Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Abstract

De mitotische bipolaire kinesine-5 motoren vervullen essentiële functies in de spindeldynamica. Deze motoren vertonen een homo-tetramere structuur met twee paar katalytische motordomeinen, gelegen aan tegenovergestelde uiteinden van het actieve complex. Deze unieke architectuur stelt kinesine-5-motoren in staat om antiparallel spindelmicrotubuli (MT's) te kruisen en uit elkaar te schuiven, waardoor de naar buiten gerichte kracht wordt geleverd die de spindelpolen uit elkaar scheidt. Voorheen werd aangenomen dat kinesine-5-motoren uitsluitend plus-end gericht waren. Recente studies toonden echter aan dat verschillende schimmelkinesisine-5-motoren minus-end gericht zijn op het niveau van één molecuul en onder verschillende experimentele omstandigheden van directionaliteit kunnen veranderen. De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een voorbeeld van een dergelijk bidirectioneel motoreiwit: in omstandigheden met hoge ionische sterkte bewegen enkele moleculen van Cin8 in de minus-eindrichting van de MT's. Er werd ook aangetoond dat Cin8 beweeglijke clusters vormt, voornamelijk aan het min-einde van de MT's, en een dergelijke clustering stelt Cin8 in staat om van directionaliteit te veranderen en langzame, plus-end gerichte motiliteit te ondergaan. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor alle stappen van het werken met GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8, van eiwitoverexpressie in S. cerevisiae-cellen en de zuivering ervan tot in vitro motiliteitstest met één molecuul. Een nieuw ontwikkelde methode die hier wordt beschreven, helpt onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, op basis van hun fluorescentie-intensiteit. Deze methode maakt een afzonderlijke analyse van de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van Cin8-motiliteit van de clustergrootte wordt gekarakteriseerd.

Introduction

Een groot aantal motiliteitsgebeurtenissen in eukaryote cellen worden gemedieerd door de functie van moleculaire motoreiwitten. Deze motoren bewegen langs de cytoskeletale filamenten, actinefilamenten en microtubuli (MT's) en zetten de chemische energie van ATP-hydrolyse om in kinetische en mechanische krachten die nodig zijn om de biologische beweeglijkheid in cellen te stimuleren. De op MT gebaseerde S. cerevisiae Cin8 is een bipolair, homotetrameer kinesine-5 motoreiwit dat spindel-MT's uit elkaar schuift1. Cin8 vervult essentiële functies tijdens mitose, in spindelassemblage 2,3,4 en spilverlenging tijdens anafase 5,6,7. Eerder was aangetoond dat Cin8 een bidirectionele motor is, die directionaliteit schakelt onder verschillende experimentele omstandigheden. Onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte bewegen enkele Cin8-motoren bijvoorbeeld naar het min-uiteinde van de MT's, terwijl cin8-motoren in clusters, in meermotorige MT-glijtests en tussen antiparallel MT's voornamelijk naar de plus-uiteinden van de MT'sbewegen 8,9,10,11,12 . Deze bevindingen waren om verschillende redenen zeer onverwacht. Ten eerste draagt Cin8 zijn katalytische motorische domein op het amino-eindpunt en dergelijke motoren werden eerder verondersteld uitsluitend plus-end gericht te zijn, terwijl Cin8 werd aangetoond dat minus-end gericht was op het niveau van één molecuul. Ten tweede werd aangenomen dat kinesinemotoren unidirectioneel waren, hetzij minus-end of plus-end gericht, terwijl Cin8 bidirectioneel bleek te zijn, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Ten slotte kon, vanwege de MT-oriëntatie op de mitotische spil, de klassieke rol van kinesine-5-motoren in de scheiding van spindelpolen tijdens spindelassemblage en anafase B alleen worden verklaard door hun plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze1,13 crosslinken. Na de eerste rapporten over de bidirectionaliteit van Cin8, werd aangetoond dat een paar andere kinesinemotoren bidirectioneel 14,15,16 zijn, wat aangeeft dat de bidirectionele beweeglijkheid van kinesinemotoren vaker voorkomt dan eerder werd aangenomen.

Eerder is gemeld dat Cin8 in cellen ook op een bidirectionele manier beweegt8, wat het idee ondersteunt dat de bidirectionele beweeglijkheid van sommige kinesine-5-motoren belangrijk is voor hun intracellulaire functies. Bovendien, aangezien de drie kinesine-5-motoren waarvan werd gemeld dat ze bidirectioneel waren, afkomstig zijn van schimmelcellen, is onlangs een mogelijke rol voor de bidirectionaliteit van kinesine-5-motoren voorgesteld in dergelijke cellen10. Volgens dit model, bij gesloten mitose van schimmelcellen, waarbij de nucleaire enveloppe niet afbreekt tijdens mitose, leveren kinesine-5-motoren de initiële kracht die de spindelpolen uit elkaar scheidt voorafgaand aan de spindelassemblage. Om deze taak uit te voeren, voorafgaand aan de scheiding van de spindelpool, lokaliseren kinesine-5-motoren zich in de buurt van de spilpolen, door hun minus-end gerichte motiliteit op enkele nucleaire MT's. Eenmaal op deze positie clusteren kinesine-5-motoren, schakelen ze van directionaliteit, vangen en cross-link MT's van naburige spindelpolen. Vervolgens zorgen kinesine-5-motoren voor de initiële scheiding van de polen door plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze crosslinken. Volgens dit model zijn zowel minus-end gerichte motiliteit op enkele MT's als plus-end gerichte motiliteit op cross-linked MT's tijdens antiparallel glijden vereist voor schimmel kinesine-5 motoren om hun rol te vervullen in spindelassemblage 1,13.

Het algemene doel van de beschreven methode is het verkrijgen van zeer zuivere schimmel GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8 en het uitvoeren van motiliteitstests met één molecuul (figuur 1) terwijl de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 afzonderlijk wordt geanalyseerd. De scheiding tussen afzonderlijke moleculen en clusters is belangrijk omdat een van de factoren waarvan is aangetoond dat ze de directionaliteit van Cin8 beïnvloeden, de accumulatie in clusters op de MT's 10,12 is. Alternatieve beweeglijkheidstests, zoals de MT-oppervlakteglijdende en MT-glijdende assays, geven geen informatie over de activiteit van enkelvoudige motoreiwitten17,18. De robuuste motiliteits- en analysemethoden met één molecuul die hier worden beschreven, zijn met succes toegepast om verschillende aspecten van kinesine-5-motoren, Cin8 en Kip1 10,11,12,14,19,20 te karakteriseren.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor Cin8-overexpressie en -zuivering, polymerisatie van MT's en de motiliteitstest met één molecuul. Verder worden ook de analyses beschreven om onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, en om enkelvoudige motor- en clustersnelheden te bepalen door middel van gemiddelde verplaatsing (MD) en gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD). Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen alle stappen van de procedures te visualiseren en te helpen bij het oplossen van problemen met dit soort testen.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van de motiliteitstest met één molecuul. Gebiotinyleerde fluorescerende MT's zijn bevestigd aan het glazen oppervlak, gecoat met Avidin dat interageert met het aan het oppervlak gehechte biotinylated-BSA. De groene pijl vertegenwoordigt de bewegingsrichting van enkele Cin8-moleculen onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte. +/- de polariteit van het MT vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van buffers en reagentia

  1. Buffers
    1. -Leu aa dropout mix: Meng 2 g elk van Adenine, Uracil, Tryptofaan, Histidine, Lysine en Methionine en bewaar bij kamertemperatuur.
    2. Gistselectief medium met raffinose (1 L): Meng 6,7 g giststikstofbasis (met ammoniumsulfaat), 2 g -Leu aa dropout-mix en 20 g raffinose in dubbel gedestilleerd water door roeren (zonder verhitting) totdat het volledig is opgelost. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm in een steriele fles.
    3. Lysisbuffer: Bereid 25 ml oplossing in drievoudig gedestilleerd water (TDW) bestaande uit 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP en 0,1% Triton X-100. Stel de pH in op 8 met 6 M HCl.
    4. Elutiebuffer: Bereid 10 ml oplossing in TDW bestaande uit 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 350 mM imidazool, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP en 0,1% Triton X-100. Stel de pH in op 7,2 met 6 M HCl.
    5. P12 Buffer: Bereid 10 ml van een oplossing in TDW bestaande uit 12 mM buizen, 1 mM EGTA en 2 mM MgCl2. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    6. BRB80-buffer: Bereid 50 ml van een oplossing bestaande uit 80 mM leidingen, 1 mM EGTA en 2 mM MgCl2 in ultrapuur water. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    7. Algemene tubulinebuffer (GTB): Bereid 50 ml van een oplossing bestaande uit 80 mM pijpen, 0,5 mM EGTA en 2 mM MgCl2 in ultrapuur water. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    8. Tris-Pipes oplossing: Bereid 40 ml 1M Tris-0,6 M Pipes-oplossing voor door 6,055 g Tris en 9,07 g Pipes in TDW te mengen en de pH aan te passen aan 7,2 met behulp van 6 M HCl. Breng het uiteindelijke volume op 50 ml met TDW.
      OPMERKING: P12,BRB80 en Tris-Pipes buffers worden gebruikt voor de bereiding van stamoplossingen voor motiliteitstest. Deze buffers kunnen in grote hoeveelheden worden bereid, aliquoteerd in buizen van 1,5 ml, vastgevroren en bewaard bij -20 °C.
  2. Stockoplossingen voor motiliteitstest
    1. Tubuline (10 mg ml-1): Los 1 mg gelyofiliseerde tubuline op in 100 μL koude (4 °C) algemene tubulinebuffer (GTB). Vries 1 μL aliquots in en bewaar ze bij -80 °C.
    2. Gebiotinyleerde tubuline (1 mg ml-1): Los 20 μg gelyofiliseerde tubuline op in 20 μl koude GTB. Vries 1 μL aliquots in en bewaar ze bij -80 °C.
    3. Rhodamine gelabelde tubuline (1 mg ml-1): Los 20 μg gelyofiliseerde tubuline op in 20 μl koude GTB. Snap-freeze 0,5 μL aliquots en bewaar ze bij -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP wordt verkregen van de leverancier als een 100 μL waterige oplossing en opgeslagen bij -80 °C. Ontdooi de injectieflacon met GMPCPP op ijs. Bereid 1 μL aliquots, vries ze in en bewaar ze bij -80 °C.
    5. ATP: Bereid 500 μL oplossing van 100 mM ATP in 0,5 M Tris buffer (pH 8). 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    6. MgCl2: Bereid 1 ml oplossing van 200 mM MgCl2 in P12 buffer. Bewaar 5 μL aliquots bij -20 °C.
    7. Caseïne: Bereid een 1 ml oplossing van 5 mg ml-1 caseïne in BRB 80 buffer. Vries 10 μL aliquots in en bewaar ze bij -20 °C.
    8. D-Glucose: Bereid een 1 ml oplossing van 1 M D-glucose in P12 buffer. Bewaar 10 μL aliquots bij -20 °C.
    9. Glucoseoxidase: Bereid een 1 ml oplossing van 10 mg ml-1 glucoseoxidase in P12-buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    10. Catalase: Bereid een 1 ml oplossing van 0,8 mg ml-1 catalase in P12-buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Bereid een 1 ml oplossing van 1 M DTT in P12-buffer in een zuurkast. Vries 10 μL aliquots in en bewaar ze bij -20 °C.
    12. Creatinefosfaat: Bereid een 1 ml oplossing van 1 M creatinefosfaat in P12 buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    13. Creatinefosfokinase: Bereid een 1 ml oplossing van 5 mg ml-1 creatinefosfokinase in 0,25 M glycylglycine, pH 7,4. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    14. EGTA: Bereid een EGTA-oplossing van 100 mM in ultrapuur water en bewaar deze bij kamertemperatuur.
    15. KCl: Bereid een 1 M KCl-oplossing in ultrapuur water en bewaar deze bij kamertemperatuur.
  3. Motiliteitsbuffer en reactiemix
    1. Motiliteitsbuffer (MB) met 145 mM KCl, 2x bouillon: Bereid 1 ml 2x bouillon van de beweeglijkheidsbuffer door 100 μL voorgefabriceerde Tris-Pipes-oplossing, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl en 590 μL TDW te mengen. Houd de buffer op ijs.
    2. Motiliteitsreactiemix: Bereid een motiliteitsreactiemix volgens tabel 1 en bewaar deze op ijs.
Volume Voorraad Naam reagens
50 μL 2x MB (vanaf stap 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μl 100m ATP
1 μl 200m MgCl2
2 μl 5mg/ml Caseïne
1 μl 1 miljoen Glucose
1 μl 1 miljoen DTT
1 μl 10mg/ml Glucoseoxidase
1 μl 8mg/ml Katalase
1 μl 1 miljoen Fosfocreatine
1 μl 5mg/ml Creatinefosfokinase
100 μL Totaal

Tabel 1.

2. Cin8 overexpressie en zuivering van S. cerevisiae cellen

  1. Kweek S. cerevisiae-cellen die het plasmide bevatten voor overexpressie van Cin8-GFP-6His tot de exponentiële groeifase (OD600 = 0,6-0,8) in 1 L gistselectief medium aangevuld met 2% raffinose (zie stap 1.1.2) bij 28 °C12.
  2. Induceer Cin8-GFP-6His overexpressie door toevoeging van 2% galactose. Monitor de groei van de gistcultuur door de absorptie bij 600 nm te meten.
  3. Oogst vijf uur na galactosetoevoeging de cellen door centrifugering bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C, suspensie de cellen in de lysisbuffer en vries in vloeistof N2.
    OPMERKING: Bevroren cellen kunnen worden bewaard bij -80 °C voor verder gebruik of onmiddellijk worden gemalen in vloeistof N2.
  4. Maal de bevroren cellen in vloeibare N2 met gekoelde vijzel en stamper. Voeg vloeistof N2 toe tijdens het malen om de extracten bevroren te houden. Het vereist meestal 4-5 keer het toevoegen van vloeistof N2.
  5. Monitor cellysis door observatie onder fasecontrast of DIC-microscoop.
  6. Ontdooi de gemalen cellen en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Laad het supernatant op een zwaartekrachtstroomkolom gevuld met 2 ml Ni-NTA en vooraf gebalanceerd met lysisbuffer. Laat het bovennatuurlijk door de kolom naar buiten stromen.
  7. Was de kolom met vijf kolomvolumes lysisbuffer en vervolgens met vijf kolomvolumes lysisbuffer aangevuld met 25 mM imidazool.
  8. Elute Cin8-GFP-6His met elutiebuffer (zie stap 1.1.4).
  9. Analyseer de geëlueerde monsters door SDS-PAGE fractionering, gevolgd door Coomassie blue staining en western blot analyse gesondeerd met α-GFP antilichaam19.
  10. Pool de fracties die Cin8-GFP-6His bevatten (stappen 2.8 en 2.9). Zuiver ze bovendien door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) bij een debiet van 0,5 ml min-1 en kolomdruklimiet van 1,5 MPa, met gelijktijdige bewaking van de absorptie bij 280 nm en de GFP-florescentie-emissie met excitatie bij 488 nm (figuur 2A).
  11. Verzamel de fracties die overeenkomen met het Cin8-GFP-tetrameer en analyseer ze met SDS-PAGE en western blotting (zie stap 2.9) (figuur 2B).
  12. Schat de eiwitconcentratie met behulp van spectrofotometrie of biochemische assays zoals Bradford assay, BCA assay etc.
  13. Vul de geselecteerde fracties toe, vries deze in vloeistof N2 in en bewaar tot gebruik bij -80 °C. Deze gezuiverde eiwitmonsters kunnen gedurende 6 maanden worden gebruikt.
    OPMERKING: Cin8-GFP wordt overexpressie gegeven en gezuiverd van een protease-deficiënte S. cerevisiae-stam die een plasmide van 2 μm bevat voor Cin8-GFP-6His overexpressie van de galactose-induceerbare promotor, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). De giststam en plasmide zijn op aanvraag beschikbaar.

Figure 2
Figuur 2: Zuivering van Cin8-GFP. (A) Het grootte-uitsluitingschromatogram van Ni-NTA gezuiverde Cin8-GFP, met continue GFP-fluorescentiedetectie door 488 nm excitatie en emissie bij ~ 510 nm. Het Cin8-GFP-tetrameer elueert bij ~ 10 ml van de SEC-kolom (gemarkeerd met een pijl). (B) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel (boven) en α-GFP western blot (onder) van Cin8-GFP-fracties geëlueerd uit SEC. Monsters in de rijstroken zijn als volgt: M - Moleculaire gewichtsmarker, Ni2 +- Ni-NTA gezuiverd Cin8-GFP-monster dat in de SEC-kolom wordt geladen, GF-fracties: fractie die overeenkomt met Cin8-GFP SEC-elutie zoals gemarkeerd in paneel A. De pijl rechts geeft de grootte van het Cin8-GFP monomeer aan (verwacht op de SDS-PAGE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Single-molecule motiliteitstest met de gezuiverde Cin8

  1. Polymerisatie van biotine en rhodamine gelabelde MT's, gestabiliseerd met GMPCPP.
    1. Start MT-polymerisatie door de volgende componenten in een buis van 1,5 ml te mengen: 1 μl tubuline-eiwit van 10 mg/ml, 1 μl 1 mg/ml gebiotinyleerde tubuline, 0,5 μl 1 mg/ml tubuline met rhodaminelabel, 1 μl 10 mM GMPCPP en 6,5 μl algemene tubulinebuffer (GTB). Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Voeg na MT-polymerisatie 80 μL warme (37 °C) GTB toe, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.500 x g .
    3. Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw door op en neer te pipetteren met 50 μL warme GTB. Bewaar de suspensie bij 28 °C.
    4. Onderzoek de MT's met een fluorescentiemicroscoop met behulp van het 647 nm rhodaminekanaal (figuur 3A).
      OPMERKING: Om gebiotinyleerde fluorescerend gelabelde MT's te verkrijgen, bevat de polymerisatiereactie niet-gelabelde tubuline, evenals gebiotinyleerde en fluorescerend gelabelde tubuline. In dit protocol wordt rhodamine-gelabelde tubuline gebruikt, maar andere fluorescerende conjugaten kunnen ook worden gebruikt.
  2. Flow Chamber assemblage
    1. Monteer een stromingskamer door vier stroken dubbelzijdige tape (~4 cm x ~3 mm) op een geavanceerde zelfklevende glasplaat (evenwijdig aan de langere rand en ~3-4 mm uit elkaar) te plaatsen om drie 'lanes' tussen de tapestroken te creëren. Verwijder het beschermende papier van tapestroken en plaats een silanized coverslip10 op de tapestrips om drie stroomkamers van ~ 10 μL in volume te creëren.
  3. MT-immobilisatie naar het met avidine bedekte oppervlak (figuur 1)
    1. Bestrijk de gesilaniseerde coverslip door met een micropipette met 15 μL 1 mg/ml gebiotinyleerd-runderserumalbumine (b-BSA, opgelost in GTB) in de stroomkamer te perfuseren. Was de kamer na 5 minuten met 80 μL GTB.
    2. Breng vervolgens, net als in stap 3.3.1, 15 μL avidine (opgelost in GTB) in de stroomkamer in die aan het b-BSA bindt. Was de kamer na 5 minuten met 80 μL GTB.
    3. Passiveer het gesilaniseerde afdekvlak met 20 μL 1% poloxameer. Na 3 min, wassen met 80 μL GTB.
    4. Bevestig gebiotinyleerde MT's (stap 3.1) aan de met b-BSA-avidine gecoate coverslip door 20 μL MT's in te brengen die doorgaans verdund zijn tot 1:20 in GTB. Incubeer de dia's in een omgekeerde positie, d.w.z. met de afdekplaat naar beneden gericht in een donkere vochtigheidskamer (bijvoorbeeld een petrischaal met nat tissuepapier) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens met 200 μL GTB.
    5. Breng 30 μL motiliteitsreactiemix (zie stap 1.3.2) aan in de stroomkamer.
    6. Verdun de Cin8-GFP-motoren (stap 2.13) in 20 μL motiliteitsreactiemix (zie tabel 1) (meestal tot een eindconcentratie van 5-10 μM). Breng ze aan op de stroomkamer en breng onmiddellijk de beweging van de motoren langs de MT's in beeld.
  4. Beeldvorming van motormotiliteit
    OPMERKING: MT-binding en de beweeglijkheid van motoren werden gecontroleerd met behulp van een epifluorescentie-omgekeerde microscoop uitgerust met een kwikbooglamp, een numeriek diafragmaobjectief van 100x /1,4 en twee fluorescentiebandpassfiltersets, één met een golflengte van 647 nm (voor rhodamine) en een andere met een golflengte van 488 nm (voor GFP).
    1. Plaats een druppel onderdompelingsolie op het microscoopobjectief. Plaats de stroomkamer op de fluorescentiemicroscooptrap met de afdekking naar beneden gericht op het objectief.
    2. Schakel het rhodaminekanaal in om scherp te stellen op de MT's die aan het oppervlak van de coverslip zijn bevestigd en verkrijg het beeld met een belichting van 20 ms met behulp van de Micro-Manager ImageJ-Fiji-software21.
    3. Schakel het GFP-kanaal in en verkrijg 90 time-lapse-beelden met een interval van 1 s en een belichting van 800 ms voor het analyseren van de Cin8-GFP-beweeglijkheid.

Figure 3
Figuur 3: MT's en MT-gebonden Cin8-GFP. (A) Afbeeldingen uit twee velden (links en rechts) voor MT's gepolymeriseerd volgens het protocol beschreven in stap 3.1 en afgebeeld met 100x objectief zoals beschreven in stap 3.4. (B) Afbeeldingen uit twee velden (links en rechts) voor de Cin8-GFP (onderste panelen, gemarkeerd met pijlen) bevestigd aan de MT die in de bovenste panelen wordt weergegeven. Schaalbalk: 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Motiliteitsanalyse

OPMERKING: Voer alle beeldanalyses uit en genereer kymografen met behulp van ImageJ-Fiji Software.

  1. Kymograaf generatie
    1. Open de timelapse-film en de bijbehorende MT-veldafbeelding. Synchroniseer deze twee vensters door de volgende optie te kiezen: >-hulpprogramma's analyseren > Windows synchroniseren.
    2. Markeer één MT met de optie Gesegmenteerde lijn en gebruik het tabblad Analyseren > Multi-kymograaf om een kymograaf te verkrijgen.
  2. Bepaling van de clustergrootte van Cin8-GFP (d.w.z. het aantal Cin8-moleculen in een cluster)
    1. Voer de achtergrondaftrek en de correctie voor ongelijke verlichting uit met de optie Achtergrond aftrekken > proces. Stel de rolling ball radius in op 100 pixels en vink de optie Glijdende paraboloïde aan .
    2. Volg de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een specifieke niet-beweeglijke Cin8-GFP-motor (figuur 3B) als functie van de tijd binnen een cirkel van 4 pixels radius met behulp van de TrackMate-plug-in van de ImageJ-Fiji-software door de volgende optie te kiezen: Plug-ins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Herhaal stap 4.2.2 voor verschillende Cin8-GFP-motoren. Zet de fluorescentie-intensiteit van de verschillende Cin8-GFP-motoren uit als functie van de tijd.
      OPMERKING: Een experimentele strategie om de clustergrootte te meten - d.w.z. het aantal Cin8-moleculen in een cluster - vormt een basis voor de analyse van Cin8-clusteringgerelateerde beweeglijkheid. Photobleaching van GFP bevestigd aan Cin8 wordt gebruikt om de bijdrage van enkele GFP-moleculen aan de totale intensiteit van Cin8-clusters te bepalen. De fluorescentie-intensiteiten nemen bijvoorbeeld af in stappen van ~ 50 willekeurige eenheden (a.u.), waarbij elke stap waarschijnlijk de fotobleaching van één GFP-molecuul vertegenwoordigt (figuur 4A). Omdat Cin8 een homo-tetrameer motoreiwit is, bevat het vier GFP-moleculen. Alle Cin8-motoren met een intensiteit ≤ 200 a.u. zijn dus waarschijnlijk enkele tetramere Cin8-moleculen. Volgens deze methode worden intensiteitsbereiken van Cin8-motorfluorescentie toegewezen als <200, 200-400 en >400 voor afzonderlijke Cin8-moleculen, paren Cin8-moleculen (dimeer van Cin8-tetrameer) en Cin8-oligomeren, respectievelijk12.
  3. Intensiteitsverdelingsanalyse voor Cin8-GFP-motoren
    1. Meet de gemiddelde florescence-intensiteit van alle fluorescerende Cin8-GFP-motoren in het eerste frame van de time-lapse-reeks met behulp van de TrackMate-plug-in in ImageJ-Fiji zoals beschreven in stap 4.2.2.
    2. Plot een histogram van de gemiddelde intensiteiten van Cin8-GFP met een bakgrootte van 20 a.u. en pas de belangrijkste piek van het histogram aan op een Gaussiaanse curve (figuur 4B).
      OPMERKING: De intensiteitsverdelingsanalyse vormt een aanvulling op de bepaling van de clustergrootte voor Cin8-GFP-motoren uit de fotobleachingexperimenten. De Gaussiaanse curve paste bij het intensiteitsverdelingshistogram voor de Cin8-GFP-populatie piekt op ~ 125 a.u., wat consistent is met de gemiddelde intensiteit van enkele tetramere Cin8-moleculen die één, twee, drie of vier fluorescerende (niet-gebleekte) GFP-moleculen bevatten, waarbij elk fluorescerend GFP-molecuul ~ 50 a.u. bijdraagt. Met behulp van deze intensiteitsverdelingsmethode kan dus ook de bijdrage van één GFP-molecuul worden berekend, die verder kan worden gebruikt om de clustergrootte van Cin8-GFP-moleculen toe te wijzen.

Figure 4
Figuur 4: Cin8-GFP bleekprofiel en intensiteitsverdeling. (A) Fotobleaching van GFP in vier verschillende Cin8-GFP motoren. Enkele fotobleachingstappen, die elk waarschijnlijk de fotobleaching van één GFP vertegenwoordigen, leiden tot een daling van de fluorescentie-intensiteit van ~ 50 a.u. (B) De intensiteitsverdeling van Cin8-GFP-motoren in het eerste frame van een time-lapse-reeks (inzet). De Gaussische piek (blauw) gecentreerd op ~125 a.u vertegenwoordigt enkele Cin8-GFP-moleculen. Deze piek vertoont de gemiddelde intensiteit van enkele Cin8-tetrameren met één, twee, drie of vier fluorescerende GFP-moleculen, waarbij elk GFP-molecuul ~ 50 a.u. bijdraagt aan de totale intensiteit (d.w.z. (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Het volgen van de beweeglijkheid van de Cin8-GFP-moleculen langs de MT-sporen
    1. Snijd de MT die moet worden geanalyseerd bij in de time-lapse-reeks van opgenomen frames door deze te markeren met het gereedschap Rechthoek en vervolgens Afbeelding > bijsnijden te kiezen.
    2. Kies een fluorescerend Cin8-GFP-deeltje voor de analyse. Noteer de deeltjescoördinaten in elk frame (tijdspunt) van de timelapse-reeks met de opties Point Tool en Measure . Voer een vergelijkbare registratie uit van coördinaten voor andere fluorescerende deeltjes in de time-lapse-reeks.
    3. Wijs clustergrootte toe aan alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes in het eerste frame van hun verschijning, zoals beschreven in stap 4.2.
  2. Gemiddelde verplaatsing (MD) en gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) analyses
    1. Bereken uit de coördinaten van Cin8-GFP-bewegingen bepaald in stap 4.4 de verplaatsingen van Cin8-GFP op elk tijdstip ten opzichte van de begincoördinaten, met behulp van de vergelijking voor de berekening van de afstand tussen twee punten met gegeven coördinaten:
      Equation 1
      waarbij dt de verplaatsingen van Cin8-GFP is op het moment t, xt en yt de respectievelijke coördinaten zijn op tijdstip t. x0 en y0 zijn de respectievelijke coördinaten van Cin8-GFP bij t = 0.
    2. Bereken op basis van deze verplaatsingswaarden de verplaatsing voor alle mogelijke tijdsintervallen voor een specifiek Cin8-GFP-deeltje. Herhaal de procedure voor alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes.
    3. Plot de gemiddelde verplaatsing (MD) van alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes versus tijdsinterval en afhankelijk van een lineaire fit, MD = v x t + c. De helling van deze fit (v) vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid van beweeglijke Cin8-GFP-deeltjes.
      OPMERKING: Op deze manier kan de gemiddelde snelheid van alle Cin8-GFP-moleculen die tot elke clustergrootte behoren, afzonderlijk worden berekend, waarbij de beweeglijkheid van verschillende clustergroottes wordt gekarakteriseerd. Naast de MD-analyse kan ook de gemiddelde kwadraatverplaatsingsanalyse (MSD) worden uitgevoerd door de verplaatsingswaarden berekend in stap 4.5.1 en 4.5.2 te kwadrateren. MSD-waarden worden uitgezet versus tijdsinterval en aangepast aan de polynomiale curve MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, wat de extra parameter D oplevert, wat de diffusiecoëfficiënt van Cin8-GFP-beweging is. MD-analyse moet worden uitgevoerd op polariteit gemarkeerd met MT's 8,10, terwijl voor de MSD-analyse kennis van de MT-polariteit niet nodig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het experiment heeft tot doel de beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele MT's te onderzoeken. Representatieve beweeglijkheid van Cin8-GFP blijkt ook uit de kymografen in figuur 5A, waar de ruimtelijke positie van de motor in de loop van de tijd wordt getoond.

Voor de analyse van de beweeglijke eigenschappen van Cin8-GFP wordt eerst de clustergrootte toegewezen (stap 4.3) aan elk MT-bevestigd beweeglijk Cin8-GFP-deeltje, en vervolgens wordt de positie van de onderzochte Cin8-deeltjes gevolgd als functie van de tijd (stap 4.4). Voor elke clustergroottecategorie werden >40 trajecten van individuele Cin8-GFP uit de opnames geëxtraheerd (figuur 5B). Met behulp van de coördinaten verkregen uit trackinganalyse, MD- en MSD-analyse wordt uitgevoerd voor elke clustergroottepopulatie afzonderlijk. De snelheden worden verkregen uit lineaire fits naar MD zoals weergegeven in figuur 5C. Het bleek dat enkele Cin8-GFP-moleculen op een unidirectionele, minus-end gerichte manier met hoge snelheid bewegen, terwijl de Cin8-clusters een aanzienlijk lagere snelheid vertonen met een hogere neiging tot bidirectionele motiliteit (figuur 5B, C).

Figure 5
Figuur 5: Cin8-GFP beweeglijkheid. (A) Kymografen die de beweeglijkheid van Cin8-GFP-motoren op MT's vertegenwoordigen. X- en Y-as vertegenwoordigen respectievelijk MT-rooster en tijd. Gele pijlen markeren de snelle beweeglijkheid van enkele Cin8-GFP-deeltjes in de richting van het min-uiteinde van de MT, terwijl blauwe pijlen de langzame beweeglijkheid van Cin8-clusters in de plus-end richting van de MT markeren. De polariteit van de MT's wordt aangegeven aan de onderkant van elke kymograaf (+/-). Horizontale balk: 4 μm, verticale balk: 20 s. (B) Verplaatsingssporen van enkele motoren (links) en clusters (rechts) van Cin8-GFP-motoren. De verplaatsingssporen werden uitgezet met behulp van de coördinaten die werden verkregen na het volgen van de individuele Cin8-GFP-motoren zoals uitgelegd in stap 4.4. Negatieve en positieve waarden van verplaatsing duiden op beweging in respectievelijk de min-end en plus-end richting van de MT. Merk op dat onder dezelfde test de beweeglijkheid van Cin8-clusters langzamer en bidirectioneel is in vergelijking met de afzonderlijke moleculen van Cin8. (C) Plots van gemiddelde verplaatsing (MD) ± SEM, van afzonderlijke moleculen (links) en clusters (rechts) van Cin8-motoren als functie van het tijdsinterval. Zwarte lijnen vertegenwoordigen lineaire passen van de plot (MD = v xt + c, waarbij v de gemiddelde snelheid is, t het tijdsinterval en c het onderschepping). Uit de fitting blijkt dat de gemiddelde snelheid voor enkele motoren en clusters van Cin8 respectievelijk -265 ± 20 nm/s en -48 ± 5 nm/s is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk wordt een protocol voor single-molecule motiliteitstest met de bidirectionele kinesine-5 Cin8 en de motiliteitsanalyse gepresenteerd. De full-length Cin818 inclusief het native nuclear localization signal (NLS) op de C-terminal is gezuiverd van de native host S. cerevisiae. Omdat de Cin8 een nucleair motoreiwit is, blijkt het malen van de S. cerevisiae-cellen onder vloeibare stikstof de meest efficiënte methode voor cellysis te zijn. Na lysis, door metaalaffiniteit en grootte-uitsluitingschromatografie te combineren, wordt zeer zuivere Cin8 verkregen, wat belangrijk is voor de motiliteitstests met één molecuul. Eerder is gemeld dat er verschillen zijn tussen beweeglijke eigenschappen van Cin8 in ruwe extracten en gezuiverde monsters8. Daarnaast is ook gemeld dat MT-verdringing met motorische en niet-motorische eiwitten de directionaliteit van bidirectionele kinesine-5 Cut722 beïnvloedt. Een hoge zuiverheid van de motor is dus vereist voor betrouwbare motiliteitsanalyse en conclusies met betrekking tot wild-type en mutant motorisch gedrag. De hier beschreven technieken kunnen eenvoudig worden aangepast om andere nucleaire eiwitten uit de gist te zuiveren met de juiste bufferaanpassingen.

Hier wordt een zeer robuuste en gevoelige motiliteitstest met één molecuul beschreven met GFP-gelabelde Cin8. Het succes van deze test is sterk afhankelijk van de juiste MT-polymerisatie en immobilisatie naar het oppervlak. De sterke avidine-biotine interactie wordt gebruikt om de MT's te immobiliseren aan het hydrofobe glazen oppervlak, dat de MT's onomkeerbaar hecht. Op deze geïmmobiliseerde MT's met GFP-label Cin8 kan de Cin8-beweeglijkheid betrouwbaar worden gevolgd 11,12,19.

Cin8 zou clusters vormen die meer dan één tetramere motor10,12 bevatten, waarbij de beweeglijkheid van deze clusters verschilt van die van enkele Cin8-moleculen. Om cin8-beweeglijkheid nauwkeurig te karakteriseren als een functie van zijn grootte, is een op fluorescentie-intensiteit gebaseerde methode ontwikkeld om de clustergrootte van elk Cin8-deeltje12 te identificeren. Op basis van deze groottecategorisatie wordt de beweeglijkheid afzonderlijk geanalyseerd in elke groottecategorie. Na deze op grootte gebaseerde analyse worden inzichtelijke details verstrekt, die kunnen worden gebruikt om het verschillende gedrag van oligomeren van hetzelfde molecuul te begrijpen 11,12,19. De hier beschreven procedure voor het bepalen van de clustergrootte kan worden toegepast om de grootte van een verscheidenheid aan fluorescerend gelabelde moleculen te bepalen. Bij het uitvoeren van de op fluorescentie gebaseerde groottebepaling, moet men voorzichtig zijn om de clustergrootte van Cin8-GFP-deeltjes te bepalen bij het eerste uiterlijk om de impact van bleken te voorkomen, omdat de grote clusters na fotobleaching als kleinere kunnen verschijnen.

De motiliteitskarakterisering wordt uitgevoerd door de MD- en/of MSD-analyses. Als het van belang is om alleen de motorsnelheid te bepalen, is MD-analyse voldoende. Als de motormotiliteit echter zowel actieve als passieve componenten bevat en bepaling van de diffusiecoëfficiënt ook vereist is, moet een MSD-analyse worden uitgevoerd 20,23,24,25. Voor zowel MD- als MSD-analyses moeten de coördinaten van de motor voor elk tijdstip worden bepaald. Voor een efficiënte tracking is het belangrijk om de motorconcentratie optimaal te houden. De MT's moeten niet te vol zitten met motoren; idealiter zouden er 3-4 Cin8-GFP motoren/deeltjes tegelijk moeten zijn op een MT van ~10 μm. Geautomatiseerde tools zoals de "KymoButler" of "TrackMate" plugin in ImageJ-Fiji kunnen ook worden gebruikt om de beweeglijke motorente volgen 26,27. Deze geautomatiseerde tools besparen tijd en werk, maar ze hebben een paar beperkingen. Als de beweeglijkheid van sommige deeltjes bijvoorbeeld erg traag is, kunnen deze hulpmiddelen ze lezen als niet-beweeglijke deeltjes. Bovendien hebben deze tools grenzen in het herkennen van moleculen met een lage intensiteit. Daarom kunnen ze een hoge intensiteitsbias vertonen. Aan de andere kant is handmatige tracking (hoewel tijdrovend) minder gevoelig voor trackingfouten.

Samenvattend verklaart dit protocol, uitgaande van de zuivering van Cin8 overexpressie in S. cerevisiae, uitgebreid de single-molecule motiliteitstest en de daaropvolgende motiliteitsanalyse van deze bidirectionele kinesine-5. Dit protocol kan gemakkelijk worden gevolgd om de beweeglijkheid van motoreiwitten zoals Cin8 te zuiveren en te karakteriseren. Bovendien kunnen de verschillende delen van het protocol worden aangepast om eiwitten uit gist te zuiveren of motiliteitstests met één molecuul te ontwikkelen voor verschillende motoreiwitten en hun motiliteitskarakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Israel Science Foundation-beurs (ISF-386/18) en de Israel Binational Science Foundation-beurs (BSF-2019008), toegekend aan L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

Biochemie kinesine Cin8 single-molecule motiliteit microtubule bi-directionele motiliteit

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit <em>S. cerevisiae-cellen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter