Summary
Un protocole robuste est présenté ici pour isoler les granules de neuromélanine à partir de tissu humain post-mortem substantia nigra pars compacta par microdissection laser. Ce protocole révisé et optimisé minimise considérablement le temps requis pour le prélèvement des échantillons, réduit la quantité d’échantillon requise et améliore l’identification et la quantification des protéines par analyse LC-MS/MS.
Abstract
La neuromélanine est un pigment noir-brunâtre, présent dans les granules de neuromélanine (NMG) dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta. Outre la neuromélanine, les NMG contiennent une variété de protéines, de lipides et de métaux. Bien que les neurones dopaminergiques contenant des NMG soient préférentiellement perdus dans les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy, on ne sait que peu de choses sur le mécanisme de formation des NMG et le rôle des NMG dans la santé et la maladie. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches sur la caractérisation moléculaire des NMG. Malheureusement, les protocoles standard pour l’isolement des protéines sont basés sur l’ultracentrifugation à gradient de densité et nécessitent donc de grandes quantités de tissu humain. Ainsi, un protocole automatisé basé sur la microdissection laser (LMD) est établi ici qui permet la collecte de NMG et de tissus substantiels environnants (SN) en utilisant des quantités minimales de tissu de manière impartiale et automatisée. Les échantillons excisés sont ensuite analysés par spectrométrie de masse pour déchiffrer leur composition protéomique. Avec ce flux de travail, 2 079 protéines ont été identifiées, dont 514 protéines ont été identifiées exclusivement dans les NMG et 181 dans SN. Les résultats actuels ont été comparés à une étude précédente utilisant une approche similaire basée sur le LMD atteignant un chevauchement de 87,6% pour les deux protéomes, vérifiant l’applicabilité du protocole révisé et optimisé présenté ici. Pour valider les résultats actuels, les protéines d’intérêt ont été analysées par spectrométrie de masse ciblée, par exemple des expériences de surveillance des réactions parallèles (PRM).
Introduction
Chaque tissu est constitué d’un mélange hétérogène de différents types de cellules, mais l’isolement spécifique d’un type de cellule est souvent indispensable pour une caractérisation plus précise. La microdissection laser (LMD), qui associe un microscope à une application laser, est un outil puissant pour l’isolation spécifique de zones tissulaires, de cellules individuelles ou de sous-structures cellulaires à partir d’un composite complexe. L’application du LMD en combinaison avec la spectrométrie de masse (LMD-MS) a déjà été mise en œuvre avec succès pour plusieurs questions de recherche, notamment l’isolement de l’ADN1, de l’ARN2 et des protéines 3,4,5. Dans ce protocole, un protocole LMD-MS révisé et optimisé est décrit pour l’analyse protéomique du tissu cérébral humain post-mortem et des composants sous-cellulaires afin de déchiffrer les nouveaux mécanismes pathologiques de la maladie de Parkinson.
La neuromélanine est un pigment noir, presque insoluble, trouvé dans les neurones catécholaminergiques producteurs de dopamine de la substance noire pars compacta6. Avec les protéines et les lipides, il s’accumule en granules ressemblant à des organites entourés d’une double membrane, appelés granules de neuromélanine (NMG)7,8,9. Les NMG peuvent être observés dès l’âge de trois ans chez l’homme augmentant en quantité et en densité au cours du processus de vieillissement10,11. À ce jour, il n’y a pas d’hypothèse définie sur la formation de neuromélanine, mais une hypothèse est que la neuromélanine est formée par l’oxydation de la dopamine12. D’autres hypothèses sont basées sur la production enzymatique de neuromélanine (par exemple, tyrosinase)13. La neuromélanine elle-même s’est avérée avoir une forte affinité de liaison aux lipides, aux toxines, aux ions métalliques et aux pesticides. Sur la base de ces résultats, la formation de NMG est supposée protéger la cellule de l’accumulation de substances toxiques et oxydatives et des toxines environnementales14,15. Outre cette fonction neuroprotectrice, il existe des preuves que la neuromélanine peut provoquer des effets neurodégénératifs, par exemple par saturation en fer et la catalyse ultérieure des radicaux libres16,17. De plus, la neuromélanine libérée au cours des processus neurodégénératifs peut être décomposée par le peroxyde d’hydrogène, ce qui pourrait accélérer la nécrose par les métaux réactifs et d’autres composés toxiques précédemment liés à la neuromélanine et peut contribuer à la neuroinflammation et aux dommages cellulaires18. Cependant, jusqu’à présent, le rôle exact des NMG dans les processus neurodégénératifs comme dans l’évolution de la maladie de Parkinson n’est pas clairement compris. Pourtant, les NMG semblent être impliqués dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson et leur analyse spécifique est de la plus haute importance pour démêler leur rôle dans la neurodégénérescence. Malheureusement, les animaux de laboratoire courants (p. ex. souris et rats) et les lignées cellulaires n’ont pas de NMG19. Par conséquent, les chercheurs s’appuient particulièrement sur le tissu cérébral post-mortem pour leur analyse. Dans le passé, l’isolement des NMG par centrifugation par gradient de densité reposait sur la disponibilité de grandes quantités de tissu substantiel nigra 20,21. Aujourd’hui, LMD présente un outil polyvalent pour isoler spécifiquement les NMG à partir d’échantillons de cerveau humain afin de les analyser ensuite par LC-MS/MS.
Dans ce protocole, une version améliorée et automatisée d’un protocole précédent22 est présentée pour l’isolement des NMG et des tissus environnants (SN), permettant une génération d’échantillons plus rapide, un nombre plus élevé de protéines identifiées et quantifiées et une réduction sévère des quantités tissulaires requises.
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Protocol
L’utilisation de tissus cérébraux humains a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de la Ruhr à Bochum, en Allemagne (numéro de dossier 4760-13), conformément aux réglementations et directives allemandes. Ce protocole a été appliqué sur des tranches de tissu substantielles nigra pars compacta obtenues commercialement. Un aperçu graphique du protocole présenté est présenté à la figure 1.
1. Sectionnement des tissus
- Prérefroidir la chambre du cryostat.
REMARQUE: Chaque tissu nécessite des températures de cryostat différentes, qui peuvent être trouvées dans le protocole du fournisseur respectif. - Nettoyez le couteau en acier inoxydable avec de l’éthanol à 70% et installez-le dans le porte-lame.
- Transférer le tissu du congélateur à -80 °C au cryostat à l’aide d’une glacière et le laisser s’ajuster à la température de la chambre du cryostat pendant 15 min.
- Étiquetez sans ambiguïté les lames de membrane à l’aide d’un crayon.
REMARQUE: Des lames de membrane TEP/stylo sont requises pour le prélèvement d’échantillons basé sur LMD. Manipulez les lames de membrane PET/PEN avec précaution car elles sont extrêmement fragiles. - Appliquez une goutte de milieu de section congelé commercial sur le support de mouchoir. Avant qu’il ne soit complètement congelé, placez le tissu sur le milieu de section congelé et laissez-le durcir, de sorte que le tissu soit connecté au porte-tissu.
- Installez le porte-tissu dans la chambre du cryostat et ajustez son orientation avant de commencer la section. L’orientation optimale du support dépend de l’orientation du tissu.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de couper le tissu jusqu’à ce que le plan de section nécessaire pour les tranches soit atteint. - Avant d’atteindre la zone tissulaire d’intérêt, ajustez le réglage de coupe à l’épaisseur de tissu souhaitée.
REMARQUE : 5 ou 10 μm est l’épaisseur suggérée pour ce protocole, car des sections de 20 μm d’épaisseur se sont révélées incompatibles avec le prélèvement d’échantillons basé sur le LMD22. - Coupez deux sections et jetez-les.
- Posez la plaque anti-roulis.
- Coupez une section du tissu, ouvrez soigneusement la plaque antiroulis, prenez une lame de membrane et empêchez le pliage du tissu tout en plaçant la section de tissu sur la lame de membrane.
REMARQUE: Le stockage des lames de membrane à température ambiante avant l’adhésion permet une fixation précise de l’échantillon. Plusieurs sections peuvent être placées sur la même lame de membrane, mais le chevauchement des tissus doit être évité. - Entreposer les coupes de tissus placées sur des lames de membrane dans le cryostat jusqu’à ce que la section soit terminée.
- Conserver le tissu cryoséqué à -20 °C jusqu’à la poursuite du traitement ou procéder directement à la procédure ci-dessous. Conserver les lames de tissu sectionnées à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
2. Microdissection laser et catapultage de pression
REMARQUE: Comme les granules de neuromélanine sont visibles sans aucune coloration en raison de leur couleur noir-brunâtre, aucune coloration n’est nécessaire pour ce protocole. Néanmoins, différentes procédures de coloration peuvent être combinées avec ce protocole si nécessaire. Gardez à l’esprit que l’utilisation de solutions bloquantes ou d’anticorps influencera les analyses LC-MS/MS.
- Allumez le système MicroBeam et ouvrez le logiciel associé sur l’ordinateur (voir le tableau des matériaux).
- Placez la lame de membrane tissulaire dans le SlideHolder sur le RoboStage, le tissu tourné vers le haut.
REMARQUE: Selon le dispositif LMD, il peut être nécessaire de placer la lame de membrane de manière à ce que le tissu soit orienté vers le bas. En général, le prélèvement d’échantillons est effectué dans un environnement à température contrôlée afin d’assurer des conditions optimales et reproductibles. - Réglez le microscope sur le grossissement souhaité (50 fois est utilisé ici) pour les balayages de vue d’ensemble.
- Utilisez la fonction Scan, qui se trouve dans la fenêtre Navigateur de l’interface du logiciel, pour obtenir une vue d’ensemble de la section de tissu. Recherchez le coin supérieur gauche et le coin inférieur droit de la zone d’intérêt et sélectionnez-les dans l’interface du logiciel. Ensuite, sélectionnez Analyser tous les retours sur investissement pour effectuer les analyses.
REMARQUE: Les analyses de vue d’ensemble ne sont pas obligatoires, mais elles permettent une meilleure orientation dans la diapositive et peuvent être enregistrées pour une utilisation ultérieure. - Ajustez le grossissement du microscope pour le tissu approprié, qui est de 400 fois dans le cas présent des granules de neuromélanine.
- Recherchez une zone contenant des granules de neuromélanine. Sélectionnez Analyse du champ de vision dans l’interface du logiciel, sélectionnez Inverser le résultat et définissez le seuil pour les canaux RVB de sorte que seuls les granules de neuromélanine soient surlignés en rouge dans la fenêtre d’aperçu. Cliquez sur OK pour utiliser les paramètres ajustés pour le champ de vision.
REMARQUE: Il peut arriver que des objets plus petits ayant une couleur sombre soient également sélectionnés. Pour tenir compte de cela, jetez tous les objets couvrant une surface inférieure à 100 μm2 avant d’isoler les granules de neuromélanine. Pour ce faire, ouvrez la liste des éléments en cliquant sur l’icône dans la barre d’outils, sélectionnez la diapositive considérée et classez les éléments par zone. Sélectionnez ceux dont la surface est inférieure à 100 μm2 et supprimez-les. - Ajustez les réglages laser en utilisant une zone de la glissière recouverte uniquement par la membrane.
REMARQUE: Il est suggéré d’utiliser l’assistant de réglage du laser de coupe et de suivre les instructions du logiciel. Les réglages laser requis peuvent différer d’une glissière à l’autre. Pour les sections de 5 μm avec un grossissement de 400 fois, les réglages typiques sont 32 énergie et 51 focalisation pour la découpe, et 28 énergie et -1 mise au point pour le catapultage d’impulsions laser (LPC). - Ajustez les paramètres de vitesse pour le positionnement et la coupe afin d’assurer une bonne isolation.
REMARQUE: Une vitesse de 30% s’est avérée optimale pour l’isolation NMG. - Remplissez le bouchon du tube de prélèvement d’échantillon avec 50 μL d’eau ultrapure et insérez le bouchon dans le collecteur du RoboMover.
NOTE: Le collecteur de tubes utilisé pour les expériences actuelles peut transporter un tube de prélèvement d’échantillon à la fois. - Placez le RoboMover au-dessus du RoboStage II à l’aide de l’interface du logiciel pour démarrer la collecte d’échantillons.
REMARQUE: Pour ce faire, ouvrez la fenêtre RoboMover, qui affiche le collecteur. Cliquez sur le bouchon du tube de prélèvement d’échantillon affiché dans la fenêtre RoboMover pour déplacer le capuchon vers la zone de travail. Ajustez la hauteur de déplacement et de travail optimale dans la fenêtre RoboMover. Sinon, l’eau dans le bouchon peut tomber sur la glissière ou les objets catapultés n’atteindront pas le bouchon. - Démarrez le laser. Contrôlez les réglages d’énergie et de mise au point pendant le processus laser et ajustez les paramètres si nécessaire. Assurer l’isolation et le catapultage appropriés des objets isolés dans le bouchon du tube de prélèvement d’échantillons pour au moins les dix premiers objets.
REMARQUE: L’isolation et le catapultage appropriés doivent être vérifiés visuellement. Les deux devraient aboutir à une zone exempte de tissu de la taille de l’objet présélectionné dans la tranche de tissu (voir la figure 2C, D). Ajustez les réglages du laser si l’objet reste attaché à la tranche de tissu après la coupe et la catapultation. Pour le catapultage, l’option CenterRoboLPC s’avère bien adaptée à l’isolation NMG. Les paramètres de catapultage peuvent être ajustés pour chaque objet sélectionné dans la liste des éléments. - Une fois l’échantillonnage terminé, dirigez le RoboMover jusqu’à sa position de départ. Retirez le tube de prélèvement de l’échantillon.
REMARQUE : Lorsque le nombre d’objets collectés est plutôt faible et que les objets sont suffisamment grands, le prélèvement d’échantillons peut être assuré en cliquant sur Vérification du bouchon, ce qui placera le bouchon du tube de prélèvement d’échantillon sous le microscope afin que le nombre d’objets à l’intérieur de l’eau dans le bouchon puisse être compté (voir la figure 2H). - Faire tourner l’échantillon à l’aide d’une centrifugeuse. De courtes rotations de 5 s avec une force centrifuge croissante due à l’accélération de la centrifugeuse se sont avérées suffisantes. À ce stade, conservez les échantillons à -80 °C, car tous les échantillons doivent être traités ensemble.
NOTE: Pour la comparaison du profil protéomique, le tissu entourant les NMG a également été isolé après leur excision. L’isolement du tissu environnant a été effectué à un grossissement de 50 fois. - Sécher les échantillons dans un concentrateur sous vide. 1,5 h ont été jugées suffisantes pour 50 μL d’eau.
- Solubiliser et lyser le tissu dans de l’acide formique 40 μL pendant 20 min (température ambiante).
- Améliorer la lyse tissulaire par sonication à 45 kHz (kilohertz) pendant 5 minutes dans un bain de sonication. Remplissez le bain de sonication avec de la glace pour empêcher les tubes de fondre. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à la poursuite du traitement.
3. Digestion tryptique
- Décongeler les échantillons sur la glace.
- Sécher complètement les échantillons dans un concentrateur sous vide.
- Remplir l’échantillon avec 50 μL d’un tampon de digestion approprié, par exemple 50 mM de bicarbonate d’ammonium.
- Après addition de 1,25 μL de 1,4-dithiothréitol 200 mM, incuber les échantillons pendant 30 min à 60 °C et 300 rpm à l’aide d’un thermomélangeur et les refroidir ensuite à température ambiante (RT).
- Ensuite, incuber les échantillons à TA pendant 30 minutes dans l’obscurité après l’ajout de 1,36 μL 0,55 M iodoacétamide.
- Ajouter une quantité appropriée de trypsine aux échantillons et incuber les échantillons pendant une nuit (~16 h) à 37 °C.
REMARQUE : Pour 1 000 000 μm2, 0,1 μg de trypsine s’est avéré suffisant. - Ajouter 2,6 μL d’acide trifluoroacétique (AGT) à 10 % aux échantillons pour arrêter la digestion (concentration finale de 0,5 % de TFA).
- Sécher complètement les échantillons à l’aide d’un concentrateur sous vide. Ensuite, remplissez les échantillons jusqu’à un volume final défini avec 0,1% TFA. Les échantillons de NMG ont été remplis jusqu’à 20 μL, dont 5 μL ont été utilisés pour une expérience de spectrométrie de masse (MS).
- Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation. Déterminer la concentration de peptides par analyse des acides aminés ou par une autre méthode de quantification appropriée (p. ex., détection directe).
REMARQUE : Les faibles quantités d’échantillons peuvent ne pas être quantifiables à l’aide des techniques mentionnées. Pour assurer un chargement d’échantillon identique, chaque échantillon doit contenir la même quantité de tissu isolé et chaque échantillon doit être traité de la même manière.
4. Chromatographie liquide et spectrométrie de masse à haute performance
REMARQUE: Les analyses de spectrométrie de masse (SM) par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) suivantes sont optimisées pour le système LC spécifique avec un dispositif de colonne de piégeage et un spectromètre de masse utilisés ici (voir le tableau des matériaux). Pour les autres systèmes LC et MS, l’adaptation des paramètres est recommandée.
- À l’aide du logiciel Xcalibur, réglez les paramètres HPLC comme suit.
- Colonne piège : Régler la température à 60 °C, débit à 30 μL/min, faire fonctionner le tampon à 0,1 % d’acide trifluoroacétique.
- Colonne analytique en phase inversée C18 : Régler la température à 60 °C, le débit à 30 μL/min, le tampon A courant à 0,1 % d’acide trifluoroacétique, le tampon B à 84 % d’acétonitrile et le gradient à 5 % à 30 % du tampon B pendant 98 min.
REMARQUE: L’adaptation du gradient peut être inévitable et est fortement recommandée lors de l’utilisation de différents tissus ou cellules. La durée totale du gradient peut varier en raison de la charge de l’échantillon au début du gradient et du lavage de l’échantillon à la fin du gradient. Le gradient total dans ce protocole consiste en un chargement d’échantillon de 7 minutes et un lavage supplémentaire de la colonne pendant 15 minutes, ce qui donne un temps de gradient total de 120 min.
- Créez une méthode d’acquisition dépendante des données (DDA) à l’aide de la configuration de l’instrument XCalibur, qui se trouve dans le menu de la feuille de route du logiciel HPLC.
- Dans l’onglet Paramètres globaux , définissez le mode de perfusion Chromatographie liquide, la Largeur de pic LC attendue (30 s) et l’état de charge par défaut (2).
- Passez à l’onglet Paramètres d’analyse et ajoutez les analyses et filtres suivants dans l’ordre mentionné : MS OT, MIPS, Intensité, État de charge, Exclusion dynamique et ddMS2 OT HCD.
REMARQUE : Les paramètres détaillés de chaque analyse et filtre se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Les paramètres MS et DDA optimaux peuvent varier en fonction du spectromètre de masse spécifique utilisé ainsi que du type d’échantillon et doivent donc être adaptés. - Préparer les échantillons en dissolvant 200 à 400 ng de peptides d’échantillon dans un volume défini de 0,1% de TFA dans des entrées de flacon en verre de spectrométrie de masse inerte. Si la détermination de la concentration n’est pas applicable en raison de la faible quantité d’échantillon, vérifier la charge d’échantillon identique en comparant le courant ionique total (TIC).
REMARQUE: Pour ce faire, ouvrez le fichier résultant de la mesure spectrométrique de masse dans un logiciel approprié, par exemple, FreeStyle, et vérifiez le chromatogramme. Les intensités doivent être comparables pour tous les échantillons. Une TIC représentative est illustrée à la figure 3. - Analyser les données brutes obtenues à l’aide d’un logiciel protéomique approprié, par exemple, MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics, ou Proteome Discoverer, et effectuer une analyse statistique des données basée sur la question de recherche.
5. Analyse des données brutes protéomiques à l’aide de MaxQuant
NOTE: Une information détaillée sur les paramètres MaxQuant est fournie dans le tableau supplémentaire 2. Ils sont brièvement décrits ci-dessous.
- Chargez les fichiers bruts dans le logiciel MaxQuant dans l’en-tête des données brutes en cliquant sur Charger.
- Attribuez des noms d’échantillon en cliquant sur Définir l’expérience.
- Définissez des paramètres spécifiques au groupe. Tout d’abord, ajoutez des modifications. En raison du traitement de l’échantillon, choisissez la désamidation (NQ), l’oxydation (M) et la carbamidométhylation (N-terme) comme modifications variables, et ajoutez la carbamidométhylation (C) comme modification fixe.
- Choisissez la trypsine comme enzyme de digestion dans l’onglet Digestion .
- Ajoutez l’option de quantification sans étiquette LFQ dans l’onglet Quantification sans étiquette . Si plus de 10 fichiers doivent être traités, choisissez l’option Fast LFQ pour raccourcir le temps de traitement. Ajouter l’option iBAQ comme mesure de quantification des protéines24.
- Assurez-vous que tous les autres paramètres spécifiques au groupe restent dans les paramètres d’usine.
- Passez à l’onglet Paramètres globaux et ajoutez le fichier FASTA dérivé de uniprot.org dans l’onglet Séquences . Modifiez la règle d’identificateur en conséquence et ajoutez l’ID de taxonomie, dans ce cas, 9606 pour homo sapiens.
- Pour la quantification des protéines, choisissez les peptides Unique et Razor .
- Assurez-vous que tous les autres paramètres globaux restent dans les paramètres d’usine.
- Cliquez sur Démarrer et récupérez la sortie des groupes de protéines .txt après l’analyse MaxQuant pour une analyse plus approfondie dans Perseus.
6. Analyse statistique à l’aide de Persée
- Chargez le fichier proteingroups.txt dans Perseus, ajoutez les valeurs iBAQ en tant que colonnes principales et triez toutes les autres colonnes en fonction de leur type.
- Filtrez les leurres et les contaminants en filtrant les lignes en fonction de la colonne catégorielle.
- Filtrez les résultats en fonction de valeurs valides. Dans le cas présent, avec seulement deux échantillons inclus dans l’analyse, un nombre minimal d’une valeur valide a été choisi.
- Exportez la sortie Perseus dans .txt format pour un traitement ultérieur, par exemple dans Excel, et évaluez les résultats concernant la question de recherche.
7. Validation des protéines sélectionnées
REMARQUE : Les méthodes couramment utilisées pour valider les données sur la SEP sont, par exemple, la coloration immunologique ou le transfert Western. En raison de la couleur foncée et de l’autofluorescence de la neuromélanine, la coloration immunologique des protéines à l’intérieur des granules de neuromélanine avec des anticorps conjugués à la peroxydase de raifort ou au fluorophore n’est pas applicable. Pour l’analyse Western Blot, de très grandes quantités de tissu post-mortem seraient nécessaires. Par conséquent, les protéines sélectionnées sont validées par spectrométrie de masse ciblée et, dans le cas présent, des expériences de surveillance des réactions parallèles (PRM) ont été mises en place.
- Sélectionnez les protéines à valider. Choisissez des peptides de ces protéines déjà détectés dans les expériences DDA. Les peptides ne doivent pas contenir de clivages manqués ou de modifications pour assurer une quantification fiable.
NOTE: Il peut y avoir plusieurs raisons pour la validation d’une protéine spécifique, par exemple, les abondances différentielles dans les conditions étudiées. Pour les résultats représentatifs, la dynéine cytoplasmique 1 de la chaîne lourde 1 a été sélectionnée, qui s’est avérée d’une abondance équivalente dans les échantillons de NMG et de SN et pourrait donc être utilisée comme référence pour assurer une charge égale de l’échantillon. - Utilisez les peptides sélectionnés pour configurer la première version d’une méthode PRM à l’aide du logiciel HPLC. Conservez tous les paramètres de chromatographie et de paramètres globaux de la méthode DDA.
- Ajoutez MS OT et tMS2 OT HCD comme types d’analyse. Assurez-vous que les paramètres de MS OT sont les mêmes que ceux de la méthode DDA. Les paramètres détaillés de la méthode PRM sont disponibles dans le tableau supplémentaire 1.
- Pour tMS2 OT HCD, ajoutez les peptides sélectionnés comme liste d’inclusion. Par conséquent, ajoutez la séquence d’acides aminés et la valeur m/z observée dans les mesures DDA. Pour la première expérience PRM, n’ajoutez pas de fenêtres de temps de rétention ou ne définissez pas t start sur 0 et t stop sur 120 (pour un gradient de 120 minutes).
- Évaluer la méthode PRM après la mesure à l’aide d’un logiciel approprié, par exemple, Skyline, et obtenir le temps de rétention des peptides ajoutés à la liste d’inclusion. Pour les peptides inclus, vérifier que des pics comparables sont observables pour au moins trois ions précurseurs dans les scans MS1 et cinq ions fragments dans les scans MS2 avec une erreur de faible masse (±5 ppm).
- Affinez la méthode PRM, par exemple, en augmentant la résolution de l’analyse tMS2 OT HCD et en ajoutant des fenêtres de temps de rétention à la liste d’inclusion.
NOTE: Des fenêtres de temps de rétention de 3 min se sont avérées bien adaptées dans les expériences actuelles (le temps de rétention observé dans la première expérience PRM ± 1,5 min). - Avec la méthode PRM raffinée, effectuez la quantification des peptides et des protéines d’intérêt en fonction de la zone de pic à la fois sur les niveaux MS1 et MS2 avec un logiciel approprié.
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Representative Results
L’isolement spécifique des NMG et des tissus SN est l’étape la plus importante pour l’application réussie de ce protocole. Grâce à la fonction d’analyse du champ de vision du logiciel du LMD fourni par le fournisseur, les NMG peuvent être automatiquement sélectionnés en fonction de la couleur. Par conséquent, les zones tissulaires contenant des NMG (Figure 2A) doivent être identifiées et une analyse du champ de vision avec des seuils de couleur ajustés doit être effectuée, ce qui entraîne l’étiquetage des NMG (Figure 2B). Après filtrage des objets couvrant une zone inférieure à 100 μm², seuls les NMG doivent rester étiquetés pour l’isolement (Figure 2C). L’isolation précise des NMG marqués est obtenue après ajustement des réglages laser (Figure 2D). Après l’isolement des NMG (Figure 2E), le tissu SN peut être sélectionné avec un grossissement de 50 fois (Figure 2F) et isolé (Figure 2G) pour la comparaison du profil protéomique. Pour les tissus SN, les objets isolés peuvent être visualisés à l’aide de la fonction Cap Check (Figure 2H). Pour les deux types d’échantillons, NMG et SN, l’isolement de 500 000μm2 de tissu cérébral s’est avéré suffisant pour ce protocole, permettant un minimum de trois essais de SEP par échantillon.
Un exemple représentatif d’une expérience DDA de 120 min est présenté à la figure 3 (comme la colonne principale est lavée dans les 15 dernières minutes de la mesure, le chromatogramme est recadré juste avant 105 min). La méthode appliquée devrait permettre une élution de l’échantillon sur le gradient complet, créant des pics nets et concis, et l’intensité du courant ionique total (TIC) devrait être comparable dans tous les échantillons.
L’application du protocole présenté sur un échantillon de 500 000 μm² de NMG et un échantillon de tissu SN de 1 000 000 μm² avec des volumes ajustés pour les échantillons de SEP (5 μL pour NMG et 2,5 μL pour SN) afin d’assurer une charge peptidique identique, a permis d’identifier 1 898 groupes protéiques (PG) dans l’échantillon NMG et 1 565 PG dans l’échantillon SN. Une comparaison plus poussée a révélé que 1 384 GE devaient être identifiés dans les deux échantillons, tandis que 514 GE étaient exclusivement identifiés dans les NMG et 181 GE dans les tissus SN (figure 4). Au total, 2 079 PG ont été identifiés dans cette expérience représentative. La comparaison avec un ensemble de données de référence d’une étude antérieure22 a montré que 87,6 % des GP déclarés dans cette étude pouvaient également être identifiés par le présent protocole révisé et automatisé, ce qui prouve son applicabilité. En outre, le nombre de GP identifiés pourrait être amélioré de 1 143.
Comme les quantités minimales d’échantillons ne permettent pas l’application de méthodes de validation classiques telles que les Western Blots, la validation des protéines d’intérêt peut être réalisée par des approches de spectrométrie de masse ciblées, par exemple PRM. Des résultats représentatifs pour le peptide ESPEVLLTLDILK de la protéine cytoplasmique dynéine 1 chaîne lourde 1 sont présentés à la figure 5. La valeur iBAQ de cette protéine s’est avérée légèrement plus élevée dans les NMG par rapport à SN dans les mesures de DDA, ce qui a pu être vérifié par des expériences PRM basées sur la zone de pic au niveau MS1- (Figure 5A, B, E) et MS2 (Figure 5C, D, F).
Figure 1 : Flux de travail pour la caractérisation protéomique des granules de neuromélanine (NMG) et des tissus environnants (SN). Des échantillons de NMG et de SN ont été isolés à partir de tranches de tissu par microdissection laser (LMD). Les protéines ont été isolées et une digestion tryptique en solution a été effectuée. Les peptides résultants ont été analysés via des mesures LC-MS/MS en mode d’acquisition dépendante des données (DDA). L’analyse des données a été réalisée à l’aide des logiciels MaxQuant et Perseus. La validation des protéines sélectionnées a été effectuée avec des expériences de surveillance des réactions parallèles (PRM). Les données PRM ont été analysées à l’aide du logiciel Skyline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sélection et isolement à l’aide de LMD d’échantillons de NMG et de SN. Dans un premier temps, une zone contenant des NMG, visible sans coloration supplémentaire à un grossissement de 400 fois, est placée sous le microscope (A). Après avoir effectué une analyse du champ de vision, les NMG et autres zones sombres sont sélectionnés (B). Seuls les NMG restent sélectionnés après le filtrage (C) et sont isolés après le réglage du laser (D). Une fois que tous les NMG sont isolés (E), le tissu SN est sélectionné avec un grossissement de 50 fois (F) et isolé (G). Comme les objets isolés pour les échantillons SN sont assez gros, ils peuvent être observés dans le bouchon de prélèvement d’échantillons à l’aide de la fonction Cap Check (H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Courant ionique total (TIC) d’une mesure DDA de 120 min. Le chromatogramme montre l’abondance relative des ions correspondant aux peptides éluants sur la plage de temps de rétention de 0 à ~105 min. Comme la colonne principale est lavée entre 105et 120 e min, le chromatogramme est coupé à la 105e min. L’intensité du pic le plus élevé est de 2,86 x 108. Les nombres au-dessus des pics indiquent le temps de rétention et l’ion le plus abondant de ce pic spécifique (BP = pic de base). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Diagramme de Venn montrant la correspondance des groupes protéiques (PG) identifiés dans les NMG et les tissus SN. Au total, 1 898 PG ont été identifiés dans les NMG et 1 565 PG dans les tissus SN, dont 1 384 PG ont été identifiés dans les deux zones tissulaires. 514 PG ont été identifiés exclusivement dans les tissus NMG, tandis que 181 PG ont été identifiés exclusivement dans les tissus SN. Le diagramme a été créé à l’aide de l’outil en ligne Venny25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats des expériences PRM pour le peptide ESPEVLLTLDILK (dynéine cytoplasmique 1 chaîne lourde 1, ++). Les chromatogrammes aux niveaux MS1- (A, B) et MS2 (C, D), ainsi que les zones de pics au niveau MS1- (E) et MS2 (F), sont présentés pour un échantillon exemplaire de NMG et de tissu SN. Différentes couleurs sont utilisées pour désigner différents précurseurs (au niveau MS1) ou ions de produit (au niveau MS2). Les chromatogrammes sont affichés après le lissage Savitzky-Golay. Les intensités et les zones de pics étaient comparables aux niveaux MS1- (A, B, E) et MS2 (C, D, F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Paramètres des expériences de spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire 2 : Paramètres de l’analyse MaxQuant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
La LMD est une technique largement applicable pour l’isolement de zones tissulaires spécifiques, de cellules uniques ou de structures subcellulaires. Dans le protocole révisé et automatisé présenté ici, cette technique est appliquée pour l’isolement spécifique des granules de neuromélanine (NMG) et des tissus environnants (SN) NMG. Jusqu’à présent, deux approches différentes pour l’isolement des NMG hors du tissu cérébral humain post-mortem ont été publiées et largement utilisées:
a) Un gradient discontinu de saccharose consommant 1 g de tissu substantiel de nigra 20. Comme le tissu humain post-mortem substantia nigra est rare et d’un grand intérêt pour plusieurs questions de recherche, il est malheureusement assez difficile de mettre en place une grande étude de cohorte si de grandes quantités de tissu sont nécessaires par patient. Par conséquent, cette approche a été encore améliorée, réduisant la quantité tissulaire requise à 0,15 g pour une isolation suffisante des NMGs26. Cependant, au moins la moitié d’une substance noire complète pars compacta était nécessaire.
b) L’excision des NMG à l’aide de LMD. En 2016, Plum et al ont établi un nouveau protocole basé sur l’excision précise des NMG via LMD. Avec ce protocole, la quantité d’échantillon requise pourrait être réduite à dix coupes de tissu de 10 μm, ce qui entraînerait une réduction impressionnante de l’échantillon de tissu requis de 150 mg à 16,6 mg22.
Le protocole optimisé et automatisé basé sur le LMD présenté ici nécessite des quantités d’échantillons encore plus faibles car des coupes plus minces (5 μm contre 10 μm) et moins nombreuses (maximum de 7 contre 8) ont dû être utilisées et nécessitent moins de temps pour la génération d’échantillons (4 h par échantillon contre 1-2 jours) grâce à l’utilisation de la détection NMG automatisée. Ainsi, le temps de prélèvement requis a été considérablement raccourci et le nombre de PG identifiés a pu être considérablement augmenté en appliquant une méthode LC-MS optimisée et une instrumentation de pointe. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres questions de recherche et tissus.
Pour l’adaptation du protocole présenté concernant les questions de recherche définies par l’utilisateur, les aspects suivants sont mis en évidence sur la base de l’expérience:
a) Isolement de quantités d’échantillons comparables : Comme le rendement peptidique attendu de ce protocole est plutôt faible comparé, par exemple, à la culture cellulaire ou aux lysats tissulaires, la détermination de la concentration peptidique peut ne pas être possible. Ainsi, il est crucial que des quantités égales de tissu soient isolées via LMD, ce qui peut être estimé en fonction de la surface tissulaire des objets sélectionnés. Dans la configuration actuelle, des zones tissulaires de 500 000 μm² sont suffisantes pour la génération de peptides pour au moins trois mesures MS.
b) Digestion de la trypsine : La durée de la digestion et la concentration de trypsine doivent être comparables d’un échantillon à l’autre.
c) Adaptation des paramètres pour différents tissus: Selon le tissu à analyser, la quantité de tissu recueillie doit être ajustée, ce qui rend nécessaire d’ajuster également la quantité de trypsine ajoutée. Le rapport trypsine/protéines ne doit pas être inférieur à 1:40.
d) Limitation du processus LMD : Pour l’isolation des objets d’intérêt basée sur le LMD, il existe des limites en ce qui concerne la taille des objets sélectionnés et l’épaisseur des tranches. En raison de la perte de tissu lors de la découpe laser du tissu, les objets de moins de 100 μm² ont été considérés comme trop petits pour être isolés.
e) Adaptation des paramètres LC et MS : Selon les systèmes LC et MS utilisés, la quantité de tissu isolé doit être augmentée (par exemple, lors du fonctionnement avec un système à microflux) et les paramètres MS doivent être adaptés (par exemple, lorsque vous travaillez avec un système de détection à piège à ions).
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par de. NBI, un projet du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) (numéro de subvention FKZ 031 A 534A) et P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) et Center for Protein Diagnostics (ProDi), tous deux du ministère de l’Innovation, de la Science et de la Recherche de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, Allemagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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