Summary
Hier wird ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granulaten aus humanem postmortalem Substantia nigra pars compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion vorgestellt. Dieses überarbeitete und optimierte Protokoll minimiert massiv die benötigte Zeit für die Probenentnahme, reduziert die erforderliche Probenmenge und verbessert die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch LC-MS/MS-Analyse.
Abstract
Neuromelanin ist ein schwarz-bräunliches Pigment, das in sogenannten Neuromelanin-Granula (NMGs) in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta vorkommt. Neben Neuromelanin enthalten NMGs eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Metallen. Obwohl NMGs-haltige dopaminerge Neuronen bevorzugt bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und Demenz mit Lewy-Körpern verloren gehen, ist nur wenig über den Mechanismus der NMG-Bildung und die Rolle von NMGs bei Gesundheit und Krankheit bekannt. Daher sind weitere Forschungen zur molekularen Charakterisierung von NMGs unerlässlich. Leider basieren Standardprotokolle für die Isolierung von Proteinen auf der Ultrazentrifugation mit Dichtegradienten und erfordern daher hohe Mengen an menschlichem Gewebe. So wird hier ein automatisiertes Lasermikrodissektionsprotokoll (LMD) etabliert, das die Entnahme von NMGs und umgebendem Substantia nigra (SN)-Gewebe mit minimalen Gewebemengen unvoreingenommen und automatisiert ermöglicht. Ausgeschnittene Proben werden anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihre proteomische Zusammensetzung zu entschlüsseln. Mit diesem Workflow wurden 2.079 Proteine identifiziert, von denen 514 Proteine ausschließlich in NMGs und 181 in SN identifiziert wurden. Die vorliegenden Ergebnisse wurden mit einer früheren Studie verglichen, die einen ähnlichen LMD-basierten Ansatz verwendete, der eine Überlappung von 87,6% für beide Proteome erreichte, was die Anwendbarkeit des hier vorgestellten überarbeiteten und optimierten Protokolls bestätigt. Um aktuelle Ergebnisse zu validieren, wurden interessante Proteine mittels gezielter Massenspektrometrie analysiert, z.B. Parallel Reaction Monitoring (PRM)-Experimente.
Introduction
Jedes Gewebe besteht aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen, aber die spezifische Isolierung eines Zelltyps ist für eine genauere Charakterisierung oft unerlässlich. Die Lasermikrodissektion (LMD), die ein Mikroskop mit einer Laseranwendung koppelt, ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur spezifischen Isolierung von Gewebebereichen, einzelnen Zellen oder zellulären Substrukturen aus einem komplexen Verbund. Die Anwendung von LMD in Kombination mit Massenspektrometrie (LMD-MS) wurde bereits erfolgreich für mehrere Forschungsfragen umgesetzt, darunter die Isolierung von DNA1, RNA2 und Proteinen 3,4,5. In diesem Protokoll wird ein überarbeitetes und optimiertes LMD-MS-Protokoll für die proteomische Analyse von humanem postmortalem Hirngewebe und subzellulären Komponenten beschrieben, um neuartige Pathomechanismen der Parkinson-Krankheit zu entschlüsseln.
Neuromelanin ist ein schwarzes, fast unlösliches Pigment, das in den katecholaminergen, Dopamin produzierenden Neuronen der Substantia nigra pars compacta6 vorkommt. Zusammen mit Proteinen und Lipiden reichert es sich in organellenartigen Granula an, die von einer Doppelmembran umgeben sind, die Neuromelanin-Granula (NMGs)7,8,9 genannt wird. NMGs können ab dem Alter von drei Jahren beim Menschen beobachtet werden, der während des Alterungsprozesses an Menge und Dichte zunimmt10,11. Bis heute gibt es keine eindeutige Hypothese zur Bildung von Neuromelanin, aber eine Annahme ist, dass Neuromelanin durch die Oxidation von Dopamin12 gebildet wird. Andere Hypothesen basieren auf der enzymatischen Produktion von Neuromelanin (z.B. Tyrosinase)13. Es wurde festgestellt, dass Neuromelanin selbst eine hohe Bindungsaffinität zu Lipiden, Toxinen, Metallionen und Pestiziden aufweist. Basierend auf diesen Erkenntnissen wird angenommen, dass die Bildung von NMGs die Zelle vor der Ansammlung toxischer und oxidativer Substanzen und vor Umweltgiften schützt14,15. Neben dieser neuroprotektiven Funktion gibt es Hinweise darauf, dass Neuromelanin neurodegenerative Effekte hervorrufen kann, z.B. durch Eisensättigung und die anschließende Katalyse freier Radikale16,17. Darüber hinaus kann Neuromelanin, das während neurodegenerativer Prozesse freigesetzt wird, durch Wasserstoffperoxid abgebaut werden, was die Nekrose durch reaktive Metalle und andere toxische Verbindungen, die zuvor an Neuromelanin gebunden waren, beschleunigen und zu Neuroinflammation und Zellschäden beitragen kann18. Die genaue Rolle von NMGs bei neurodegenerativen Prozessen wie im Verlauf der Parkinson-Krankheit ist bisher jedoch nicht klar geklärt. Dennoch scheinen NMGs an der Pathogenese der Parkinson-Krankheit beteiligt zu sein, und ihre spezifische Analyse ist von größter Bedeutung, um ihre Rolle bei der Neurodegeneration zu entschlüsseln. Leider fehlen gewöhnlichen Labortieren (z.B. Mäusen und Ratten) und ZelllinienNMGs 19. Daher verlassen sich Forscher für ihre Analyse vor allem auf postmortales Hirngewebe. In der Vergangenheit beruhte die NMG-Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation auf der Verfügbarkeit hoher Mengen an Substantia nigra-Gewebe 20,21. Heute stellt LMD ein vielseitiges Werkzeug dar, um NMGs gezielt aus menschlichen Gehirnproben zu isolieren, um sie dann mittels LC-MS/MS zu analysieren.
In diesem Protokoll wird eine verbesserte und automatisierte Version eines früheren Protokolls22 für die Isolierung von NMGs und umgebendem Gewebe (SN) vorgestellt, was eine schnellere Probengenerierung, eine höhere Anzahl identifizierter und quantifizierter Proteine und eine starke Reduzierung der erforderlichen Gewebemengen ermöglicht.
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Protocol
Die Verwendung von menschlichem Hirngewebe wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum (Aktenzeichen 4760-13) nach deutschen Vorschriften und Richtlinien genehmigt. Dieses Protokoll wurde auf kommerziell gewonnene Gewebeschnitte von Substantia nigra pars compacta angewendet. Eine grafische Übersicht über das vorgestellte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Gewebeschnitt
- Die Kryostatkammer vorkühlen.
HINWEIS: Jedes Gewebe benötigt unterschiedliche Kryostattemperaturen, die im jeweiligen Herstellerprotokoll zu finden sind. - Reinigen Sie das Edelstahlmesser mit 70% Ethanol und setzen Sie es in den Klingenhalter ein.
- Das Gewebe aus dem -80 °C Gefrierschrank mit einem Eisfach in den Kryostaten überführen und 15 min auf die Temperatur der Kryostatkammer einstellen lassen.
- Beschriften Sie Folienobjektträger eindeutig mit einem Bleistift.
HINWEIS: PET/PEN-Folienobjektträger sind für die LMD-basierte Probenentnahme erforderlich. Behandeln Sie die PET/PEN-Membranobjektträger mit Vorsicht, da sie extrem zerbrechlich sind. - Tragen Sie einen Tropfen handelsübliches gefrorenes Schnittmedium auf den Gewebehalter auf. Bevor es vollständig eingefroren ist, legen Sie das Gewebe auf das gefrorene Schnittmedium und lassen Sie es aushärten, so dass das Gewebe mit dem Gewebehalter verbunden ist.
- Installieren Sie den Gewebehalter in der Kryostatkammer und passen Sie seine Ausrichtung an, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen. Die optimale Halterorientierung hängt von der Ausrichtung des Gewebes ab.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, das Gewebe zu trimmen, bis die für die Scheiben benötigte Schnittebene erreicht ist. - Bevor der interessierende Gewebebereich erreicht ist, stellen Sie die Schnitteinstellung auf die gewünschte Gewebedicke ein.
HINWEIS: 5 oder 10 μm ist die empfohlene Dicke für dieses Protokoll, da 20 μm mächtige Abschnitte als nicht kompatibel mit der LMD-basierten Probenentnahme22 befunden wurden. - Schneiden Sie zwei Abschnitte aus und werfen Sie sie weg.
- Legen Sie die Stabilisatorplatte ab.
- Schneiden Sie einen Abschnitt des Gewebes ab, öffnen Sie die Anti-Roll-Platte vorsichtig, nehmen Sie einen Membranobjektträger und verhindern Sie die Gewebefaltung, während Sie den Gewebeabschnitt auf den Membranobjektträger legen.
HINWEIS: Die Lagerung der Membranobjektträger bei Raumtemperatur vor der Haftung ermöglicht eine genaue Probenbefestigung. Mehrere Abschnitte können auf demselben Membranobjektträger platziert werden, aber Gewebeüberlappungen müssen verhindert werden. - Lagern Sie Gewebeschnitte, die auf Membranobjektträgern im Kryostaten platziert sind, bis die Sektion abgeschlossen ist.
- Lagern Sie das kryosezierte Gewebe bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 °C oder fahren Sie direkt mit dem folgenden Verfahren fort. Lagern Sie die geschnittenen Objektträger bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
2. Lasermikrodissektion und Druckkatapultierung
HINWEIS: Da Neuromelanin-Granulate aufgrund ihrer schwarz-bräunlichen Farbe ohne Färbung sichtbar sind, ist für dieses Protokoll keine Färbung erforderlich. Dennoch können bei Bedarf verschiedene Färbeverfahren mit diesem Protokoll kombiniert werden. Beachten Sie, dass die Verwendung von Blockierungslösungen oder Antikörpern die LC-MS/MS-Analysen beeinflusst.
- Schalten Sie das MicroBeam-System ein und öffnen Sie die zugehörige Software auf dem Computer (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie den Gewebemembranobjektträger mit dem Gewebe nach oben in den SlideHolder auf der RoboStage.
HINWEIS: Je nach LMD-Gerät kann es notwendig sein, den Membranobjektträger so zu platzieren, dass das Gewebe nach unten zeigt. Im Allgemeinen wird die Probenentnahme in einer temperaturkontrollierten Umgebung durchgeführt, um optimale und reproduzierbare Bedingungen zu gewährleisten. - Stellen Sie das Mikroskop für die Übersichtsscans auf die gewünschte Vergrößerung ein (hier wird das 50-fache verwendet).
- Verwenden Sie die Scan-Funktion, die Sie im Navigator-Fenster der Softwareoberfläche finden, um einen Übersichtsscan des Gewebeschnitts zu erhalten. Suchen Sie nach der oberen linken Ecke und der unteren rechten Ecke des Interessenbereichs und wählen Sie sie in der Softwareoberfläche aus. Wählen Sie dann Alle ROIs scannen aus, um die Scans durchzuführen.
HINWEIS: Übersichtsscans sind nicht zwingend erforderlich, ermöglichen aber eine bessere Orientierung in der Folie und können für die spätere Verwendung gespeichert werden. - Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops für das entsprechende Gewebe ein, die im vorliegenden Fall von Neuromelanin-Granula das 400-fache beträgt.
- Suchen Sie nach einem Bereich mit Neuromelanin-Granula. Wählen Sie in der Softwareoberfläche die Option Sichtfeldanalyse , wählen Sie Ergebnis umkehren und legen Sie den Schwellenwert für die RGB-Kanäle so fest, dass nur Neuromelanin-Granulate im Vorschaufenster rot hervorgehoben werden. Klicken Sie auf OK , um die angepassten Einstellungen für das Sichtfeld zu verwenden.
HINWEIS: Es kann vorkommen, dass auch kleinere Objekte mit dunkler Farbe ausgewählt werden. Um dies zu berücksichtigen, verwerfen Sie alle Objekte, die eine Fläche von weniger als 100 μm2 bedecken, bevor Sie Neuromelanin-Granulate isolieren. Öffnen Sie dazu die Elementliste, indem Sie auf das Symbol in der Symbolleiste klicken, die betrachtete Folie auswählen und Elemente nach Bereich sortieren. Wählen Sie solche mit Bereichen kleiner als 100 μm2 aus und löschen Sie sie. - Passen Sie die Lasereinstellungen mithilfe eines Bereichs des Objektträgers an, der nur von der Membran bedeckt ist.
HINWEIS: Es wird empfohlen, den Cut Laser Adjustment Wizard zu verwenden und den Anweisungen der Software zu folgen. Die erforderlichen Lasereinstellungen können zwischen verschiedenen Objektträgern unterschiedlich sein. Für 5-μm-Schnitte mit 400-facher Vergrößerung sind die typischen Einstellungen 32 Energie und 51 Fokus für das Schneiden und 28 Energie und -1 Fokus für Laserpulskatapultierung (LPC). - Passen Sie die Geschwindigkeitseinstellungen für das Positionieren und Schneiden an, um eine ordnungsgemäße Isolierung zu gewährleisten.
HINWEIS: 30% Geschwindigkeit erwies sich als optimal für die NMG-Isolierung. - Füllen Sie die Probenentnahmeröhrchenkappe mit 50 μL Reinstwasser und führen Sie die Kappe in den Kollektor des RoboMover ein.
HINWEIS: Der für die vorliegenden Experimente verwendete Röhrenkollektor kann jeweils ein Probensammelröhrchen tragen. - Positionieren Sie den RoboMover über der Softwareschnittstelle über dem RoboStage II, um die Probenentnahme zu starten.
HINWEIS: Öffnen Sie dazu das RoboMover-Fenster, in dem der Kollektor angezeigt wird. Klicken Sie auf die Kappe des Probenentnahmeröhrchens, die im RoboMover-Fenster angezeigt wird, um die Kappe in den Arbeitsbereich zu bewegen. Passen Sie die optimale Bewegungs- und Arbeitshöhe im RoboMover-Fenster an. Andernfalls kann das Wasser in der Kappe auf den Schlitten fallen oder die katapultierten Objekte erreichen die Kappe nicht. - Starten Sie den Laser. Steuern Sie die Energie- und Fokuseinstellungen während des Laserprozesses und passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an. Stellen Sie sicher, dass die isolierten Objekte für mindestens die ersten zehn Objekte ordnungsgemäß isoliert und in die Probenentnahmeröhrchenkappe katapultiert werden.
HINWEIS: Die ordnungsgemäße Isolierung und das Katapultieren müssen visuell überprüft werden. Beides sollte zu einem gewebefreien Bereich von der Größe des vorselektierten Objekts in der Gewebescheibe führen (siehe Abbildung 2C,D). Passen Sie die Lasereinstellungen an, wenn das Objekt nach dem Schneiden und Katapultieren an der Gewebescheibe haftet. Für das Katapultieren ist die CenterRoboLPC-Option gut für die NMG-Isolierung geeignet. Die Katapultierungseinstellungen können für jedes ausgewählte Objekt in der Elementliste angepasst werden. - Wenn die Abtastung abgeschlossen ist, navigieren Sie den RoboMover zu seiner Ausgangsposition. Entfernen Sie das Probenentnahmeröhrchen.
HINWEIS: Wenn die Anzahl der gesammelten Objekte eher gering und die Objekte groß genug sind, kann die Probenentnahme durch Klicken auf Cap Check sichergestellt werden, wodurch die Probenentnahmeröhrchenkappe unter das Mikroskop gelegt wird, so dass die Anzahl der Objekte im Wasser in der Kappe gezählt werden kann (siehe Abbildung 2H). - Drehen Sie die Probe mit einer Zentrifuge herunter. Kurze Spins von 5 s mit zunehmender Zentrifugalkraft aufgrund der Beschleunigung der Zentrifuge erwiesen sich als ausreichend. Lagern Sie zu diesem Zeitpunkt die Proben bei -80 °C, da alle Proben zusammen weiterverarbeitet werden sollten.
HINWEIS: Für den Vergleich des proteomischen Profils wurde auch das die NMGs umgebende Gewebe nach ihrer Exzision isoliert. Die Isolierung des umgebenden Gewebes erfolgte bei 50-facher Vergrößerung. - Trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator. 1,5 h erwiesen sich als ausreichend für 50 μL Wasser.
- Lösen und lysieren Sie das Gewebe in 40 μL Ameisensäure für 20 min (Raumtemperatur).
- Verbessern Sie die Gewebelyse durch Beschallung bei 45 kHz (Kilohertz) für 5 Minuten in einem Ultraschallbad. Füllen Sie das Ultraschallbad mit Eis, um ein Schmelzen der Röhrchen zu verhindern. Lagern Sie die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C.
3. Tryptische Verdauung
- Proben auf Eis auftauen.
- Trocknen Sie die Proben vollständig in einem Vakuumkonzentrator.
- Füllen Sie die Probe mit 50 μL eines geeigneten Aufschlusspuffers, z. B. 50 mM Ammoniumbicarbonat.
- Nach Zugabe von 1,25 μL 200 mM 1,4-Dithiothreitol werden die Proben 30 min bei 60 °C und 300 U/min mit einem Thermomischer inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt.
- Dann werden Proben bei RT für 30 min im Dunkeln nach Zugabe von 1,36 μL 0,55 M Iodacetamid inkubiert.
- Fügen Sie den Proben eine geeignete Menge Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht (~16 h) bei 37 °C.
HINWEIS: Für 1.000.000 μm2 wurden 0,1 μg Trypsin als ausreichend befunden. - Geben Sie 2,6 μL 10% Trifluoressigsäure (TFA) in die Proben, um den Aufschluss zu stoppen (Endkonzentration von 0,5% TFA).
- Trocknen Sie die Proben vollständig mit einem Vakuumkonzentrator. Anschließend werden Proben bis zu einem definierten Endvolumen mit 0,1% TFA gefüllt. NMG-Proben wurden bis zu 20 μL gefüllt, von denen 5 μL für ein massenspektrometrisches (MS) Experiment verwendet wurden.
- Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C. Bestimmung der Peptidkonzentration durch Aminosäureanalyse oder eine andere geeignete Quantifizierungsmethode (z. B. Direct Detect).
HINWEIS: Niedrige Probenmengen sind mit den genannten Techniken möglicherweise nicht quantifizierbar. Um eine identische Probenbeladung zu gewährleisten, sollte jede Probe die gleiche Menge an isoliertem Gewebe enthalten und jede Probe sollte gleich behandelt werden.
4. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie
HINWEIS: Die folgenden Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrien (MS) sind für das spezifische LC-System mit einer hier verwendeten Fangsäulenvorrichtung und einem Massenspektrometer optimiert (siehe Materialtabelle). Für andere LC- und MS-Systeme wird eine Anpassung der Parameter empfohlen.
- Passen Sie mit der Software Xcalibur die HPLC-Einstellungen wie folgt an.
- Fallensäule: Temperatur auf 60 °C einstellen, Durchflussrate auf 30 μL/min, Laufpuffer auf 0,1% Trifluoressigsäure.
- Analytische C18-Umkehrphasensäule: Temperatur auf 60 °C, Durchflussrate auf 30 μL/min, Laufpuffer A auf 0,1% Trifluoressigsäure, Laufpuffer B auf 84% Acetonitril und Gradient auf 5%-30% Laufpuffer B über 98 min.
HINWEIS: Die Anpassung des Gradienten kann unvermeidlich sein und wird dringend empfohlen, wenn verschiedene Gewebe oder Zellen verwendet werden. Die Gesamtgradientenzeit kann aufgrund der Probenbeladung zu Beginn des Gradienten und des Probenwaschens am Ende des Gradienten variieren. Der Gesamtgradient in diesem Protokoll besteht aus 7 Minuten Probenbeladung und zusätzlicher Säulenwäsche für 15 Minuten, was zu einer Gesamtgradientenzeit von 120 Minuten führt.
- Erstellen Sie eine datenabhängige Erfassungsmethode (DDA) mit dem XCalibur Instrument Setup, das Sie im HPLC-Software-Roadmap-Menü finden.
- Definieren Sie auf der Registerkarte Globale Parameter den Infusionsmodus Flüssigkeitschromatographie, die erwartete LC-Spitzenbreite (30 s) und den Standardchargenzustand (2).
- Fahren Sie mit der Registerkarte Scan-Parameter fort und fügen Sie die folgenden Scans und Filter in der angegebenen Reihenfolge hinzu: MS OT, MIPS, Intensität, Ladezustand, dynamischer Ausschluss und ddMS2 OT HCD.
HINWEIS: Die detaillierten Parametereinstellungen für jeden Scan und Filter finden Sie in der Zusatztabelle 1. Die optimalen MS- und DDA-Einstellungen können je nach verwendetem Massenspektrometer sowie Probentyp variieren und sollten daher angepasst werden. - Präparation von Proben, indem 200-400 ng Probenpeptide in einem definierten Volumen von 0,1% TFA in inerten massenspektrometrischen Glasfläschcheneinlässen gelöst werden. Wenn die Konzentrationsbestimmung aufgrund einer geringen Probenmenge nicht anwendbar ist, überprüfen Sie die identische Probenbeladung, indem Sie den Gesamtionenstrom (TIC) vergleichen.
HINWEIS: Öffnen Sie dazu die resultierende Datei der massenspektrometrischen Messung in einer geeigneten Software, z. B. FreeStyle, und überprüfen Sie das Chromatogramm. Die Intensitäten sollten für alle Proben vergleichbar sein. Ein repräsentativer TIC ist in Abbildung 3 dargestellt. - Analysieren Sie die Rohdaten, die Sie mit einer für Proteomik geeigneten Software erhalten, z. B. MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics oder Proteome Discoverer, und führen Sie eine statistische Datenanalyse basierend auf der Forschungsfrage durch.
5. Analyse proteomischer Rohdaten mit MaxQuant
ANMERKUNG: Detaillierte Informationen zu den MaxQuant-Parametern finden Sie in der Zusatztabelle 2. Sie werden im Folgenden kurz beschrieben.
- Laden Sie RAW-Dateien in die MaxQuant-Software im Rohdaten-Header, indem Sie auf Laden klicken.
- Weisen Sie Beispielnamen zu, indem Sie auf Test festlegen klicken.
- Definieren Sie gruppenspezifische Parameter. Fügen Sie zunächst Änderungen hinzu. Wählen Sie aufgrund der Probenverarbeitung Deamidierung (NQ), Oxidation (M) und Carbamidomethylierung (N-Term) als variable Modifikationen und fügen Sie Carbamidomethylierung (C) als feste Modifikation hinzu.
- Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym auf der Registerkarte Verdauung.
- Fügen Sie die labelfreie Quantifizierungsoption LFQ auf der Registerkarte Label Free Quantification hinzu. Wenn mehr als 10 Dateien verarbeitet werden sollen, wählen Sie die Option Fast LFQ , um die Bearbeitungszeit zu verkürzen. Fügen Sie die iBAQ-Option als Maß für die Proteinquantifizierunghinzu 24.
- Stellen Sie sicher, dass alle anderen gruppenspezifischen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
- Fahren Sie mit der Registerkarte Globale Parameter fort und fügen Sie die von uniprot.org abgeleitete FASTA-Datei auf der Registerkarte Sequenzen hinzu. Ändern Sie die Bezeichnerregel entsprechend und fügen Sie die Taxonomie-ID hinzu, in diesem Fall 9606 für homo sapiens.
- Für die Proteinquantifizierung wählen Sie Unique und Razor Peptide .
- Stellen Sie sicher, dass alle anderen globalen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
- Klicken Sie auf Start und rufen Sie die Proteingruppen.txt Ausgabe nach der MaxQuant-Analyse für die weitere Analyse in Perseus ab.
6. Statistische Auswertung mit Perseus
- Laden Sie die Datei proteingroups.txt in Perseus, fügen Sie die iBAQ-Werte als Hauptspalten hinzu und sortieren Sie alle anderen Spalten nach ihrem Typ.
- Filtern Sie Lockvögel und Verunreinigungen heraus, indem Sie Zeilen basierend auf der kategorialen Spalte filtern.
- Filtern Sie Ergebnisse basierend auf gültigen Werten. Im vorliegenden Fall, in dem nur zwei Proben in die Analyse einbezogen wurden, wurde eine Mindestanzahl von einem gültigen Wert gewählt.
- Exportieren Sie die Perseus-Ausgabe in .txt Format zur Weiterverarbeitung, z.B. in Excel, und werten Sie die Ergebnisse zur Forschungsfrage aus.
7. Validierung ausgewählter Proteine
HINWEIS: Häufig verwendete Methoden zur Validierung von MS-Daten sind beispielsweise die immunologische Färbung oder Western Blot. Aufgrund der dunklen Farbe und der Autofluoreszenz von Neuromelanin ist eine immunologische Färbung von Proteinen innerhalb von Neuromelaningranulaten entweder mit Meerrettichperoxidase- oder fluorophorkonjugierten Antikörpern nicht anwendbar. Für die Western-Blot-Analyse wären sehr große Mengen an postmortalem Gewebe erforderlich. Daher werden ausgewählte Proteine durch gezielte Massenspektrometrie validiert und im vorliegenden Fall wurden parallele Reaktionsüberwachungsexperimente (PRM) aufgebaut.
- Wählen Sie Proteine für die Validierung aus. Wählen Sie Peptide dieser Proteine, die bereits in DDA-Experimenten nachgewiesen wurden. Peptide sollten keine verpassten Spaltungen oder Modifikationen enthalten, um eine zuverlässige Quantifizierung zu gewährleisten.
HINWEIS: Es kann mehrere Gründe für die Validierung eines bestimmten Proteins geben, z. B. differentielle Häufigkeiten unter den untersuchten Bedingungen. Für die repräsentativen Ergebnisse wurde zytoplasmatisches Dynein 1 schwere Kette 1 ausgewählt, das in NMG- und SN-Proben als gleichwertig häufig befunden wurde und daher als Referenz verwendet werden könnte, um eine gleichmäßige Probenbeladung zu gewährleisten. - Verwenden Sie die ausgewählten Peptide, um die erste Version einer PRM-Methode mit der HPLC-Software einzurichten. Behalten Sie alle Einstellungen für die Chromatographie und die globalen Parameter der DDA-Methode bei.
- Fügen Sie MS OT und tMS2 OT HCD als Scantypen hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für MS OT mit denen für die DDA-Methode übereinstimmen. Detaillierte Einstellungen für die PRM-Methode finden Sie in der Zusatztabelle 1.
- Für tMS2 OT HCD fügen Sie ausgewählte Peptide als Einschlussliste hinzu. Fügen Sie daher die Aminosäuresequenz und den in den DDA-Messungen beobachteten m/z-Wert hinzu. Fügen Sie für das erste PRM-Experiment keine Aufbewahrungszeitfenster hinzu und legen Sie t start auf 0 und t stop auf 120 fest (für einen Farbverlauf von 120 Minuten).
- Bewerten Sie die PRM-Methode nach der Messung mit geeigneter Software, z. B. Skyline, und erhalten Sie die Retentionszeit der in die Einschlussliste aufgenommenen Peptide. Überprüfen Sie für eingeschlossene Peptide, ob vergleichbare Peaks für mindestens drei Vorläuferionen in MS1-Scans und fünf Fragmentionen in MS2-Scans mit geringem Massenfehler (±5 ppm) beobachtbar sind.
- Verfeinern Sie die PRM-Methode, indem Sie beispielsweise die Auflösung für den tMS2 OT HCD-Scan erhöhen und der Einschlussliste Zeitfenster hinzufügen.
HINWEIS: Retentionszeitfenster von 3 min erwiesen sich in den vorliegenden Experimenten als gut geeignet (beobachtete Retentionszeit im ersten PRM-Experiment ± 1,5 min). - Mit der verfeinerten PRM-Methode können Sie die Quantifizierung von Peptiden und Proteinen von Interesse basierend auf dem Peakbereich sowohl auf MS1- als auch auf MS2-Ebene mit geeigneter Software durchführen.
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Representative Results
Die spezifische Isolierung von NMGs und SN-Gewebe ist der wichtigste Schritt für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Über die Funktion Field of View Analysis in der vom Hersteller bereitgestellten Software des LMD können NMGs automatisch farbabhängig ausgewählt werden. Daher müssen Gewebebereiche, die NMGs enthalten (Abbildung 2A), identifiziert und eine Sichtfeldanalyse mit angepassten Farbschwellen durchgeführt werden, was zur Markierung von NMGs führt (Abbildung 2B). Nach der Filterung von Objekten, die einen Bereich unter 100 μm² abdecken, sollten nur NMGs zur Isolierung markiert bleiben (Abbildung 2C). Eine präzise Isolierung der markierten NMGs wird erreicht, nachdem die Lasereinstellungen angepasst wurden (Abbildung 2D). Nach der Isolierung von NMGs (Abbildung 2E) kann SN-Gewebe mit 50-facher Vergrößerung (Abbildung 2F) und isoliert (Abbildung 2G) zum Vergleich des proteomischen Profils ausgewählt werden. Für SN-Gewebe können isolierte Objekte mit der Cap-Check-Funktion visualisiert werden (Abbildung 2H). Für beide Probentypen, NMG und SN, erwies sich die Isolierung von 500.000 μm2 Hirngewebe für dieses Protokoll als ausreichend, was mindestens drei MS-Durchläufe pro Probe ermöglicht.
Ein repräsentatives Beispiel für ein 120-minütiges DDA-Experiment ist in Abbildung 3 dargestellt (da die Hauptsäule in den letzten 15 Minuten der Messung gewaschen wird, wird das Chromatogramm kurz vor 105 Minuten abgeschnitten). Die angewandte Methode sollte eine Probenelution über den gesamten Gradienten ermöglichen, wobei scharfe und prägnante Peaks erzeugt werden, und die Intensität des Gesamtionenstroms (TIC) sollte über alle Proben hinweg vergleichbar sein.
Die Anwendung des vorliegenden Protokolls auf eine Probe von 500.000 μm² NMG und eine Probe von 1.000.000 μm² SN-Gewebe mit angepassten Volumina für MS-Proben (5 μL für NMG und 2,5 μL für SN), um eine identische Peptidbelastung zu gewährleisten, führte zur Identifizierung von 1.898 Proteingruppen (PGs) in der NMG-Probe und 1.565 PGs in der SN-Probe. Ein weiterer Vergleich ergab, dass in beiden Proben 1.384 PGs identifiziert wurden, während 514 PGs ausschließlich in NMG und 181 PGs in SN-Gewebe identifiziert wurden (Abbildung 4). Insgesamt wurden in diesem repräsentativen Experiment 2.079 PGs identifiziert. Der Vergleich mit einem Referenzdatensatz aus einer früheren Studie22 zeigte, dass 87,6 % der in dieser Studie berichteten PGs auch durch das vorliegende überarbeitete und automatisierte Protokoll identifiziert werden konnten, was seine Anwendbarkeit belegt. Darüber hinaus konnte die Anzahl der identifizierten PGs um 1.143 verbessert werden.
Da minimale Probenmengen die Anwendung klassischer Validierungsmethoden wie Western Blots nicht zulassen, kann die Validierung von interessierenden Proteinen durch gezielte massenspektrometrische Ansätze, z.B. PRM, erreicht werden. Repräsentative Ergebnisse für das Peptid ESPEVLLTLDILK des Proteins zytoplasmatisches Dynein 1 schwere Kette 1 sind in Abbildung 5 dargestellt. Der iBAQ-Wert dieses Proteins war in NMGs etwas höher als SN in den DDA-Messungen, was durch PRM-Experimente basierend auf der Peakfläche auf MS1- (Abbildung 5A,B,E) und MS2-Ebene (Abbildung 5C,D,F) nachgewiesen werden konnte.
Abbildung 1: Workflow zur proteomischen Charakterisierung von Neuromelanin-Granula (NMGs) und umgebendem Gewebe (SN). NMG- und SN-Proben wurden mittels Lasermikrodissektion (LMD) aus Gewebeschnitten isoliert. Proteine wurden isoliert und eine tryptische In-Solution-Verdauung durchgeführt. Die resultierenden Peptide wurden mittels LC-MS/MS-Messungen im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) analysiert. Die Datenanalyse wurde mit der Software MaxQuant und Perseus durchgeführt. Die Validierung ausgewählter Proteine wurde mit Parallelreaktionsüberwachungsexperimenten (PRM) durchgeführt. PRM-Daten wurden mit Hilfe der Skyline-Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Selektion und LMD-basierte Isolierung von NMG- und SN-Proben. Zunächst wird ein Bereich mit NMGs, der ohne weitere Färbung bei 400-facher Vergrößerung sichtbar ist, unter das Mikroskop gelegt (A). Nach Durchführung einer Sichtfeldanalyse werden NMGs und andere dunkle Bereiche ausgewählt (B). Nur NMGs bleiben nach dem Filtern ausgewählt (C) und werden nach Anpassung der Lasereinstellungen isoliert (D). Nachdem alle NMGs isoliert wurden (E), wird SN-Gewebe mit 50-facher Vergrößerung (F) ausgewählt und isoliert (G). Da Objekte, die für SN-Proben isoliert wurden, recht groß sind, können sie mit der Cap-Check-Funktion (H) in der Probenentnahmekappe beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Gesamtionenstrom (TIC) einer 120-minütigen DDA-Messung. Das Chromatogramm zeigt die relative Häufigkeit der Ionen, die den eluierenden Peptiden über den Retentionszeitbereich von 0 bis ~105 min entsprechen. Da die Hauptsäule zwischen 105und 120 min gewaschen wird, wird das Chromatogramm am 105.min beschnitten. Die Intensität des höchsten Peaks beträgt 2,86 x 108. Zahlen über Peaks geben die Verweilzeit und das am häufigsten vorkommende Ion dieses spezifischen Peaks an (BP = Base Peak). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Venn-Diagramm, das die Übereinstimmung von Proteingruppen (PGs) zeigt, die in NMGs und SN-Gewebe identifiziert wurden. Insgesamt wurden 1.898 PGs in NMGs und 1.565 PGs in SN-Gewebe identifiziert, von denen 1.384 PGs in beiden Gewebebereichen identifiziert wurden. 514 PGs wurden ausschließlich in NMG-Gewebe identifiziert, während 181 PGs ausschließlich in SN-Gewebe identifiziert wurden. Das Diagramm wurde mit dem Online-Tool Venny25 erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Ergebnisse von PRM-Experimenten für das Peptid ESPEVLLTLDILK (zytoplasmatisches Dynein 1 schwere Kette 1, ++). Chromatogramme auf MS1- (A,B) und MS2-Ebene (C,D) sowie Peakbereiche auf MS1- (E) und MS2-Ebene (F) werden für eine exemplarische Probe von NMGs und SN-Gewebe gezeigt. Verschiedene Farben werden verwendet, um verschiedene Vorläufer (auf MS1-Ebene) oder Produktionen (auf MS2-Ebene) zu bezeichnen. Chromatogramme werden angezeigt, nachdem die Savitzky-Golay-Glättung durchgeführt wurde. Intensitäten und Spitzenflächen waren auf MS1- (A,B,E) und MS2-Ebene (C,D,F) vergleichbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatztabelle 1: Parameter der massenspektrometrischen Experimente. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Zusatztabelle 2: Parameter der MaxQuant-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
LMD ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung bestimmter Gewebebereiche, einzelner Zellen oder subzellulärer Strukturen. In dem hier vorgestellten überarbeiteten und automatisierten Protokoll wird diese Technik zur spezifischen Isolierung von Neuromelaningranula (NMGs) und NMG-umgebendem Gewebe (SN) angewendet. Bisher wurden zwei verschiedene Ansätze zur Isolierung von NMGs aus menschlichem postmortalem Hirngewebe veröffentlicht und weit verbreitet:
a) Ein diskontinuierlicher Saccharosegradient, der 1 g Substantia nigra Gewebe verbraucht20. Da humanes postmortales substantia nigra Gewebe selten und für mehrere Forschungsfragen von großem Interesse ist, ist es leider recht schwierig, eine große Kohortenstudie aufzusetzen, wenn pro Patient hohe Gewebemengen benötigt werden. Daher wurde dieser Ansatz weiter verbessert, indem die erforderliche Gewebemenge auf 0,15 g für eine ausreichende Isolierung vonNMGs 26 reduziert wurde. Dennoch war mindestens die Hälfte einer vollständigen substantia nigra pars compacta erforderlich.
b) Die Exzision von NMGs unter Verwendung von LMD. Im Jahr 2016 etablierten Plum et al. ein neues Protokoll, das auf der präzisen Exzision von NMGs über LMD basiert. Mit diesem Protokoll konnte die erforderliche Probenmenge auf zehn 10 μm Gewebeschnitte reduziert werden, was zu einer beeindruckenden Reduzierung der benötigten Gewebeprobe von 150 mg auf 16,6 mgführte 22.
Das hier vorgestellte optimierte und automatisierte LMD-basierte Protokoll erfordert noch geringere Probenmengen, da dünnere (5 μm im Vergleich zu 10 μm) und weniger Gewebeschnitte (maximal 7 im Vergleich zu 8) verwendet werden mussten und weniger Zeit für die Probengenerierung benötigt (4 h pro Probe im Vergleich zu 1-2 Tagen) durch den Einsatz der automatisierten NMG-Detektion. Dadurch konnte die benötigte Probenentnahmezeit massiv verkürzt und die Anzahl der identifizierten PGs durch den Einsatz einer optimierten LC-MS-Methode und modernster Instrumentierung drastisch erhöht werden. Dieses Protokoll kann leicht an andere Forschungsfragen und Gewebe angepasst werden.
Für die Anpassung des vorgestellten Protokolls an benutzerdefinierte Forschungsfragen werden erfahrungsgemäß folgende Aspekte hervorgehoben:
a) Isolierung vergleichbarer Probenmengen: Da die erwartete Peptidausbeute dieses Protokolls im Vergleich zu z.B. Zellkultur- oder Gewebelysaten eher gering ist, ist eine Bestimmung der Peptidkonzentration möglicherweise nicht möglich. Daher ist es entscheidend, dass gleiche Mengen an Gewebe über LMD isoliert werden, was anhand der Gewebefläche der ausgewählten Objekte geschätzt werden kann. Im aktuellen Aufbau reichen Gewebeareale von 500.000 μm² für die Erzeugung von Peptiden für mindestens drei MS-Messungen aus.
b) Trypsin-Aufschluss: Die Dauer des Aufschlusses und die Trypsinkonzentration sollten probenübergreifend vergleichbar sein.
c) Anpassung der Parameter für verschiedene Gewebe: Je nach zu analysierendem Gewebe muss die gesammelte Gewebemenge angepasst werden, wodurch auch die Menge des zugesetzten Trypsins angepasst werden muss. Das Verhältnis von Trypsin zu Protein sollte nicht niedriger als 1:40 sein.
d) Einschränkung des LMD-Prozesses: Für die LMD-basierte Isolierung von Objekten von Interesse gibt es Einschränkungen hinsichtlich der Größe ausgewählter Objekte und der Dicke der Scheiben. Aufgrund des Gewebeverlustes beim laserbasierten Schneiden des Gewebes wurden Objekte, die kleiner als 100 μm² waren, als zu klein für die Isolierung angesehen.
e) Anpassung von LC- und MS-Parametern: Abhängig von den verwendeten LC- und MS-Systemen muss die Menge an isoliertem Gewebe erhöht (z.B. beim Betrieb mit einem Mikroflusssystem) und MS-Parameter angepasst werden (z.B. bei der Arbeit mit einem Ionenfallen-basierten Detektorsystem).
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von de. NBI, ein Projekt des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Förderkennzeichen FKZ 031 A 534A) und P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) und Center for Protein Diagnostics (ProDi) Grants, beide vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
