Summary
Здесь представлен надежный протокол для выделения гранул нейромеланина из посмертной субстанции nigra pars compacta человека с помощью лазерной микродиссекции. Этот пересмотренный и оптимизированный протокол значительно минимизирует необходимое время для сбора образцов, уменьшает требуемое количество образца и улучшает идентификацию и количественную оценку белков с помощью анализа LC-MS / MS.
Abstract
Нейромеланин представляет собой черно-коричневатый пигмент, присутствующий в так называемых гранулах нейромеланина (НМГ) в дофаминергических нейронах черной субстанции pars compacta. Помимо нейромеланина, НМГ содержат различные белки, липиды и металлы. Хотя NMG-содержащие дофаминергические нейроны преимущественно теряются при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона и деменция с тельцами Леви, о механизме образования НМГ и роли НМГ в здоровье и болезни известно лишь немного. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования молекулярной характеристики НМГ. К сожалению, стандартные протоколы выделения белков основаны на ультрацентрифугировании градиента плотности и поэтому требуют большого количества тканей человека. Таким образом, здесь установлен автоматизированный протокол на основе лазерной микродиссекции (LMD), который позволяет собирать NMG и окружающую ткань черной субстанции (SN) с использованием минимального количества ткани непредвзятым, автоматизированным способом. Иссеченные образцы впоследствии анализируются масс-спектрометрией для расшифровки их протеомного состава. С помощью этого рабочего процесса было идентифицировано 2079 белков, из которых 514 белков были идентифицированы исключительно в NMG и 181 в SN. Настоящие результаты были сопоставлены с предыдущим исследованием с использованием аналогичного подхода, основанного на LMD, достигшего перекрытия 87,6% для обоих протеомов, что подтверждает применимость пересмотренного и оптимизированного протокола, представленного здесь. Чтобы подтвердить текущие результаты, интересующие белки были проанализированы с помощью целевой масс-спектрометрии, например, параллельных экспериментов по мониторингу реакций (PRM).
Introduction
Каждая ткань состоит из гетерогенной смеси различных типов клеток, но специфическое выделение одного типа клеток часто необходимо для более точной характеристики. Лазерная микродиссекция (LMD), соединяющая микроскоп с лазерным применением, является мощным инструментом для специфического выделения областей тканей, отдельных клеток или клеточных подструктур из сложного композита. Применение LMD в сочетании с масс-спектрометрией (LMD-MS) уже успешно реализовано для нескольких исследовательских вопросов, включая выделение ДНК1, РНК2 и белков 3,4,5. В этом протоколе описан пересмотренный и оптимизированный протокол LMD-MS для протеомного анализа посмертной ткани мозга человека и субклеточных компонентов для расшифровки новых патомеханизмов болезни Паркинсона.
Нейромеланин представляет собой черный, почти нерастворимый пигмент, обнаруженный в катехоламинергических, дофамин-продуцирующих нейронах черной субстанции pars compacta6. Вместе с белками и липидами он накапливается в органеллоподобных гранулах, окруженных двойной мембраной, называемой гранулами нейромеланина (NMGs)7,8,9. НМГ можно наблюдать с трехлетнего возраста у человека, увеличиваясь в количестве и плотности в процессе старения10,11. На сегодняшний день нет определенной гипотезы об образовании нейромеланина, но одно предположение заключается в том, что нейромеланин образуется в результате окисления дофамина12. Другие гипотезы основаны на ферментативной продукции нейромеланина (например, тирозиназы)13. Было обнаружено, что сам нейромеланин обладает высоким сродством связывания с липидами, токсинами, ионами металлов и пестицидами. Исходя из этих выводов, предполагается, что образование НМГ защищает клетку от накопления токсичных и окислительных веществ и от токсинов окружающей среды14,15. Помимо этой нейропротекторной функции, есть доказательства того, что нейромеланин может вызывать нейродегенеративные эффекты, например, путем насыщения железом и последующего катализа свободных радикалов16,17. Кроме того, нейромеланин, высвобождаемый во время нейродегенеративных процессов, может разлагаться перекисью водорода, которая может ускорить некроз реактивными металлами и другими токсичными соединениями, ранее связанными с нейромеланином, и может способствовать нейровоспалению и повреждению клеток18. Однако до сих пор точная роль НМГ в нейродегенеративных процессах, как при течении болезни Паркинсона, четко не изучена. Тем не менее, НМГ, по-видимому, участвуют в патогенезе болезни Паркинсона, и их специфический анализ имеет первостепенное значение для разгадки их роли в нейродегенерации. К сожалению, обычным лабораторным животным (например, мышам и крысам) и клеточным линиям не хватает NMG19. Поэтому исследователи особенно полагаются на посмертную ткань мозга для своего анализа. В прошлом выделение НМГ центрифугированием градиента плотности основывалось на наличии большого количества ткани черной субстанции 20,21. Сегодня LMD представляет собой универсальный инструмент для специального выделения NMG из образцов человеческого мозга, чтобы затем проанализировать их с помощью LC-MS / MS.
В этом протоколе представлена улучшенная и автоматизированная версия предыдущего протокола22 для выделения NMG и окружающих тканей (SN), что позволяет быстрее генерировать образцы, большее количество идентифицированных и количественных белков и значительное сокращение необходимых количеств тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование мозговой ткани человека было одобрено комитетом по этике Рурского университета в Бохуме, Германия (номер файла 4760-13), в соответствии с немецкими правилами и руководящими принципами. Этот протокол был применен к коммерчески полученным срезам ткани substantia nigra pars compacta . Графический обзор представленного протокола показан на рисунке 1.
1. Сечение тканей
- Предварительно охладите криостатную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая ткань требует различных температур криостата, которые можно найти в соответствующем протоколе поставщика. - Очистите нож из нержавеющей стали с 70% этанолом и установите его в держатель лезвия.
- Перенесите ткань из морозильной камеры -80 °C в криостат с помощью ледяного ящика и дайте ей приспособиться к температуре криостатной камеры в течение 15 минут.
- Однозначно маркируйте мембранные слайды карандашом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора проб на основе LMD требуются мембранные слайды ПЭТ/ПЕН. Обращайтесь с мембранными слайдами ПЭТ/ПЕН с осторожностью, так как они чрезвычайно хрупкие. - Нанесите каплю коммерческой замороженной срезной среды на держатель ткани. Прежде чем он будет полностью заморожен, поместите ткань на замороженный слой среды и дайте ей затвердеть, чтобы ткань была соединена с держателем ткани.
- Установите держатель ткани в криостатную камеру и отрегулируйте его ориентацию перед началом сечения. Оптимальная ориентация держателя зависит от ориентации ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться обрезать ткань до тех пор, пока не будет достигнута плоскость сечения, необходимая для срезов. - Прежде чем будет достигнута область ткани, представляющая интерес, отрегулируйте настройку разреза до желаемой толщины ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 или 10 мкм является рекомендуемой толщиной для этого протокола, поскольку было установлено, что участки толщиной 20 мкм несовместимы со сбором образцов22 на основе LMD. - Вырежьте две секции и отбросьте их.
- Положите противокатаную пластину.
- Отрежьте участок ткани, осторожно откройте антирулонную пластину, возьмите мембранный слайд и предотвратите сворачивание ткани, разместив участок ткани на мембранном слайде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение мембранных слайдов при комнатной температуре перед адгезией обеспечивает точное прикрепление образца. Несколько секций могут быть помещены на один и тот же мембранный слайд, но перекрытие тканей должно быть предотвращено. - Храните участки тканей, размещенные на мембранных слайдах в криостате, до тех пор, пока не будет завершено сечение.
- Храните криосекционную ткань при -20 °C до дальнейшей обработки или непосредственно приступайте к процедуре ниже. Храните разрезанные тканевые слайды при -80 °C до дальнейшего использования.
2. Лазерная микродиссекция и катапультирование давлением
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку гранулы нейромеланина видны без какого-либо окрашивания из-за их черно-коричневатого цвета, для этого протокола окрашивание не требуется. Тем не менее, различные процедуры окрашивания могут быть объединены с этим протоколом, если это необходимо. Имейте в виду, что использование блокирующих растворов или антител повлияет на анализы LC-MS / MS.
- Включите систему MicroBeam и откройте соответствующее программное обеспечение на компьютере (см. Таблицу материалов).
- Поместите слайд тканевой мембраны в SlideHolder на RoboStage, повернув ткань вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от устройства LMD может потребоваться размещение мембранного слайда таким образом, чтобы ткань была обращена вниз. Как правило, отбор проб осуществляется в среде с контролируемой температурой для обеспечения оптимальных и воспроизводимых условий. - Установите микроскоп на нужное увеличение (здесь используется 50-кратное) для обзорного сканирования.
- Используйте функцию Scan, которую можно найти в окне Navigator интерфейса программного обеспечения, чтобы получить обзорное сканирование участка ткани. Найдите верхний левый угол и нижний правый угол интересующей области и выберите их в интерфейсе программного обеспечения. Затем выберите Сканировать все ROI , чтобы выполнить сканирование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзорное сканирование не является обязательным, но оно обеспечивает лучшую ориентацию на слайде и может быть сохранено для последующего использования. - Отрегулируйте увеличение микроскопа для соответствующей ткани, которое в 400 раз в данном случае гранул нейромеланина.
- Поиск области с гранулами нейромеланина. Выберите Анализ поля зрения в программном интерфейсе, выберите Инвертировать результат и установите пороговое значение для каналов RGB таким образом, чтобы только гранулы нейромеланина выделялись красным цветом в окне предварительного просмотра. Нажмите OK , чтобы использовать скорректированные настройки для поля зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может случиться так, что небольшие объекты, имеющие темный цвет, также будут выбраны. Чтобы учесть это, отбросьте все объекты, занимающие площадь менее 100мкм2 , прежде чем выделять гранулы нейромеланина. Для этого откройте Список элементов, нажав на иконку на панели инструментов, выберите рассматриваемый слайд и упорядочите элементы по областям. Выберите области размером менее 100мкм2 и удалите их. - Отрегулируйте настройки лазера, используя область слайда, которая покрыта только мембраной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать мастер настройки лазера резки и следовать инструкциям программного обеспечения. Требуемые настройки лазера могут отличаться в разных слайдах. Для 5-мкм секций с 400-кратным увеличением типичные настройки составляют 32 энергии и 51 фокус для резки и 28 энергий и -1 фокус для лазерной импульсной катапультации (LPC). - Отрегулируйте настройки скорости для позиционирования и резки , чтобы обеспечить надлежащую изоляцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: 30% скорость была признана оптимальной для изоляции НМГ. - Заполните крышку пробирки для сбора проб сверхчистой водой объемом 50 мкл и вставьте колпачок в коллектор RoboMover.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатый коллектор, используемый для настоящих экспериментов, может нести одну пробирку для сбора проб за раз. - Расположите RoboMover над RoboStage II с помощью программного интерфейса, чтобы начать сбор образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого откройте окно RoboMover, в котором отображается коллектор. Нажмите на колпачок пробирки для сбора образцов, отображаемый в окне RoboMover, чтобы переместить колпачок в рабочую зону. Отрегулируйте оптимальную высоту перемещения и рабочей высоты в окне RoboMover. В противном случае вода в крышке может упасть на горку или катапультированные объекты не достигнут крышки. - Запустите лазер. Управляйте настройками энергии и фокусировки во время лазерного процесса и при необходимости регулируйте настройки. Обеспечьте надлежащую изоляцию и катапультирование изолированных объектов в колпачок пробоотборника по крайней мере для первых десяти объектов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная изоляция и катапультирование должны быть проверены визуально. Оба должны привести к созданию свободной от тканей области размером с предварительно выбранный объект в срезе ткани (см. Рисунок 2C,D). Отрегулируйте настройки лазера, если объект остается прикрепленным к срезу ткани после резки и катапультирования. Для катапультирования вариант CenterRoboLPC хорошо подходит для изоляции НМГ. Параметры катапультирования можно настроить для каждого выбранного объекта в списке элементов. - После завершения выборки переместите RoboMover в исходное положение. Извлеките пробирку для сбора проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда количество собранных объектов довольно мало, а объекты достаточно велики, сбор образцов может быть обеспечен нажатием кнопки Cap Check, которая поместит крышку трубки для сбора образцов под микроскоп, чтобы можно было подсчитать количество объектов внутри воды в колпачке (см. Рисунок 2H). - Открутите образец с помощью центрифуги. Короткие спины 5 с с увеличением центробежной силы за счет ускорения центрифуги были признаны достаточными. На этом этапе храните образцы при -80 °C, так как все образцы должны быть дополнительно обработаны вместе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения протеомного профиля ткань, окружающая НМГ, также была выделена после их иссечения. Выделение окружающих тканей выполняли при 50-кратном увеличении. - Высушите образцы в вакуумном концентраторе. Было установлено, что 1,5 ч достаточно для 50 мкл воды.
- Солюбилизируют и лизируют ткань в 40 мкл муравьиной кислоты в течение 20 мин (комнатная температура).
- Усиливают лизис тканей путем обработки ультразвуком при 45 кГц (килогерц) в течение 5 мин в ванне с ультразвуком. Наполните ванну с ультразвуком льдом, чтобы предотвратить таяние трубок. Храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшей обработки.
3. Триптическое пищеварение
- Разморозка образцов на льду.
- Полностью высушите образцы в вакуумном концентраторе.
- Заполните образец 50 мкл подходящего буфера пищеварения, например, бикарбонатом аммония 50 мМ.
- После добавления 1,25 мкл 200 мМ 1,4-дитиотрейтола инкубируют образцы в течение 30 мин при 60 °C и 300 об/мин с помощью термомикшера и затем охлаждают их до комнатной температуры (RT).
- Затем инкубируют образцы на RT в течение 30 мин в темноте после добавления 1,36 мкл 0,55 М йодоацетамида.
- Добавьте подходящее количество трипсина в образцы и инкубируйте образцы в течение ночи (~16 ч) при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 000 000мкм2 было признано достаточным 0,1 мкг трипсина. - Добавьте 2,6 мкл 10% трифторуксусной кислоты (TFA) в образцы, чтобы остановить пищеварение (конечная концентрация 0,5% TFA).
- Полностью высушите образцы с помощью вакуумного концентратора. Затем заполните образцы до определенного конечного объема с 0,1% TFA. Образцы НМГ заполняли до 20 мкл, из которых 5 мкл использовали для одного масс-спектрометрического (МС) эксперимента.
- Храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Определение концентрации пептидов с помощью анализа аминокислот или другого подходящего метода количественной оценки (например, Direct Detect).
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие количества проб могут не поддаваться количественной оценке с использованием упомянутых методов. Чтобы обеспечить одинаковую загрузку образца, каждый образец должен содержать одинаковое количество изолированной ткани, и каждый образец должен рассматриваться одинаково.
4. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий высокопроизводительный масс-спектрометрический (MS) анализ жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) оптимизирован для конкретной системы LC с устройством улавливающей колонны и масс-спектрометром, используемым здесь (см. Таблицу материалов). Для других систем LC и MS рекомендуется адаптация параметров.
- Используя программное обеспечение Xcalibur, настройте параметры ВЭЖХ следующим образом.
- Колонка ловушки: Установите температуру на 60 °C, скорость потока до 30 мкл/мин, работающий буфер до 0,1% трифторуксусной кислоты.
- Аналитическая колонка C18 с обратной фазой: установите температуру на уровне 60 °C, скорость потока до 30 мкл/мин, работающий буфер A до 0,1% трифторуксусной кислоты, работающий буфер B до 84% ацетонитрила и градиент до 5%-30% работающего буфера B в течение 98 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптация градиента может быть неизбежной и настоятельно рекомендуется при использовании различных тканей или клеток. Общее время градиента может изменяться из-за загрузки образца в начале градиента и промывки образца в конце градиента. Общий градиент в этом протоколе состоит из 7-минутной загрузки образца и дополнительной промывки колонны в течение 15 минут, что приводит к общему времени градиента 120 мин.
- Создайте метод сбора данных (DDA) с помощью XCalibur Instrument Setup, который можно найти в меню дорожной карты программного обеспечения HPLC.
- На вкладке Глобальные параметры определите режим инфузии Жидкостная хроматография, Ожидаемая пиковая ширина LC (30 с) и Состояние заряда по умолчанию (2).
- Перейдите на вкладку Параметры сканирования и добавьте следующие сканы и фильтры в указанном порядке: MS OT, MIPS, Интенсивность, Состояние заряда, Динамическое исключение и ddMS2 OT HCD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные настройки параметров для каждого сканирования и фильтра можно найти в дополнительной таблице 1. Оптимальные настройки MS и DDA могут варьироваться для конкретного используемого масс-спектрометра, а также типа образца и, следовательно, должны быть адаптированы. - Подготовка образцов путем растворения 200-400 нг пептидов образца в определенном объеме 0,1% TFA в инертных масс-спектрометрических стеклянных флаконах. Если определение концентрации неприменимо из-за низкого количества пробы, проверьте одинаковую загрузку образца, сравнив общий ионный ток (TIC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого откройте полученный файл масс-спектрометрических измерений в подходящем программном обеспечении, например, FreeStyle, и проверьте хроматограмму. Интенсивность должна быть сопоставимой для всех образцов. Репрезентативный ИТК показан на рисунке 3. - Проанализируйте необработанные данные, полученные с помощью протеомного подходящего программного обеспечения, например, MaxQuant23, Progenesis QI для протеомики или Proteome Discoverer, и выполните статистический анализ данных на основе исследовательского вопроса.
5. Анализ протеомных необработанных данных с использованием MaxQuant
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о параметрах MaxQuant приведена в Дополнительной таблице 2. Они кратко описаны ниже.
- Загрузите необработанные файлы в программное обеспечение MaxQuant в заголовке необработанных данных, нажав кнопку Загрузить.
- Назначьте имена образцов, щелкнув Установить эксперимент.
- Определите параметры, специфичные для группы. Во-первых, добавьте изменения. В связи с обработкой образцов выберите деамидацию (NQ), окисление (M) и карбамидометилирование (N-член) в качестве переменных модификаций и добавьте карбамидометилирование (C) в качестве фиксированной модификации.
- Выберите Трипсин в качестве фермента пищеварения во вкладке Пищеварение .
- Добавьте опцию бесплатной количественной оценки меток LFQ на вкладке Label Free Quantification . Если необходимо обработать более 10 файлов, выберите параметр Fast LFQ , чтобы сократить время обработки. Добавьте опцию iBAQ в качестве меры для количественной оценки белка24.
- Убедитесь, что все остальные параметры группы остаются в заводских настройках.
- Перейдите на вкладку Глобальные параметры и добавьте файл FASTA, производный от uniprot.org на вкладке Последовательности . Измените правило идентификатора соответствующим образом и добавьте идентификатор таксономии, в данном случае 9606 для homo sapiens.
- Для количественной оценки белка выбирайте пептиды Unique и Razor .
- Убедитесь, что все остальные глобальные параметры остаются в заводских настройках.
- Нажмите «Пуск» и извлеките белковые группы.txt выходные данные после анализа MaxQuant для дальнейшего анализа в Perseus.
6. Статистический анализ с использованием Персея
- Загрузите белковые группы.txt файл в Perseus, добавьте значения iBAQ в качестве основных столбцов и отсортируйте все остальные столбцы в соответствии с их типом.
- Отфильтровывайте приманки и загрязняющие вещества, фильтруя строки на основе категориального столбца.
- Фильтрация результатов на основе допустимых значений. В данном случае, когда в анализ были включены только два образца, было выбрано минимальное число из одного допустимого значения.
- Экспортируйте выходные данные Perseus в формате .txt для дальнейшей обработки, например, в Excel, и оцените результаты по исследовательскому вопросу.
7. Валидация выбранных белков
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемыми методами валидации данных РС являются, например, иммунологическое окрашивание или вестерн-блот. Из-за темного цвета и аутофуоресценции нейромеланина иммунологическое окрашивание белков внутри гранул нейромеланина либо пероксидазой хрена, либо флуорофор-конъюгированными антителами неприменимо. Для анализа Вестерн Блотт потребуется очень большое количество посмертной ткани. Поэтому выбранные белки проверяются целевой масс-спектрометрией, и в данном случае были поставлены эксперименты по параллельному мониторингу реакций (PRM).
- Выберите белки для проверки. Выбирайте пептиды этих белков, уже обнаруженных в экспериментах DDA. Пептиды не должны содержать пропущенных расщеплений или модификаций для обеспечения надежной количественной оценки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Причин для валидации одного конкретного белка может быть несколько, например, дифференциальное содержание в исследуемых условиях. Для репрезентативных результатов был выбран цитоплазматический динеин 1 тяжелой цепи 1, который, как было установлено, эквивалентно распространен в образцах НМГ и SN и поэтому может быть использован в качестве эталона для обеспечения равной загрузки образца. - Используйте выбранные пептиды для настройки первой версии PRM-метода с помощью программного обеспечения ВЭЖХ. Сохраните все настройки хроматографии и глобальных параметров из метода DDA.
- Добавьте MS OT и tMS2 OT HCD в качестве типов сканирования. Убедитесь, что параметры для MS OT совпадают с параметрами метода DDA. Подробные настройки метода PRM можно найти в дополнительной таблице 1.
- Для tMS2 OT HCD добавьте выбранные пептиды в качестве списка включения. Поэтому добавьте аминокислотную последовательность и значение m/z, наблюдаемое в измерениях DDA. Для первого эксперимента PRM не добавляйте окна времени удержания или устанавливайте t start равным 0, а t stop равным 120 (для 120-минутного градиента).
- Оцените метод PRM после измерения с помощью подходящего программного обеспечения, например, Skyline, и получите время удержания пептидов, добавленных в список включения. Для включенных пептидов проверьте, что сопоставимые пики наблюдаются по крайней мере для трех ионов-предшественников в сканировании MS1 и пяти фрагментов ионов в сканировании MS2 с погрешностью низкой массы (±5 ppm).
- Уточните метод PRM, например, увеличив разрешение для сканирования tMS2 OT HCD и добавив окна времени хранения в список включения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что окна времени удержания в 3 мин хорошо подходят для настоящих экспериментов (наблюдаемое время удержания в первом эксперименте PRM ± 1,5 мин). - С помощью усовершенствованного PRM-метода выполняют количественную оценку интересующих пептидов и белков на основе пиковой области как на уровнях MS1, так и на УРОВНЯХ MS2 с помощью соответствующего программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Специфическая изоляция NMG и ткани SN является наиболее важным шагом для успешного применения этого протокола. Используя функцию анализа поля зрения в программном обеспечении LMD, предоставляемом поставщиком, NMG могут быть автоматически выбраны в зависимости от цвета. Поэтому необходимо идентифицировать участки тканей, содержащие НМГ (рисунок 2А), и провести анализ поля зрения с скорректированными пороговыми значениями цвета, что приведет к маркировке НМГ (рисунок 2В). После фильтрации объектов, занимающих площадь ниже 100 мкм², только НМГ должны оставаться помеченными для изоляции (рисунок 2C). Точная изоляция маркированных НМГ достигается после корректировки настроек лазера (рисунок 2D). После выделения NMG (рисунок 2E) ткань SN может быть выбрана с 50-кратным увеличением (рисунок 2F) и выделена (рисунок 2G) для сравнения протеомного профиля. Для ткани SN изолированные объекты могут быть визуализированы с помощью функции Cap Check (рисунок 2H). Для обоих типов образцов, NMG и SN, выделение 500 000мкм2 мозговой ткани было признано достаточным для этого протокола, что позволяет как минимум три пробега MS на выборку.
Репрезентативный пример 120-минутного эксперимента DDA показан на рисунке 3 (поскольку основной столб промыт в последние 15 минут измерения, хроматограмма обрезается непосредственно перед 105 мин). Применяемый метод должен допускать элюирование образца над полным градиентом, создавая резкие и краткие пики, а интенсивность общего ионного тока (TIC) должна быть сопоставима по всем образцам.
Применение представленного протокола на одном образце 500 000 мкм² НМГ и одном образце ткани SN площадью 1 000 000 мкм² с скорректированными объемами для образцов MS (5 мкл для NMG и 2,5 мкл для SN) для обеспечения идентичной пептидной нагрузки привело к идентификации 1 898 белковых групп (PG) в образце NMG и 1 565 PG в образце SN. Дальнейшее сравнение выявило 1 384 ПГ, которые были идентифицированы в обоих образцах, в то время как 514 ПГ были идентифицированы исключительно в НМГ и 181 ПГ в ткани SN (рисунок 4). В общей сложности в этом репрезентативном эксперименте было идентифицировано 2079 ПГ. Сравнение со справочным набором данных из предыдущего исследования22 показало, что 87,6% ПГ, о которых сообщалось в этом исследовании, также могут быть идентифицированы с помощью нынешнего пересмотренного и автоматизированного протокола, что доказывает его применимость. Кроме того, число выявленных ПГ может быть увеличено на 1 143.
Поскольку минимальные количества образцов не позволяют применять классические методы валидации, такие как western Blots, валидация интересующих белков может быть достигнута целевыми масс-спектрометрическими подходами, например, PRM. Репрезентативные результаты для пептида ESPEVLLTLDILK белка цитоплазматического динеина 1 тяжелой цепи 1 показаны на фиг.5. Было обнаружено, что значение iBAQ этого белка несколько выше в NMG по сравнению с SN в измерениях DDA, которые могут быть проверены PRM-экспериментами на основе пиковой области на MS1- (рисунок 5A, B, E) и MS2-уровне (рисунок 5C, D, F).
Рисунок 1: Рабочий процесс для протеомной характеристики гранул нейромеланина (NMG) и окружающих тканей (SN). Образцы NMG и SN были выделены из срезов тканей с помощью лазерной микродиссекции (LMD). Были выделены белки и проведено триптическое переваривание в растворе. Полученные пептиды анализировали с помощью измерений LC-MS/MS в режиме сбора данных (DDA). Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения MaxQuant и Perseus. Валидацию выбранных белков проводили с помощью экспериментов с параллельным мониторингом реакций (PRM). PRM-данные анализировались с помощью программного обеспечения Skyline. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Отбор и изоляция образцов НМГ и СН на основе LMD. Сначала область, содержащую НМГ, видимую без дальнейшего окрашивания при 400-кратном увеличении, помещают под микроскоп (А). После выполнения анализа поля зрения выбираются NMG и другие темные области (B). Только НМГ остаются выбранными после фильтрации (C) и изолируются после настройки параметров лазера (D). После того, как все НМГ выделены (E), ткань SN выбирается с 50-кратным увеличением (F) и выделяется (G). Поскольку объекты, изолированные для образцов SN, довольно большие, их можно наблюдать в колпачке сбора образцов с помощью функции Cap Check (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Общий ионный ток (TIC) 120-минутного измерения DDA. Хроматограмма показывает относительное обилие ионов, соответствующих элюирующим пептидам, в диапазоне времени удержания от 0 до ~105 мин. Поскольку основная колонна промывается между105-й и 120-й минутой, хроматограмма обрезается на 105-йминуте. Интенсивность самого высокого пика составляет 2,86 х 108. Числа выше пиков указывают время удержания и наиболее распространенный ион этого конкретного пика (BP = базовый пик). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Диаграмма Венна, показывающая соответствие белковых групп (ПГ), идентифицированных в NMG и SN ткани. В общей сложности 1 898 PG были идентифицированы в NMG и 1 565 PG в ткани SN, из которых 1 384 PG были идентифицированы в обеих областях ткани. 514 PG были идентифицированы исключительно в ткани NMG, в то время как 181 PG были идентифицированы исключительно в ткани SN. Диаграмма была создана с помощью онлайн-инструмента Venny25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Результаты PRM-экспериментов на пептиде ESPEVLLTLDILK (цитоплазматический динеин 1 тяжелой цепи 1, ++). Хроматограммы на уровнях MS1- (A,B) и MS2 (C,D), а также пиковые участки на MS1-(E) и MS2-уровне (F) показаны для примерного образца NMG и SN-ткани. Различные цвета используются для обозначения различных предшественников (на уровне MS1) или ионов продукта (на уровне MS2). Хроматограммы отображаются после выполнения сглаживания Савицкого-Голея. Интенсивности и пиковые области были сопоставимы на уровне MS1- (A,B,E) и MS2 (C,D,F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Параметры масс-спектрометрических экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Параметры анализа MaxQuant. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD является широко применимым методом выделения определенных областей тканей, отдельных клеток или субклеточных структур. В пересмотренном и автоматизированном протоколе, представленном здесь, этот метод применяется для специфической изоляции гранул нейромеланина (NMG) и NMG-окружающих тканей (SN). До сих пор были опубликованы и широко использовались два различных подхода к выделению НМГ из посмертной ткани головного мозга человека:
а) Прерывистый градиент сахарозы, потребляющий 1 г ткани черной субстанции 20. Поскольку посмертная ткань черной субстанции человека встречается редко и представляет большой интерес для нескольких исследовательских вопросов, к сожалению, довольно сложно организовать большое когортное исследование, если на одного пациента требуется большое количество ткани. Таким образом, этот подход был дополнительно улучшен, уменьшая необходимое количество тканей до 0,15 г для достаточной изоляции NMGs26. Тем не менее, по крайней мере, половина полной substantia nigra pars compacta требовалась.
б) Иссечение НМГ с использованием ЛМД. В 2016 году Plum et al создали новый протокол, основанный на точном иссечении NMG через LMD. С помощью этого протокола требуемое количество образца может быть уменьшено до десяти 10 мкм участков ткани, что приводит к впечатляющему сокращению требуемого образца ткани со 150 мг до 16,6 мг22.
Оптимизированный и автоматизированный протокол на основе LMD, представленный здесь, требует еще меньших количеств образцов, поскольку пришлось использовать более тонкие (5 мкм по сравнению с 10 мкм) и меньшее количество участков ткани (максимум 7 по сравнению с 8) и требует меньше времени для генерации образца (4 ч на образец по сравнению с 1-2 днями) за счет использования автоматизированного обнаружения НМГ. Таким образом, требуемое время сбора проб было значительно сокращено, а количество идентифицированных ПГ может быть значительно увеличено за счет применения оптимизированного метода LC-MS и современных приборов. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим вопросам исследования и тканей.
Для адаптации представленного протокола, касающегося определяемых пользователем исследовательских вопросов, выделяются следующие аспекты, основанные на опыте:
a) Выделение сопоставимых количеств образцов: поскольку ожидаемый выход пептидов по настоящему протоколу довольно низок по сравнению, например, с клеточной культурой или лизатами тканей, определение концентрации пептидов может быть невозможным. Таким образом, крайне важно, чтобы равное количество ткани было выделено с помощью LMD, которая может быть оценена на основе области ткани выбранных объектов. В текущей установке площадей тканей 500 000 мкм² достаточно для генерации пептидов по крайней мере для трех измерений РС.
б) Трипсин-пищеварение: продолжительность пищеварения и концентрация трипсина должны быть сопоставимы по образцам.
в) Адаптация параметров для различных тканей: в зависимости от ткани для анализа, количество собранной ткани должно быть скорректировано, что делает необходимым также корректировку количества добавленного трипсина. Соотношение трипсина к белку не должно быть ниже 1:40.
d) Ограничение процесса LMD: Для изоляции объектов, представляющих интерес, на основе LMD существуют ограничения, когда речь идет о размере выбранных объектов и толщине срезов. Из-за потери ткани во время лазерной резки ткани объекты размером менее 100 мкм² считались слишком маленькими для изоляции.
e) Адаптация параметров LC и MS: В зависимости от используемых систем LC и MS количество изолированной ткани должно быть увеличено (например, при работе с системой микропотока) и параметры MS должны быть адаптированы (например, при работе с детекторной системой на основе ионной ловушки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана de. NBI, проект Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (номер гранта FKZ 031 A 534A) и P.U.R.E. (Исследовательский отдел белка в Руре в Европе) и Центр белковой диагностики (ProDi), гранты, оба от Министерства инноваций, науки и исследований Северного Рейна-Вестфалии, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
