Summary
ここでは、レーザーマイクロダイセクションを介してヒトの死後黒質緻密組織から神経メラニン顆粒を分離するための堅牢なプロトコルを示します。この改訂および最適化されたプロトコルは、サンプル収集に必要な時間を大幅に最小限に抑え、必要なサンプル量を削減し、LC-MS/MS分析によるタンパク質の同定と定量を強化します。
Abstract
ニューロメラニンは黒褐色がかった色素であり、 黒質のドーパミン作動性ニューロンのいわゆるニューロメラニン顆粒(NMG)に存在する。NMGには、ニューロメラニン以外にも、さまざまなタンパク質、脂質、金属が含まれています。パーキンソン病やレビー小体型認知症などの神経変性疾患では、NMGsを含むドーパミン作動性ニューロンが優先的に失われますが、NMGの形成メカニズムや健康や病気におけるNMGの役割についてはほとんど知られていません。したがって、NMGの分子特性評価に関するさらなる研究が不可欠です。残念ながら、タンパク質の単離のための標準的なプロトコルは、密度勾配超遠心分離に基づいているため、大量のヒト組織が必要です。したがって、自動レーザーマイクロダイセクション(LMD)ベースのプロトコルがここで確立され、偏りのない自動化された方法で最小限の量の組織を使用してNMGおよび周囲の 黒質 (SN)組織の収集が可能になります。その後、摘出されたサンプルを質量分析法で分析し、プロテオミクス組成を解読します。このワークフローでは、2,079のタンパク質が同定され、そのうち514のタンパク質がNMGで、181のタンパク質がSNでのみ同定されました。現在の結果は、両方のプロテオームで87.6%の重複に達する同様のLMDベースのアプローチを使用した以前の研究と比較され、ここに提示された改訂および最適化されたプロトコルの適用性を検証しました。現在の知見を検証するために、目的のタンパク質を、並行反応モニタリング(PRM)実験などの標的質量分析法で分析しました。
Introduction
すべての組織は、異なる細胞タイプの不均一な混合物で構成されていますが、より正確な特性評価には、多くの場合、1つの細胞タイプの特異的分離が不可欠です。顕微鏡とレーザーアプリケーションを組み合わせたレーザーマイクロダイセクション(LMD)は、複雑な複合材料から組織領域、単一細胞、または細胞下部構造を特異的に分離するための強力なツールです。質量分析(LMD-MS)と組み合わせたLMDの適用は、DNA1、RNA2、タンパク質3,4,5の単離を含むいくつかの研究課題に対してすでに成功裏に実施されています。このプロトコルでは、パーキンソン病の新しい病態メカニズムを解読するために、ヒトの死後脳組織および細胞内成分のプロテオミクス分析のために、改訂および最適化されたLMD-MSプロトコルが説明されています。
ニューロメラニンは、黒質コンパクタ6のカテコールアミン作動性のドーパミン産生ニューロンに見られる黒色のほぼ不溶性の色素です。タンパク質や脂質とともに、ニューロメラニン顆粒(NMG)と呼ばれる二重膜に囲まれたオルガネラ様顆粒に蓄積します7,8,9。NMGは、老化プロセス中に量と密度が増加するヒトの3歳から観察することができます10,11。今日まで、ニューロメラニン形成に関する明確な仮説はありませんが、1つの仮定は、ニューロメラニンがドーパミン12の酸化によって形成されるというものです。他の仮説は、ニューロメラニン(例えば、チロシナーゼ)の酵素的産生に基づいている13。ニューロメラニン自体は、脂質、毒素、金属イオン、農薬に対して高い結合親和性を有することが判明した。これらの知見に基づいて、NMGの形成は、有毒および酸化性物質の蓄積および環境毒素から細胞を保護すると仮定されている14,15。この神経保護機能に加えて、ニューロメラニンが、例えば、鉄飽和およびそれに続くフリーラジカルの触媒作用によって、神経変性作用を引き起こす可能性があるという証拠がある16,17。さらに、神経変性プロセス中に放出されるニューロメラニンは過酸化水素によって分解される可能性があり、これは以前にニューロメラニンに結合していた反応性金属および他の毒性化合物による壊死を加速し、神経炎症および細胞損傷に寄与する可能性がある18。しかし、これまで、パーキンソン病の経過のような神経変性過程におけるNMGの正確な役割は明確に理解されていません。それでも、NMGはパーキンソン病の病因に関与しているようであり、神経変性におけるNMGの役割を解明するには、NMGの特定の分析が最も重要です。残念なことに、一般的な実験動物(例えば、マウスおよびラット)および細胞株はNMGを欠いている19。したがって、研究者は特に分析のために死後の脳組織に依存しています。過去には、密度勾配遠心分離によるNMG単離は、大量の黒質組織の利用可能性に依存していました20,21。今日、LMDは、ヒトの脳サンプルからNMGを特異的に分離し、LC-MS/MSで分析するための汎用性の高いツールを提供しています。
このプロトコルでは、NMGおよび周辺組織(SN)の単離のために、以前のプロトコル22 の改良および自動化バージョンが提示され、より速いサンプル生成、より多くの同定および定量されたタンパク質、および必要な組織量の大幅な削減を可能にする。
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Protocol
人間の脳組織の使用は、ドイツの規制とガイドラインに従って、ドイツのルール大学ボーフムの倫理委員会(ファイル番号4760-13)によって承認されました。このプロトコルは、商業的に入手した 黒質コンパクタ 組織スライスに適用されています。提示されたプロトコルの概要を 図1に示します。
1.組織切片
- クライオスタットチャンバーを予冷します。
注:組織ごとに異なるクライオスタット温度が必要であり、これはそれぞれのベンダープロトコルに記載されています。 - ステンレス鋼のナイフを70%エタノールで洗浄し、ブレードホルダーに取り付けます。
- アイスボックスを使用して、-80°Cの冷凍庫からクライオスタットに組織を移し、クライオスタットチャンバーの温度に15分間調整します。
- 鉛筆を使用してメンブレンスライドに明確にラベルを付けます。
注:LMDベースのサンプル収集には、PET/PENメンブレンスライドが必要です。PET / PENメンブレンスライドは非常に壊れやすいため、取り扱いには注意してください。 - 市販の凍結切片培地をティッシュホルダーに一滴塗布します。完全に凍結する前に、組織を凍結切片培地の上に置き、硬化させて、組織を組織ホルダーに接続します。
- クライオスタットチャンバーにティッシュホルダーを取り付け、切片作成を開始する前にその向きを調整します。最適なホルダーの向きは、組織の向きによって異なります。
注意: スライスに必要な断面面に達するまで、組織をトリミングする必要がある場合があります。 - 目的の組織領域に到達する前に、切断設定を目的の組織の厚さに調整します。
注:厚さ20 μmの切片はLMDベースのサンプルコレクションと互換性がないことが判明したため、このプロトコルの推奨厚さは5または10μmです22。 - 2つのセクションを切り取って破棄します。
- アンチロールプレートを置きます。
- 組織の一部を切断し、アンチロールプレートを慎重に開き、メンブレンスライドを取り、組織セクションをメンブレンスライドに配置しながら組織の折り畳みを防ぎます。
注:メンブレンスライドを接着前に室温で保管すると、サンプルを正確に付着させることができます。複数の切片を同じメンブレンスライド上に配置してもよいが、組織の重なりを防ぐ必要がある。 - メンブレンスライドに置かれた組織切片は、切片化が完了するまでクライオスタットに保管します。
- 凍結した組織をさらに処理するまで-20°Cで保存するか、以下の手順に直接進めます。切片化した組織スライドは、さらに使用するまで-80°Cで保管してください。
2. レーザーマイクロダイセクションと圧力カタパルト
注:ニューロメラニン顆粒は黒茶色がかった色のために染色なしで見えるため、このプロトコルでは染色は必要ありません。それにもかかわらず、必要に応じて、異なる染色手順をこのプロトコルと組み合わせることができます。ブロッキング溶液または抗体の使用は、LC-MS/MS分析に影響を与えることに注意してください。
- MicroBeamシステムの電源を入れ、コンピューター上の関連ソフトウェアを開きます(材料表を参照)。
- 組織膜スライドをロボステージのスライドホルダーに配置し、組織を上に向けて配置します。
注意: LMDデバイスによっては、組織が下を向くようにメンブレンスライドを配置する必要がある場合があります。一般に、サンプル収集は、最適で再現性のある条件を確保するために、温度制御された環境で行われます。 - 顕微鏡をオーバービュースキャンの希望の倍率(ここでは50倍を使用)に設定します。
- ソフトウェアインターフェイスのナビゲータウィンドウにあるスキャン機能を使用して、組織セクションの概要スキャンを取得します。対象地域の左上隅と右下隅を検索し、ソフトウェアインターフェイスで選択します。次に、[ すべての ROI をスキャン ] を選択してスキャンを実行します。
メモ: 概要スキャンは必須ではありませんが、スライド内の向きを改善し、後で使用するために保存できます。 - 適切な組織に対して顕微鏡の倍率を調整し、これは本件ニューロメラニン顆粒の場合400倍である。
- ニューロメラニン顆粒のある領域を検索します。ソフトウェアインターフェイスで視野 分析 を選択し、 結果を反転を選択し、プレビューウィンドウでニューロメラニン顆粒のみが赤で強調表示されるようにRGBチャネルのしきい値を設定します。[ OK ]をクリックして、視野の調整された設定を使用します。
注: 暗い色の小さいオブジェクトも選択される場合があります。それを考慮するには、ニューロメラニン顆粒を単離する前に、100μm2未満の領域をカバーするすべての物体を廃棄します。これを行うには、ツールバーのアイコンをクリックして要素リストを開き、検討中のスライドを選択して、領域ごとに要素を並べ替えます。面積が100μm2未満のものを選択して削除します。 - メンブレンのみで覆われているスライドの領域を使用してレーザー設定を調整します。
注意: カットレーザー調整ウィザード を使用して、ソフトウェアの指示に従うことをお勧めします。必要なレーザー設定は、スライドによって異なる場合があります。倍率400倍の5μm切片の場合、一般的な設定は、切断の場合は32エネルギーと51フォーカス、レーザーパルスカタパルト(LPC)の場合は28エネルギーと-1フォーカスです。 - 位置決めと切断の速度設定を調整して、適切な分離を確保します。
注:NMG分離には30%の速度が最適であることがわかりました。 - サンプル採取チューブキャップに50μLの超純水を入れ、ロボムーバーのコレクターに挿入します。
注:本実験に使用したチューブコレクターは、一度に1つのサンプル収集チューブを運ぶことができます。 - ソフトウェアインターフェースを使用してロボムーバーをロボステージIIの上に配置して、サンプル収集を開始します。
メモ: これを行うには、コレクターを表示する RoboMover ウィンドウを開きます。RoboMoverウィンドウに表示されているサンプル収集チューブキャップをクリックして、キャップを作業領域に移動します。RoboMoverウィンドウで最適な移動高さと作業高さを調整します。そうしないと、キャップ内の水がスライドに落ちたり、カタパルトされた物体がキャップに到達しなくなったりする可能性があります。 - レーザーを開始します。レーザー加工中にエネルギーとフォーカスの設定を制御し、必要に応じて設定を調整します。少なくとも最初の10個のオブジェクトについて、孤立したオブジェクトをサンプル収集チューブキャップに適切に分離およびカタパルトするようにしてください。
注意: 適切な分離とカタパルトは視覚的に確認する必要があります。どちらも、組織スライス内の事前に選択されたオブジェクトのサイズの組織のない領域をもたらすはずです( 図2C、Dを参照)。切断およびカタパルト後にオブジェクトが組織スライスに付着したままの場合は、レーザー設定を調整します。カタパルトの場合、CenterRoboLPCオプションはNMGアイソレーションに適していることがわかります。カタパルト設定は、要素リストで選択したオブジェクトごとに調整できます。 - サンプリングが完了したら、ロボムーバーを開始位置に移動します。サンプル収集チューブを取り外します。
注:収集されたオブジェクトの数がかなり少なく、オブジェクトが十分に大きい場合は、キャップ チェックをクリックしてサンプル収集チューブキャップを顕微鏡下に置き、キャップ内の水中の物体の数をカウントできるようにすることで、サンプル収集を確実に行うことができます( 図2Hを参照)。 - 遠心分離機を使用してサンプルをスピンダウンします。遠心分離機の加速による遠心力の増加に伴う5秒の短いスピンで十分であることがわかった。この時点で、すべてのサンプルをさらに一緒に処理する必要があるため、サンプルを-80°Cで保存してください。
注:プロテオミクスプロファイルの比較のために、NMGの周囲の組織も切除後に分離されました。周囲組織の単離は50倍の倍率で行った。 - 真空濃縮器でサンプルを乾燥させます。50 μLの水に対して1.5時間で十分であることがわかりました。
- 組織を40 μLのギ酸に20分間(室温)可溶化して溶解します。
- 超音波処理浴中で5分間45kHz(キロヘルツ)で超音波処理することにより、組織溶解を強化する。チューブが溶けないように、超音波処理浴を氷で満たします。さらに処理されるまで、サンプルを-80°Cで保管してください。
3.トリプシン消化
- 氷上でサンプルを凍結解除します。
- 真空濃縮器でサンプルを完全に乾燥させます。
- サンプルに50 μLの適切な消化バッファー(50 mM重炭酸アンモニウムなど)を充填します。
- 1.25 μLの200 mM 1,4-ジチオスレイトールを添加した後、サーモミキサーを使用してサンプルを60°Cおよび300 rpmで30分間インキュベートし、その後室温(RT)まで冷却します。
- 次に、サンプルをRTで暗所で30分間インキュベートし、1.36 μL 0.55 Mヨードアセトアミドを添加した後。
- 適量のトリプシンをサンプルに加え、37°Cで一晩(~16時間)インキュベートします。
注:1,000,000 μm2の場合、0.1 μgのトリプシンで十分であることがわかりました。 - サンプルに2.6 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、消化を停止します(最終濃度0.5%TFA)。
- 真空濃縮器を使用してサンプルを完全に乾燥させます。次に、定義された最終容量までのサンプルに0.1%TFAを充填します。NMGサンプルは20μLまで充填され、そのうち5μLは1回の質量分析(MS)実験に使用されました。
- さらに使用するまで、サンプルを-80°Cで保管してください。ペプチド濃度は、アミノ酸分析または別の適切な定量法(例えば、Direct Detect)によって決定する。
注:サンプル量が少ないと、上記の手法を使用して定量化できない場合があります。同一のサンプルローディングを確保するには、各サンプルに同じ量の単離組織を含める必要があり、すべてのサンプルを均等に処理する必要があります。
4. 高速液体クロマトグラフィー・質量分析
注:以下の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)質量分析(MS)分析は、ここで使用するトラッピングカラムデバイスと質量分析計を備えた特定のLCシステム用に最適化されています( 材料表を参照)。他のLCおよびMSシステムでは、パラメータの適応が推奨されます。
- ソフトウェアXcaliburを使用して、HPLC設定を次のように調整します。
- トラップカラム:温度を60°Cに設定し、流速を30 μL/minに設定し、バッファーを0.1%トリフルオロ酢酸に流します。
- 分析用C18逆相カラム:温度を60°Cに設定し、流速を30 μL/minに設定し、ランニングバッファーAを0.1%トリフルオロ酢酸に、ランニングバッファーBを84%アセトニトリルに、5%-30%ランニングバッファーBにグラジエントを98分間かけて行います。
注:勾配の適応は避けられない場合があり、異なる組織または細胞を使用する場合は強く推奨されます。合計グラジエント時間は、グラジエントの開始時のサンプルローディングとグラジエント終了時のサンプル洗浄によって異なる場合があります。このプロトコルの総グラジエントは、7分間のサンプルローディングと15分間の追加カラム洗浄で構成され、合計グラジエント時間は120分です。
- HPLCソフトウェアのロードマップメニューにあるXCalibur機器のセットアップを使用して、データ依存集録(DDA)メソッドを作成します。
- [グローバルパラメータ]タブで、注入モードの液体クロマトグラフィー、予想されるLCピーク幅(30秒)、およびデフォルトの充電状態(2)を定義します。
- [スキャン パラメーター] タブに進み、MS OT、MIPS、強度、充電状態、動的除外、および ddMS2 OT HCD の順序でスキャンとフィルターを追加します。
メモ: 各スキャンとフィルターの詳細なパラメーター設定は、 補足表 1 に記載されています。最適なMSおよびDDA設定は、使用する特定の質量分析計やサンプルタイプによって異なる可能性があるため、調整する必要があります。 - 200〜400 ngのサンプルペプチドを、不活性質量分析ガラスバイアルインレットに規定容量の0.1%TFAに溶解してサンプルを調製します。サンプル量が少ないために濃度測定が適用できない場合は、全イオン電流(TIC)を比較して、同一のサンプル負荷を検証します。
注:これを行うには、質量分析測定の結果ファイルをFreeStyleなどの適切なソフトウェアで開き、クロマトグラムを確認します。強度はすべてのサンプルで比較可能である必要があります。代表的なTICを 図3に示します。 - プロテオミクスに適したソフトウェア(MaxQuant23、プロテオミクス用プロジェネシスQI、プロテオームディスカバラーなど)を使用して得られた生データを分析し、研究課題に基づいて統計データ分析を実行します。
5. MaxQuantを用いたプロテオミクス生データの解析
メモ: MaxQuant パラメータの詳細については、 補足表 2 を参照してください。以下に簡単に説明します。
- [ロード]をクリックして、生データをMaxQuantソフトウェアにロードします。
- サンプル名を割り当てるには、[ 実験の設定] をクリックします。
- グループ固有のパラメータを定義します。まず、変更を追加します。サンプル処理のため、可変修飾として脱アミド化(NQ)、酸化(M)、およびカルバミドメチル化(N項)を選択し、固定修飾としてカルバミドメチル化(C)を追加します。
- [消化]タブで消化酵素としてトリプシンを選択します。
- ラベルフリー定量オプション LFQ を ラベルフリー定量タブ に追加します。10 個を超えるファイルを処理する場合は、[ 高速 LFQ ] オプションを選択して処理時間を短縮します。タンパク質定量の尺度として iBAQ オプションを追加24.
- 他のすべてのグループ固有のパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認してください。
- [グローバル パラメータ]タブに進み、[シーケンス]タブで uniprot.org から派生した FASTA ファイルを追加します。それに応じて識別子ルールを変更し、分類 ID (この場合はホモ サピエンスの 9606) を追加します。
- タンパク質の定量には 、ユニークペプチドとカミソリ ペプチドを選択してください。
- 他のすべてのグローバルパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認します。
- [開始して取得]をクリックします タンパク質グループ.txt 出力 MaxQuant分析後、ペルセウスでさらに分析します。
6. ペルセウス座を用いた統計解析
- Perseusにタンパク質グループ.txtファイルをロードし、iBAQ値をメインカラムとして追加し、他のすべてのカラムをタイプに従ってソートします。
- カテゴリ列に基づいて行をフィルター処理して、おとりと汚染物質を除外します。
- 有効な値に基づいて結果をフィルター処理します。この場合、分析に含まれるサンプルが2つだけであるため、有効な値が1つ以上選択されました。
- Perseus出力を.txt形式でエクスポートして、Excelなどでさらに処理し、研究の質問に関する結果を評価します。
7. 選択したタンパク質の検証
注:MSデータの検証に一般的に使用される方法は、免疫学的染色やウェスタンブロットなどです。色が濃く、ニューロメラニンが自家蛍光を発するため、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体または蛍光色素結合抗体によるニューロメラニン顆粒内のタンパク質の免疫学的染色は適用できません。ウェスタンブロット解析では、非常に大量の 死後 組織が必要になります。したがって、選択されたタンパク質は標的質量分析によって検証され、この場合、並行反応モニタリング(PRM)実験が設定されました。
- 検証するタンパク質を選択します。DDA実験で既に検出されているこれらのタンパク質のペプチドを選択してください。ペプチドは、信頼性の高い定量を確実にするために、切断漏れや修飾を含んではいけません。
注:1つの特定のタンパク質の検証には、調査された条件での存在量の差など、いくつかの理由が考えられます。代表的な結果のために、NMGおよびSNサンプルに同等に豊富に存在することが判明した細胞質ダイニン1重鎖1が選択されており、したがって、等しいサンプル負荷を確保するための基準として使用できます。 - 選択したペプチドを使用して、HPLCソフトウェアを使用してPRMメソッドの最初のバージョンを設定します。クロマトグラフィーとグローバルパラメータの設定はすべてDDAメソッドから保持します。
- スキャンタイプとして MS OT および tMS2 OT HCD を追加します。 MS OT の設定が DDA 方式の設定と同じであることを確認します。PRM メソッドの詳細な設定は、 補足表 1 に記載されています。
- tMS2 OT HCDについては、選択したペプチドをインクルージョンリストとして追加します。したがって、DDA測定で観察されたアミノ酸配列とm/z値を追加します。最初の PRM 実験では、保持時間ウィンドウを追加したり、t start を 0 に設定したり、t stop を 120 に設定したりしないでください (120 分の勾配の場合)。
- Skylineなどの適当なソフトウェアを用いて測定後のPRM法を評価し、包含リストに追加されたペプチドの保持時間を求める。含まれるペプチドについては、MS1スキャンで少なくとも3つのプリカーサーイオン、MS2スキャンで5つのフラグメントイオンについて、質量誤差が低い(±5 ppm)同等のピークが観察できることを確認してください。
- たとえば、 tMS2 OT HCD スキャンの解像度を上げ、包含リストに保持時間枠を追加することで、PRM法を改良します。
注:3分の保持時間ウィンドウは、本実験によく適していることがわかりました(最初のPRM実験で観察された保持時間は1.5分±)。 - 洗練されたPRM法では、適切なソフトウェアを使用して、MS1レベルとMS2レベルの両方でピーク面積に基づいて目的のペプチドおよびタンパク質の定量を実行します。
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Representative Results
NMGおよびSN組織の特異的分離は、このプロトコルの適用を成功させるための最も重要なステップです。ベンダーが提供するLMDソフトウェアの 視野分析 機能を使用すると、NMGを色に応じて自動的に選択できます。したがって、NMGを含む組織領域(図2A)を特定し、色の閾値を調整した視野分析を実行して、NMGを標識する必要があります(図2B)。100μm²未満の領域をカバーする物体をフィルタリングした後は、NMGのみが分離のためにラベル付けされたままになります(図2C)。標識されたNMGの正確な分離は、レーザー設定を調整した後に達成されます(図2D)。NMGの単離後(図2E)、プロテオミクスプロファイルの比較のためにSN組織を50倍の倍率で選択し(図2F)、単離(図2G)することができます。SN組織の場合、 キャップチェック 機能を使用して孤立した物体を視覚化できます(図2H)。NMGとSNの両方のサンプルタイプについて、500,000 μm2 の脳組織の単離がこのプロトコルに十分であり、サンプルあたり最低3回のMSランが可能であることが判明しました。
120分のDDA実験の代表例を 図3 に示します(測定の最後の15分間にメインカラムが洗浄されるため、クロマトグラムは105分の直前にトリミングされます)。適用された方法は、完全なグラジエントにわたってサンプル溶出を可能にし、鋭く簡潔なピークを作成し、全イオン電流(TIC)の強度はすべてのサンプルで同等である必要があります。
提示されたプロトコルを、500,000 μm²のNMGの1つのサンプルと1,000,000 μm²のSN組織の1つのサンプルに適用し、MSサンプルの容量を調整し(NMGの場合は5 μL、SNの場合は2.5 μL)、同一のペプチド負荷を確保した結果、NMGサンプルで1,898のタンパク質グループ(PG)、SNサンプルで1,565のPGが同定されました。さらに比較すると、両方のサンプルで1,384個のPGが同定され、NMGでは514個のPG、SN組織では181個のPGのみが同定されました(図4)。この代表的な実験では、合計2,079のPGが同定されました。以前の研究22 の参照データセットと比較すると、その研究で報告されたPGの87.6%が、現在の改訂および自動化されたプロトコルによっても識別できることが示され、その適用性が証明されました。さらに、識別されたPGの数は1,143改善される可能性があります。
最小限のサンプル量ではウェスタンブロットなどの従来のバリデーション法を適用できないため、PRMなどのターゲット質量分析アプローチによって目的のタンパク質の検証を実現できます。タンパク質細胞質ダイニン1重鎖1のペプチドESPEVLLTLDILKについての代表的な結果を図5に示す。このタンパク質のiBAQ値は、DDA測定においてSNと比較してNMGでわずかに高いことがわかり、MS1-(図5A、B、E)およびMS2レベル(図5C、D、F)のピーク面積に基づくPRM実験によって検証できました。
図1:ニューロメラニン顆粒(NMG)および周辺組織(SN)のプロテオミクス特性評価のワークフロー。 NMGおよびSNサンプルは、レーザーマイクロダイセクション(LMD) を介して 組織スライスから単離されました。タンパク質を単離し、トリプシン溶液中消化を行った。得られたペプチドは、データ依存取得(DDA)モードでLC-MS/MS測定 を介して 分析されました。データ解析は、MaxQuantおよびPerseusソフトウェアを使用して実行されました。選択されたタンパク質の検証は、並行反応モニタリング(PRM)実験を用いて行った。PRMデータはスカイラインソフトウェアを使用して分析されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:NMGおよびSNサンプルの選択とLMDベースの分離。まず、400倍の倍率でさらに染色することなく見えるNMGを含む領域を顕微鏡下に置きます(A)。視野分析を実行した後、NMGおよびその他の暗い領域が選択されます(B)。NMGのみがフィルタリング後(C)に選択されたままになり、レーザー設定の調整後(D)に分離されます。すべてのNMGが単離された後(E)、SN組織を50倍の倍率で選択し(F)、単離する(G)。SNサンプル用に分離されたオブジェクトは非常に大きいため、キャップチェック機能(H)を使用してサンプルコレクションキャップで観察できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:120分間のDDA測定の総イオン電流(TIC)。 クロマトグラムは、0〜~105分の保持時間範囲における溶出ペプチドに対応するイオンの相対存在量を示しています。メインカラムは105分目から120分目の間で洗浄されるため、クロマトグラムは105分目でトリミングされます。最高ピークの強度は2.86 x 108です。ピークより上の数字は、保持時間と、その特定のピークの最も豊富なイオン(BP=ベースピーク)を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:NMGとSN組織で同定されたタンパク質群(PG)の対応を示すベン図。合計で、NMGで1,898個のPG、SN組織で1,565個のPGが同定され、そのうち1,384個のPGが両方の組織領域で同定されました。514個のPGはNMG組織でのみ同定され、181個のPGはSN組織でのみ同定されました。この図は、オンラインツールVenny25を使用して作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ペプチドESPEVLLTLDILK(細胞質ダイニン1重鎖1、++)についてのPRM実験の結果。 NMGおよびSN組織の例示的なサンプルについて、MS1-(A,B)およびMS2レベル(C,D)のクロマトグラム、ならびにMS1-(E)およびMS2レベル(F)のピーク面積を示す。異なる前駆体(MS1レベル)またはプロダクトイオン(MS2レベル)を示すために、異なる色が使用されます。クロマトグラムは、サビツキー-ゴレイ平滑化を実行した後に表示されます。強度とピーク面積は、MS1-(A、B、E)とMS2レベル(C、D、F)で同等でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:質量分析実験のパラメータ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:MaxQuant分析のパラメータ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
LMDは、特定の組織領域、単一細胞、または細胞内構造の単離に広く適用可能な技術です。ここで提示された改訂および自動化されたプロトコルでは、この技術は、神経メラニン顆粒(NMG)およびNMG周辺組織(SN)の特異的単離に適用されます。これまで、人間の 死後 脳組織からNMGを分離するための2つの異なるアプローチが公開され、広く使用されていました。
a)黒質組織20の1gを消費する不連続スクロース勾配。人間の死後黒質組織はまれであり、いくつかの研究課題で高い関心が寄せられているため、残念ながら、患者ごとに大量の組織が必要な場合、大規模なコホート研究を設定することは非常に困難です。したがって、このアプローチは、NMGs26の十分な単離に必要な組織量を0.15gに低減することをさらに改善した。しかし、それでも、完全な黒質化の少なくとも半分が必要でした。
b)LMDを使用したNMGの切除。2016年、Plumらは、LMD を介した NMGの正確な切除に基づく新しいプロトコルを確立しました。このプロトコルを使用すると、必要なサンプル量を10個の10 μm組織切片に減らすことができ、その結果、必要な組織サンプルが150 mgから16.6 mg22に大幅に削減されました。
ここで紹介する最適化および自動化されたLMDベースのプロトコルは、より薄く(10μmと比較して5μm)、より少ない組織切片(8に対して最大7)を使用する必要があり、自動化されたNMG検出の使用により、サンプル生成に必要な時間が短くなるため(サンプルあたり4時間、1〜2日)。したがって、必要なサンプル収集時間が大幅に短縮され、最適化されたLC-MSメソッドと最先端の機器を適用することで、同定されたPGの数を大幅に増やすことができました。このプロトコルは、他の研究課題や組織に簡単に適応させることができます。
ユーザー定義の研究課題に関する提示されたプロトコルの適応のために、経験に基づいて以下の側面が強調されています。
a)同等のサンプル量の単離:このプロトコルの予想されるペプチド収量は、例えば細胞培養物や組織溶解物と比較してかなり低いため、ペプチド濃度の決定が不可能な場合があります。したがって、選択した物体の組織面積に基づいて推定できるLMD を介して 等量の組織を分離することが重要です。現在の設定では、少なくとも3回のMS測定でペプチドを生成するには、500,000 μm²の組織面積で十分です。
b)トリプシン消化:消化時間とトリプシン濃度は、サンプル間で同等である必要があります。
c)異なる組織に対するパラメータの適応:分析する組織に応じて、収集する組織量を調整する必要があり、それによってトリプシンの添加量も調整する必要があります。トリプシンとタンパク質の比率は1:40以上でなければなりません。
d)LMDプロセスの制限:LMDベースの対象オブジェクトの分離では、選択したオブジェクトのサイズとスライスの厚さに関して制限があります。レーザーベースの組織切断中の組織損失により、100μm²未満の物体は分離するには小さすぎると考えられていました。
e)LCおよびMSパラメータの適応:使用するLCおよびMSシステムに応じて、単離された組織の量を増やし(マイクロフローシステムで操作する場合など)、MSパラメーターを調整する必要があります(イオントラップベースの検出器システムを使用する場合など)。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業はdeによってサポートされました。NBI、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(助成金番号FKZ 031 A 534A)およびP.U.R.E.(ヨーロッパ内のタンパク質研究ユニットルール)およびタンパク質診断センター(ProDi)のプロジェクト、どちらもドイツのノルトラインヴェストファーレン州のイノベーション科学研究省からの助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
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