Summary
Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd voor het isoleren van neuromelaninekorrels uit menselijk post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel via lasermicrodissectie. Dit herziene en geoptimaliseerde protocol minimaliseert massaal de vereiste tijd voor monsterverzameling, vermindert de vereiste monsterhoeveelheid en verbetert de identificatie en kwantificering van eiwitten door LC-MS / MS-analyse.
Abstract
Neuromelanine is een zwartbruin pigment, aanwezig in zogenaamde neuromelaninekorrels (NMG's) in dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta. Naast neuromelanine bevatten NMG's een verscheidenheid aan eiwitten, lipiden en metalen. Hoewel NMG-bevattende dopaminerge neuronen bij voorkeur verloren gaan bij neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en dementie met Lewy-lichamen, is er slechts weinig bekend over het mechanisme van NMG-vorming en de rol van NMG's in gezondheid en ziekte. Verder onderzoek naar de moleculaire karakterisering van NMG's is dus essentieel. Helaas zijn standaardprotocollen voor de isolatie van eiwitten gebaseerd op ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt en vereisen daarom grote hoeveelheden menselijk weefsel. Zo is hier een geautomatiseerd lasermicrodissectie (LMD) -gebaseerd protocol vastgesteld dat het verzamelen van NMG's en het omliggende substantia nigra (SN) -weefsel mogelijk maakt met behulp van minimale hoeveelheden weefsel op een onbevooroordeelde, geautomatiseerde manier. Uitgesneden monsters worden vervolgens geanalyseerd door massaspectrometrie om hun proteomische samenstelling te ontcijferen. Met deze workflow werden 2.079 eiwitten geïdentificeerd, waarvan 514 eiwitten uitsluitend werden geïdentificeerd in NMG's en 181 in SN. De huidige resultaten zijn vergeleken met een eerdere studie met behulp van een vergelijkbare LMD-gebaseerde benadering die een overlap van 87,6% bereikte voor beide proteomen, waarbij de toepasbaarheid van het herziene en geoptimaliseerde protocol dat hier wordt gepresenteerd, wordt geverifieerd. Om de huidige bevindingen te valideren, werden eiwitten van belang geanalyseerd door gerichte massaspectrometrie, bijvoorbeeld parallelle reactiemonitoring (PRM)-experimenten.
Introduction
Elk weefsel bestaat uit een heterogene mix van verschillende celtypen, maar de specifieke isolatie van één celtype is vaak onmisbaar voor een preciezere karakterisering. Lasermicrodissectie (LMD), waarbij een microscoop wordt gekoppeld aan een lasertoepassing, is een krachtig hulpmiddel voor de specifieke isolatie van weefselgebieden, enkele cellen of cellulaire substructuren uit een complex composiet. De toepassing van LMD in combinatie met massaspectrometrie (LMD-MS) is al succesvol geïmplementeerd voor verschillende onderzoeksvragen, waaronder isolatie van DNA1, RNA2 en eiwitten 3,4,5. In dit protocol wordt een herzien en geoptimaliseerd LMD-MS-protocol beschreven voor de proteomische analyse van menselijk postmortaal hersenweefsel en subcellulaire componenten om nieuwe pathomechanismen van de ziekte van Parkinson te ontcijferen.
Neuromelanine is een zwart, bijna onoplosbaar pigment dat wordt aangetroffen in de catecholaminerge, dopamine-producerende neuronen van de substantia nigra pars compacta6. Samen met eiwitten en lipiden hoopt het zich op in organelachtige korrels omgeven door een dubbel membraan, neuromelaninekorrels (NMG's) genoemd 7,8,9. NMG's kunnen worden waargenomen vanaf de leeftijd van drie jaar bij mensen die in hoeveelheid en dichtheid toenemen tijdens het verouderingsproces10,11. Tot op heden is er geen definitieve hypothese over neuromelaninevorming, maar een aanname is dat neuromelanine wordt gevormd door de oxidatie van dopamine12. Andere hypothesen zijn gebaseerd op enzymatische productie van neuromelanine (bijv. tyrosinase)13. Neuromelanine zelf bleek een hoge bindingsaffiniteit te hebben voor lipiden, toxines, metaalionen en pesticiden. Op basis van deze bevindingen wordt aangenomen dat de vorming van NMG's de cel beschermt tegen de accumulatie van toxische en oxidatieve stoffen en tegen milieutoxines14,15. Naast deze neuroprotectieve functie zijn er aanwijzingen dat neuromelanine neurodegeneratieve effecten kan veroorzaken, bijvoorbeeld door ijzerverzadiging en de daaropvolgende katalyse van vrije radicalen16,17. Bovendien kan neuromelanine dat vrijkomt tijdens neurodegeneratieve processen worden afgebroken door waterstofperoxide, wat necrose kan versnellen door reactieve metalen en andere toxische verbindingen die eerder aan neuromelanine waren gebonden en kan bijdragen aan neuro-inflammatie en cellulaire schade18. Tot nu toe is de exacte rol van NMG's in neurodegeneratieve processen zoals in het verloop van de ziekte van Parkinson echter niet duidelijk begrepen. Toch lijken NMG's betrokken te zijn bij de pathogenese van de ziekte van Parkinson en hun specifieke analyse is van het grootste belang om hun rol in neurodegeneratie te ontrafelen. Helaas missen gewone proefdieren (bijv. Muizen en ratten) en cellijnen NMG's19. Daarom vertrouwen onderzoekers voor hun analyse vooral op postmortaal hersenweefsel. In het verleden was NMG-isolatie door dichtheidsgradiëntcentrifugatie afhankelijk van de beschikbaarheid van grote hoeveelheden substantia nigra-weefsel 20,21. Tegenwoordig presenteert LMD een veelzijdig hulpmiddel om NMG's specifiek te isoleren van menselijke hersenmonsters om ze vervolgens te analyseren door LC-MS / MS.
In dit protocol wordt een verbeterde en geautomatiseerde versie van een eerder protocol22 gepresenteerd voor de isolatie van NMG's en het omliggende weefsel (SN), waardoor een snellere monstergeneratie, hogere aantallen geïdentificeerde en gekwantificeerde eiwitten en een ernstige vermindering van de vereiste weefselhoeveelheden mogelijk wordt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van menselijk hersenweefsel werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Ruhr-Universiteit Bochum, Duitsland (dossiernummer 4760-13), volgens de Duitse regelgeving en richtlijnen. Dit protocol is toegepast op commercieel verkregen substantia nigra pars compacta tissue slices. Een grafisch overzicht van het gepresenteerde protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Weefseldoorsnede
- Koel de cryostaatkamer voor.
OPMERKING: Elk weefsel vereist verschillende cryostaattemperaturen, die te vinden zijn in het respectieve leveranciersprotocol. - Reinig het roestvrijstalen mes met 70% ethanol en installeer het in de meshouder.
- Breng het weefsel van de -80 °C vriezer over naar de cryostaat met behulp van een ijskast en laat het gedurende 15 minuten wennen aan de temperatuur van de cryostaatkamer.
- Label membraanglaasjes ondubbelzinnig met een potlood.
OPMERKING: PET/PEN-membraanglaasjes zijn vereist voor de op LMD gebaseerde monsterverzameling. Behandel de PET/PEN-membraanglaasjes met zorg, omdat ze extreem kwetsbaar zijn. - Breng een druppel commercieel bevroren sectiemedium aan op de weefselhouder. Voordat het volledig wordt ingevroren, plaatst u het weefsel op het bevroren sectiemedium en laat u het uitharden, zodat het weefsel verbonden is met de weefselhouder.
- Installeer de weefselhouder in de cryostaatkamer en pas de oriëntatie aan voordat u begint met snijden. Optimale houderoriëntatie hangt af van de oriëntatie van het weefsel.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om het weefsel bij te snijden totdat het sectievlak dat nodig is voor de plakjes is bereikt. - Voordat het weefselgebied van belang wordt bereikt, past u de snij-instelling aan de gewenste weefseldikte aan.
OPMERKING: 5 of 10 μm is de voorgestelde dikte voor dit protocol, aangezien 20 μm dikke secties onverenigbaar bleken te zijn met de op LMD gebaseerde monsterverzameling22. - Snijd twee secties en gooi ze weg.
- Leg de Anti-roll Plate neer.
- Snijd een deel van het weefsel, open de antirolplaat voorzichtig, neem een membraanschuif en voorkom weefselvouwing terwijl u het weefselgedeelte op de membraanschuif plaatst.
OPMERKING: Het opslaan van de membraanglaasjes bij kamertemperatuur voorafgaand aan de hechting maakt een nauwkeurige monsteraanhechting mogelijk. Verschillende secties kunnen op dezelfde membraanschuif worden geplaatst, maar weefseloverlapping moet worden voorkomen. - Bewaar weefselsecties die op membraanglaasjes in de cryostaat zijn geplaatst totdat de sectie is voltooid.
- Bewaar het gecryopteerde weefsel bij -20 °C tot verdere verwerking of ga direct verder met de onderstaande procedure. Bewaar de doorsneden weefselglaasjes bij -80 °C tot verder gebruik.
2. Laser microdissectie en druk katapulteren
OPMERKING: Omdat neuromelaninekorrels zichtbaar zijn zonder enige vlek vanwege hun zwartbruine kleur, is er geen kleuring nodig voor dit protocol. Toch kunnen indien nodig verschillende kleuringsprocedures met dit protocol worden gecombineerd. Houd er rekening mee dat het gebruik van blokkerende oplossingen of antilichamen de LC-MS/MS-analyses zal beïnvloeden.
- Schakel het MicroBeam-systeem in en open de bijbehorende software op de computer (zie Materiaaltabel).
- Plaats de weefselmembraanschuif in de SlideHolder op de RoboStage met het weefsel naar boven gericht.
OPMERKING: Afhankelijk van het LMD-apparaat kan het nodig zijn om de membraanschuif zo te plaatsen dat het weefsel naar beneden is gericht. Over het algemeen wordt monsterverzameling uitgevoerd in een temperatuurgecontroleerde omgeving om optimale en reproduceerbare omstandigheden te garanderen. - Zet de microscoop op de gewenste vergroting (hier wordt 50-voudig gebruikt) voor de overzichtsscans.
- Gebruik de scanfunctie, die te vinden is in het Navigator-venster van de software-interface, om een overzichtsscan van het weefselgedeelte te verkrijgen. Zoek naar de linkerbovenhoek en de rechterbenedenhoek van het interessegebied en selecteer deze in de software-interface. Selecteer vervolgens Alle ROI's scannen om de scans uit te voeren.
OPMERKING: Overzichtsscans zijn niet verplicht, maar ze maken een betere oriëntatie in de dia mogelijk en kunnen worden opgeslagen voor later gebruik. - Pas de vergroting van de microscoop aan voor het juiste weefsel, dat in het huidige geval van neuromelaninekorrels 400 keer zo groot is.
- Zoek naar een gebied met neuromelaninekorrels. Selecteer Gezichtsveldanalyse in de software-interface, selecteer Resultaat omkeren en stel de drempel voor de RGB-kanalen zo in dat alleen neuromelaninekorrels rood worden gemarkeerd in het voorbeeldvenster. Klik op OK om de aangepaste instellingen voor het gezichtsveld te gebruiken.
OPMERKING: Het kan voorkomen dat kleinere objecten met een donkere kleur ook worden geselecteerd. Om daar rekening mee te houden, gooit u alle objecten weg die een gebied kleiner dan 100 μm2 bestrijken voordat u neuromelaninekorrels isoleert. Om dit te doen, opent u de elementenlijst door op het pictogram in de werkbalk te klikken, de dia in kwestie te selecteren en elementen per gebied te ordenen. Selecteer gebieden kleiner dan 100 μm2 en verwijder ze. - Pas de laserinstellingen aan met een deel van de dia dat alleen door het membraan wordt bedekt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Wizard Laseraanpassing knippen te gebruiken en de instructies van de software te volgen. De vereiste laserinstellingen kunnen verschillen tussen verschillende dia's. Voor secties van 5 μm met een 400-voudige vergroting zijn de typische instellingen 32 energie en 51 focus voor snijden, en 28 energie en -1 focus voor laserpuls katapuls (LPC). - Pas de snelheidsinstellingen voor positionering en snijden aan om een goede isolatie te garanderen.
OPMERKING: 30% snelheid bleek optimaal te zijn voor NMG-isolatie. - Vul de dop van de monsterverzamelingsbuis met 50 μL ultrapuur water en steek de dop in de collector van de RoboMover.
OPMERKING: De buiscollector die voor de huidige experimenten wordt gebruikt, kan één monsterverzamelingsbuis tegelijk dragen. - Plaats de RoboMover boven de RoboStage II met behulp van de software-interface om het verzamelen van monsters te starten.
OPMERKING: Om dit te doen, opent u het RoboMover-venster, waarin het verzamelprogramma wordt weergegeven. Klik op de buisdop van de monsterverzameling die wordt weergegeven in het RoboMover-venster om de dop naar het werkgebied te verplaatsen. Pas de optimale bewegings- en werkhoogte aan in het RoboMover-venster. Anders kan het water in de dop op de glijbaan vallen of zullen de gekatapulteerde objecten de dop niet bereiken. - Start de laser. Regel de energie- en focusinstellingen tijdens het laserproces en pas de instellingen indien nodig aan. Zorg voor een goede isolatie en katapultatie van de geïsoleerde objecten in de buisdop van de monsterverzameling voor ten minste de eerste tien objecten.
OPMERKING: De juiste isolatie en katapultatie moeten visueel worden gecontroleerd. Beide moeten resulteren in een weefselvrij gebied ter grootte van het vooraf geselecteerde object in het weefselsegment (zie figuur 2C,D). Pas de laserinstellingen aan als het object na het snijden en katapulteren aan het weefselsegment blijft zitten. Voor katapulteren blijkt de CenterRoboLPC-optie zeer geschikt voor NMG-isolatie. De katapulterende instellingen kunnen worden aangepast voor elk geselecteerd object in de elementenlijst. - Wanneer de bemonstering is voltooid, navigeert u de RoboMover naar de beginpositie. Verwijder de monsterafnamebuis.
OPMERKING: Wanneer het aantal verzamelde objecten vrij laag is en objecten groot genoeg zijn, kan het verzamelen van monsters worden verzekerd door op Cap Check te klikken, waardoor de buisdop van de monsterverzameling onder de microscoop wordt geplaatst, zodat het aantal objecten in het water in de dop kan worden geteld (zie figuur 2H). - Draai het monster af met behulp van een centrifuge. Korte spins van 5 s met toenemende centrifugale kracht als gevolg van versnelling van de centrifuge bleken voldoende te zijn. Bewaar monsters op dit punt bij -80 °C, omdat alle monsters samen verder moeten worden verwerkt.
OPMERKING: Voor de vergelijking van het proteomische profiel werd het weefsel rond de NMG's ook geïsoleerd na hun excisie. De isolatie van het omliggende weefsel werd uitgevoerd bij 50-voudige vergroting. - Droog de monsters in een vacuümconcentrator. 1,5 uur bleek voldoende voor 50 μL water.
- Solubiliteer en lyseer het weefsel in 40 μL mierenzuur gedurende 20 minuten (kamertemperatuur).
- Verbeter de weefsellyse door ultrasoonapparaat op 45 kHz (kilohertz) gedurende 5 minuten in een ultrasoonapparaatbad. Vul het ultrasoonapparaatbad met ijs om te voorkomen dat buizen smelten. Bewaar de monsters bij -80 °C tot verdere verwerking.
3. Tryptische vertering
- Ontdooi monsters op ijs.
- Droog de monsters volledig in een vacuümconcentrator.
- Vul het monster met 50 μL van een geschikte digestiebuffer, bijvoorbeeld 50 mM ammoniumbicarbonaat.
- Na toevoeging van 1,25 μL van 200 mM 1,4-dithiothreitol, incubeer de monsters gedurende 30 min bij 60 °C en 300 tpm met behulp van een thermomixer en koel ze daarna af tot kamertemperatuur (RT).
- Incubeer vervolgens monsters op RT gedurende 30 minuten in het donker na toevoeging van 1,36 μL 0,55 M jodoacetamide.
- Voeg een geschikte hoeveelheid trypsine toe aan de monsters en incubeer de monsters een nacht (~16 uur) bij 37 °C.
OPMERKING: Voor 1.000.000 μm2 bleek 0,1 μg trypsine voldoende te zijn. - Voeg 2,6 μL 10% trifluorazijnzuur (TFA) toe aan de monsters om de spijsvertering te stoppen (eindconcentratie van 0,5% TFA).
- Droog de monsters volledig met behulp van een vacuümconcentrator. Vul vervolgens monsters tot een gedefinieerd eindvolume met 0,1% TFA. NMG-monsters werden gevuld tot 20 μL, waarvan 5 μL werd gebruikt voor één massaspectrometrisch (MS) experiment.
- Bewaar de monsters bij -80 °C tot verder gebruik. Bepaal de peptideconcentratie door aminozuuranalyse of een andere geschikte kwantificeringsmethode (bijv. Direct Detect).
OPMERKING: Lage monsterhoeveelheden zijn mogelijk niet kwantificeerbaar met behulp van de genoemde technieken. Om een identieke monsterbelasting te garanderen, moet elk monster dezelfde hoeveelheid geïsoleerd weefsel bevatten en moet elk monster gelijk worden behandeld.
4. Hoogwaardige vloeistofchromatografie en massaspectrometrie
OPMERKING: De volgende high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) massaspectrometrische (MS) analyse is geoptimaliseerd voor het specifieke LC-systeem met een vangkolomapparaat en massaspectrometer die hier wordt gebruikt (zie Materiaaltabel). Voor andere LC- en MS-systemen wordt aanpassing van parameters aanbevolen.
- Gebruik de software Xcalibur om de HPLC-instellingen als volgt aan te passen.
- Trapkolom: Stel de temperatuur in op 60 °C, het debiet op 30 μL/min, de loopbuffer op 0,1% trifluorazijnzuur.
- Analytische C18 omgekeerde fasekolom: Stel de temperatuur in op 60 °C, het debiet op 30 μL/min, de loopbuffer A op 0,1% trifluorazijnzuur, de loopbuffer B op 84% acetonitril en de gradiënt op 5%-30% loopbuffer B gedurende 98 minuten.
OPMERKING: Aanpassing van de gradiënt kan onvermijdelijk zijn en wordt sterk aanbevolen bij het gebruik van verschillende weefsels of cellen. De totale verlooptijd kan variëren als gevolg van het laden van monsters aan het begin van de gradiënt en het wassen van monsters aan het einde van de gradiënt. De totale gradiënt in dit protocol bestaat uit 7 min monsterbelasting en extra kolomwas gedurende 15 minuten, wat resulteert in een totale gradiënttijd van 120 minuten.
- Maak een DDA-methode (Data-Dependent Acquisition) met behulp van de XCalibur Instrument Setup, die u kunt vinden in het HPLC-softwareroadmapmenu.
- Definieer op het tabblad Globale parameters de vloeistofchromatografie in infusiemodus, de verwachte piekbreedte van LC (30 s) en de standaardladingsstatus (2).
- Ga naar het tabblad Scanparameters en voeg de volgende scans en filters toe in de aangegeven volgorde: MS OT, MIPS, Intensiteit, Laadstatus, Dynamische uitsluiting en ddMS2 OT HCD.
OPMERKING: De gedetailleerde parameterinstellingen voor elke scan en filter zijn te vinden in aanvullende tabel 1. Optimale MS- en DDA-instellingen kunnen variëren voor de specifieke massaspectrometer die wordt gebruikt en het monstertype en moeten daarom worden aangepast. - Bereid monsters voor door 200-400 ng monsterpeptiden op te lossen in een gedefinieerd volume van 0,1% TFA in inerte massaspectrometrische glazen injectieflaconinlaten. Als de concentratiebepaling niet van toepassing is vanwege de lage hoeveelheid monster, controleer dan de identieke monsterbelasting door de totale ionenstroom (TIC) te vergelijken.
OPMERKING: Om dit te doen, opent u het resulterende bestand van massaspectrometrische meting in een geschikte software, bijvoorbeeld FreeStyle, en controleert u het chromatogram. De intensiteiten moeten voor alle monsters vergelijkbaar zijn. Een representatieve TIC is weergegeven in figuur 3. - Analyseer de ruwe gegevens die zijn verkregen met behulp van een proteomisch geschikte software, bijvoorbeeld MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics of Proteome Discoverer, en voer een statistische gegevensanalyse uit op basis van de onderzoeksvraag.
5. Analyse van proteomische ruwe gegevens met MaxQuant
OPMERKING: Gedetailleerde informatie over MaxQuant-parameters is te vinden in aanvullende tabel 2. Ze worden hieronder kort beschreven.
- Laad RAW-bestanden in de MaxQuant-software in de raw data-header door op Laden te klikken.
- Wijs voorbeeldnamen toe door op Experiment instellen te klikken.
- Definieer groepsspecifieke parameters. Voeg eerst wijzigingen toe. Kies voor monsterverwerking Deamidatie (NQ), Oxidatie (M) en Carbamidomethylatie (N-term) als variabele modificaties en voeg Carbamidomethylatie (C) toe als vaste modificatie.
- Kies Trypsine als spijsverteringsenzym in het tabblad Spijsvertering .
- Voeg de labelvrije kwantificeringsoptie LFQ toe op het tabblad Labelvrije kwantificering . Als er meer dan 10 bestanden moeten worden verwerkt, kiest u de optie Fast LFQ om de verwerkingstijd te verkorten. Voeg de iBAQ-optie toe als maat voor eiwitkwantificering24.
- Zorg ervoor dat alle andere groepsspecifieke parameters in de fabrieksinstellingen blijven.
- Ga naar het tabblad Algemene parameters en voeg het FASTA-bestand toe dat is afgeleid van uniprot.org op het tabblad Reeksen . Wijzig de id-regel dienovereenkomstig en voeg de taxonomie-ID toe, in dit geval 9606 voor homo sapiens.
- Kies voor eiwitkwantificering Unique en Razor peptiden.
- Zorg ervoor dat alle andere globale parameters in de fabrieksinstellingen blijven.
- Klik op Start en haal de eiwitgroepen.txt output op na MaxQuant analyse voor verdere analyse in Perseus.
6. Statistische analyse met Perseus
- Laad de eiwitgroepen.txt bestand in Perseus, voeg de iBAQ-waarden toe als hoofdkolommen en sorteer alle andere kolommen op hun type.
- Filter lokvogels en verontreinigingen uit door rijen te filteren op basis van de categorische kolom.
- Filter resultaten op basis van geldige waarden. In het onderhavige geval is, met slechts twee steekproeven die in de analyse zijn opgenomen, een minimumaantal van één geldige waarde gekozen.
- Exporteer de Perseus-uitvoer in .txt formaat voor verdere verwerking, bijvoorbeeld in Excel, en evalueer de resultaten met betrekking tot de onderzoeksvraag.
7. Validatie van geselecteerde eiwitten
OPMERKING: Veelgebruikte methoden voor validatie van MS-gegevens zijn bijvoorbeeld immunologische kleuring of Western Blot. Vanwege de donkere kleur en de autofluorescentie van neuromelanine zijn immunologische kleuring van eiwitten in neuromelaninekorrels met mierikswortelperoxidase- of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen niet van toepassing. Voor Western Blot-analyse zouden zeer grote hoeveelheden postmortaal weefsel nodig zijn. Daarom worden geselecteerde eiwitten gevalideerd door gerichte massaspectrometrie en in dit geval werden parallelle reactiemonitoring (PRM)-experimenten opgezet.
- Selecteer eiwitten voor validatie. Kies peptiden van deze eiwitten die al zijn gedetecteerd in DDA-experimenten. Peptiden mogen geen gemiste splitsingen of modificaties bevatten om een betrouwbare kwantificering te garanderen.
OPMERKING: Er kunnen verschillende redenen zijn voor de validatie van één specifiek eiwit, bijvoorbeeld differentiële abundanties in de onderzochte omstandigheden. Voor de representatieve resultaten is cytoplasmatisch dyneïne 1 zware keten 1 geselecteerd, dat even overvloedig bleek te zijn in NMG- en SN-monsters en daarom als referentie kon worden gebruikt om een gelijke monsterbelasting te garanderen. - Gebruik de geselecteerde peptiden om de eerste versie van een PRM-methode op te zetten met behulp van de HPLC-software. Bewaar alle chromatografie- en globale parametersinstellingen van de DDA-methode.
- Voeg MS OT en tMS2 OT HCD toe als scantypen. Zorg ervoor dat de instellingen voor MS OT hetzelfde zijn als voor de DDA-methode. Gedetailleerde instellingen voor de PRM-methode zijn te vinden in aanvullende tabel 1.
- Voeg voor tMS2 OT HCD geselecteerde peptiden toe als een inclusielijst. Voeg daarom de aminozuurvolgorde en de m/z-waarde toe die in de DDA-metingen is waargenomen. Voeg voor het eerste PRM-experiment geen retentietijdvensters toe of stel t start in op 0 en t stop op 120 (voor een verloop van 120 minuten).
- Evalueer de PRM-methode na de meting met behulp van geschikte software, bijvoorbeeld Skyline, en verkrijg de retentietijd van de peptiden die aan de inclusielijst zijn toegevoegd. Controleer voor opgenomen peptiden of vergelijkbare pieken waarneembaar zijn voor ten minste drie voorloperionen in MS1-scans en vijf fragmentionen in MS2-scans met een lage massafout (±5 ppm).
- Verfijn de PRM-methode, bijvoorbeeld door de resolutie voor de tMS2 OT HCD-scan te verhogen en bewaartijdvensters toe te voegen aan de opnamelijst.
OPMERKING: Retentietijdvensters van 3 minuten bleken goed geschikt te zijn in huidige experimenten (waargenomen retentietijd in het eerste PRM-experiment ± 1,5 min). - Met de verfijnde PRM-methode kunt u kwantificering van peptiden en eiwitten van belang uitvoeren op basis van het piekgebied, zowel op MS1- als MS2-niveau met geschikte software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De specifieke isolatie van NMG's en SN-weefsel is de belangrijkste stap voor een succesvolle toepassing van dit protocol. Met behulp van de functie Field of View Analysis in de door de leverancier geleverde software van de LMD kunnen NMG's automatisch op een kleurafhankelijke manier worden geselecteerd. Daarom moeten weefselgebieden met NMG's (figuur 2A) worden geïdentificeerd en moet een gezichtsveldanalyse met aangepaste kleurdrempels worden uitgevoerd, wat resulteert in de etikettering van NMG's (figuur 2B). Na het filteren van objecten die een gebied van minder dan 100 μm² bestrijken, mogen alleen NMG's gelabeld blijven voor isolatie (figuur 2C). Nauwkeurige isolatie van de gelabelde NMG's wordt bereikt nadat de laserinstellingen zijn aangepast (figuur 2D). Na de isolatie van NMG's (figuur 2E) kan SN-weefsel worden geselecteerd met een 50-voudige vergroting (figuur 2F) en geïsoleerd (figuur 2G) voor vergelijking van het proteomische profiel. Voor SN-weefsel kunnen geïsoleerde objecten worden gevisualiseerd met behulp van de Cap Check-functie (figuur 2H). Voor beide monstertypen, NMG en SN, bleek isolatie van 500.000 μm2 hersenweefsel voldoende te zijn voor dit protocol, waardoor minimaal drie MS-runs per monster mogelijk zijn.
Een representatief voorbeeld van een DDA-experiment van 120 minuten wordt weergegeven in figuur 3 (aangezien de hoofdkolom in de laatste 15 minuten van de meting wordt gewassen, wordt het chromatogram net voor 105 minuten bijgesneden). De toegepaste methode moet een monsterelutie over de volledige gradiënt mogelijk maken, waardoor scherpe en beknopte pieken ontstaan en de intensiteit van de totale ionenstroom (TIC) moet voor alle monsters vergelijkbaar zijn.
Toepassing van het gepresenteerde protocol op één monster van 500.000 μm² NMG en één monster van 1.000.000 μm² SN-weefsel met aangepaste volumes voor MS-monsters (5 μL voor NMG en 2,5 μL voor SN) om identieke peptidebelasting te garanderen, resulteerde in de identificatie van 1.898 eiwitgroepen (PG's) in het NMG-monster en 1.565 PG's in het SN-monster. Verdere vergelijking onthulde dat 1.384 PG's in beide monsters werden geïdentificeerd, terwijl 514 PG's uitsluitend werden geïdentificeerd in NMG en 181 PG's in SN-weefsel (figuur 4). In totaal werden 2.079 PG's geïdentificeerd in dit representatieve experiment. Vergelijking met een referentiedataset uit een eerdere studie22 toonde aan dat 87,6% van de in die studie gerapporteerde PG's ook kon worden geïdentificeerd door het huidige herziene en geautomatiseerde protocol, wat de toepasbaarheid ervan bewijst. Bovendien kan het aantal geïdentificeerde PG's met 1 143 worden verbeterd.
Aangezien minimale monsterhoeveelheden de toepassing van klassieke validatiemethoden zoals Western Blots niet mogelijk maken, kan validatie van interessante eiwitten worden bereikt door gerichte massaspectrometrische benaderingen, bijvoorbeeld PRM. Representatieve resultaten voor het peptide ESPEVLLTLDILK van het eiwit cytoplasmatisch dyneïne 1 zware keten 1 zijn weergegeven in figuur 5. De iBAQ-waarde van dit eiwit bleek iets hoger te zijn in NMG's in vergelijking met SN in de DDA-metingen, die konden worden geverifieerd door PRM-experimenten op basis van het piekgebied op MS1- (figuur 5A, B, E) en MS2-niveau (figuur 5C, D, F).
Figuur 1: Workflow voor de proteomische karakterisering van neuromelaninekorrels (NMG's) en omringend weefsel (SN). NMG- en SN-monsters werden geïsoleerd uit weefselplakken via lasermicrodissectie (LMD). Eiwitten werden geïsoleerd en tryptische vertering in de oplossing werd uitgevoerd. De resulterende peptiden werden geanalyseerd via LC-MS/MS-metingen in data-dependent acquisition (DDA) modus. Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van MaxQuant en Perseus software. Validatie van geselecteerde eiwitten werd uitgevoerd met experimenten met parallelle reactiemonitoring (PRM). PRM-data werd geanalyseerd met behulp van Skyline software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Selectie en lmd-gebaseerde isolatie van NMG- en SN-monsters. In eerste instantie wordt een gebied met NMG's, zichtbaar zonder verdere kleuring bij 400-voudige vergroting, onder de microscoop (A) geplaatst. Na het uitvoeren van een Field of View Analysis worden NMG's en andere donkere gebieden geselecteerd (B). Alleen NMG's blijven geselecteerd na filtering (C) en worden geïsoleerd nadat de laserinstellingen zijn aangepast (D). Nadat alle NMG's zijn geïsoleerd (E), wordt SN-weefsel geselecteerd met 50-voudige vergroting (F) en geïsoleerd (G). Omdat objecten die geïsoleerd zijn voor SN-monsters vrij groot zijn, kunnen ze worden waargenomen in de monsterverzamelingslimiet met behulp van de cap check-functie (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Totale ionenstroom (TIC) van een DDA-meting van 120 minuten. Het chromatogram toont de relatieve abundantie van de ionen die overeenkomen met de eluerende peptiden over het retentietijdbereik van 0 tot ~ 105 min. Omdat de hoofdkolom tussen 105e en 120e min wordt gewassen, wordt het chromatogram bijgesneden in de 105e min. De intensiteit van de hoogste piek is 2,86 x 108. Getallen boven pieken geven de retentietijd en het meest voorkomende ion van die specifieke piek aan (BP=base peak). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Venn-diagram met de correspondentie van eiwitgroepen (PG's) geïdentificeerd in NMG's en SN-weefsel. In totaal werden 1.898 PG's geïdentificeerd in NMG's en 1.565 PG's in SN-weefsel, waarvan 1.384 PG's werden geïdentificeerd in beide weefselgebieden. 514 PG's werden uitsluitend geïdentificeerd in NMG-weefsel, terwijl 181 PG's uitsluitend werden geïdentificeerd in SN-weefsel. Het diagram is gemaakt met behulp van de online tool Venny25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Resultaten van PRM-experimenten voor het peptide ESPEVLLTLDILK (cytoplasmatisch dyneïne 1 zware keten 1, ++). Chromatogrammen op MS1- (A,B) en MS2-niveau (C,D), evenals piekgebieden op MS1- (E) en MS2-niveau (F), worden getoond voor een voorbeeldige steekproef van NMG's en SN-weefsel. Verschillende kleuren worden gebruikt om verschillende voorlopers (op MS1-niveau) of productionen (op MS2-niveau) aan te duiden. Chromatogrammen worden weergegeven nadat Savitzky-Golay Smoothing is uitgevoerd. Intensiteiten en piekgebieden waren vergelijkbaar op MS1- (A,B,E) en MS2-niveau (C,D,F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Parameters van de massaspectrometrie-experimenten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Parameters van de MaxQuant-analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD is een breed toepasbare techniek voor de isolatie van specifieke weefselgebieden, enkele cellen of subcellulaire structuren. In het herziene en geautomatiseerde protocol dat hier wordt gepresenteerd, wordt deze techniek toegepast voor de specifieke isolatie van neuromelaninekorrels (NMG's) en NMG-omringend weefsel (SN). Tot nu toe werden twee verschillende benaderingen voor de isolatie van NMG's uit menselijk postmortem hersenweefsel gepubliceerd en op grote schaal gebruikt:
a) Een discontinue sucrosegradiënt die 1 g substantia nigraweefsel verbruikt20. Omdat menselijk post-mortem substantia nigra weefsel zeldzaam is en van groot belang voor verschillende onderzoeksvragen, is het helaas een hele uitdaging om een grote cohortstudie op te zetten als er grote hoeveelheden weefsel per patiënt nodig zijn. Daarom werd deze aanpak verder verbeterd door de vereiste hoeveelheid weefsel te verminderen tot 0,15 g voor voldoende isolatie vanNMG's 26. Toch was minstens de helft van een complete substantia nigra pars compacta vereist.
b) De excisie van NMG's met behulp van LMD. In 2016 hebben Plum et al. een nieuw protocol opgesteld op basis van de precieze excisie van NMG's via LMD. Met dit protocol kon de vereiste monsterhoeveelheid worden teruggebracht tot tien weefselsecties van 10 μm, wat resulteert in een indrukwekkende vermindering van het vereiste weefselmonster van 150 mg naar 16,6 mg22.
Het geoptimaliseerde en geautomatiseerde LMD-gebaseerde protocol dat hier wordt gepresenteerd, vereist nog lagere monsterhoeveelheden omdat dunnere (5 μm in vergelijking met 10 μm) en minder weefselsecties (maximaal 7 in vergelijking met 8) moesten worden gebruikt en minder tijd nodig had voor het genereren van monsters (4 uur per monster in vergelijking met 1-2 dagen) door het gebruik van geautomatiseerde NMG-detectie. Zo werd de vereiste monsterverzamelingstijd enorm verkort en kon het aantal geïdentificeerde PG's drastisch worden uitgebreid door een geoptimaliseerde LC-MS-methode en state-of-the-art instrumentatie toe te passen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan andere onderzoeksvragen en weefsels.
Voor de aanpassing van het gepresenteerde protocol betreffende door de gebruiker gedefinieerde onderzoeksvragen worden op basis van ervaring de volgende aspecten belicht:
a) Isolatie van vergelijkbare monsterhoeveelheden: Aangezien de verwachte peptideopbrengst van dit protocol vrij laag is in vergelijking met bijvoorbeeld celkweek of weefsellysaten, is bepaling van de peptideconcentratie mogelijk niet mogelijk. Het is dus van cruciaal belang dat gelijke hoeveelheden weefsel worden geïsoleerd via LMD, dat kan worden geschat op basis van het weefselgebied van de geselecteerde objecten. In de huidige opzet zijn weefselgebieden van 500.000 μm² voldoende voor het genereren van peptiden voor ten minste drie MS-metingen.
b) Trypsine-vertering: De duur van de spijsvertering en de trypsineconcentratie moeten vergelijkbaar zijn tussen de monsters.
c) Aanpassing van parameters voor verschillende weefsels: Afhankelijk van het te analyseren weefsel, moet de verzamelde weefselhoeveelheid worden aangepast, waardoor het noodzakelijk is om ook de hoeveelheid toegevoegd trypsine aan te passen. De verhouding trypsine/eiwit mag niet lager zijn dan 1:40.
d) Beperking van het LMD-proces: Voor de op LMD gebaseerde isolatie van interessante objecten zijn er beperkingen als het gaat om de grootte van geselecteerde objecten en de dikte van segmenten. Door weefselverlies tijdens het lasergebaseerd snijden van het weefsel werden objecten kleiner dan 100 μm² als te klein beschouwd voor isolatie.
e) Aanpassing van LC- en MS-parameters: Afhankelijk van de gebruikte LC- en MS-systemen moet de hoeveelheid geïsoleerd weefsel worden verhoogd (bijvoorbeeld bij gebruik met een microflowsysteem) en moeten MS-parameters worden aangepast (bijvoorbeeld bij het werken met een op ionenvallen gebaseerd detectorsysteem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de. NBI, een project van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (subsidienummer FKZ 031 A 534A) en P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) en Center for Protein Diagnostics (ProDi) subsidies, beide van het Ministerie van Innovatie, Wetenschap en Onderzoek van Noordrijn-Westfalen, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
