कोप (ए) के नीचे रखा जाता है। फील्ड ऑफ व्यू एनालिसिस करने के बाद, एनएमजी और अन्य अंधेरे क्षेत्रों का चयन किया जाता है (बी)। फ़िल्टरिंग (सी) के बाद केवल एनएमजी का चयन किया जाता है और लेजर सेटिंग्स को समायोजित (डी) करने के बाद अलग किया जाता है। सभी एनएमजी को अलग (ई) करने के बाद, एसएन ऊतक को 50 गुना आवर्धन (एफ) और पृथक (जी) के साथ चुना जाता है। चूंकि एसएन नमूनों के लिए अलग की गई वस्तुएं काफी बड़ी हैं, इसलिए उन्हें कैप चेक फ़ंक्शन (एच) का उपयोग करके नमूना संग्रह कैप में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: 120 मिनट डीडीए माप का कुल आयन प्रवाह (टीआईसी)। क्रोमैटोग्राम प्रतिधारण समय सीमा पर एल्यूटिंग पेप्टाइड्स के अनुरूप आयनों की सापेक्ष बहुतायत को दर्शाता है जो 0 से ~ 105 मिनट तक होता है। चूंकि मुख्य स्तंभ को 105वें और 120वें मिनट के बीच धोया जाता है, क्रोमैटोग्राम को 105वें मिनट पर क्रॉप किया जाता है। उच्चतम शिखर की तीव्रता 2.86 x 108 है। चोटियों के ऊपर की संख्या प्रतिधारण समय और उस विशिष्ट शिखर (बीपी = बेस पीक) के सबसे प्रचुर आयन को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वेन आरेख एनएमजी और एसएन ऊतक में पहचाने गए प्रोटीन समूहों (पीजी) के पत्राचार को दर्शाता है। कुल मिलाकर, एनएमजी में 1,898 पीजी और एसएन ऊतक में 1,565 पीजी की पहचान की गई थी, जिनमें से 1,384 पीजी की पहचान दोनों ऊतक क्षेत्रों में की गई थी। 514 पीजी को विशेष रूप से एनएमजी ऊतक में पहचाना गया था, जबकि 181 पीजी को विशेष रूप से एसएन ऊतक में पहचाना गया था। आरेख ऑनलाइन उपकरण वेनी25 का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पेप्टाइड ESPEVLLTLDILK (साइटोप्लाज्मिक डायनिन 1 भारी श्रृंखला 1, ++) के लिए पीआरएम-प्रयोगों के परिणाम। एमएस 1- (ए, बी) और एमएस 2-स्तर (सी, डी) पर क्रोमैटोग्राम, साथ ही एमएस 1- (ई) और एमएस 2-स्तर (एफ) पर पीक क्षेत्रों को एनएमजी और एसएन ऊतक के अनुकरणीय नमूने के लिए दिखाया गया है। विभिन्न अग्रदूतों (एमएस 1-स्तर पर) या उत्पाद आयनों (एमएस 2-स्तर पर) को निरूपित करने के लिए विभिन्न रंगों का उपयोग किया जाता है। सैविट्ज़की-गोले स्मूथिंग के प्रदर्शन के बाद क्रोमैटोग्राम प्रदर्शित किए जाते हैं। तीव्रता और शिखर क्षेत्र एमएस 1- (ए, बी, ई) और एमएस 2-स्तर (सी, डी, एफ) पर तुलनीय थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों के पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: मैक्सक्वांट विश्लेषण के पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एलएमडी विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों, एकल कोशिकाओं या उपकोशिकीय संरचनाओं के अलगाव के लिए एक व्यापक रूप से लागू तकनीक है। यहां प्रस्तुत संशोधित और स्वचालित प्रोटोकॉल में, यह तकनीक न्यूरोमेलेनिन ग्रैन्यूल (एनएमजी) और एनएमजी-आसपास के ऊतक (एसएन) के विशिष्ट अलगाव के लिए लागू की जाती है। अब तक, मानव पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों से एनएमजी के अलगाव के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोण प्रकाशित किए गए थे और व्यापक रूप से उपयोग किए गए थे:

क) एक असंतुलित सुक्रोज प्रवणता जिसमें 1 ग्राम ठोस निग्रा ऊतक20 का उपभोग होता है। चूंकि मानव पोस्टमार्टम प्रमाण निग्रा ऊतक दुर्लभ है और कई शोध प्रश्नों के लिए उच्च रुचि रखता है, दुर्भाग्य से प्रति रोगी उच्च मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होने पर एक बड़े समूह अध्ययन को स्थापित करना काफी चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, एनएमजी26 के पर्याप्त अलगाव के लिए आवश्यक ऊतक राशि को 0.15 ग्राम तक कम करने के लिए इस दृष्टिकोण में और सुधार किया गया था। हालांकि, फिर भी, एक पूर्ण ठोस निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा के कम से कम आधे हिस्से की आवश्यकता थी।

बी) एलएमडी का उपयोग करके एनएमजी का छांटना। 2016 में, प्लम एट अल ने एलएमडी के माध्यम से एनएमजी के सटीक छांटने के आधार पर एक नया प्रोटोकॉल स्थापित किया। इस प्रोटोकॉल के साथ, आवश्यक नमूना राशि को दस 10 μm ऊतक वर्गों तक कम किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आवश्यक ऊतक नमूने की प्रभावशाली कमी 150 मिलीग्राम से 16.6 मिलीग्राम22 हो सकती है।

यहां प्रस्तुत अनुकूलित और स्वचालित एलएमडी-आधारित प्रोटोकॉल के लिए और भी कम नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है क्योंकि पतला (10 μm की तुलना में 5 μm) और कम ऊतक वर्गों (8 की तुलना में अधिकतम 7) का उपयोग किया जाना था और स्वचालित NMG डिटेक्शन के उपयोग के माध्यम से नमूना उत्पादन (1-2 दिनों की तुलना में 4 घंटे प्रति नमूना) के लिए कम समय की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, आवश्यक नमूना संग्रह समय को बड़े पैमाने पर छोटा कर दिया गया था और एक अनुकूलित एलसी-एमएस विधि और अत्याधुनिक इंस्ट्रूमेंटेशन को लागू करके पहचाने गए पीजी की संख्या में काफी वृद्धि की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य शोध प्रश्नों और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

उपयोगकर्ता-परिभाषित अनुसंधान प्रश्नों से संबंधित प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए, अनुभव के आधार पर निम्नलिखित पहलुओं पर प्रकाश डाला गया है:

ए) तुलनीय नमूना मात्रा का अलगाव: चूंकि इस प्रोटोकॉल की अपेक्षित पेप्टाइड उपज, उदाहरण के लिए, सेल कल्चर या ऊतक लाइसेट की तुलना में कम है, पेप्टाइड एकाग्रता का निर्धारण संभव नहीं हो सकता है। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि समान मात्रा में ऊतक को एलएमडी के माध्यम से अलग किया जाता है, जिसका अनुमान चयनित वस्तुओं के ऊतक क्षेत्र के आधार पर लगाया जा सकता है। वर्तमान सेटअप में, कम से कम तीन एमएस मापों के लिए पेप्टाइड्स की पीढ़ी के लिए 500,000 μm² के ऊतक क्षेत्र पर्याप्त हैं।

बी) ट्रिप्सिन-पाचन: पाचन की अवधि और ट्रिप्सिन एकाग्रता नमूनों में तुलनीय होनी चाहिए।

ग) विभिन्न ऊतकों के लिए मापदंडों का अनुकूलन: विश्लेषण करने के लिए ऊतक के आधार पर, एकत्रित ऊतक राशि को समायोजित करने की आवश्यकता होती है जिससे अतिरिक्त ट्रिप्सिन की मात्रा को समायोजित करना आवश्यक हो जाता है। प्रोटीन अनुपात में ट्रिप्सिन 1: 40 से कम नहीं होना चाहिए।

डी) एलएमडी प्रक्रिया की सीमा: रुचि की वस्तुओं के एलएमडी-आधारित अलगाव के लिए, चयनित वस्तुओं के आकार और स्लाइस की मोटाई की बात आने पर सीमाएं हैं। ऊतक के लेजर-आधारित काटने के दौरान ऊतक हानि के कारण, 100 μm² से छोटी वस्तुओं को अलगाव के लिए बहुत छोटा माना जाता था।

ई) एलसी और एमएस मापदंडों का अनुकूलन: उपयोग किए गए एलसी और एमएस सिस्टम के आधार पर, पृथक ऊतक की मात्रा में वृद्धि की जानी चाहिए (उदाहरण के लिए, माइक्रोफ्लो सिस्टम के साथ काम करते समय) और एमएस मापदंडों को अनुकूलित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, आयन-ट्रैप-आधारित डिटेक्टर सिस्टम के साथ काम करते समय)।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को डी द्वारा समर्थित किया गया था। एनबीआई, जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (बीएमबीएफ) (अनुदान संख्या एफकेजेड 031 ए 534 ए) और पीयूआरई (यूरोप के भीतर प्रोटीन रिसर्च यूनिट रुहर) और सेंटर फॉर प्रोटीन डायग्नोस्टिक्स (प्रोडीआई) अनुदान की एक परियोजना है, दोनों नवाचार, विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय से नॉर्थ-राइन वेस्टफेलिया, जर्मनी से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol AppliChem A1101
Acetonitrile Merck 1.00029.2500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141
Formic acid Sigma-Aldrich 56302
Iodoacetamide AppliChem A1666,0100
Micro Tube 500 Carl Zeiss 415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam Zeiss 494800-0014-000
PEN Membrane slide Carl Zeiss 415190-9041-000
substantia nigra pars compacta tissue slices Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain)
Trifluoroacetic acid Merck 91707
Trypsin sequencing grade Serva 37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO
Name of Software Weblink/Company Version
FreeStyle Thermo Fisher Scientific 1.6
MaxQuant https://www.maxquant.org/ 1.6.17.0
PALMRobo Zeiss 4.6 pro
Perseus https://www.maxquant.org/perseus/ 1.6.15.0
Skyline https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view 20.2.0.343
XCalibur Thermo Fisher Scientific 4.3

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References

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