Summary
这里提出了一个强大的方案，用于通过激光显微切割从人死后黑质致密组织中分离神经黑色素颗粒。该修订和优化的方案大大减少了样品采集所需的时间，减少了所需的样品量，并通过LC-MS/MS分析增强了蛋白质的鉴定和定量。
Abstract
神经黑色素是一种黑褐色色素，存在于 黑质致密的多巴胺能神经元中的所谓神经黑色素颗粒（NMG）中。除了神经黑色素，NMG 还含有多种蛋白质、脂质和金属。尽管含有NMG的多巴胺能神经元在帕金森病和路易体痴呆等神经退行性疾病中优先丢失，但对NMG形成的机制以及NMG在健康和疾病中的作用知之甚少。因此，进一步研究NMG的分子表征至关重要。不幸的是，蛋白质分离的标准方案基于密度梯度超速离心，因此需要大量的人体组织。因此，这里建立了一个基于自动激光显微切割（LMD）的协议，该协议允许以无偏，自动化的方式使用最少量的组织收集NMG和周围的 黑质 （SN）组织。随后通过质谱分析切除的样品以破译其蛋白质组组成。通过该工作流程，鉴定了 2，079 种蛋白质，其中 514 种蛋白质在 NMG 中独家鉴定，181 种在 SN 中鉴定。目前的结果已与先前使用类似基于LMD的方法的研究进行了比较，两种蛋白质组的重叠率为87.6%，验证了此处介绍的修订和优化方案的适用性。为了验证目前的发现，通过靶向质谱分析感兴趣的蛋白质，例如平行反应监测（PRM）实验。
Introduction
每个组织都由不同细胞类型的异质混合物组成，但一种细胞类型的特异性分离对于更精确的表征通常是必不可少的。激光显微切割（LMD）将显微镜与激光应用相结合，是一种强大的工具，用于从复杂的复合材料中特异性分离组织区域、单细胞或细胞亚结构。LMD与质谱（LMD-MS）相结合的应用已经成功地应用于多个研究问题，包括DNA1，RNA2和蛋白质3，4，5的分离。在该协议中，描述了修订和优化的LMD-MS协议，用于人类死后脑组织和亚细胞成分的蛋白质组学分析，以破译帕金森病的新病理机制。
神经黑色素是一种黑色、几乎不溶性的色素，存在于黑质致密6的儿茶酚胺能、产生多巴胺的神经元中。它与蛋白质和脂质一起积聚在被双层膜包围的细胞器样颗粒中，称为神经黑色素颗粒（NMG）7，8，9。从三岁开始，可以观察到人类的NMG在衰老过程中数量和密度增加10，11。迄今为止，关于神经黑色素的形成还没有明确的假设，但一种假设是神经黑色素是通过多巴胺12的氧化形成的。其他假设基于神经黑色素（例如酪氨酸酶）的酶促产生13。发现神经黑色素本身对脂质、毒素、金属离子和杀虫剂具有高结合亲和力。基于这些发现，假设NMG的形成可以保护细胞免受有毒和氧化物质以及环境毒素的积累14，15。除了这种神经保护功能外，有证据表明神经黑色素可能引起神经退行性作用，例如，通过铁饱和和随后的自由基催化16，17。此外，在神经退行性过程中释放的神经黑色素可以被过氧化氢分解，这可能会加速先前与神经黑色素结合的活性金属和其他有毒化合物的坏死，并可能导致神经炎症和细胞损伤18。然而，到目前为止，NMG在帕金森病过程中的神经退行性过程中的确切作用尚不清楚。尽管如此，NMG似乎参与了帕金森病的发病机制，它们的具体分析对于揭示它们在神经变性中的作用至关重要。不幸的是，常见的实验动物（例如，小鼠和大鼠）和细胞系缺乏NMG19。因此，研究人员特别依赖死后脑组织进行分析。过去，通过密度梯度离心分离NMG依赖于大量黑质组织的可用性20，21。如今，LMD提供了一种多功能工具，可以从人脑样本中特异性分离NMG，然后通过LC-MS / MS进行分析。
在该协议中，提出了先前方案22 的改进和自动化版本，用于分离NMG和周围组织（SN），从而实现更快的样品生成，更多数量的鉴定和定量蛋白质，并严重减少所需的组织量。
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Protocol
根据德国法规和指南，人类脑组织的使用得到了德国波鸿鲁尔大学伦理委员会的批准（文件编号4760-13）。该协议已应用于商业获得的 黑质致密 组织切片。所呈现协议的图形概述如图 1所示。
1. 组织切片
- 预冷低温恒温器室。
注意：每种组织都需要不同的低温恒温器温度，可以在相应的供应商协议中找到。 - 用70%乙醇清洁不锈钢刀并将其安装到刀片架中。
- 使用保温盒将组织从-80°C冰箱转移到低温恒温器中，并使其调节到低温恒温器室温度15分钟。
- 使用铅笔明确标记膜玻片。
注意：基于 LMD 的样品收集需要 PET/PEN 膜载玻片。小心处理PET / PEN膜载玻片，因为它们非常脆弱。 - 在组织支架上滴一滴商业冷冻切片培养基。在完全冷冻之前，将组织放在冷冻切片培养基上并使其变硬，使组织与组织支架连接。
- 在开始切片之前，将组织支架安装在低温恒温器室中并调整其方向。最佳支架方向取决于组织的方向。
注意：可能需要修剪组织，直到达到切片所需的截面平面。 - 在到达感兴趣的组织区域之前，将切割设置调整为所需的组织厚度。
注意：5 或 10 μm 是该协议的建议厚度，因为发现 20 μm 厚的切片与基于 LMD 的样品集合不兼容22。 - 切两部分并丢弃它们。
- 放下防倾板。
- 切开组织的一部分，小心打开防滚板，采取膜玻片，防止组织折叠，同时将组织切片放在膜载玻片上。
注意：在粘附之前将膜载玻片储存在室温下可实现准确的样品附着。可以在同一膜载玻片上放置多个切片，但必须防止组织重叠。 - 将放置在膜载玻片上的组织切片存放在低温恒温器中，直到切片完成。
- 将冷冻切片的组织储存在-20°C直至进一步处理或直接进行以下步骤。将切片的组织载玻片储存在-80°C直至进一步使用。
2. 激光显微切割和压力弹射
注意：由于神经黑色素颗粒由于其黑褐色而没有任何染色，因此此协议不需要染色。然而，如果需要，可以将不同的染色程序与该方案结合使用。请记住，封闭溶液或抗体的使用会影响LC-MS/MS分析。
- 打开微束系统并打开计算机上的相关软件（见 材料表）。
- 将组织膜载玻片放在RoboStage上的载玻片支架中，组织朝上。
注意：根据LMD设备，可能需要放置膜载玻片，使组织朝下。通常，样品采集在温度受控的环境中进行，以确保最佳和可重复的条件。 - 将显微镜设置为所需的放大倍率（此处使用50倍）以进行概览扫描。
- 使用扫描功能（可在软件界面的导航器窗口中找到）获取组织切片的概览扫描。搜索感兴趣区域的左上角和右下角，然后在软件界面中选择它们。然后，选择“扫描 所有 ROI” 以执行扫描。
注意：概述扫描不是强制性的，但它们可以在幻灯片中更好地定位，并且可以保存以供以后使用。 - 调整显微镜对适当组织的放大倍数，在目前神经黑色素颗粒的情况下为400倍。
- 搜索有神经黑色素颗粒的区域。在软件界面中选择 视场分析 ，选择反 转结果，然后设置 RGB 通道的阈值，以便在预览窗口中仅以红色突出显示神经黑色素颗粒。单击 “确定 ”以使用调整后的视野设置。
注意：可能会同时选择具有深色的较小对象。为了解决这个问题，在分离神经黑色素颗粒之前，丢弃所有覆盖小于100μm2 区域的物体。为此，请通过单击工具栏中的图标打开元素列表，选择正在考虑的幻灯片并按区域对元素进行排序。选择面积小于 100 μm2 的那些并删除它们。 - 使用仅由膜覆盖的载玻片区域调整激光设置。
注意：建议使用 切割激光调整向导 并按照软件的说明进行操作。所需的激光设置可能因不同的载玻片而异。对于放大倍数为 400 倍的 5 μm 切片，典型设置为 32 能量和 51 焦点用于切割，以及 28 能量和 -1 焦点用于激光脉冲弹射 （LPC）。 - 调整 定位 和 切割 的速度设置，以确保适当的隔离。
注意：发现 30% 的速度最适合 NMG 分离。 - 用 50 μL 超纯水填充样品收集管盖，并将盖插入 RoboMover 的收集器中。
注意：用于本实验的管收集器一次可以携带一个样品收集管。 - 使用软件界面将 RoboMover 放置在 RoboStage II 上方，开始采集样品。
注意：为此，请打开显示收集器的 RoboMover 窗口。单击RoboMover窗口中显示的样品收集管盖，将盖子移动到工作区域。在 RoboMover 窗口中调整最佳移动和工作高度。否则，盖子中的水可能会落到载玻片上，或者弹射的物体将无法到达盖子。 - 启动激光。在激光加工过程中控制能量和焦点设置，并在必要时调整设置。确保至少前十个物体将隔离的物体正确隔离并弹射到样品收集管盖中。
注意： 必须目视检查正确的隔离和弹射。两者都应导致组织切片中预先选择的对象大小的无组织区域（参见 图2C，D）。如果物体在切割和弹射后仍然附着在组织切片上，请调整激光设置。对于弹射，发现中心RoboLPC选项非常适合NMG隔离。可以为元素列表中的每个选定对象调整弹射设置。 - 采样完成后，将 RoboMover 导航到其起始位置。取出样品收集管。
注意：当收集的物体数量相当少并且物体足够大时，可以通过单击 Cap Check来确保样品收集，它将样品收集管盖放在显微镜下，以便可以计算盖子中水中的物体数量（见 图2H）。 - 使用离心机旋转样品。发现由于离心机的加速度而增加离心力的5 s短旋转就足够了。此时，将样品储存在-80°C，因为所有样品应一起进一步处理。
注意：为了比较蛋白质组学谱，NMG周围的组织在切除后也被分离出来。周围组织的分离是在50倍放大镜下进行的。 - 在真空浓缩器中干燥样品。发现 1.5 小时足以容纳 50 μL 水。
- 将组织溶解并裂解在40μL甲酸中20分钟（室温）。
- 通过在超声浴中以45kHz（千赫兹）超声处理5分钟来增强组织裂解。用冰填充超声浴以防止管融化。将样品储存在-80°C直至进一步处理。
3. 胰蛋白酶消化
- 在冰上解冻样品。
- 在真空浓缩器中完全干燥样品。
- 用 50 μL 合适的消化缓冲液（例如 50 mM 碳酸氢铵）填充样品。
- 加入 1.25 μL 200 mM 1，4-二硫苏糖醇后，使用热混合器将样品在 60 °C 和 300 rpm 下孵育 30 分钟，然后冷却至室温 （RT）。
- 然后，加入 1.36 μL 0.55 M 碘乙酰胺后，在室温下在黑暗中孵育样品 30 分钟。
- 向样品中加入适量的胰蛋白酶，并将样品在37°C孵育过夜（~16小时）。
注意：对于1，000，000μm2，发现0.1μg胰蛋白酶就足够了。 - 向样品中加入 2.6 μL 10% 三氟乙酸 （TFA） 以停止消化（终浓度为 0.5% TFA）。
- 使用真空浓缩器完全干燥样品。然后，用0.1%TFA填充样品至定义的最终体积。NMG 样品填充至20 μL，其中5 μL用于一次质谱（MS）实验。
- 将样品储存在-80°C直至进一步使用。通过氨基酸分析或其他合适的定量方法（例如直接检测）确定肽浓度。
注意：使用上述技术可能无法量化低样品量。为确保相同的样品上样量，每个样品应包含相同数量的分离组织，并且每个样品应得到平等处理。
4. 高效液相色谱与质谱
注意：以下高效液相色谱（HPLC）质谱（MS）分析针对此处使用捕获柱装置和质谱仪的特定LC系统进行了优化（参见 材料表）。对于其他液相色谱和质谱系统，建议调整参数。
- 使用Xcalibur软件，按如下方式调整HPLC设置。
- 捕集柱：设定温度为60°C，流速为30μL/min，电泳缓冲液为0.1%三氟乙酸。
- 分析C18反相色谱柱：设定温度为60°C，流速为30μL/min，电泳缓冲液A至0.1%三氟乙酸，电泳缓冲液B至84%乙腈，梯度至5%-30%电泳缓冲液B，持续98分钟。
注意：梯度的调整可能是不可避免的，强烈建议在使用不同的组织或细胞时进行调整。总梯度时间可能会因梯度开始时的样品上样和梯度结束时的样品洗涤而有所不同。该方案中的总梯度包括7分钟样品上样和15分钟的额外色谱柱洗涤，总梯度时间为120分钟。
- 使用 XCalibur 仪器设置创建数据相关采集 （DDA） 方法，可在 HPLC 软件路线图菜单中找到。
- 在 全局参数 选项卡中，定义输注模式 液相色谱、 预期LC峰宽 （30 s）和 默认电荷状态 （2）。
- 进入 “扫描参数 ”选项卡，并按上述顺序添加以下扫描和过滤器：MS OT、 MIPS、强度、充电状态、动态排除 和 ddMS2 OT HCD。
注：每个扫描和过滤器的详细参数设置可在 补充表1中找到。最佳MS和DDA设置可能因所使用的特定质谱仪以及样品类型而异，因此应进行调整。 - 通过在惰性质谱玻璃小瓶入口中以0.1%TFA的规定体积溶解200-400ng样品肽来制备样品。如果由于样品量低而无法进行浓度测定，请通过比较总离子电流（TIC）来验证相同的样品上样量。
注意：为此，请在合适的软件（例如FreeStyle）中打开质谱测量的结果文件，然后检查色谱图。所有样品的强度应相当。代表性的TIC如图 3所示。 - 分析使用适合蛋白质组学的软件（例如MaxQuant23，用于蛋白质组学的Progenesis QI或蛋白质组发现器）获得的原始数据，并根据研究问题进行统计数据分析。
5. 使用MaxQuant分析蛋白质组学原始数据
注意：有关MaxQuant参数的详细信息，请参见 补充表2。下面将简要介绍它们。
- 通过单击加载，将原始文件加载到原始数据标头中的 MaxQuant 软件中。
- 通过单击“ 设置实验”来分配样品名称。
- 定义特定于组的参数。首先，添加修改。由于样品处理，选择脱酰胺（NQ），氧化（M）和氨基甲酰甲基化（N项）作为可变修饰，并添加氨基甲酰甲基化（C）作为固定修饰。
- 在消化选项卡中选择胰蛋白酶作为消化酶。
- 在“无标签定量”选项卡中添加无标签定量选项 LFQ。如果要处理的文件超过 10 个，请选择“快速 LFQ”选项以缩短处理时间。添加 iBAQ 选项作为蛋白质定量的度量24.
- 确保所有其他特定于组的参数保留在出厂设置中。
- 转到 “全局参数 ”选项卡，然后在 “序列 ”选项卡中添加从 uniprot.org 派生的 FASTA 文件。相应地修改标识符规则并添加分类 ID，在本例中为 9606 表示 智人。
- 对于蛋白质定量，请选择 独特肽和剃刀 肽。
- 确保所有其他全局参数保留在出厂设置中。
- 单击开始并检索 蛋白质组.txt 在MaxQuant分析后输出，以便在英仙座中进行进一步分析。
6. 使用英仙座进行统计分析
- 在 Perseus 中加载 蛋白质组.txt 文件，将 iBAQ 值添加为主列，并根据其类型对所有其他列进行排序。
- 通过基于分类列筛选行来筛选出诱饵和污染物。
- 根据有效值筛选结果。在本例中，分析中仅包含两个样本，因此选择了一个有效值的最小数量。
- 以.txt格式导出 Perseus 输出以供进一步处理，例如在 Excel 中，并评估有关研究问题的结果。
7. 选定蛋白质的验证
注意：验证MS数据的常用方法是，例如，免疫染色或蛋白质印迹。由于神经黑色素的颜色较深且具有自发荧光，因此使用辣根过氧化物酶或荧光团偶联抗体对神经黑色素颗粒内的蛋白质进行免疫染色是不适用的。对于蛋白质印迹分析，需要非常大量的 死后 组织。因此，通过靶向质谱法验证了选定的蛋白质，并在本例中建立了平行反应监测（PRM）实验。
- 选择蛋白质进行验证。选择在DDA实验中已经检测到的这些蛋白质的肽。肽应不含遗漏的切割或修饰，以确保可靠的定量。
注意：验证一种特定蛋白质可能有多种原因，例如，所研究条件下的丰度差异。对于代表性结果，选择了细胞质动力蛋白1重链1，发现其在NMG和SN样品中含量相当，因此可以作为参考以确保相同的样品上样量。 - 使用选定的肽通过HPLC软件设置PRM方法的第一个版本。保留DDA方法的所有色谱和全局参数设置。
- 添加 MS OT 和 tMS 2 OT HCD 作为扫描类型。确保 MS OT 的设置与 DDA 方法的设置相同。PRM方法的详细设置可以在补充表1中找到。
- 对于 tMS2 OT HCD，添加选定的肽作为包含列表。因此，添加在DDA测量中观察到的氨基酸序列和m / z值。对于第一个PRM实验，请勿添加保留时间窗口或将 t开始 设置为0， 将t停止 设置为120（对于120分钟的梯度）。
- 测量后使用合适的软件（例如Skyline）评估PRM方法，并获得添加到包含列表的肽的保留时间。对于包含的肽，检查MS1扫描中至少3个母离子和MS2扫描中5个碎片离子的峰是否相当，质量误差低（±5 ppm）。
- 优化PRM方法，例如，通过提高 tMS2 OT HCD 扫描的分辨率并将保留时间窗口添加到包含列表中。
注意：发现3分钟的保留时间窗口非常适合本实验（在第一个PRM实验中观察到的保留时间为1.5分钟±）。 - 使用改进的PRM方法，使用合适的软件根据MS1和MS2水平的峰面积对目标肽和蛋白质进行定量。
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Representative Results
NMG和SN组织的特异性分离是成功应用该协议的最重要步骤。使用供应商提供的LMD软件中的视场分析功能，可以以颜色相关的方式自动选择NMG。因此，必须识别含有NMG的组织区域（图2A），并且必须执行具有调整颜色阈值的视场分析，从而标记NMG（图2B）。过滤覆盖面积低于100μm²的物体后，仅应保留NMG标记以进行隔离（图2C）。调整激光设置后，可实现标记NMG的精确分离（图2D）。分离NMG后（图2E），可以选择具有50倍放大倍率（图2F）和分离（图2G）的SN组织以比较蛋白质组学谱。对于SN组织，可以使用Cap检查功能可视化分离的物体（图2H）。对于两种样品类型NMG和SN，发现分离500，000μm2脑组织足以满足该协议，每个样品至少可以运行三次MS。
120 min DDA实验的代表性示例如图3所示（由于主色谱柱在测量的最后15分钟内洗涤，色谱图在105 min之前裁剪）。应用的方法应允许样品在整个梯度上洗脱，产生清晰简洁的峰，并且所有样品的总离子电流（TIC）强度应相当。
将所提出的方案应用于一个 500，000 μm² NMG 样品和一个 1，000，000 μm² SN 组织的样品，并调整 MS 样品的体积（NMG 为 5 μL，SN 为 2.5 μL）以确保相同的肽载样量，导致在 NMG 样品中鉴定出 1，898 个蛋白质基团 （PG），在 SN 样品中鉴定出 1，565 个 PG。进一步的比较显示，两个样本中均有1，384个PG，而NMG中仅鉴定出514个PG，SN组织中仅鉴定出181个PG（图4）。在这个代表性实验中，总共鉴定了2，079个PG。与之前研究22 的参考数据集进行比较表明，该研究中报告的PG中有87.6%也可以通过当前修订和自动化的方案进行识别，这证明了其适用性。此外，已确定的PG数量可以减少1，143个。
由于样品量很少，无法应用蛋白质印迹等经典验证方法，因此可以通过靶向质谱方法（例如PRM）对目标蛋白质进行验证。蛋白质胞质动力蛋白1重链1的肽ESPEVLLTLDILK的代表性结果如图5所示。在DDA测量中，与SN相比，NMG中该蛋白的iBAQ值略高，这可以通过基于MS1-（图5A，B，E）和MS2水平（图5C，D，F）峰面积的PRM实验来验证。
图 1：神经黑色素颗粒 （NMG） 和周围组织 （SN） 蛋白质组学表征的工作流程。 通过激光显微切割（LMD） 从 组织切片中分离NMG和SN样品。分离蛋白质并进行胰蛋白酶溶液内消化。所得肽在数据依赖性采集（DDA）模式下通过LC-MS/MS测量 进行分析 。使用MaxQuant和Perseus软件进行数据分析。通过平行反应监测（PRM）实验对选定的蛋白质进行验证。PRM数据使用Skyline软件进行分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：NMG 和 SN 样品的选择和基于 LMD 的分离。 首先，将含有NMG的区域放置在显微镜下，该区域在400倍放大镜下无需进一步染色即可可见（A）。执行视场分析后，选择 NMG 和其他暗区 （B）。只有NMG在过滤后保持选择（C），并在调整激光设置后被隔离（D）。分离所有NMG后（E），以50倍放大倍数（F）和分离（G）选择SN组织。由于为SN样品分离的物体非常大，因此可以使用 Cap 检查功能（H）在样品收集帽中观察它们。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：120 分钟 DDA 测量的总离子电流 （TIC）。 色谱图显示了在0至~105分钟的保留时间内对应于洗脱肽的离子的相对丰度。当主柱在第105分钟和第120分钟之间洗涤时，色谱图在第105分钟被裁剪。最高峰的强度为2.86×108。峰上方的数字表示保留时间和该特定峰的最丰度离子（BP=碱峰）。请点击此处查看此图的大图。
图 4：维恩图显示了在 NMG 和 SN 组织中鉴定的蛋白质基团 （PG） 的对应关系。在NMG中总共鉴定出1，898个PG，在SN组织中鉴定出1，565个PG，其中在两个组织区域中鉴定出1，384个PG。514个PG在NMG组织中被鉴定出来，而181个PGs在SN组织中被单独鉴定出来。该图是使用在线工具 Venny25 创建的。请点击此处查看此图的大图。
图 5：肽 ESPEVLLTLDILK（细胞质动力蛋白 1 重链 1，++）的 PRM 实验结果。 显示了 MS1-（A，B） 和 MS2 水平 （C，D） 的色谱图，以及 MS1- （E） 和 MS2 水平 （F） 的峰面积，用于 NMG 和 SN 组织的示例性样品。不同的颜色用于表示不同的母离子（在MS1水平上）或子离子（在MS2水平上）。在执行萨维茨基-戈雷平滑后显示色谱图。MS1-（A，B，E）和MS2水平（C，D，F）的强度和峰面积相当。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：质谱实验的参数。 请按此下载此表格。
补充表2：MaxQuant分析的参数。 请按此下载此表格。
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Discussion
LMD是一种广泛适用的技术，用于分离特定组织区域，单细胞或亚细胞结构。在这里介绍的修订和自动化方案中，该技术应用于神经黑色素颗粒（NMG）和NMG周围组织（SN）的特异性分离。到目前为止，已经发表了两种从人类 死后 脑组织中分离NMG的不同方法并被广泛使用：
a） 消耗 1 g 黑质 组织的不连续蔗糖梯度20.由于人类 死后黑质 组织很少见，并且对几个研究问题非常感兴趣，不幸的是，如果每位患者需要大量组织，那么建立一个大型队列研究是非常具有挑战性的。因此，该方法得到了进一步改进，将NMGs26充分分离所需的组织量减少到0.15g。然而，仍然需要至少一半完整的 实质性黑质 。
b） 使用LMD切除NMG。2016年，Plum等人建立了一个基于通过LMD 精确 切除NMG的新协议。使用该协议，所需的样品量可以减少到十个10μm组织切片，从而使所需的组织样品从150 mg显着减少到16.6 mg22。
这里介绍的优化和自动化的基于LMD的方案需要更低的样品量，因为更薄（5 μm与10 μm相比）和更少的组织切片（最多7个，而不是8个），并且通过使用自动化NMG检测需要更少的样品生成时间（每个样品4小时，而1-2天）。因此，通过应用优化的LC-MS方法和最先进的仪器，大大缩短了所需的样品收集时间，并且可以大大增加已鉴定PG的数量。该协议可以很容易地适应其他研究问题和组织。
为了适应所提出的关于用户定义研究问题的协议，根据经验强调了以下方面：
a）分离可比较的样品量：由于与例如细胞培养物或组织裂解物相比，该方案的预期肽产量相当低，因此可能无法测定肽浓度。因此，通过LMD 分离 等量的组织至关重要，LMD可以根据所选对象的组织面积进行估计。在当前设置中，500，000 μm²的组织面积足以生成至少三次MS测量的肽。
b）胰蛋白酶消化：消化的持续时间和胰蛋白酶浓度应在样品之间具有可比性。
c）不同组织的参数调整：根据要分析的组织，需要调整收集的组织量，因此也有必要调整添加胰蛋白酶的量。胰蛋白酶与蛋白质的比例不应低于1：40。
d） LMD 过程的局限性：对于基于 LMD 的感兴趣对象的隔离，在选定对象的大小和切片厚度方面存在限制。由于在基于激光的切割组织过程中组织损失，小于100μm²的物体被认为太小而无法隔离。
e） LC 和 MS 参数的调整：根据所使用的 LC 和 MS 系统，必须增加分离组织的量（例如，使用微流系统操作时），并且必须调整 MS 参数（例如，使用基于离子阱的检测器系统时）。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了德的支持。NBI，德国联邦教育和研究部（BMBF）（批准号FKZ 031 A 534A）和P.U.R.E.（欧洲鲁尔蛋白质研究单位）和蛋白质诊断中心（ProDi）资助的项目，均来自德国北莱茵-威斯特法伦州创新，科学和研究部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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