Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Brug af et cyklisk ionmobilitetsspektrometer til tandemionmobilitetseksperimenter

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

Ionmobilitetsspektrometri (IMS) er et interessant supplement til massespektrometri til karakterisering af biomolekyler, især fordi det er følsomt over for isomerisme. Denne protokol beskriver et tandem IMS (IMS / IMS) eksperiment, som tillader isolering af et molekyle og generering af mobilitetsprofilerne for dets fragmenter.

Abstract

Nøjagtig karakterisering af kemiske strukturer er vigtig for at forstå deres underliggende biologiske mekanismer og funktionelle egenskaber. Massespektrometri (MS) er et populært værktøj, men er ikke altid tilstrækkeligt til helt at afsløre alle strukturelle træk. For eksempel, selvom kulhydrater er biologisk relevante, er deres karakterisering kompliceret af adskillige niveauer af isomerisme. Ionmobilitetsspektrometri (IMS) er et interessant supplement, fordi det er følsomt over for ionkonformationer og dermed isomerisme.

Desuden har de seneste fremskridt forbedret teknikken betydeligt: Den sidste generation af cykliske IMS-instrumenter tilbyder yderligere kapaciteter sammenlignet med lineære IMS-instrumenter, såsom en øget opløsningskraft eller muligheden for at udføre tandemionmobilitetseksperimenter (IMS/IMS). Under IMS/ IMS vælges en ion baseret på dens ionmobilitet, fragmenteres og genanalyseres for at opnå ionmobilitetsoplysninger om dens fragmenter. Nyligt arbejde viste, at mobilitetsprofilerne for fragmenterne i sådanne IMS/IMS-data kan fungere som et fingeraftryk af en bestemt glycan og kan bruges i en molekylær netværksstrategi til at organisere glykomiske datasæt på en strukturelt relevant måde.

Målet med denne protokol er således at beskrive, hvordan man genererer IMS/IMS-data, fra prøveforberedelse til den endelige Collision Cross Section (CCS) kalibrering af ionmobilitetsdimensionen, der giver reproducerbare spektre. Med et eksempel på en repræsentativ glycan vil denne protokol vise, hvordan man opbygger en IMS/IMS-kontrolsekvens på et cyklisk IMS-instrument, hvordan man tager højde for denne kontrolsekvens for at oversætte IMS-ankomsttiden til driftstid (dvs. den effektive separationstid, der anvendes på ionerne), og hvordan man udtrækker de relevante mobilitetsoplysninger fra rådatane. Denne protokol er designet til klart at forklare de kritiske punkter i et IMS / IMS-eksperiment og dermed hjælpe nye cykliske IMS-brugere med at udføre ligetil og reproducerbare erhvervelser.

Introduction

Den komplette kemiske karakterisering af biomolekyler er nøglen til at forstå deres underliggende biologiske og funktionelle egenskaber. Til dette formål har "omics" -videnskaber udviklet sig i de senere år med det formål at karakterisere kemiske strukturer i stor skala ved biologiske koncentrationer. Inden for proteomik og metabolomik er MS blevet et centralt redskab til at optrævle den strukturelle heterogenitet, der findes i biologiske medier - især takket være dets følsomhed og evne til at tilvejebringe strukturel information gennem tandem MS (MS / MS). I MS / MS-strategier vælges en ion i henhold til dens masse, derefter fragmenteres, og til sidst erhverves masserne af dets fragmenter for at etablere et fingeraftryk af molekylet. MS/MS-spektre kan navnlig anvendes til at matche spektrale databaser1,2 eller foreløbigt rekonstruere de overordnede strukturer3,4. Under antagelse af, at lignende spektre tilhører lignende forbindelser, kan MS/MS-data også bruges til at opbygge molekylære netværk (MN'er), der forbinder beslægtede arter gennem en lighedsscore5,6.

På grund af MS's iboende egenskab til at detektere masse-til-ladningsforholdet (m/z) af ioner, er teknikken imidlertid blind for en række strukturelle træk, der falder inden for (stereo)isomerismens rækkevidde. For eksempel er kulhydrater lavet af flere monosaccharidunderenheder, hvoraf mange er stereoisomerer eller endda epimerer (f.eks. Glc vs. Gal eller Glc vs. Man). Disse underenheder er forbundet med glykosidbindinger, som kan variere ved placeringen af bindingen (regioisomerisme) og den steriske konfiguration af det anomere carbon (anomerisme). Disse egenskaber gør det vanskeligt for enkeltstående MS at skelne mellem kulhydratisomerer7, og kun regioisomerisme kan behandles ved hjælp af højenergiaktiveringsmetoder8,9,10. Selvom derivatisering er en mulighed for at forstyrre ækvivalensen af stereoisomere grupper11, kræver det omfattende prøveforberedelse. En anden, mere ligetil mulighed er at koble MS med en analytisk dimension, der er følsom over for isomerisme, såsom IMS.

Fordi denne protokol er designet til brugere, der allerede er bekendt med de grundlæggende begreber i IMS, og fordi detaljerede gennemgange er tilgængelige andre steder12,13, gives der kun et kort overblik over principperne for IMS her. IMS er en gasfaseseparationsmetode, der er afhængig af interaktionen mellem ioner med en buffergas og et elektrisk felt, hvilket i sidste ende adskiller ioner i henhold til deres gasfasekonformationer. Forskellige principper for IMS koblet til MS kan findes på kommercielle instrumenter: nogle opererer ved vekslende høje og lave elektriske felter (felt asymmetrisk IMS, FAIMS), mens de fleste opererer inden for den lave feltgrænse - især drivrør IMS (DTIMS, lineært faldende elektrisk felt), rejsebølge IMS (TWIMS, symmetriske potentialebølger) og fanget IMS (TIMS, høj strøm af buffergasfangningsioner mod elektriske felter)13 . Lavfeltsmetoderne giver adgang til en såkaldt CCS, en egenskab ved iongasparret, der repræsenterer overfladen (i Å2 eller nm2) af den ion, der interagerer med buffergassen under adskillelsen. CCS er teoretisk instrumentuafhængig og er derfor nyttig til at generere data, der kan reproduceres mellem forskellige laboratorier14. Ionmobilitetsseparationer kan påvirkes af forskellige parametre og især af udsving i gastrykket og gastemperaturen i mobilitetscellen. CCS-kalibreringen er en måde at afhjælpe dette på, da både kalibreren og arten af interesse vil blive påvirket på samme måde13. Det er dog obligatorisk at installere instrumentet i et temperaturstyret rum og have et pålideligt gastrykstyringssystem.

En interessant udvikling af IMS er IMS/IMS, som først blev introduceret i 2006 af Clemmers gruppe som en analog til MS/MS15,16. I IMS/IMS isoleres en ion af interesse selektivt baseret på dens ionmobilitet; den aktiveres derefter (indtil mulig fragmentering), og der udføres en ny IMS-analyse af den eller de aktiverede ion-fragmenter. I det første instrumentelle design blev to IMS-celler sat i serie, adskilt af en iontragt, hvor aktiveringen stod. Siden da, selv om der blev foreslået en række IMS/IMS-opsætninger (for en gennemgang, se Eldrid og Thalassinos17), blev det første kommercielle massespektrometer med IMS/IMS-kapacitet først tilgængeligt i 201918. Dette instrument forbedrede det oprindelige koncept væsentligt ved at kombinere det med et andet teknologisk gennembrud: et cyklisk design af IMS-cellen.

Den cykliske IMS-celle gør det teoretisk muligt at øge drivvejslængden og dermed instrumentets opløsningsevne næsten uendeligt19. Dette blev opnået ved hjælp af en bestemt instrumentgeometri, hvor den cykliske TWIMS-celle placeres ortogonalt til den optiske hovedionakse. Et multifunktionsarrayområde ved indgangen til IMS-cellen gør det muligt at styre ionbanens retning: (i) sende ioner sidelæns til IMS-separation, (ii) fremad til MS-detektion eller (iii) bagud fra IMS-cellen, der skal opbevares i en præarray-celle. Fra denne præarray-lagercelle kan ionerne aktiveres, og fragmenterne geninjiceres i IMS-cellen til måling af ionmobilitet, en tilgang, der med succes er blevet brugt til at karakterisere stereoisomerer20. I sidste ende indeholder de indsamlede data ionmobilitet og m/z-oplysninger om prækursoren og dens fragmenter.

I en nylig publikation, der brugte dette cykliske design til glycananalyser (Ollivier et al.21), viste vi, at mobilitetsprofilen for fragmenterne indeholdt i sådanne IMS/IMS-data fungerer som et fingeraftryk af et biomolekyle, der kan bruges i en molekylær netværksstrategi. Det resulterende netværk, kaldet IM-MN, førte til organisering af glycomics datasæt på en strukturelt relevant måde, mens netværket bygget udelukkende fra MS / MS data (MS-MN) afslørede lidt information. For at supplere denne publikation og hjælpe cykliske IMS-brugere med at implementere denne arbejdsgang giver denne protokol en komplet beskrivelse af den protokol, der bruges til at indsamle dataene. Denne protokol fokuserer kun på generering af IMS/IMS-data, som brugerne derefter kan bruge til at opbygge IM-MN-netværk (se21) – eller til enhver anden applikation efter eget valg. Opbygning af IM-MN vil ikke blive overvejet heri, da protokoller for molekylært netværk allerede er tilgængelige22. De afgørende punkter, der skal følges for at generere værdifulde og reproducerbare IMS/IMS-opkøb, fremhæves. Tager eksemplet på et af de oligosaccharider, der studeres af Ollivier et al. 21, er følgende trin detaljerede: i) prøveforberedelse, ii) tuning af det cykliske IMS-instrument, iii) automatiseret topplukning af dataene og iv) CCS-kalibrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over protokollen findes i figur 1. De parametre, der anvendes til de eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, findes i supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2.

1. Fremstilling af prøveopløsningen

BEMÆRK: Protokollen er beskrevet ved hjælp af et arabinoxylan pentasaccharid (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose eller XA2XX; se materialetabellen) som et eksempel.

  1. Fremstilling af opløsningsmidlet: 500 μM LiCl i 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Forbered en 100 mM stamopløsning af lithiumchlorid (LiCl) i H2O ved at veje 212 mg LiCl og tilsæt 50 ml deioniseret vand med høj renhed (H2O) i et 50 ml polypropylen konisk rør. Ryst indtil det er helt opløst.
      BEMÆRK: Opløsningsmidlet doteres med et lithiumsalt for at fremme dannelsen af [M + Li]+ addukter i spektrometerets ionkilde, da det normalt giver fragmenteringsspektre af bedre kvalitet sammenlignet med andre alkaliaddukter. Brug af LiCl anbefales, fordi organiske syrer (og dermed deres salte) tidligere har vist sig at påvirke IMS-profiler23.
    2. Fortynd LiCl-stamopløsningen i en glasflaske 200x: Til 250 μL af stamopløsningen tilsættes 24,75 ml H2O. Tilsæt 25 ml methanol (MeOH) for at nå en endelig koncentration af LiCl på 500 μM i 50:50 H2O:MeOH (v/v). Sonikat i 2 minutter for at afgasse opløsningsmidlet.
      BEMÆRK: MeOH udgør en sundhedsfare (H225, H301, H311, H331, H370); manipulere under en emhætte iført en laboratoriefrakke, handsker og øjenbeskyttelse. En andel på 50:50 MeOH / H2O (v / v) synes at være det bedste opløsningsmiddel til ionisering af oligosaccharider; MeOH kan dog erstattes af acetonitril (ACN), hvis det er nødvendigt.
  2. I et 1,5 ml polypropylenrør vejes 1 mg af kulhydratet. Opløses med et passende volumen på 500 μM LiCl for at nå en koncentration på 1 mg/ml. Fortynd til en endelig koncentration på 10 μg/ml i 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl. Opbevares ved 4 °C.
    BEMÆRK: Koncentrationen på 10 μg/ml blev valgt for at optimere signalet over alle fragmentioner under IMS/IMS-MS (dette er for en ren forbindelse; øg koncentrationen, når du arbejder på blandinger). Ved erhvervelse af ims/IMS-referencespektre må prøven ikke fortyndes yderligere: Mætning af MS-detektoren inden fragmentering forventes, selv om instrumentet giver mulighed for at korrigere den (se trin 3.2.).

2. Tuning af det cykliske IMS-massespektrometer

BEMÆRK: Softwarerelaterede instruktioner (vinduer, menuer og kommandoer) er fremhævet med fed skrift.

  1. Åbn instrumentkonsollen fra instrumentstyringssoftwaren (MS tune-siden , se softwareoplysningerne i materialetabellen), og sæt instrumentet i driftstilstand . Vent i mindst 3 timer på, at de høje spændinger stabiliseres i IMS-cellen.
    BEMÆRK: For at få den bedste reproducerbarhed skal spændingerne i IMS-cellen stabiliseres fuldstændigt. Tænd for højspændingerne, og lad instrumentet stabilisere sig natten over før en cyklisk IMS-analyse. Desuden skal trykket og temperaturen i ionmobilitetscellen holdes så konstant som muligt. Selvom en tilbagelæsning af trykket er tilgængelig under fanen Vakuum , er der ingen tilbagelæsning tilgængelig for temperaturen. Opbevar instrumentet i et termostatlaboratorium. Instrumentet, der anvendes i dette arbejde, fungerer ved 1,75 mbar i et laboratorium termostat ved 20 °C.
  2. Opsætning af cyklisk IMS-instrument
    BEMÆRK: Standardløsninger skal infunderes ved hjælp af det indbyggede fluidics-system til instrumentopsætningen.
    1. Fluidikbeholderne, der er fyldt med de relevante standarder fra fabrikanten, anbringes på fluidiksystemet: Reservoir B (»Lockmass«): 10 pg/μL leucinenkephalin (LEU ENK) i 50:50 ACN/H2O + 0,1 % myresyre Reservoir C (»Calibrant«): MajorMix.
      BEMÆRK: I denne protokol vil MajorMix-kalibreringsopløsningen blive brugt til at kalibrere både m/z- og CCS-dimensionerne. Af praktiske årsager vil der blive udført en ekstern CCS-kalibrering (se trin 5 i protokollen); Derfor er det også muligt at anvende en intern calibrrantblanding til CCS og en anden calibrant til m/z (f.eks. natriumformiat eller natriumiodid).
    2. På Siden Tune på Quartz-konsollen skal du gå til fanen Fluidics . Sæt prøvevæsken til reservoir C og referencefluidikken til reservoir B. Tilsæt begge opløsninger fortløbende i ionkilden for at kontrollere MS-signalet.
    3. Udfør ADC-opsætningen, detektoropsætningen (ved hjælp af LEU ENK) og massekalibreringen (se materialetabellen for kalibreringsløsningen) fra siden Instrumentopsætning i henhold til producentens anvisninger.
  3. Registrer en IMS-anskaffelse af kalibreringsopløsningen med en enkeltpasadskillelse (brug denne til ekstern IMS-kalibrering).
    BEMÆRK: Parametrene ionkilde og rejsebølge (TW) (statisk bølgehøjde og bølgehastighed) skal holdes konstante under alle erhvervelser (kalibrering og erhvervelser). Hvis brugeren ikke har forudgående kendskab til de optimale parametre for sin prøve, kan dette trin udføres efter trin 3 i protokollen (for [M + Li]+ addukter af neutrale oligosaccharider bruger de repræsentative resultater en TW-højde på 16 V og TW-hastighed på 350 m / s, hvilket giver de bedste resultater).
    1. Fra fanen Fluidics skal du vælge baffelposition Prøve og tilføre kalibreren (se materialetabellen) i ionkilden (ved hjælp af det indbyggede fluidiksystem) gennem 'Prøve'-sonden med en strømningshastighed på 10 μL/min.
    2. Konfigurer en IMS-sekvens med et enkelt pas. Fra siden Tune skal du sætte instrumentet i mobilitetstilstand og åbne vinduet Cyklisk sekvenskontrol . Vælg Avanceret tilstand. Fra fanen Cykliske funktioner i dette nye vindue skal du vælge Tilføj bundt og derefter Enkelt / Multipass. Vent på, at en sekvens af mobilitetshændelser vises under fanen Sekvens i det samme vindue.
      BEMÆRK: For at aktivere realtidsdisplayet skal brugeren anvende instrumentparametrene: Klik på Indstil i TOF-tilstand eller Kør i mobilitetstilstand . Før du skifter instrumentet mellem TOF- og mobilitetstilstande , er det nødvendigt at afbryde enhver løbende anskaffelse (herunder Tune-sidevisningen). Den relative overflod af ioner kan variere mellem TOF-tilstand og mobilitetstilstand på grund af ændringer i iontransmissionsparametrene.
    3. Tilpas sekvensen, så alle kaliberionerne laver et enkelt pas rundt om den cykliske IMS-racerbane. Du må ikke ændre indsprøjtningstiden eller udstødningen og få tid; Sænk dog Separat tid til 1 ms (under fanen Sekvens ). Hvis nogle ioner af kalibreringsblandingen ikke passer ind i det viste ankomsttidsvindue, skal du ændre synkroniseringen af IMS med skubberen til tof-analysatoren til ortogonal acceleration ved at øge antallet af pushes pr. placering på fanen ADC-indstillinger .
      BEMÆRK: Tiderne i kontrolsekvensen styrer kun multifunktionsarrayet til ion-gating. Så længe ionerne er involveret i deres første (eller niende) pasning rundt om racerbanen, vil de afslutte passet, selvom TW's retning er ændret i arrayet i mellemtiden. Sænkning af separationstiden til 1 ms betyder, at arrayet skifter til udstødningstilstand efter 1 ms. Dette sikrer, at de hurtigere ioner ikke har tid nok til at passere gennem arrayet og engagere sig i et andet pas, før de langsommere ioner afslutter deres første pas. Derfor vil alle ioner blive udsat for det samme antal passager (dvs. et pas), hvilket er nødvendigt for at udføre IMS-kalibrering.
    4. Optag en 2-minutters erhvervelse. I vinduet Cyclic Sequence Control skal du klikke på Erhverv for at åbne pop op-vinduet Anskaffelsesindstillinger . Indtast filnavn, beskrivelse og anskaffelseslængde (min.), og klik på Gem.
  4. Registrer yderligere 2 minutters anskaffelse af kalibreringsopløsningen under de samme betingelser som trin 2.3 (brug dette til at kontrollere kvaliteten af CCS-kalibreringen). I vinduet Cyclic Sequence Control skal du klikke på Erhverv for at åbne pop op-vinduet Anskaffelsesindstillinger . Indtast filnavn, beskrivelse og anskaffelseslængde (min.), og klik på Gem.
  5. Vask fluidics-systemet grundigt med 50:50 H2O/ACN for at undgå krystallisation af calibrantet i kigslangen.

3. Erhvervelse af IMS/IMS-MS

  1. Ved hjælp af en sprøjtepumpe tilføres den (lithium-doterede) prøve ved 10 μg/ml gennem prøvesonden med en strømningshastighed på 10 μL/min.
  2. Skift instrumentet til TOF-tilstand (fra MS-indstillingssiden ) for at kontrollere signalets stabilitet. Registrer en fuld MS-erhvervelse (1 min) af prøven, hvilket vil være nyttigt til at kontrollere isotopmønsteret og tilstedeværelsen af potentielle forurenende stoffer.
    BEMÆRK: Fordi prøvekoncentrationen er valgt for at opnå et godt ionsignal for fragmenterne, kan der observeres en TOF-mætning på dette trin. TOF-mætning kan identificeres ved hjælp af følgende artefakter: (i) en kunstigt øget MS-opløsning, (ii) en ændring i isotopforhold og (iii) en lang række toppe med lav overflod mellem isotoper. Brug DRE-objektivet (Dynamic Range enhancement, Quad/MS Profile/DRE på hovedtunesiden) til at dæmpe transmissionen af ioner og kassere mætningen i TOF-tilstand (figur 2A,B).
  3. Sæt instrumentet i MSMS-tilstand (fanen Quad/MS Profile på hovedtunesiden), og vælg massen af den målrettede ion i FELTET MSMS-masse til isolering i quadrupolen (i eksemplet: m/z på 685,2, svarende til [M+Li]+ -ioniske arter af arabinoxylan-pentasaccharid). Optag en 1 min erhvervelse for at kontrollere forløberisoleringen, når dataene behandles.
    BEMÆRK: Lithium-addukter har en isotop ved -1 Da af den monoisotopiske top, som skal fjernes fra MS / MS-udvælgelsesvinduet, så det ikke forstyrrer behandlingstrinnene. Det kan fjernes ved at indsnævre valgområdet ved hjælp af parametrene LM-opløsning og HM-opløsning under fanen Quad/MS-profil (figur 2C).
  4. Konfigurer en "udskæring" IMS-sekvens for at udføre et mobilitetsbaseret udvalg af den isomer, der er af interesse.
    1. Skift instrumentet til mobilitetstilstand (se trin 2.3.2). I vinduet Cyklisk sekvenskontrol skal du under fanen Cykliske funktioner vælge Tilføj bundt og derefter Udskæring. Vent på, at en kompleks sekvens af mobilitetshændelser vises under fanen Sekvens (figur 3).
      BEMÆRK: Det er muligt at visualisere hvert trin i IMS / IMS-processen: Klik på hændelsen Skub ud og hent i fanen Sekvens . Når den er fremhævet med rødt, skal du flytte den til den rigtige position i sekvensen ved hjælp af knapperne Op og Ned .
    2. Placer hændelsen Skub ud og hent lige efter den første Separate hændelse (dvs. flyt den i række 3 i stedet for række 8 i sekvensen som vist i figur 3), og klik derefter på Kør. Se efter resultaterne af den oprindelige adskillelse, der skal vises i realtid. Forøg varigheden af den første separate hændelse for en multipasseparation ved at ændre tidsværdien for denne hændelse i sekvensen, indtil opløsningen af IMS-toppe er tilfredsstillende. Optag en 1 min erhvervelse til reference.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på ADC Start Delay-værdien under fanen ADC-opsætning : Det vil være nyttigt at kontrollere kvaliteten af isoleringen.
    3. Klik på Pause. Bemærk, at resultaterne af den oprindelige adskillelse vises, selvom ændringer i kontrolsekvensen ikke anvendes, før brugeren klikker på Kør igen. Placer hændelsen Skub ud og hent under skub ud, skub ud til pre-store, og hold og skub hændelser ud . Juster varigheden af hændelserne, så den målrettede spidsbelastning er i området Skub ud til pre-store , og enhver anden ion enten er i området Skub ud eller Hold og skub ud .
      BEMÆRK: Varigheden af disse tre hændelser sammenlignet med ankomsttidsfordelingerne (ATD'er) kan visualiseres ved hjælp af den farvekodede bjælke under mobilitetsspektret under fanen Mobilogram (figur 3).
    4. Placer hændelsen Skub ud og hent i slutningen af sekvensen under Genindstæd fra Pre-Store og den anden Separate hændelse. Klik på Kør for at få vist den valgte population.
      BEMÆRK: Fordi den valgte population har forladt IMS-cellen, er al tidligere adskillelse gået tabt, og den er tilbage til en enkeltpasseparation (som ønskes).
    5. Kontroller kvaliteten af isoleringen. For at kontrollere, at kun toppen af interessen er valgt, skal du udføre den samme adskillelse efter rejektion som før rejektion (dvs. samme separate tid) som vist i figur 4. Optag en 1 min erhvervelse til reference.
      BEMÆRK: Brugerne opfordres til at kontrollere den udstødte befolkning; Tidsvinduet Skub ud til forbutik skal være grundlinjeniveau (figur 4B). For at kontrollere dette skal du sætte ADC Start Delay i manuel tilstand under fanen ADC-indstillinger og indtaste den forsinkelsestid, der er angivet i trin 3.4.2. Optag en 1 min erhvervelse til reference.
    6. Under fanen Sekvens i kolonnen ud for de brugerdefinerede hændelsestider (kolonnen Time Abs , fremhævet med rødt) skal du kigge efter de opsummerede tidspunkter for alle hændelser. Vær opmærksom på Time Abs, der findes på linjen i Reinject from Pre-Store-hændelsen til udførelse af CCS-kalibreringen.
  5. Fragmenter den målrettede top mellem de to runder af IMS. Skift spændingerne i rejektionstrinnet for at øge ionernes kinetiske energi, og fragmenter dem ved kollision med ionmobilitetsgassen.
    1. Indstil varigheden af hændelsen Separat lige før Skub ud og Hent til 1 ms (se forklaringen i trin 2.3.3).
    2. Markér afkrydsningsfeltet Aktivér aktivering på linjen Genindst fra før butik, og optimer fragmenteringen med det indbyggede kontrolelement. Hvis spektret er tilfredsstillende (f.eks. hvis basistoppen er et fragment), skal du fortsætte direkte til trin 3.5.4.
      BEMÆRK: Når aktivering aktiveres, bliver tre spændinger på linjen grå: dette er de spændinger, som brugeren skal ændre, hvis der kræves manuel optimering af spændingerne (se næste trin). Disse tre spændinger (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias og Array Offset) danner den gradient, der bruges til at aktivere ionerne. Ionernes kinetiske energi vil stige med hældningen mellem Pre-Array Bias og Array Offset (se figur 5). Standardværdierne for Gradient → Bias → Offset-værdierne er: uden aktivering 85 → 70 → 45 V; maksimal aktivering af den indbyggede funktion 185 → 170 → -5 V (+150 V). Efter fragmentering skal du ikke glemme at justere iontransmissionen ved hjælp af DRE-linsen (reducer dæmpning af signalet) (se trin 3.2.).
    3. Hvis fragmenteringen ikke er tilfredsstillende med den indbyggede kontrol, skal du fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Aktivér aktivering og fortsætte med manuelt at optimere genreguleringsspændingerne. Forøg Pre-Array Gradient-spændingen ( Pre-Array Bias-spændingen skal altid holdes 15 V under Pre-Array Gradient), og sænk Array Offset-spændingen (som kan indstilles som negativ), indtil resultaterne er tilfredsstillende.
      BEMÆRK: Ved manuel indstilling af spændingerne i multifunktionsarrayet kan brugeren skifte fra visningen 'Mobilogram' til interaktive skemaer over de spændinger, der anvendes i multifunktionsarrayet (PE-diagrammet) for bedre at visualisere spændingsindstillingerne (figur 5A).
    4. Optag en 2 minutters erhvervelse. I pop op-vinduet til anskaffelse skal du markere indstillingen Bevar driftstid for at generere en fil, der kun indeholder ankomsttiderne i forhold til m/z (den anskaffelsestid, der bruges til kromatografiske analyser – opbevaringstiden – fjernes fra filen). Bemærk, at denne fil er mærket *_dt. RÅ.
      BEMÆRK: Hvis brugeren glemmer at kontrollere indstillingen Bevar driftstid , er det stadig muligt at udtrække IMS-dimensionen ved hjælp af Driftscope 2.9-softwaren (File | Eksporter til MassLynx | Bevar driftstiden).
  6. Drej instrumentet tilbage til TOF-tilstand på hovedtunesiden, og skyl systemet grundigt med 50:50 MeOH/H2O, før du fortsætter med den næste prøve.

4. IMS/IMS-MS-behandling med MZmine 224

BEMÆRK: MZmine 2 er tilgængelig fra URL'en i materialetabellen. Brug af MZmine 2.51 anbefales. På tidspunktet for udarbejdelsen af dette manuskript kan de senere versioner ikke åbne RAW-filer fra cykliske IMS-instrumenter på grund af en ændring i importfunktionen.

  1. Importer den eller de rå filer, der kun indeholder IMS- og m/z-dimensionerne (*_dt. RAW) ved hjælp af raw-datametoder | Import af rådata.
    BEMÆRK: Raw-filer vises i venstre side af MZmine-hovedvinduet. Importer ikke originalen *. RAW-filer , der stadig indeholder opbevaringstidsdimensionen. MZmine skelner ikke mellem opbevaringstid og IMS-ankomsttid, og datapunkterne i begge dimensioner overlapper hinanden.
  2. Optimer arbejdsgangsparametrene i en repræsentativ fil ved at vælge den i Rå datafiler liste.
    1. Evaluer støjniveauet i dataene. Højreklik på filen på listen Rå datafiler , vælg Vis TIC og vis basistoppen "chromatogram" (BPC). Dobbeltklik på den mindste top, der kan observeres med øjet, for at få vist dens massespektrum. Betragt støjniveauet i dataene som værende omkring den anden isotop af basistoppen i dette spektrum, og brug den samme værdi for alle intensitetstærsklerne i de følgende behandlingstrin.
      BEMÆRK: Dataene blev erhvervet ved hjælp af quadrupolisolering og betragtes således af MZmine som MS / MS. Gennem hele MZmine-behandlingen skal du sørge for at arbejde på et MS-niveau = 2.
    2. Udfør masseregistreringen ved hjælp af rådatametoder | | til registrering af funktioner Massedetektion. For data, der er erhvervet i profiltilstand, skal du bruge Wavelet-transformationsalgoritmen . For at konfigurere parametrene for algoritmerne i MZmine skal du klikke på knappen [...] ved siden af algoritmen og bruge indstillingen Vis forhåndsvisning til at visualisere dataene, mens parametrene optimeres.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt vises de toppe, der er valgt af algoritmen, med rødt i eksempelvinduet. Når du bruger wavelet-transformationsalgoritmen på proprietære RAW-filer, vil MZmine undertiden forveksle profildatapunkterne med centroiderede toppe. Softwaren viser en meddelelse om, at brugeren kører en profilalgoritme på centroiderede spektre: ignorer denne meddelelse og klik på OK.
    3. Rekonstruer de ekstraherede ionmobilitetsspektre (EIM) for hver fragmentmasse ved hjælp af rådatametoder | | til registrering af funktioner ADAP Chromatogram builder på masselisten 'masser', der genereres af det foregående trin. Da m/z-toleranceindgangen på dette stadium er en scan-to-scan-tolerance, skal du sørge for at lade den være mindst 3-4 gange højere end den samlede forventede nøjagtighed.
    4. Da det foregående trin ikke har en forhåndsvisningsindstilling, skal du kontrollere kvaliteten af topplukningen direkte ved hjælp af funktionslisten , der dukkede op på højre panel i MZmine-hovedvinduet. Åbn listen Funktion, vælg alle rækker, højreklik, og vælg Vis/XIC (dialog). Klik på Alle for at få vist alle ioner på mobilitetsspektret. Undersøg de plukkede toppe, der vises i farve for at sikre, at der ikke er nogen åbenlyse ubesvarede toppe.
    5. DekonvolverE VM'erne for at opdele m/z , der indeholder forskellige toppe, i flere funktioner. Brug metoder til funktionsliste | | til registrering af funktioner Kromatogramdekonvolution, og vælg Wavelets (ADAP) algoritmen. Optimer algoritmen for dataene ved hjælp af indstillingen Vis forhåndsvisning og følgende nøgleparametre: S/N-tærskel, koefficient/arealtærskel og RT-bølgeområde.
      BEMÆRK: Det anbefales at kontrollere aspektet af det dekonvolverede spektrum. Brug værktøjet til visualisering af kromatogrammet som beskrevet i trin 4.2.4. De dekonvolvede toppe vises i farve, og toppe af samme masse skal opdeles, som vist i figur 6A.
    6. Deisotop de dekonvolverede EIM'er ved hjælp af funktionslistemetoder | Isotoper | Isotopiske toppe grouper. Brug instrumentets forventede nøjagtighed til m/z-toleranceværdien , og indstil ankomsttidstolerancen til 0,1 ms (vist i MZmine som Retentionstidstolerance 0,1 min), da isotoper ikke løses under IMS-separationen. Kontroller funktionslisten: Hvis der er isotoper tilbage, skal du øge toleranceværdierne.
      BEMÆRK: Selvom deisotopingen teoretisk kan udføres når som helst i behandlingen af funktionslisten, er det vigtigt at gøre det sidst, så gebyrværdierne kan eksporteres (algoritmerne, der bruges til de andre trin, fjerner undertiden oplysningerne om gebyrtilstanden).
  3. Hvis du behandler flere IMS/IMS-MS-spektre, skal du gentage behandlingen med disse optimerede parametre. Opbevar de samme parametre for alle spektre.
  4. I tilfælde af flere spektre grupperes dem i en enkelt tabel for at eksportere dem; Hvis ikke, skal du springe direkte til trin 4.5. Hvis du vil gruppere spektrene, skal du bruge metoderne | Justering | Deltag i aligner. Da målet ikke er rent faktisk at justere toppe, skal du bruge restriktive toleranceværdier for både m / z og ankomsttid. Giv den samme vægt til begge dimensioner.
  5. Eksporter den endelige funktionsliste til en * .csv fil. Brug metoder til funktionsliste | Eksport/import | Eksporter til CSV-fil , og eksporter følgende værdier: Eksporter række m/z, Eksportér rækkeopbevaringstid (det faktiske IMS-ankomsttidspunkt), Peak m/z og Peak height. Brug et komma som feltseparator.

5. TWCCSN2 af de centroiderede IMS/IMS-spektre

BEMÆRK: I denne protokol anvendes en logaritmisk tilpasningskalibrering25,26, som har tendens til at give bedre resultater end lineær kalibrering og er let at implementere i et regneark eller et internt behandlingsscript. Et internt script (skrevet i R) er tilgængeligt på url'en i tabellen over materialer.

  1. Vælg referenceankomsttidsværdierne fra calibrantanskaffelsen (se trin 2.3). Gør dette manuelt ved hjælp af konstruktørsoftwaren (se materialetabellen) for at kontrollere aspektet af alle IMS-kalibertoppe.
    1. Åbn *_dt i vinduet Kromatogram. RAW-fil svarende til calibrranten.
    2. For hvert kalibreringspunkt genereres EIM'et ved hjælp af displayet | Masse mulighed.
    3. Kontroller EIM'ernes profil. Hvis nogle er dårligt definerede, skal du udjævne dem ved hjælp af processten | Glat mulighed (da de bedste resultater typisk opnås med Savitzky-Golay-algoritmen, glat 2 gange over 3 skraldespande). Rapportér de højeste værdier i et regneark.
      BEMÆRK: Da referencepunkterne generelt erhverves ved hjælp af DTIMS-enheder med lav opløsning, kan nogle multimodale distributioner forekomme i cyklisk IMS afhængigt af kalibranterne. Fjern enhver top, der præsenterer en sådan fordeling, fra kalibreringslisten.
  2. Beregn de logaritmiske tilpasningsparametre fra kalibranterne.
    1. For alle kalibreringspunkter beregnes følgende.
      1. Beregn drivtiden ved hjælp af Eq (1):
        Equation 1 (1)
        med td driftstiden, tA den målte ankomsttid og tinj injektionstidspunktet i IMS-cellen (alt i ms).
        BEMÆRK: For små molekyler, såsom oligosaccharidfragmenter, ligger variationen i død tid (flyvetid mellem udgangen fra IMS-cellen og detektoren) mellem forskellige masser inden for CCS-kalibreringens fejlområde og kan ignoreres.
      2. Beregn ionernes neutrale masse ved hjælp af Eq (2):
        Equation 2 (2)
        med z ionens ladningstilstand og mion massen af modionen (i Da). Brug nøjagtige masser for at undgå at indføre usikkerhed. Hvis der er et atomtab i stedet for en modion, skal du bruge negative mionværdier (f.eks. for [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Beregn CCS' parameter ved hjælp af Eq (3):
        Equation 3 (3)
        med CCS referencedriftrøret DTCCSN2-værdien (i nm2) og mgas massen af drivgassen (i Da; eks. for nitrogen: mgas = 28,01 Da).
      4. Beregn td'-parameteren ved hjælp af Eq (4):
        Equation 4 (4)
        med d detektorens startforsinkelse, der bruges eksperimentelt til at korrigere for død tid (typisk ~ 1,5 ms).
      5. Beregn logaritme af ovenstående parametre:
        ln (CCS') og ln (t'd)
    2. Udfør en lineær regression for at bestemme R2-koefficienten og x - og y-parametrene for den logaritmiske pasform (med x hældningen og ln(y) aflytningen) ved hjælp af Eq (5):
      Equation 5 (5)
      BEMÆRK: Brugeren kan afbilde ln(CCS') vs ln(td') værdierne for visuelt at kontrollere resultaterne af kalibreringen, selvom dette er valgfrit.
  3. Anvend kalibreringen på forsøgsdataene for at kalibrere de toppe, som MZmine har plukket for hvert IMS/IMS-spektrum, der eksporteres til *.csv-filen. For hvert punkt beregnes følgende.
    1. Beregn drivtiden ved hjælp af Eq (6):
      Equation 6 (6)
      med tseq tiden forud for den endelige IMS-separation (værdien »Time Abs« noteret i trin 3.4.6).
      BEMÆRK: Hvis du kalibrerer flere IMS/IMS-spektre, der er erhvervet med forskellige sekvenser, skal du omhyggeligt kontrollere tseq-værdierne.
    2. Beregn ionernes neutrale masse ved hjælp af Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Beregn parametrene td' og td'' ved hjælp af Eq (8) og Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Beregn de endelige kalibrerede CCS-værdier (TWCCSN2 i nm2) ved hjælp af Eq (10):
      Equation 10 (10)
      BEMÆRK: Selvom trin 5.2.2. giver ln(y) som aflytning, skal y bruges til at opnå den endelige CCS-værdi. Glem ikke at anvende en eksponentiel funktion.
  4. Kontroller kalibreringens nøjagtighed ved at anvende kalibreringen på den anden anskaffelse af kalibreringsopløsningen, der blev erhvervet i trin 2.4.
    BEMÆRK: Kalibreringen skal give resultater med en fejl på ~1-2%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et arabinoxylan pentasaccharid, XA2XX, blev valgt som et eksempel for at illustrere denne protokol. Denne forbindelse er kommercielt tilgængelig, men kun som en blanding med et andet arabinoxylan pentasaccharid, XA3XX (ren XA3XX er også kommercielt tilgængelig). Strukturerne for XA2XX og XA3XX er angivet i supplerende figur S1. Da forholdet mellem XA2XX og XA3XX i den kommercielle blanding er ~50:50, blev der fremstillet en opløsning ved 20 μg/ml af blandingen for at nå en XA2XX-koncentration på ~10 μg/ml i 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl.

For det første blev der udført en MS-analyse af XA2XX + XA3XX-blandingen under anvendelse af MS med høj opløsning. Da de to forbindelser er isomerer, blev der observeret en enkelt top ved [M+Li]+m/z 685,24. Denne MS-top blev valgt med quadrupolen og udvælgelsesvinduet justeret for at fjerne -1 Da lithiumisotopen, som kunne forveksles med den monoisotopiske top ved at behandle algoritmer (figur 2).

[M+Li]+- addukterne af pentasacchariderne blev derefter sendt til den første fase af IMS-separationen: Efter 3 passager omkring den cykliske IMS-celle blev 3 toppe adskilt med ankomsttider på 83, 90 og 94 ms. Denne profil blev sammenlignet med den for ren XA3XX (infunderet ved 10 μg/ml), hvilket viste, at toppe ved 83 og 90 ms svarede til XA3XX, mens toppen ved 94 ms svarede til XA2XX (figur 4A). Toppen på 94 ms blev udvalgt til IMS/IMS-analyse: Ionerne tilhørende XA3XX blev slynget ud (figur 4B), og toppen af interessen blev sendt til præarray-lagercellen. En 3-pass adskillelse blev udført efter genindsættelse af ionen uden aktivering for at sikre, at kun XA2XX-toppen forblev efter udvælgelsen (ankommer til 199 ms i figur 4C).

Derefter blev ionen fragmenteret ved rejektion fra prestore-området, og en IMS-adskillelse med et enkelt pas blev udført på alle fragmenterne. To forskellige aktiveringer blev forsøgt: Den maksimale indstilling af den indbyggede prestore-aktiveringsfunktion blev først forsøgt (figur 5B,C); forløberen forblev imidlertid den grundlæggende top af spektret. Dette ønskes ikke, fordi fragmenter under en vis intensitetstærskel typisk vil blive fjernet for referencespektre. Således blev der valgt en manuelt defineret præarray-gradient → pre-array-bias → array-forskudt spændingsgradient (figur 5D,E).

De genererede IMS/IMS-MS-data blev dekonvolveret med MZmine 2.51 ved hjælp af ankomsttids- og m/z-dimensionerne (figur 6A) for at give IMS/IMS-spektre, der kun indeholdt mobilitetsoplysningerne for fragmenterne. Toppene over 0,2 % relativ intensitet blev eksporteret til CCS-kalibrering (de detaljerede MZmine-parametre er angivet i supplerende tabel S1). CCS-kalibreringen blev udført ved hjælp af kalibreringsopløsningen (R2 = 0,995, gennemsnitlig absolut afvigelse af kontrol = 1,63%, se supplerende tabel S3). Denne behandling gav endelig et centroideret, CCS-kalibreret IMS/IMS-spektrum (figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over IMS/IMS-datagenereringsprocessen. Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Isotopisk mønster af en XA3XX + XA2XX arabinoxylan pentasaccharidblanding. (A) Mættet signal uden DRE; (B) signal korrigeret ved hjælp af DRE med en 5% iontransmission (dvs. 95% dæmpning) og (C) profil efter quadrupolvalg for at fjerne -1 Da-toppen svarende til en lithiumisotop. I lilla: det område, hvor artefakttoppe kan forekomme på grund af mætning, forstørres 6 gange. Forkortelser: DRE = forbedring af dynamisk område; MS = massespektrometri; MSMS = tandem MS; LM Res = opløsning med lav masse; HM Res = høj masseopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Oversigt over det cykliske IMS-kontrolvindue, hvor brugeren definerer IMS/IMS-sekvensen. Den viste sekvens viser, hvordan man kontrollerer kvaliteten af isolationen i IMS/IMS med et udvalg af XA2XX efter 3 passager (det viste spektrum svarer til indstillingen af valghændelserne efter adskillelsen i første fase). Sekvensen består i at køre en første 3-pass IMS-adskillelse over 58 ms, derefter skubbe de to hurtigere isoformer ud fra IMS-cellen (segment 3), skubbe den langsommere isoform (ATD mellem 92 og 96 ms) ud i prestore (segment 4), genindskyde den i IMS-cellen uden aktivering (segment 6), hvilket gør det muligt for ionerne at gennemgå en yderligere 3-pass (58 ms) adskillelse (segment 7), derefter skubbe ioner ud fra IMS-cellen og indsamle data (segment 8). Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; cIMS = cyklisk IMS; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = analog-til-digital konverter; TW = rejsebølge; PE = potentiel energi ATD = fordeling af ankomsttid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Udvælgelse af XA2XX fra blandingen af XA2XX og XA3XX. (A) Separation af arabinoxylan pentasaccharider, XA3XX og XA2XX, efter 3 passager (svarende til en separationstid fastsat til 58 ms) omkring den cykliske IMS-celle. B) Fraktion, der udslynges direkte efter den første fase af IMS-separationen. C) Fraktion udvalgt til IMS/IMS, hvor der efter rejektion blev udført endnu en 3-pass-separation. XA2XX-toppen af interessen er fremhævet med gråt. Ionmobilitetsspektrene vises i databakker og kommenteres med deres ankomsttid (ms). Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Principper for kollisionsinduceret dissociation ved hjælp af prearray-lagerområdet. (A) Skemaer over multifunktionsarrayområdet med detaljerede oplysninger om nøglespændinger (i rødt), der anvendes til udvælgelse, rejektion og aktivering under IMS/IMS-eksperimenter. De blå pile viser retningen af den kørende bølge i multifunktionsarrayet. (B, C) IMS/IMS- og MS/MS-spektre opnået til XA2XX ved hjælp af den indbyggede prestore-aktiveringsfunktion (+150 V). Farvebjælken repræsenterer ionintensitetsskalaen (blå = lav; rød = høj). (D, E) IMS/IMS og MS/MS spektre opnået for XA2XX med manuel optimering af spændingerne (prearray gradient 195 V, prearray bias 180 V, array offset -10 V). Forløberioner er angivet med stjerner på spektrene. Ionmobilitetsspektrene vises i databakker og kommenteres med deres ankomsttid (ms). Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = flyvetid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Illustration af behandlingstrinnene. Resultater af (A) MZmine peak picking og (B) CCS kalibrering af arabinoxylan pentasaccharid XA2XX. A viser massedekonvolutionen af IMS/IMS-spektret gennem en farvekode. B viser det endelige IMS/IMS-spektrum efter centroidering og CCS-kalibrering. Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisionstværsnit. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: En sammenligning af to IMS/IMS-spektre af XA2XX illustrerer metodens reproducerbarhed. Det endelige kalibrerede spektrum fra dette papir (øverst) sammenlignes med spektret fra Ollivier et al.'s arbejde. 21 (nederst, vendt). Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisionstværsnit. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Strukturer af XA2XX og XA3XX arabinoxylan pentasaccharider. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Evaluering af interday repeterbarhed ved hjælp af XA2XX. IMS/IMS-opkøbene blev gentaget på dag 1 (øverst) og dag 95 (nederst). Forkortelser: IMS = ionmobilitetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Detaljerede MZmine-parametre. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S2: Instrumentparametre ændret for at evaluere reproducerbarheden. Forkortelse: ESI = elektrosprayionisering. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S3: Kontrol af CCS-kalibreringen ved hjælp af en anden anskaffelse af kalibreringsopløsning. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELECT SERIES Cyclic IMS er et kraftfuldt værktøj, der gør det muligt at vælge en defineret ionpopulation – af en given m/z og ionmobilitet – uden behov for opstrøms kromatografisk adskillelse. Instrumentet giver mulighed for at generere et todimensionelt fragmenteringskort over denne ionpopulation, hvorfra både MS/MS og IMS/IMS-spektre kan udvindes. Brugeren skal dog bemærke flere kritiske punkter, der kræver opmærksomhed under forsøgsprocessen.

For det første skal brugeren omhyggeligt kontrollere MS-isolationsvinduet for tilstedeværelsen af mulige isobariske forurenende stoffer. Faktisk er isolationsvinduet for en quadrupol relativt bredt, og at kende ioner af en lidt anden m / z , der kan coselected i quadrupole, vil hjælpe brugeren med korrekt at tildele toppen af interessen for ionmobilitet.

For det andet skal brugeren, når han udfører den indledende adskillelse, sikre, at alle ioner gennemgår det samme antal passager omkring den cykliske ionmobilitetscelle. Dette er et vigtigt og vanskeligt aspekt af ionmobilitetsadskillelse i en cyklisk enhed. En fejlagtig vurdering af antallet af passager for en given ion kan føre til en forkert identifikation og fortolkning af toppe. Det kan være vanskeligt at kontrollere antallet af passager af forskellige ionpopulationer på grund af den relativt korte enkeltpaslængde (~ 1 m), og arter med meget forskellige mobiliteter kan hurtigt overlappe hinanden.

Især kan en top opdeles mellem to forskellige passager, hvis arrayet skifter retning, når denne ionpopulation passerer igennem (dette er relativt let at identificere: den delte top vil fremstå skarpere med en befolkning lige i begyndelsen af Eject and Acquire-begivenheden ). For korrekt at indstille antallet af pas skal brugeren starte med en kort separationstid (1-5 ms), der giver 1-pass-profilen. Derefter skal brugeren gradvist øge separationstiden, indtil hele befolkningen er flyttet til højere ankomsttider, hvilket vil give 2-pass-profilen. 2-pass-profilen skal ligne 1-pass-profilen, men med bedre løste toppe. Den tid, en given ionpopulation tager at få en til at passere rundt om den cykliske celle, er en konstant, som brugeren kan bruge til at beregne antallet af passager som en funktion af separationstiden. For eksempel, hvis der er en forskel på 10 ms mellem det første og andet pas, vil der også være en forskel på 10 ms mellem det andet og det tredje.

For det tredje skal brugeren i IMS-udvælgelsesfasen omhyggeligt kontrollere isolationens kvalitet, som vist i figur 4. Det er især vigtigt at kontrollere den geninjicerede profil, fordi hvis TW-højde- og hastighedsindstillingerne er for lave, er udslyngningen af de andre populationer muligvis ikke fuldstændig. Avancerede brugere kan rette op på dette ved at justere Driftcell RF-radiofrekvensspændingen under fanen RF på Tune-siden .

For det fjerde bør brugeren være forsigtig med at generere fragmenteringsspektret og navnlig med at vælge den passende kollisionsenergi, især hvis spændingerne indstilles manuelt. Faktisk kan overdreven sænkning af Array Offset-spændingen påvirke den samlede ionintensitet negativt ved at forhindre genreguleringen. Desuden kan forløberen og fragmenterne spænde over en bred vifte af mobiliteter. Således vil de hurtigt gennemgå et andet antal passager, hvis den endelige separationstid er høj, så det er vigtigt at holde en 1-ms Separat begivenhed som forklaret i protokoltrin 2.3.3. Dette er en stor begrænsning, da enkeltpaslængden er relativt kort, hvilket begrænser enkeltpasløsningseffekten til ~ 100 for oligosaccharider27. I denne henseende ville en øget stilængde i et enkelt pas være gavnlig (dvs. de TWIMS-baserede strukturer til tabsfri ionmanipulation eller SLIM med en stilængde på 13 m28). SLIM-opsætningen blev lanceret kommercielt for nylig29.

Endelig skal brugeren være forsigtig med at definere det endelige mobilitetsområde for anskaffelse ved hjælp af kommandoen Pushes per bin , især hvis han arbejder på multiplicere ladede ioner. Ionmobilitet er faktisk en funktion af ladningen12, og f.eks. vil enslyladede fragmenter, der genereres fra en dobbeltladet forløber, sandsynligvis være langsommere end forløberen (selv om de er mindre forbindelser).

En væsentlig begrænsning ved kun at bruge MS- og IMS-separationer til at vælge forløberen (og ikke for eksempel et opstrøms trin i kromatografien) er, at en given m/z kan give flere toppe i IMS, og at flere toppe kan komme fra den samme forbindelse. Dette illustreres af fordelingen af m/z 685.2 for både XA2XX+XA3XX-blandingen og ren XA3XX i figur 4A. Multimodale IMS-fordelinger på en enkelt m/z er resultatet af forskellige gasfasekonformationer. For arter, der analyseres som kationtildukter (i positiv tilstand), opstår de forskellige konformationer muligvis fra forskelle i koordination med modionen30,31,32.

For oligosaccharider kan de også opstå ved adskillelse af reducerende anomerer, selvom adskillelse af reducerende anomerer typisk kræver højere IMS-opløsningseffekt end det, der bruges her33,34,35. I den foreliggende sag skyldes den multimodale IMS-fordeling i figur 4A delvist de individuelle bidrag fra XA2XX og XA3XX. Det er dog bemærkelsesværdigt, at XA3XX giver to toppe, som sandsynligvis er kationkoordineringskonformatorer. Det var let at identificere, hvilken top der svarede til XA2XX (dvs. arten af interesse), fordi ren XA3XX er tilgængelig kommercielt, og dens mobilitetsprofil kunne registreres separat. For at arbejde med komplekse blandinger såsom biologiske medier kan det være vigtigt at overveje at tilføje et kromatografisk separationstrin.

To punkter skal bemærkes vedrørende den behandlingsarbejdsgang, der bruges til at opnå massedekonvolverede IMS / IMS-spektre. For det første foreslås det i denne protokol at anvende MZmine 224 til at dekonvolvere IMS/IMS-spektret ved hjælp af MS-dimensionen og navnlig anvende ADAP-algoritmen36 til at opdele EVM'erne i forskellige toppe. Selv om det giver ret gode resultater, som illustreret i figur 6, blev ADAP-algoritmen designet til kromatografiske analyser og tegner sig således for asymmetrifaktorer, der er forbundet med væskefasekromatografi, såsom peak tailing. Derfor kan ADAP-algoritmen resultere i, at nogle af funktionerne ikke identificeres, når de anvendes på IMS-toppe (f.eks. Skuldre). I det væsentlige er IMS-data enklere end kromatografiske data: Fordi der ikke er nogen kemisk interaktion mellem forbindelserne og en kolonne, forventes IMS-data, der er erhvervet under passende forhold (dvs. uden at mætte IMS-cellen), at følge gaussiske fordelinger37,38. Ideelt set ville ADAP-dekonvolutionstrinnet bedst erstattes af en gaussisk tilpasningsfunktion, såsom den, der bruges af software bestemt til IMS som CUISuite 239. Som det står, var gaussisk deconvolution imidlertid ikke direkte tilpasset den komplette behandlingskæde, der er beskrevet i denne protokol. Derfor syntes brugen af den gratis open source-software MZmine at være et godt kompromis for slutbrugerne.

Den anden del af behandlingen, der berettiger til diskussion, er CCS-kalibreringen. I denne protokol foreslås det at anvende en logaritmisk tilpasningskalibrering25,26 og en kommerciel kalibreringsblanding fra samme leverandør som spektrometeret (se materialetabellen). Denne procedure er den mest ligetil at implementere i laboratoriet. Med hensyn til valget af calibrrantblandingen bør brugeren overveje, at nøjagtigheden af CCS-kalibreringen som nævnt i flere undersøgelser forbedres, når der anvendes calibranter af samme molekylære klasse og ladningstilstand som analytten26,40,41. Den fejl, der indføres ved kalibrering med relativt ens typer forbindelser (f.eks. Kulhydrater vs. peptider), er moderat. Det anbefales dog ikke at bruge meget forskellige ioner som for eksempel at bruge saltklynger som calibrants ved måling af kulhydrater41. Med hensyn til valget af kalibreringsmetoden rapporterede Richardson et al.42 for nylig en ny kalibreringsmetode, der tager højde for TWIMS's fysik for at forbedre kalibreringens nøjagtighed (med en medfølgende software). Tilgangen kræver imidlertid evaluering af meget specifikke parametre gennem analyse af forskellige typer forbindelser - lige fra metabolitter til indfødte proteiner. Da ingen blanding af en sådan række forbindelser kan findes kommercielt, blev denne metode ikke implementeret i denne protokol.

Endelig evaluerede vi for at evaluere metodens reproducerbarhed interday-reproducerbarhed ved at gentage IMS/IMS-MS-erhvervelsen på dag 1 og dag 95 (supplerende figur S2). Eksperimentet viste, at IMS/IMS-MS-data er meget reproducerbare, uden at IMS-spidsskifter med mere end 0,2 ms i løbet af denne forlængede periode. IMS/IMS-spektret, der blev genereret i dette arbejde, blev yderligere sammenlignet med et andet spektrum af XA2XX, der blev erhvervet under forskellige betingelser for tidligere arbejde med ionmobilitetsmolekylært netværk21. Nogle instrumentelle parametre, der kan påvirke ionstrukturen og ionmobilitetsprofilen13, blev bevidst ændret - kildeparametrene og aktiveringsspændingsgradienten (en sammenligning af de forskellige instrumentelle betingelser er angivet i supplerende tabel S2). Derefter blev de to spektre sammenlignet ved hjælp af cosinuslighedsscoren - som er populær til sammenligning af MS / MS-spektre i metabolomics - på GNPS-platformen5 (CCS-tolerance for matchende fragmenter = 0,015 nm2).

Sammenligningen viste en cosinuslighedsscore på 0,87 (figur 7), hvilket kan betragtes som højt med hensyn til de vigtige instrumentelle variationer, der anvendes. Dette fører til ideen om, at IMS/IMS-spektralbiblioteker kan bruges til at dereksplikere glycaner i komplekse blandinger med en høj grad af tillid, hvilket ikke ville være tilfældet med MS/MS-spektre. Bemærk, at selv om den nuværende tilgang kun anvender CCS-dimensionen af fragmenteringsspektret, indeholder IMS/IMS-MS-dataene også oplysninger fra medlemsstaterne, som ikke er overflødige i forhold til CCS. For at optimere IMS/IMS's dereplikative effekt skal der udvikles et todimensionelt pointsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at oplyse.

Acknowledgments

S.O. er taknemmelig over for det franske nationale forskningsagentur for at finansiere sin ph.d. (bevilling ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Tags

Kemi udgave 179
Brug af et cyklisk ionmobilitetsspektrometer til tandemionmobilitetseksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter