Summary
Aquí se presenta un protocolo robusto para aislar gránulos de neuromelanina del tejido humano post-mortem substantia nigra pars compacta mediante microdisección láser. Este protocolo revisado y optimizado minimiza enormemente el tiempo requerido para la recolección de muestras, reduce la cantidad de muestra requerida y mejora la identificación y cuantificación de proteínas mediante análisis LC-MS / MS.
Abstract
La neuromelanina es un pigmento negro-marrón, presente en los llamados gránulos de neuromelanina (NMG) en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta. Además de la neuromelanina, los NMG contienen una variedad de proteínas, lípidos y metales. Aunque las neuronas dopaminérgicas que contienen NMG se pierden preferentemente en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la demencia con cuerpos de Lewy, solo se sabe poco sobre el mecanismo de formación de NMG y el papel de los NMG en la salud y la enfermedad. Por lo tanto, es esencial una mayor investigación sobre la caracterización molecular de los NMG. Desafortunadamente, los protocolos estándar para el aislamiento de proteínas se basan en la ultracentrifugación por gradiente de densidad y, por lo tanto, requieren grandes cantidades de tejido humano. Por lo tanto, aquí se establece un protocolo automatizado basado en microdisección láser (LMD) que permite la recolección de NMG y tejido circundante de sustancia negra (SN) utilizando cantidades mínimas de tejido de manera imparcial y automatizada. Las muestras extirpadas se analizan posteriormente por espectrometría de masas para descifrar su composición proteómica. Con este flujo de trabajo, se identificaron 2.079 proteínas, de las cuales 514 proteínas se identificaron exclusivamente en NMG y 181 en SN. Los resultados actuales se han comparado con un estudio previo que utiliza un enfoque similar basado en LMD que alcanza una superposición del 87,6% para ambos proteomas, verificando la aplicabilidad del protocolo revisado y optimizado presentado aquí. Para validar los hallazgos actuales, las proteínas de interés se analizaron mediante espectrometría de masas dirigida, por ejemplo, experimentos de monitoreo de reacciones paralelas (PRM).
Introduction
Cada tejido consiste en una mezcla heterogénea de diferentes tipos de células, pero el aislamiento específico de un tipo de célula a menudo es indispensable para una caracterización más precisa. La microdisección láser (LMD), que acopla un microscopio con una aplicación láser, es una herramienta poderosa para el aislamiento específico de áreas de tejido, células individuales o subestructuras celulares a partir de un compuesto complejo. La aplicación de LMD en combinación con espectrometría de masas (LMD-MS) ya se ha implementado con éxito para varias preguntas de investigación, incluido el aislamiento de ADN1, ARN2 y proteínas 3,4,5. En este protocolo, se describe un protocolo LMD-MS revisado y optimizado para el análisis proteómico del tejido cerebral post-mortem humano y los componentes subcelulares para descifrar nuevos mecanismos patológicos de la enfermedad de Parkinson.
La neuromelanina es un pigmento negro, casi insoluble, que se encuentra en las neuronas catecolaminérgicas, productoras de dopamina de la sustancia negra pars compacta6. Junto con proteínas y lípidos, se acumula en gránulos similares a orgánulos rodeados por una doble membrana, llamada gránulos de neuromelanina (NMG)7,8,9. Los NMG pueden ser observados a partir de los tres años de edad en humanos aumentando en cantidad y densidad durante el proceso de envejecimiento10,11. Hasta la fecha, no existe una hipótesis definitiva sobre la formación de neuromelanina, pero una suposición es que la neuromelanina se forma a través de la oxidación de la dopamina12. Otras hipótesis se basan en la producción enzimática de neuromelanina (por ejemplo, tirosinasa)13. Se encontró que la neuromelanina en sí misma tiene una alta afinidad de unión a lípidos, toxinas, iones metálicos y pesticidas. Con base en estos hallazgos, se supone que la formación de NMGs protege a la célula de la acumulación de sustancias tóxicas y oxidativas y de toxinas ambientales14,15. Además de esta función neuroprotectora, hay evidencia de que la neuromelanina puede causar efectos neurodegenerativos, por ejemplo, por saturación de hierro y la posterior catálisis de radicales libres16,17. Además, la neuromelanina liberada durante los procesos neurodegenerativos puede ser descompuesta por peróxido de hidrógeno, lo que podría acelerar la necrosis por metales reactivos y otros compuestos tóxicos previamente unidos a la neuromelanina y puede contribuir a la neuroinflamación y al daño celular18. Sin embargo, hasta ahora el papel exacto de los NMG en procesos neurodegenerativos como en el curso de la enfermedad de Parkinson no se entiende claramente. Aún así, los NMG parecen estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y su análisis específico es de suma importancia para desentrañar su papel en la neurodegeneración. Desafortunadamente, los animales comunes de laboratorio (por ejemplo, ratones y ratas) y las líneas celulares carecen de NMG19. Por lo tanto, los investigadores confían especialmente en el tejido cerebral post-mortem para su análisis. En el pasado, el aislamiento de NMG por centrifugación por gradiente de densidad dependía de la disponibilidad de altas cantidades de tejido de sustancia negra 20,21. Hoy, LMD presenta una herramienta versátil para aislar específicamente los NMG de muestras de cerebro humano para luego analizarlos mediante LC-MS / MS.
En este protocolo, se presenta una versión mejorada y automatizada de un protocolo anterior22 para el aislamiento de NMG y tejido circundante (SN), lo que permite una generación de muestras más rápida, un mayor número de proteínas identificadas y cuantificadas, y una reducción severa de las cantidades de tejido requeridas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de tejido cerebral humano fue aprobado por el comité de ética de la Ruhr-University Bochum, Alemania (número de expediente 4760-13), de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas. Este protocolo se ha aplicado en rodajas de tejido de substantia nigra pars compacta obtenidas comercialmente. En la figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo presentado.
1. Sección de tejidos
- Preenfríe la cámara de criostato.
NOTA: Cada tejido requiere diferentes temperaturas de criostato, que se pueden encontrar en el protocolo del proveedor respectivo. - Limpie la cuchilla de acero inoxidable con etanol al 70% e instálela en el soporte de la cuchilla.
- Transfiera el tejido del congelador a -80 °C al criostato utilizando una nevera y deje que se ajuste a la temperatura de la cámara de criostato durante 15 minutos.
- Etiquete inequívocamente las diapositivas de membrana con un lápiz.
Nota: Las diapositivas de membrana PET/PEN son necesarias para la recogida de muestras basada en LMD. Manipule los portaobjetos de membrana PET/PEN con cuidado, ya que son extremadamente frágiles. - Aplique una gota de medio de sección congelada comercial en el soporte de tejido. Antes de que esté completamente congelado, coloque el tejido en el medio de la sección congelada y deje que se endurezca, de modo que el tejido esté conectado con el soporte del tejido.
- Instale el soporte de tejido en la cámara de criostato y ajuste su orientación antes de comenzar a seccionar. La orientación óptima del soporte depende de la orientación del tejido.
NOTA: Puede ser necesario recortar el tejido hasta alcanzar el plano de sección necesario para las rodajas. - Antes de alcanzar el área de tejido de interés, ajuste el ajuste de corte al grosor de tejido deseado.
NOTA: 5 o 10 μm es el espesor sugerido para este protocolo, ya que se encontró que las secciones de 20 μm de espesor eran incompatibles con la recolección de muestras basada en LMD22. - Corte dos secciones y deséchelas.
- Coloque la placa estabilizadora.
- Corte una sección del tejido, abra la placa estabilizadora con cuidado, tome un portaobjetos de membrana y evite que el tejido se pliegue mientras coloca la sección de tejido en el portaobjetos de membrana.
NOTA: El almacenamiento de los portaobjetos de membrana a temperatura ambiente antes de la adhesión permite una fijación precisa de la muestra. Se pueden colocar varias secciones en el mismo portaobjetos de membrana, pero se debe evitar la superposición de tejido. - Almacene las secciones de tejido colocadas en portaobjetos de membrana en el criostato hasta que se complete la sección.
- Almacene el tejido criosecado a -20 °C hasta su posterior procesamiento o proceda directamente con el procedimiento siguiente. Conservar los portaobjetos seccionados a -80 °C hasta su uso posterior.
2. Microdisección láser y catapulta a presión
NOTA: Como los gránulos de neuromelanina son visibles sin ninguna tinción debido a su color negro-marrón, no es necesaria ninguna tinción para este protocolo. Sin embargo, se pueden combinar diferentes procedimientos de tinción con este protocolo si es necesario. Tenga en cuenta que el uso de soluciones de bloqueo o anticuerpos influirá en los análisis LC-MS/MS.
- Encienda el sistema MicroBeam y abra el software asociado en el ordenador (consulte Tabla de materiales).
- Coloque el portaobjetos de membrana de tejido en el SlideHolder del RoboStage con el tejido hacia arriba.
NOTA: Dependiendo del dispositivo LMD, puede ser necesario colocar el portaobjetos de membrana de manera que el tejido quede hacia abajo. En general, la recolección de muestras se realiza en un ambiente de temperatura controlada para garantizar condiciones óptimas y reproducibles. - Ajuste el microscopio al aumento deseado (aquí se utilizan 50 veces) para los escaneos generales.
- Utilice la función Escanear, que se puede encontrar en la ventana Navegador de la interfaz del software, para adquirir un escaneo general de la sección de tejido. Busque la esquina superior izquierda y la esquina inferior derecha del área de interés y selecciónelas en la interfaz del software. Luego, seleccione Escanear todos los ROI para realizar los escaneos.
NOTA: Los escaneos de información general no son obligatorios, pero permiten una mejor orientación en la diapositiva y se pueden guardar para su uso posterior. - Ajuste el aumento del microscopio para el tejido apropiado, que es 400 veces mayor en el presente caso de los gránulos de neuromelanina.
- Busque un área con gránulos de neuromelanina. Seleccione Análisis de campo de visión en la interfaz del software, seleccione Invertir resultado y establezca el umbral para los canales RGB de modo que solo los gránulos de neuromelanina se resalten en rojo en la ventana de vista previa. Haga clic en Aceptar para utilizar la configuración ajustada para el campo de visión.
NOTA: Puede ocurrir que también se seleccionen objetos más pequeños que tengan un color oscuro. Para tener en cuenta eso, deseche todos los objetos que cubran un área menor de 100 μm2 antes de aislar los gránulos de neuromelanina. Para hacer esto, abra la Lista de elementos haciendo clic en el icono de la barra de herramientas, seleccione la diapositiva en consideración y ordene los elementos por área. Seleccione aquellos con áreas inferiores a 100 μm2 y elimínelas. - Ajuste la configuración del láser utilizando un área de la diapositiva que esté cubierta solo por la membrana.
NOTA: Se sugiere utilizar el Asistente de ajuste de láser de corte y seguir las instrucciones del software. Los ajustes láser requeridos pueden diferir entre las diferentes diapositivas. Para secciones de 5 μm con un aumento de 400 veces, los ajustes típicos son 32 de energía y 51 de enfoque para el corte, y 28 de energía y -1 de enfoque para la catapulta de pulso láser (LPC). - Ajuste la configuración de velocidad para el posicionamiento y el corte para garantizar un aislamiento adecuado.
NOTA: Se encontró que la velocidad del 30% era óptima para el aislamiento de NMG. - Llene la tapa del tubo de recolección de muestras con 50 μL de agua ultrapura e inserte la tapa en el colector del RoboMover.
NOTA: El colector de tubos utilizado para los experimentos actuales puede transportar un tubo de recolección de muestras a la vez. - Coloque el RoboMover encima del RoboStage II utilizando la interfaz del software para iniciar la recolección de muestras.
NOTA: Para ello, abra la ventana RoboMover, que muestra el recopilador. Haga clic en la tapa del tubo de recolección de muestras que se muestra en la ventana de RoboMover para mover la tapa al área de trabajo. Ajuste la altura óptima de movimiento y trabajo en la ventana de RoboMover. De lo contrario, el agua en la tapa puede caer sobre el tobogán o los objetos catapultados no llegarán a la tapa. - Inicie el láser. Controle los ajustes de energía y enfoque durante el proceso láser y ajuste los ajustes si es necesario. Asegúrese de aislar y catapultar adecuadamente los objetos aislados en la tapa del tubo de recolección de muestras para al menos los primeros diez objetos.
NOTA: El aislamiento adecuado y la catapulta deben verificarse visualmente. Ambos deben dar como resultado un área libre de tejido del tamaño del objeto preseleccionado en el corte de tejido (ver Figura 2C, D). Ajuste la configuración del láser si el objeto permanece adherido a la rebanada de tejido después de cortar y catapultarse. Para catapultarse, la opción CenterRoboLPC es muy adecuada para el aislamiento de NMG. La configuración de catapulta se puede ajustar para cada objeto seleccionado en la Lista de elementos. - Cuando se complete el muestreo, navegue por el RoboMover hasta su posición inicial. Retire el tubo de recolección de muestras.
NOTA: Cuando el número de objetos recolectados es bastante bajo y los objetos son lo suficientemente grandes, la recolección de muestras se puede garantizar haciendo clic en Cap Check, que colocará la tapa del tubo de recolección de muestras debajo del microscopio para que se pueda contar el número de objetos dentro del agua en la tapa (ver Figura 2H). - Haga girar la muestra con una centrífuga. Se encontró que los giros cortos de 5 s con fuerza centrífuga creciente debido a la aceleración de la centrífuga eran suficientes. En este punto, almacenar las muestras a -80 °C, ya que todas las muestras deben procesarse juntas.
NOTA: Para la comparación del perfil proteómico, el tejido que rodea a los NMG también se aisló después de su escisión. El aislamiento del tejido circundante se realizó con un aumento de 50 veces. - Secar las muestras en un concentrador de vacío. Se encontró que 1,5 h eran suficientes para 50 μL de agua.
- Solubilizar y lisar el tejido en 40 μL de ácido fórmico durante 20 min (temperatura ambiente).
- Mejorar la lisis tisular mediante sonicación a 45 kHz (kilohercios) durante 5 minutos en un baño de sonicación. Llene el baño de sonicación con hielo para evitar que los tubos se derritan. Almacenar las muestras a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
3. Digestión tríptica
- Descongele las muestras en hielo.
- Seque completamente las muestras en un concentrador de vacío.
- Llene la muestra con 50 μL de un tampón de digestión adecuado, por ejemplo, 50 mM de bicarbonato de amonio.
- Después de la adición de 1,25 μL de 200 mM de 1,4-ditiotritol, incubar las muestras durante 30 min a 60 °C y 300 rpm utilizando un termomezclador y enfriarlas a temperatura ambiente (RT) después.
- Luego, incubar muestras a RT durante 30 minutos en la oscuridad después de la adición de 1.36 μL 0.55 M de yodoacetamida.
- Añadir una cantidad adecuada de tripsina a las muestras e incubar las muestras durante la noche (~16 h) a 37 °C.
NOTA: Para 1.000.000μm2, 0,1 μg de tripsina se encontró que era suficiente. - Añadir 2,6 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% a las muestras para detener la digestión (concentración final de 0,5% TFA).
- Seque completamente las muestras con un concentrador de vacío. Luego, llene las muestras hasta un volumen final definido con 0.1% de TFA. Las muestras de NMG se llenaron hasta 20 μL, de los cuales 5 μL se utilizaron para un experimento de espectrometría de masas (MS).
- Almacenar las muestras a -80 °C hasta su posterior uso. Determinar la concentración de péptidos mediante análisis de aminoácidos u otro método de cuantificación adecuado (por ejemplo, detección directa).
NOTA: Las cantidades bajas de muestra pueden no ser cuantificables utilizando las técnicas mencionadas. Para garantizar una carga de muestra idéntica, cada muestra debe contener la misma cantidad de tejido aislado y cada muestra debe tratarse por igual.
4. Cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas
NOTA: El siguiente análisis de espectrometría de masas (MS) de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) está optimizado para el sistema LC específico con un dispositivo de columna de captura y un espectrómetro de masas utilizado aquí (consulte la Tabla de materiales). Para otros sistemas LC y MS, se recomienda la adaptación de los parámetros.
- Con el software Xcalibur, ajuste la configuración de HPLC de la siguiente manera.
- Columna de trampa: ajuste la temperatura a 60 °C, caudal a 30 μL/min, tampón de funcionamiento a ácido trifluoroacético al 0,1%.
- Columna analítica de fase inversa C18: ajuste la temperatura a 60 °C, caudal a 30 μL/min, tampón de funcionamiento A a ácido trifluoroacético al 0,1%, tampón de funcionamiento B al 84% de acetonitrilo y gradiente al 5%-30% del tampón de funcionamiento B durante 98 min.
NOTA: La adaptación del gradiente puede ser inevitable y se recomienda encarecidamente cuando se utilizan diferentes tejidos o células. El tiempo total de gradiente puede variar debido a la carga de la muestra al comienzo del gradiente y al lavado de la muestra al final del gradiente. El gradiente total en este protocolo consiste en una carga de muestra de 7 minutos y un lavado de columna adicional durante 15 minutos, lo que resulta en un tiempo de gradiente total de 120 minutos.
- Cree un método de adquisición dependiente de datos (DDA) utilizando la configuración del instrumento XCalibur, que se puede encontrar en el menú de la hoja de ruta del software HPLC.
- En la ficha Parámetros globales , defina el modo de infusión Cromatografía líquida, el Ancho de pico LC esperado (30 s) y el Estado de carga predeterminado (2).
- Vaya a la pestaña Parámetros de escaneo y agregue los siguientes escaneos y filtros en el orden mencionado: MS OT, MIPS, Intensidad, Estado de carga, Exclusión dinámica y ddMS2 OT HCD.
NOTA: La configuración detallada de los parámetros para cada escaneo y filtro se puede encontrar en la Tabla complementaria 1. Los ajustes óptimos de MS y DDA pueden variar para el espectrómetro de masas específico utilizado, así como para el tipo de muestra y, por lo tanto, deben adaptarse. - Preparar muestras disolviendo 200-400 ng de péptidos de muestra en un volumen definido de 0,1% TFA en entradas de viales de vidrio espectrométricos de masas inertes. Si la determinación de la concentración no es aplicable debido a la baja cantidad de muestra, verifique la carga idéntica de la muestra comparando la corriente de iones totales (TIC).
NOTA: Para ello, abra el archivo resultante de medición espectrométrica de masas en un software adecuado, por ejemplo, FreeStyle, y compruebe el cromatograma. Las intensidades deben ser comparables para todas las muestras. En la Figura 3 se muestra un TIC representativo. - Analice los datos brutos obtenidos utilizando un software proteómico adecuado, por ejemplo, MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics o Proteome Discoverer, y realice un análisis estadístico de datos basado en la pregunta de investigación.
5. Análisis de datos brutos proteómicos utilizando MaxQuant
NOTA: En la Tabla complementaria 2 se proporciona información detallada sobre los parámetros de MaxQuant. A continuación se describen brevemente.
- Cargue archivos sin procesar en el software MaxQuant en el encabezado de datos sin procesar haciendo clic en Cargar.
- Asigne nombres de muestra haciendo clic en Establecer experimento.
- Definir parámetros específicos del grupo. Primero, agregue modificaciones. Debido al procesamiento de la muestra, elija la desamidación (NQ), la oxidación (M) y la carbamidometilación (N-término) como modificaciones variables, y agregue la carbamidometilación (C) como modificación fija.
- Elija tripsina como enzima de digestión en la pestaña Digestión .
- Agregue la opción de cuantificación sin etiqueta LFQ en la pestaña Cuantificación sin etiqueta . Si se van a procesar más de 10 archivos, elija la opción Fast LFQ para acortar el tiempo de procesamiento. Añadir la opción iBAQ como medida para la cuantificación de proteínas24.
- Asegúrese de que todos los demás parámetros específicos del grupo permanezcan en la configuración de fábrica.
- Vaya a la pestaña Parámetros globales y agregue el archivo FASTA derivado de uniprot.org en la pestaña Secuencias . Modifique la regla de identificador en consecuencia y agregue el ID de taxonomía, en este caso, 9606 para homo sapiens.
- Para la cuantificación de proteínas, elija péptidos únicos y afeitar.
- Asegúrese de que todos los demás parámetros globales permanezcan en la configuración de fábrica.
- Haga clic en Inicio y recupere la salida .txt grupos de proteínas después del análisis MaxQuant para su posterior análisis en Perseo.
6. Análisis estadístico usando Perseo
- Cargue el archivo .txt grupos de proteínas en Perseo, agregue los valores de iBAQ como columnas principales y ordene todas las demás columnas según su tipo.
- Filtre los señuelos y contaminantes filtrando filas basadas en la columna categórica.
- Filtre los resultados en función de valores válidos. En el presente caso, con sólo dos muestras incluidas en el análisis, se eligió un número mínimo de un valor válido.
- Exporte la salida de Perseo en formato .txt para su posterior procesamiento, por ejemplo, en Excel, y evalúe los resultados con respecto a la pregunta de investigación.
7. Validación de proteínas seleccionadas
NOTA: Los métodos comúnmente utilizados para la validación de los datos de EM son, por ejemplo, la tinción inmunológica o Western Blot. Debido al color oscuro y la autofluorescencia de la neuromelanina, la tinción inmunológica de las proteínas dentro de los gránulos de neuromelanina, ya sea con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante o fluoróforos, no es aplicable. Para el análisis Western Blot, serían necesarias cantidades muy grandes de tejido post-mortem . Por lo tanto, las proteínas seleccionadas se validan mediante espectrometría de masas dirigida y, en el presente caso, se establecieron experimentos de monitoreo de reacciones paralelas (PRM).
- Seleccionar proteínas para validación. Elija péptidos de estas proteínas ya detectados en experimentos con DDA. Los péptidos no deben contener escisiones o modificaciones perdidas para garantizar una cuantificación confiable.
NOTA: Puede haber varias razones para la validación de una proteína específica, por ejemplo, abundancias diferenciales en las condiciones investigadas. Para los resultados representativos, se ha seleccionado la cadena pesada 1 de la dineína citoplasmática, que resultó ser equivalentemente abundante en muestras de NMG y SN y, por lo tanto, podría usarse como referencia para garantizar una carga de muestra igual. - Utilice los péptidos seleccionados para configurar la primera versión de un método PRM utilizando el software HPLC. Mantenga todos los ajustes de cromatografía y parámetros globales del método DDA.
- Agregue MS OT y tMS2 OT HCD como tipos de escaneo. Asegúrese de que la configuración para MS OT es la misma que para el método DDA. Los ajustes detallados para el método PRM se pueden encontrar en la Tabla suplementaria 1.
- Para tMS2 OT HCD, agregue péptidos seleccionados como una lista de inclusión. Por lo tanto, agregue la secuencia de aminoácidos y el valor m / z observado en las mediciones de DDA. Para el primer experimento PRM, no agregue ventanas de tiempo de retención ni establezca t start en 0 y t stop en 120 (para un gradiente de 120 min).
- Evalúe el método PRM después de la medición utilizando un software adecuado, por ejemplo, Skyline, y obtenga el tiempo de retención de los péptidos agregados a la lista de inclusión. Para los péptidos incluidos, verifique que se observen picos comparables para al menos tres iones precursores en exploraciones MS1 y cinco iones de fragmento en exploraciones MS2 con bajo error de masa (±5 ppm).
- Refine el método PRM, por ejemplo, aumentando la resolución para el escaneo tMS2 OT HCD y agregando ventanas de tiempo de retención a la lista de inclusión.
NOTA: Se encontró que las ventanas de tiempo de retención de 3 min eran adecuadas en los experimentos actuales (tiempo de retención observado en el primer experimento PRM ± 1.5 min). - Con el método PRM refinado, realice la cuantificación de péptidos y proteínas de interés en función del área pico tanto en los niveles MS1 como MS2 con el software adecuado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El aislamiento específico de NMGs y tejido SN es el paso más importante para la aplicación exitosa de este protocolo. Utilizando la función de análisis de campo de visión en el software proporcionado por el proveedor del LMD, los NMG se pueden seleccionar automáticamente de una manera dependiente del color. Por lo tanto, se deben identificar las áreas de tejido que contienen NMG (Figura 2A) y se debe realizar un análisis de campo de visión con umbrales de color ajustados, lo que resulta en el etiquetado de NMG (Figura 2B). Después de filtrar los objetos que cubren un área inferior a 100 μm², solo los NMG deben permanecer etiquetados para el aislamiento (Figura 2C). El aislamiento preciso de los NMG marcados se logra después de ajustar los ajustes del láser (Figura 2D). Después del aislamiento de NMG (Figura 2E), el tejido SN puede seleccionarse con un aumento de 50 veces (Figura 2F) y aislarse (Figura 2G) para la comparación del perfil proteómico. Para el tejido SN, los objetos aislados se pueden visualizar utilizando la función Cap Check (Figura 2H). Para ambos tipos de muestras, NMG y SN, se encontró que el aislamiento de 500,000 μm2 de tejido cerebral era suficiente para este protocolo, lo que permite un mínimo de tres ejecuciones de EM por muestra.
Un ejemplo representativo de un experimento DDA de 120 minutos se muestra en la Figura 3 (como la columna principal se lava en los últimos 15 minutos de la medición, el cromatograma se recorta justo antes de 105 min). El método aplicado debe permitir una elución de la muestra sobre el gradiente completo, creando picos agudos y concisos, y la intensidad de la corriente de iones totales (TIC) debe ser comparable en todas las muestras.
La aplicación del protocolo presentado en una muestra de 500.000 μm² de NMG y una muestra de tejido SN de 1.000.000 μm² con volúmenes ajustados para muestras de MS (5 μL para NMG y 2,5 μL para SN) para asegurar una carga peptídica idéntica, resultó en la identificación de 1.898 grupos de proteínas (PG) en la muestra de NMG y 1.565 PG en la muestra SN. La comparación adicional reveló que se identificaron 1.384 PG en ambas muestras, mientras que 514 PG se identificaron exclusivamente en NMG y 181 PG en tejido SN (Figura 4). En total, se identificaron 2.079 PG en este experimento representativo. La comparación con un conjunto de datos de referencia de un estudio anterior22 mostró que el 87,6% de los PG informados en ese estudio también podían identificarse mediante el presente protocolo revisado y automatizado, lo que demuestra su aplicabilidad. Además, el número de PG identificados podría mejorarse en 1.143.
Como las cantidades mínimas de muestra no permiten la aplicación de métodos de validación clásicos como Western Blots, la validación de proteínas de interés se puede lograr mediante enfoques espectrométricos de masas específicos, por ejemplo, PRM. Los resultados representativos para el péptido ESPEVLLTLDILK de la proteína citoplasmática dineína 1 de la cadena pesada 1 se muestran en la Figura 5. Se encontró que el valor iBAQ de esta proteína era ligeramente mayor en NMG en comparación con SN en las mediciones de DDA, lo que podría verificarse mediante experimentos PRM basados en el área pico en MS1- (Figura 5A, B, E) y MS2 (Figura 5C, D, F).
Figura 1: Flujo de trabajo para la caracterización proteómica de gránulos de neuromelanina (NMG) y tejido circundante (SN). Las muestras de NMG y SN se aislaron de cortes de tejido mediante microdisección láser (LMD). Se aislaron proteínas y se realizó digestión tríptica en solución. Los péptidos resultantes se analizaron a través de mediciones LC-MS / MS en modo de adquisición dependiente de datos (DDA). El análisis de los datos se realizó utilizando el software MaxQuant y Perseo. La validación de proteínas seleccionadas se llevó a cabo con experimentos de monitoreo de reacción paralela (PRM). Los datos de PRM se analizaron utilizando el software Skyline. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Selección y aislamiento basado en LMD de muestras NMG y SN. Al principio, un área que contiene NMG, visible sin más tinciones con un aumento de 400 veces, se coloca bajo el microscopio (A). Después de realizar un análisis de campo de visión, se seleccionan los NMG y otras áreas oscuras (B). Solo los NMG permanecen seleccionados después del filtrado (C) y se aíslan después de ajustar los ajustes del láser (D). Después de que todos los NMG se aíslan (E), se selecciona el tejido SN con un aumento de 50 veces (F) y se aísla (G). Como los objetos aislados para muestras SN son bastante grandes, se pueden observar en la tapa de recolección de muestras utilizando la función Cap Check (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Corriente de iones total (TIC) de una medición DDA de 120 minutos. El cromatograma muestra la abundancia relativa de los iones correspondientes a los péptidos eluentes en el rango de tiempo de retención de 0 a ~ 105 min. Como la columna principal se lava entre 105y 120minutos , el cromatograma se recorta enel minuto 105. La intensidad del pico más alto es 2.86 x 108. Los números por encima de los picos indican el tiempo de retención y el ion más abundante de ese pico específico (BP = pico base). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama de Venn que muestra la correspondencia de grupos de proteínas (PG) identificados en NMGs y tejido SN. En total, se identificaron 1.898 PG en NMG y 1.565 PG en tejido SN, de los cuales 1.384 PG se identificaron en ambas áreas de tejido. 514 PG se identificaron exclusivamente en el tejido NMG, mientras que 181 PG se identificaron exclusivamente en el tejido SN. El diagrama fue creado usando la herramienta en línea Venny25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados de experimentos PRM para el péptido ESPEVLLTLDILK (citopplasmática dineína 1 cadena pesada 1, ++). Los cromatogramas en MS1- (A,B) y MS2-level (C,D), así como las áreas pico en MS1- (E) y MS2-level (F), se muestran para una muestra ejemplar de NMGs y tejido SN. Se utilizan diferentes colores para denotar diferentes precursores (en el nivel MS1) o iones del producto (en el nivel MS2). Los cromatogramas se muestran después de realizar el suavizado Savitzky-Golay. Las intensidades y las áreas máximas fueron comparables en el nivel MS1- (A, B, E) y MS2 (C, D, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Cuadro complementario 1: Parámetros de los experimentos de espectrometría de masas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla complementaria 2: Parámetros del análisis MaxQuant. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La LMD es una técnica ampliamente aplicable para el aislamiento de áreas específicas de tejido, células individuales o estructuras subcelulares. En el protocolo revisado y automatizado presentado aquí, esta técnica se aplica para el aislamiento específico de gránulos de neuromelanina (NMG) y tejido circundante de NMG (SN). Hasta ahora, se publicaron y utilizaron ampliamente dos enfoques diferentes para el aislamiento de NMG del tejido cerebral post-mortem humano:
a) Un gradiente de sacarosa discontinuo que consume 1 g de tejido de sustancia negra 20. Como el tejido humano post-mortem substantia nigra es raro y de gran interés para varias preguntas de investigación, desafortunadamente es bastante difícil establecer un gran estudio de cohorte si se requieren grandes cantidades de tejido por paciente. Por lo tanto, este enfoque se mejoró aún más reduciendo la cantidad de tejido requerida a 0,15 g para un aislamiento suficiente de NMG26. Sin embargo, aún así, se requería al menos la mitad de una sustancia negra completa pars compacta .
b) La escisión de NMG utilizando LMD. En 2016, Plum et al establecieron un nuevo protocolo basado en la escisión precisa de NMG a través de LMD. Con este protocolo, la cantidad de muestra requerida podría reducirse a diez secciones de tejido de 10 μm, lo que resultaría en una reducción impresionante de la muestra de tejido requerida de 150 mg a 16,6 mg22.
El protocolo optimizado y automatizado basado en LMD presentado aquí requiere cantidades de muestra aún más bajas, ya que se tuvieron que usar secciones de tejido más delgadas (5 μm en comparación con 10 μm) y menos secciones de tejido (máximo de 7 en comparación con 8) y requiere menos tiempo para la generación de muestras (4 h por muestra en comparación con 1-2 días) mediante el uso de la detección automatizada de NMG. Por lo tanto, el tiempo requerido de recolección de muestras se acortó enormemente y el número de PG identificados podría mejorarse drásticamente mediante la aplicación de un método LC-MS optimizado e instrumentación de última generación. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras preguntas de investigación y tejidos.
Para la adaptación del protocolo presentado con respecto a las preguntas de investigación definidas por el usuario, se destacan los siguientes aspectos basados en la experiencia:
a) Aislamiento de cantidades de muestra comparables: Como el rendimiento peptídico esperado de este protocolo es bastante bajo en comparación con, por ejemplo, el cultivo celular o los lisados tisulares, la determinación de la concentración de péptidos puede no ser posible. Por lo tanto, es crucial que se aíslen cantidades iguales de tejido a través de LMD, que se pueden estimar en función del área de tejido de los objetos seleccionados. En la configuración actual, las áreas de tejido de 500.000 μm² son suficientes para la generación de péptidos para al menos tres mediciones de EM.
b) Tripsina-digestión: La duración de la digestión y la concentración de tripsina deben ser comparables entre las muestras.
c) Adaptación de parámetros para diferentes tejidos: Dependiendo del tejido a analizar, la cantidad de tejido recolectado debe ajustarse, lo que hace necesario ajustar también la cantidad de tripsina añadida. La proporción tripsina/proteína no debe ser inferior a 1:40.
d) Limitación del proceso LMD: Para el aislamiento basado en LMD de objetos de interés, existen limitaciones en cuanto al tamaño de los objetos seleccionados y el grosor de los sectores. Debido a la pérdida de tejido durante el corte del tejido con láser, los objetos menores de 100 μm² se consideraron demasiado pequeños para el aislamiento.
e) Adaptación de los parámetros de LC y MS: Dependiendo de los sistemas LC y MS utilizados, se debe aumentar la cantidad de tejido aislado (por ejemplo, cuando se opera con un sistema de microflujo) y los parámetros de MS deben adaptarse (por ejemplo, cuando se trabaja con un sistema detector basado en trampas de iones).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por de. NBI, un proyecto del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (número de subvención FKZ 031 A 534A) y P.U.R.E. (Unidad de Investigación de Proteínas del Ruhr dentro de Europa) y subvenciones del Centro de Diagnóstico de Proteínas (ProDi), ambas del Ministerio de Innovación, Ciencia e Investigación de Renania del Norte-Westfalia, Alemania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
