Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Använda en cyklisk jonrörlighetsspektrometer för tandemjonrörlighetsexperiment

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

Jonrörlighetsspektrometri (IMS) är ett intressant komplement till masspektrometri för karakterisering av biomolekyler, särskilt eftersom det är känsligt för isomerism. Detta protokoll beskriver ett tandem IMS-experiment (IMS/IMS), som möjliggör isolering av en molekyl och generering av mobilitetsprofilerna för dess fragment.

Abstract

Noggrann karakterisering av kemiska strukturer är viktigt för att förstå deras underliggande biologiska mekanismer och funktionella egenskaper. Masspektrometri (MS) är ett populärt verktyg men är inte alltid tillräckligt för att helt avslöja alla strukturella funktioner. Till exempel, även om kolhydrater är biologiskt relevanta, kompliceras deras karakterisering av många nivåer av isomerism. Jonrörlighetsspektrometri (IMS) är ett intressant komplement eftersom det är känsligt för jonkonformationer och därmed för isomerism.

Dessutom har de senaste framstegen avsevärt förbättrat tekniken: den senaste generationens cykliska IMS-instrument erbjuder ytterligare kapacitet jämfört med linjära IMS-instrument, såsom ökad upplösningskraft eller möjligheten att utföra IMS/IMS-experiment (Tandem ion Mobility). Under IMS/IMS väljs en jon ut baserat på dess jonrörlighet, fragmenterad och omanalyserad för att få jonrörlighetsinformation om dess fragment. Nyligen visat att mobilitetsprofilerna för fragmenten i sådana IMS/IMS-data kan fungera som ett fingeravtryck av en viss glykan och kan användas i en molekylär nätverksstrategi för att organisera glykomiska datamängder på ett strukturellt relevant sätt.

Målet med detta protokoll är således att beskriva hur man genererar IMS/IMS-data, från provberedning till den slutliga kollisions tvärsnittet (CCS) kalibrering av jonrörlighetsdimensionen som ger reproducerbara spektra. Med exemplet med en representativ glykan kommer detta protokoll att visa hur man bygger en IMS/IMS-kontrollsekvens på ett cykliskt IMS-instrument, hur man tar hänsyn till denna kontrollsekvens för att översätta IMS ankomsttid till drifttid (dvs. den effektiva separationstiden som tillämpas på jonerna) och hur man extraherar relevant mobilitetsinformation från rådata. Detta protokoll är utformat för att tydligt förklara de kritiska punkterna i ett IMS/IMS-experiment och därmed hjälpa nya cykliska IMS-användare att utföra enkla och reproducerbara förvärv.

Introduction

Den fullständiga kemiska karakteriseringen av biomolekyler är nyckeln till att förstå deras underliggande biologiska och funktionella egenskaper. För detta ändamål har "omics" vetenskaper utvecklats under de senaste åren, med sikte på storskalig karakterisering av kemiska strukturer vid biologiska koncentrationer. Inom proteomik och metabolomik har MS blivit ett centralt verktyg för att lösa upp den strukturella heterogenitet som finns i biologiska medier, särskilt tack vare dess känslighet och förmåga att tillhandahålla strukturell information genom tandem MS (MS/MS). I MS/MS-strategier väljs en jon efter massa, fragmenteras sedan, och slutligen förvärvas massorna av dess fragment för att upprätta ett fingeravtryck av molekylen. MS/MS-spektra kan särskilt användas för att matcha spektraldatabaser1,2 eller preliminärt rekonstruera de överordnade strukturerna3,4. Under antagandet att liknande spektra tillhör liknande föreningar kan MS/MS-data också användas för att bygga molekylära nätverk (MN) som förbinder relaterade arter genom en likhetspoäng5,6.

Men på grund av MS: s inneboende egenskap för att upptäcka massa-till-laddning-förhållandet (m/z) av joner, är tekniken blind för ett antal strukturella egenskaper som faller inom intervallet (stereo)isomerism. Till exempel är kolhydrater gjorda av flera monosackaridunderenheter, varav många är stereoisomerer eller till och med epimerer (t.ex. Glc vs. Gal eller Glc vs. Man). Dessa underenheter är kopplade till glykosidiska bindningar, som kan skilja sig åt genom länkningens (regioisomerism) och den steriska konfigurationen av det anomeriska kolet (anomerism). Dessa egenskaper gör det svårt för fristående MS att skilja mellan kolhydrater isomers7, och endast regioisomerism kan hanteras med hjälp av högenergiaktiveringsmetoder8,9,10. Även om härledning är ett alternativ för att störa ekvivalensen av stereoisomeriska grupper11, kräver det omfattande provberedning. Ett annat, enklare alternativ är att koppla ihop MS med en analytisk dimension som är känslig för isomerism, till exempel IMS.

Eftersom det här protokollet är utformat för användare som redan är bekanta med de grundläggande begreppen IMS, och eftersom detaljerade granskningar finns tillgängliga någon annanstans12,13, ges endast en kort översikt över principerna för IMS här. IMS är en gasfasseparationsmetod som bygger på interaktionen mellan joner med en buffertgas och ett elektriskt fält, vilket i slutändan separerar joner enligt deras gasfaskonformationer. Olika principer för IMS kopplade till MS finns på kommersiella instrument: vissa arbetar på alternerande höga och låga elektriska fält (fältasymmetriska IMS, FAIMS), medan de flesta arbetar inom den låga fältgränsen - särskilt driftrör IMS (DTIMS, linjärt minskande elektriskt fält), resande våg IMS (TWIMS, symmetriska potentiella vågor) och fångade IMS (TIMS, högt flöde av buffertgasfångsjoner mot elektriska fält)13 . Lågfältsmetoderna ger tillgång till en så kallad CCS, en egenskap hos jongasparet som representerar ytan (i Å2 eller nm2) av den jon som interagerar med buffertgasen under separationen. CCS är teoretiskt instrumentoberoende och är därför användbart för att generera data som kan reproduceras mellan olika laboratorier14. Jonrörlighetsseparationer kan påverkas av olika parametrar och särskilt av fluktuationer i gastrycket och gastemperaturen i mobilitetscellen. CCS-kalibreringen är ett sätt att åtgärda detta, eftersom både kalibreringen och arten av intresse kommer att påverkas på samma sätt13. Det är dock obligatoriskt att installera instrumentet i ett temperaturstyrt rum och att ha ett tillförlitligt gastryckskontrollsystem.

En intressant utveckling av IMS är IMS/IMS, som först introducerades 2006 av Clemmers grupp som en analog till MS/MS15,16. I IMS/IMS isoleras en del av intresse selektivt på grundval av dess jonrörlighet. Den aktiveras sedan (tills det är möjligt fragmentering) och en ny IMS-analys av den aktiverade jonen eller fragmenten utförs. I den första instrumentala designen sattes två IMS-celler i serie, åtskilda av en jontratt där aktiveringen stod. Sedan dess, även om ett antal IMS/IMS-inställningar föreslogs (för en granskning, se Eldrid och Thalassinos17), blev den första kommersiella masspektrometern med IMS/ IMS-kapacitet tillgänglig först 201918. Detta instrument förbättrade avsevärt det ursprungliga konceptet genom att kombinera det med ett annat tekniskt genombrott: en cyklisk design av IMS-cellen.

Den cykliska IMS-cellen tillåter teoretiskt att nästan oändligt öka drivbanans längd och därmed instrumentets upplösningskraft19. Detta uppnåddes med hjälp av en viss instrumentgeometri, där den cykliska TWIMS-cellen placeras ortogonellt till huvudjonens optiska axel. Ett multifunktionsmatrisområde vid ingången till IMS-cellen gör det möjligt att styra jonbanans riktning: i) skicka joner i sidled för IMS-separation, (ii) framåt för MS-identifiering eller (iii) bakåt från IMS-cellen som ska lagras i en prearraycell. Från denna prearray-lagercell kan jonerna aktiveras och fragmenten återföras i IMS-cellen för jonrörlighetsmätning, ett tillvägagångssätt som framgångsrikt har använts för att karakterisera stereoisomerer20. I slutändan innehåller de insamlade uppgifterna jonrörlighet och m/z-information för föregångaren och dess fragment.

I en nyligen publicerad publikation som använde denna cykliska design för glykananalyser (Ollivier et al.21) visade vi att mobilitetsprofilen för fragmenten i sådana IMS/IMS-data fungerar som ett fingeravtryck av en biomolekyl som kan användas i en molekylär nätverksstrategi. Det resulterande nätverket, kallat IM-MN, ledde till att glykomiska datamängder organisationsuppsättningar organiserades på ett strukturellt relevant sätt, medan nätverket som enbart byggdes av MS/MS-data (MS-MN) avslöjade lite information. För att komplettera den här publikationen och hjälpa cykliska IMS-användare att implementera det här arbetsflödet innehåller det här protokollet en fullständig beskrivning av protokollet som används för att samla in data. Det här protokollet fokuserar bara på generering av IMS/IMS-data som användare sedan kan använda för att skapa IM-MN-nätverk (se21) – eller för något annat program som de väljer. Byggande av IM-MN kommer inte att övervägas häri, eftersom protokoll för molekylära nätverk redan finns tillgängliga22. De avgörande punkter som måste följas för att generera värdefulla och reproducerbara IMS/IMS-förvärv lyfts fram. Tar exemplet med en av de oligosackarider som ollivier et al har studerat. 21 skall följande steg anges: i) provberedning, ii) justering av det kykiska IMS-instrumentet, iii) automatisk toppplockning av data och iv) CCS-kalibrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: En översikt över protokollet finns i figur 1. De parametrar som används för de experiment som beskrivs i detta protokoll finns i kompletterande tabell S1 och kompletterande tabell S2.

1. Beredning av provlösningen

OBS: Protokollet beskrivs med hjälp av en arabinoxylan pentasackarid (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose eller XA2XX; se tabellen över material) som ett exempel.

  1. Beredning av lösningsmedlet: 500 μM LiCl i 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Förbered en 100 mM lagerlösning av litiumklorid (LiCl) i H2O genom att väga 212 mg LiCl och tillsätt 50 ml hög renhet avjoniserat vatten (H2O) i ett 50 mL polypropylenkoniskt rör. Skaka tills den är helt upplöst.
      OBS: Lösningsmedlet är dopat med ett litiumsalt för att främja bildandet av [M+Li]+ adduat i jonkällan för spektrometern, eftersom det vanligtvis ger fragmenteringsspektra av bättre kvalitet jämfört med andra alkalitillägg. Användning av LiCl rekommenderas eftersom organiska syror (och därmed deras salter) tidigare har visat sig påverka IMS-profiler23.
    2. Späd LiCl-stamlösningen 200x till 250 μL av stamlösningen och tillsätt 24,75 ml H2O. Tillsätt 25 ml metanol (MeOH) för att nå en slutlig koncentration av LiCl på 500 μM år 50:50 H2O:MeOH (v/v). Sonikera i 2 minuter för att avgasa lösningsmedlet.
      OBS: MeOH utgör en hälsorisk (H225, H301, H311, H331, H370); manipulera under en extraktorhuv med en labbrock, handskar och ögonskydd. En andel av 50:50 MeOH/H2O (v/v) verkar vara det bästa lösningsmedlet för jonisering av oligosackarider; MeOH kan dock vid behov ersättas med acetonitril (ACN).
  2. I ett 1,5 mL polypropylenrör, väg 1 mg av kolhydraterna. Lös upp med en lämplig volym på 500 μM LiCl för att nå en koncentration på 1 mg/ml. Späd till en slutlig koncentration på 10 μg/ml i 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl. Förvara vid 4 °C.
    OBS: Koncentrationen av 10 μg/ml valdes för att optimera signalen över alla fragmentjoner under IMS/IMS-MS (detta är för en ren förening; öka koncentrationen vid arbete på blandningar). För förvärv av referens-IMS/IMS-spektra ska du inte späda ut provet ytterligare: Mättnad av MS-detektorn före fragmentering förväntas, även om instrumentet erbjuder alternativ för att korrigera det (se steg 3.2.).

2. Justering av den cykliska IMS-masspektrometern

Programrelaterade instruktioner (fönster, menyer och kommandon) markeras i fetstil.

  1. Öppna instrumentkonsolen från instrumentkontrollprogramvaran (MS-tunesidan , se programvaruinformationen i tabellen över material) och sätt instrumentet i driftsläge . Vänta i minst 3 timmar tills de höga spänningarna stabiliseras i IMS-cellen.
    OBS: För bästa reproducerbarhet måste spänningarna i IMS-cellen vara helt stabiliserade. Slå på de höga spänningarna och låt instrumentet stabiliseras över natten före någon cyklisk IMS-analys. Dessutom måste trycket och temperaturen i jonrörscellen hållas så konstant som möjligt. Även om det finns en återläsning för trycket på fliken Vakuum är ingen återläsning tillgänglig för temperaturen. Förvara instrumentet i ett termostatlaboratorium. Instrumentet som används i detta arbete arbetar på 1,75 mbar i ett laboratorium som är termostat vid 20 °C.
  2. Cyklisk iMS-instrumentinställning
    OBS: Standardlösningar måste infunderas med hjälp av det inbyggda fluidiksystemet för instrumentinställningen.
    1. Placera fluidikbehållare fyllda med lämpliga standarder från tillverkaren på fluidiksystemet: Reservoir B (nedan(Lockmass): 10 pg/μL leucinenkefalin (LEU ENK) i 50:50 ACN/H2O + 0,1 % myrsyra. Reservoar C ('Calibrant'): MajorMix.
      OBS: I detta protokoll kommer MajorMix kalibreringslösning att användas för att kalibrera både m/z - och CCS-dimensionerna. Av praktiska skäl kommer en extern CCS-kalibrering att utföras (se steg 5 i protokollet); Därför är det också möjligt att använda en intern kalibrerblandning för CCS och en annan kalibrant för m/z (t.ex. natriumformat eller natriumjodid).
    2. Gå till fliken Fluidics på sidan Tune på Quartz-konsolen. Ställ in provflukiken på reservoar C och referensvätskan till reservoar B. Infusera båda lösningarna i följd i jonkällan för att kontrollera MS-signalen.
    3. Utför ADC-installationen, detektorinställningen (med hjälp av LEU ENK) och masskalibrering (se tabellen över material för kalibreringslösningen) från sidan För instrumentinställningar enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Registrera ett IMS-förvärv av kalibreringslösningen med en enda passseparation (använd detta för extern IMS-kalibrering).
    OBS: Jonkällan och parametrarna för den resande vågen (TW) (statisk våghöjd och våghastighet) måste hållas konstanta under alla förvärv (kalibrering och förvärv). Om användaren inte har förkunskaper om de optimala parametrarna för sitt prov kan detta steg utföras efter steg 3 i protokollet (för [M+Li]+ adducts av neutrala oligosackarider, de representativa resultaten använder en TW-höjd på 16 V och TW hastighet på 350 m/s, vilket ger bästa resultat).
    1. På fliken Fluidics väljer du baffelposition Prov och infuserar kalibranten (se materialtabellen) i jonkällan (med hjälp av det inbyggda fluidiksystemet) genom "Provsonden" med en flödeshastighet på 10 μL/min.
    2. Konfigurera en IMS-sekvens med ett enda pass. På sidan Tune placerar du instrumentet i mobilitetsläge och öppnar fönstret Cyklisk sekvenskontroll. Välj avancerat läge. Välj Lägg till paket på fliken cykliska funktioner i det här nya fönstret och sedan Enkel/Multipass. Vänta tills en sekvens av mobilitetshändelser visas på fliken Sekvens i samma fönster.
      OBS: För att aktivera realtidsdisplayen måste användaren tillämpa instrumentparametrarna: klicka på Tune in TOF-läge eller Kör i mobilitetsläge . Innan du byter instrument mellan TOF - och mobilitetslägena är det nödvändigt att avbryta alla anskaffningar som körs ( inklusive tune-sidvisningen ). Det relativa överflödet av joner kan variera mellan TOF-läge och mobilitetsläge på grund av förändringar i jonöverföringsparametrarna.
    3. Anpassa sekvensen så att alla calibrantjoner gör ett enda pass runt den cykliska IMS-racerbanan. Ändra inte injektionstiden eller utmatningen och skaffa tid. Sänk dock den separata tiden till 1 ms (på fliken Sekvens ). Om vissa joner av kalibreringsblandningen inte får plats i det visade ankomsttidsfönstret ändrar du synkroniseringen av IMS med pushern för den ortogonala accelerations-TOF-analysatorn genom att öka antalet pushar per lagerplats på fliken ADC-inställningar .
      Tiderna i kontrollsekvensen styr bara multifunktionsmatrisen för jon gating. Så länge jonerna är engagerade i sin första (eller n: e) passning runt racerbanan, kommer de att avsluta nämnda pass även om riktningen på TW har ändrats i matrisen under tiden. Om separationstiden sänks till 1 ms växlar matrisen till utmatningsläge efter 1 ms. Detta säkerställer att de snabbare jonerna inte har tillräckligt med tid att passera genom matrisen och engagera sig i ett andra pass innan de långsammare jonerna avslutar sitt första pass. Därför kommer alla joner att utsättas för samma antal pass (dvs. ett pass), vilket är nödvändigt för att utföra IMS-kalibrering.
    4. Spela in ett 2-minuters förvärv. I fönstret Cyklisk sekvenskontroll klickar du på Hämta för att öppna popup-fönstret Anskaffningsinställningar . Ange filnamn, beskrivning och anskaffningslängd (minuter) och klicka på Spara.
  4. Registrera ytterligare 2 minuters förvärv av kalibreringslösningen under samma förhållanden som steg 2.3 (använd detta för att kontrollera kvaliteten på CCS-kalibreringen). I fönstret Cyklisk sekvenskontroll klickar du på Hämta för att öppna popup-fönstret Anskaffningsinställningar . Ange filnamn, beskrivning och anskaffningslängd (minuter) och klicka på Spara.
  5. Tvätta fluidiksystemet noggrant med 50:50 H2O/ACN för att undvika kristallisering av kalibranten i kikarslangen.

3. Förvärv av IMS/IMS-MS

  1. Använd en sprutpump och infusera (litiumdumpad) provet vid 10 μg/ml genom provsonden med en flödeshastighet på 10 μL/min.
  2. Växla instrumentet till TOF-läge (från MS-tunesidan ) för att kontrollera signalens stabilitet. Registrera ett fullständigt MS-förvärv (1 min) av provet, vilket kommer att vara användbart för att kontrollera isotopmönstret och förekomsten av potentiella föroreningar.
    OBS: Eftersom provkoncentrationen väljs för att erhålla en bra jonsignal för fragmenten kan en TOF-mättnad observeras i detta steg. TOF-mättnad kan identifieras med hjälp av följande artefakter: i) en artificiellt ökad MS-upplösning, ii) en förändring av isotopförhållanden och iii) en mängd lågförekomsttoppar mellan isotoper. Använd fliken DRE-objektiv (Dynamic Range enhancement, Quad/MS Profile/DRE på huvudsidan) för att dämpa överföringen av joner och kassera mättnaden i TOF-läge (bild 2A,B).
  3. Placera instrumentet i MSMS-läge (fliken Quad/MS Profile på huvudsidan Stämma ) och välj massan av den riktade jonen i MSMS Mass-fältet för isolering i fyrbäddslingen (i exemplet: m/z på 685,2, motsvarande [M+Li]+ joniska arter av arabinoxylan pentasackarid). Registrera ett 1 minuters förvärv för att kontrollera prekursor isoleringen när data bearbetas.
    OBS: Litium adducts har en isotop vid -1 Da av den monoisotopic toppen, som måste tas bort från MS / MS urvalsfönstret så att det inte kommer att störa bearbetningsstegen. Det kan tas bort genom att begränsa markeringsområdet med parametrarna LM-upplösning och HM-upplösning på fliken Quad/MS Profile (bild 2C).
  4. Ställ in en "skivningssekvens" i IMS för att utföra ett mobilitetsbaserat urval av den isomer som är av intresse.
    1. Växla instrumentet till mobilitetsläge (se steg 2.3.2). I fönstret Cyklisk sekvenskontroll väljer du Lägg till bunt på fliken cykliska funktioner i fönstret Cyklisk sekvenskontroll och sedan skivning. Vänta tills en komplex sekvens av mobilitetshändelser visas på fliken Sekvens (bild 3).
      Det är möjligt att visualisera varje steg i IMS/IMS-processen: klicka på händelsen Mata ut och Hämta på fliken Sekvens . När den har markerats i rött flyttar du den till lämplig plats i sekvensen med knapparna Upp och ned .
    2. Placera händelsen Mata ut och hämta direkt efter den första separata händelsen (dvs. flytta den på rad 3 i stället för rad 8 i sekvensen som visas i bild 3) och klicka sedan på Kör. Leta efter resultaten av den första separationen som ska visas i realtid. Öka varaktigheten för den första separata händelsen för en separation med flera steg genom att ändra tidsvärdet för den här händelsen i sekvensen tills upplösningen för IMS-topparna är tillfredsställande. Registrera ett 1 minuters förvärv som referens.
      OBS: Notera ADC Start Delay-värdet på fliken ADC-installation : det kommer att vara användbart att kontrollera isoleringens kvalitet.
    3. Klicka på Paus. Observera att resultatet av den första separationen visas, även om ändringar i kontrollsekvensen inte tillämpas förrän användaren klickar på Kör igen. Placera händelsen Mata ut och hämta under utmatningen, mata ut till förlagring och Håll och mata ut händelser. Justera varaktigheten för händelserna så att den riktade toppen finns i utmatningen till förlagringsregionen och alla andra ioner antingen finns i området Mata ut eller Håll och mata ut .
      OBS: Varaktigheten för dessa tre händelser jämfört med ankomsttidsfördelningarna (ATD) kan visualiseras med hjälp av den färgkodade stapeln under mobilitetsspektrumet på fliken Mobilogram (bild 3).
    4. Placera händelsen Mata ut och hämta i slutet av sekvensen, under reinject från förlagring och den andra separata händelsen. Klicka på Kör om du vill visa den valda populationen.
      OBS: Eftersom den valda populationen har lämnat IMS-cellen har all tidigare separation gått förlorad och den är tillbaka till en separation med ett enda pass (vilket önskas).
    5. Kontrollera isoleringens kvalitet. För att kontrollera att endast den högsta intressetoppen har valts, utför samma separation efter återinmatning som före återinmatning (dvs. samma separata tid) som visas i figur 4. Registrera ett 1 minuters förvärv som referens.
      OBS: Användarna uppmuntras att kontrollera den utstötta populationen; Tidsfönstret Mata ut till förlagring bör vara baslinjenivå (bild 4B). Kontrollera detta genom att placera ADC Start Delay i manuellt läge på fliken ADC-inställningar och ange den fördröjningstid som anges i steg 3.4.2. Registrera ett 1 minuters förvärv som referens.
    6. Leta efter de summerade tiderna för alla händelser i kolumnen bredvid de användardefinierade händelsetiderna (kolumnen Time Abs, markerad i rött) i kolumnen bredvid de användardefinierade händelsetiderna (kolumnen Time Abs , markerad i rött). Notera time abs som finns på linjen för Reinject från Pre-Store-evenemanget för att utföra CCS-kalibreringen.
  5. Fragmentera den riktade toppen mellan de två omgångarna av IMS. Ändra spänningarna i återinjektionssteget för att öka jonernas kinetiska energi och fragmentera dem vid kollision med jonrörsgasen.
    1. Ange varaktigheten för den separata händelsen direkt före utmatningen och Hämta till 1 ms (se förklaring i steg 2.3.3).
    2. Markera rutan Aktivera aktivering på raden Återföd från Förlagring och optimera fragmenteringen med den inbyggda kontrollen. Om spektrumet är tillfredsställande (t.ex. bastoppen är ett fragment), fortsätt direkt till steg 3.5.4.
      OBS: Vid aktivering blir tre spänningar på linjen grå: det här är de spänningar som användaren behöver ändra om manuell optimering av spänningarna krävs (se nästa steg). Dessa tre spänningar (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias och Array Offset) bildar den övertoning som används för att aktivera jonerna. Jonernas kinetiska energi ökar med lutningen mellan prematrisförskjutningen och matrisförskjutningen (se bild 5). Standardvärdena för värdena för gradient → bias → offset är: utan aktivering 85 → 70 → 45 V; maximal aktivering av den inbyggda funktionen 185 → 170 → -5 V (+150 V). Efter fragmentering, glöm inte att justera jonöverföringen med HJÄLP AV DRE-linsen (minska dämpningen av signalen) (se steg 3.2.).
    3. Om fragmenteringen inte är tillfredsställande med den inbyggda kontrollen avmarkerar du rutan Aktivera aktivering och fortsätter med att manuellt optimera återutmatningsspänningarna. Öka spänningen för förmatt arraygradient ( pre-array bias-spänningen måste alltid hållas 15 V under pre-array gradienten) och sänk matrisförskjutningsspänningen (som kan ställas in som negativ) tills resultaten är tillfredsställande.
      OBS: När användaren manuellt justerar spänningarna i multifunktionsmatrisen kan han eller hon växla från vyn "Mobilogram" till interaktiva scheman för de spänningar som tillämpas i pe-diagrammet (Multifunction Array) för att bättre visualisera spänningsinställningarna (bild 5A).
    4. Spela in ett förvärv på 2 minuter. I popup-fönstret för förvärv markerar du alternativet Behåll drifttid för att generera en fil som endast innehåller ankomsttiderna jämfört med m/z (förvärvstiden som används för kromatografiska analyser - kvarhållningstiden - tas bort från filen). Observera att den här filen är märkt *_dt. RÅ.
      OBS: Om användaren glömmer att kontrollera alternativet Behåll drifttid är det fortfarande möjligt att extrahera IMS-dimensionen med programvaran Driftscope 2.9 (Arkiv | Exportera till MassLynx | Behåll drifttiden).
  6. Vrid tillbaka instrumentet till TOF-läge på huvudsidan och skölj systemet noggrant med 50:50 MeOH/H2O innan du fortsätter med nästa prov.

4. IMS/IMS-MS-bearbetning med MZmine 224

MZmine 2 är tillgänglig från webbadressen som anges i materialförteckningen. Användning av MZmine 2.51 rekommenderas. Vid tidpunkten för utarbetandet av detta manuskript kan de senare versionerna inte öppna RAW-filer från cykliska IMS-instrument på grund av en förändring i importfunktionen.

  1. Importera de råfiler som endast innehåller IMS - och m/z-dimensionerna (*_dt. RAW) med raw-datametoder | Import av rådata.
    OBS: Råa filer visas till vänster i huvudfönstret för MZmine. Importera inte originalet *. RAW-filer som fortfarande innehåller dimensionen kvarhållningstid. MZmine skiljer inte lagringstid från IMS ankomsttid, och datapunkterna för båda dimensionerna skulle överlappa varandra.
  2. Optimera arbetsflödesparametrarna för en representativ fil genom att välja den i Rådatafiler lista.
    1. Utvärdera ljudnivån i data. Högerklicka på filen i listan Rådata filer , välj Visa TIC och visa bastoppen "kromatogram" (BPC). Dubbelklicka på den minsta topp som kan observeras med öga för att visa dess massspektrum. Tänk på att ljudnivån i data ligger runt den andra isotopen i bastoppen i det här spektrumet och använd samma värde för alla intensitetströsklar i följande bearbetningssteg.
      OBS: Uppgifterna förvärvades med hjälp av fyrdubbla isolering och betraktas därför av MZmine som MS/MS. Under hela MZmine-bearbetningen, var noga med att arbeta på en MS-nivå = 2.
    2. Utför massidentifieringen med raw-datametoder | | Massidentifiering. För data som har förvärvats i profilläge använder du Wavelet-transformeringsalgoritmen . För att ställa in parametrarna för algoritmerna i MZmine, klicka på [...] -knappen bredvid algoritmen och använd alternativet Visa förhandsgranskning för att visualisera data samtidigt som parametrarna optimeras.
      I det här skedet visas de toppar som valts av algoritmen i rött i förhandsgranskningsfönstret. När du använder wavelet transform-algoritmen på proprietära RAW-filer kommer MZmine ibland att missta profildatapunkterna för centroided toppar. Programvaran visar ett meddelande om att användaren kör en profilalgoritm på centroided spektra: ignorera det här meddelandet och klicka på OK.
    3. Rekonstruera det extraherade jonrörlighetsspektrat (EIM) för varje fragmentmassa med hjälp av Raw-datametoder | | ADAP Chromatogram builder på masslistan "massor" som genererades av föregående steg. Eftersom m/z-toleransingången i detta skede är en skanningstolerans, se till att lämna den minst 3-4 gånger högre än den totala förväntade noggrannheten.
    4. Eftersom föregående steg inte har något förhandsgranskningsalternativ kontrollerar du kvaliteten på toppplockningen direkt med hjälp av funktionslistan som visades på den högra panelen i huvudfönstret för MZmine. Öppna funktionslistan, markera alla rader, högerklicka och välj Visa/XIC (dialogruta). Klicka på Alla om du vill visa alla joner på mobilitetsspektrumet. Inspektera de plockade topparna som visas i färg för att säkerställa att det inte finns några uppenbara missade toppar.
    5. Dekonstruera EE-skivorna för att dela m/z som innehåller olika toppar i flera funktioner. Använda funktionslistemetoder | | Chromatogram deconvolution och välj Wavelets (ADAP) algoritmen. Optimera algoritmen för data med alternativet Visa förhandsgranskning och följande nyckelparametrar: S/N-tröskelvärde, koefficient-/områdeströskel och RT-vågområde.
      OBS: Kontrollera aspekten av det decentraliserade spektrumet rekommenderas. Använd visualiseringsverktyget för kromatogram enligt beskrivningen i steg 4.2.4. De decentraliserade topparna kommer att visas i färg, och toppar av samma massa bör delas, som presenteras i figur 6A.
    6. Deisotopera de decentraliserade EVE:erna med hjälp av funktionslistemetoder | Isotoper | Isotopiska toppar grouper. Använd instrumentets förväntade noggrannhet för m/z-toleransvärdet och ställ in toleransen för ankomsttid till 0,1 ms (visas i MZmine som retentionstidtolerans 0,1 min), eftersom isotoper inte löses under IMS-separationen. Kontrollera funktionslistan: om några isotoper finns kvar ökar toleransvärdena.
      OBS: Även om deisotopningen teoretiskt kan utföras när som helst under bearbetningen av funktionslistan, är det viktigt att göra det sist så att laddningsvärdena kan exporteras (algoritmerna som används för de andra stegen tar ibland bort laddningstillståndsinformationen).
  3. Om du bearbetar flera IMS/IMS-MS-spektra upprepar du bearbetningen med dessa optimerade parametrar. Behåll samma parametrar för alla spektra.
  4. När det gäller flera spektra grupperar du dem i en enda tabell för att exportera dem. Om inte, hoppa direkt till steg 4.5. Om du vill gruppera spektrat använder du funktionslistemetoder | Justering | Gå med i justeraren. Eftersom målet inte är att justera topparna använder du restriktiva toleransvärden för både m/z och ankomsttid. Ge samma vikt till båda dimensionerna.
  5. Exportera den slutliga funktionslistan till en *.csv-fil . Använda funktionslistemetoder | Exportera/importera | Exportera till CSV-fil och exportera följande värden: Exportera rad m/z, Exportera kvarhållningstid för rad (den faktiska ankomsttiden för IMS), Topp m/z och Topphöjd. Använd ett kommatecken som fältavgränsare.

5. TWCCSN2 av det centroided IMS/IMS-spektra

OBS: I detta protokoll kommer en logaritmisk passformskalibrering25,26 att användas, vilket tenderar att ge bättre resultat än linjär kalibrering och är lätt att implementera i ett kalkylblad eller ett internt bearbetningsskript. Ett internt skript (skrivet i R) finns på webbadressen som anges i materialförteckningen.

  1. Välj referens ankomsttidsvärden från calibrant-förvärvet (se steg 2.3). Gör detta manuellt med hjälp av konstruktörsprogramvaran (se tabellen över material) för att kontrollera aspekten av alla IMS-calibranttoppar.
    1. Öppna *_dt i fönstret Kromatogram. RAW-fil som motsvarar kalibranten.
    2. För varje kalibreringspunkt genererar du EIM med displayen | Massalternativ .
    3. Kontrollera profilen för EIC:erna. Om vissa är dåligt definierade jämnar du ut dem med | Smidigt alternativ (eftersom de bästa resultaten vanligtvis erhålls med Savitzky-Golay-algoritmen, smidigt 2 gånger över 3 fack). Rapportera apex-värdena i ett kalkylblad.
      Eftersom referenspunkterna i allmänhet förvärvas med DTIMS-enheter med låg upplösning kan vissa multimodala distributioner visas i cykliskt IMS beroende på kalibreringarna. Ta bort en topp som presenterar en sådan fördelning från kalibreringslistan.
  2. Beräkna de logaritmiska passformsparametrarna från kalibrerna.
    1. För alla kalibreringspunkter, beräkna följande.
      1. Beräkna drifttiden med Eq (1):
        Equation 1 (1)
        med td drifttiden, tA den uppmätta ankomsttiden och tinj injektionstiden i IMS-cellen (allt i ms).
        OBS: För små molekyler, såsom oligosackariderfragment, ligger dödtiden (flygtiden mellan utgången från IMS-cellen och detektorn) variationen mellan olika massor inom felområdet för CCS-kalibreringen och kan ignoreras.
      2. Beräkna jonernas neutrala massa med Eq (2):
        Equation 2 (2)
        med z jonens laddningstillstånd och mion massan av motjonen (i Da). Använd exakta massor för att undvika att införa osäkerhet. Om det finns en atomförlust i stället för en motjon, använd negativa mionvärden (t.ex. för [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Beräkna CCS parameter med Eq (3):
        Equation 3 (3)
        med CCS referensdriftsröret DTCCSN2-värde (i nm2) och mgas massan av drivgasen (i Da; ex. för kväve: mgas = 28,01 Da).
      4. Beräkna td-parametern med Eq (4):
        Equation 4 (4)
        med d detektorstartfördröjningen som används experimentellt för att korrigera för dödtid (vanligtvis ~ 1,5 ms).
      5. Beräkna logarithm för ovanstående parametrar:
        ln (CCS' och ln (t'd)
    2. Utför en linjär regression för att bestämma R2-koefficienten och x - och y-parametrarna för den logaritmiska passformen (med x lutningen och ln(y) skärningspunkten) med Eq (5):
      Equation 5 (5)
      OBS: Användaren kan rita värdena ln (CCS) vs ln(td') för att visuellt kontrollera resultatet av kalibreringen, även om detta är valfritt.
  3. Tillämpa kalibreringen på experimentella data för att kalibrera topparna som valts av MZmine för varje IMS/IMS-spektrum som exporteras till *.csv-filen. Beräkna följande för varje punkt.
    1. Beräkna drifttiden med Eq (6):
      Equation 6 (6)
      med tseq tiden före den slutliga IMS-separationen (värdet "Time Abs" anges i steg 3.4.6).
      OBS: Om kalibrering av flera IMS/IMS-spektra som förvärvats med olika sekvenser, kontrollera noggrant tseq-värdena.
    2. Beräkna jonernas neutrala massa med Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Beräkna parametrarna td' och td'' med eq (8) och Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Beräkna de slutliga kalibrerade CCS-värdena (TWCCSN2 i nm2) med Eq (10):
      Equation 10 (10)
      OBS: Även om steg 5.2.2. ger ln(y) som avlyssning, måste y användas för att erhålla det slutliga CCS-värdet. Glöm inte att använda en exponentiell funktion.
  4. Kontrollera kalibreringens noggrannhet genom att tillämpa kalibreringen på det andra förvärvet av kalibreringslösningen som förvärvats i steg 2.4.
    OBS: Kalibreringen ska ge resultat med ett fel på ~1-2%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En arabinoxylan pentasackarid, XA2XX, valdes som ett exempel för att illustrera detta protokoll. Denna förening är kommersiellt tillgänglig, men endast som en blandning med en annan arabinoxylan pentasackarrid, XA3XX (ren XA3XX är också kommersiellt tillgänglig). Strukturerna i XA2XX och XA3XX anges i kompletterande figur S1. Eftersom förhållandet mellan XA2XX och XA3XX i den kommersiella blandningen är ~50:50, förbereddes en lösning vid 20 μg/ml av blandningen för att nå en XA2XX-koncentration på ~10 μg/mL i 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl.

För det första utfördes en MS-analys av XA2XX + XA3XX-blandningen med hög upplösning ms. Eftersom de två föreningarna är isomerer observerades en enda topp vid [M+Li]+m/z 685.24. Denna MS-topp valdes med fyrdubbla och urvalsfönstret justerat för att ta bort -1 Da litiumisotoper, som kan misstas som den monoisotopic toppen genom bearbetningsalgoritmer (bild 2).

[M+Li]+ adducts av pentasackarider skickades sedan till det första steget i IMS-separation: efter 3 pass runt den cykliska IMS-cellen separerades 3 toppar med ankomsttider på 83, 90 och 94 ms. Denna profil jämfördes med den för ren XA3XX (infunderad vid 10 μg/ml), vilket visade att topparna på 83 och 90 ms motsvarade XA3XX, medan topp på 94 ms motsvarade XA2XX (figur 4A). Topp på 94 ms valdes för IMS/IMS analys: jonerna som tillhör XA3XX kastades ut (figur 4B), och topp av intresse skickades till prearray lagra cellen. En 3-pass separation utfördes efter återinlägga jonen utan aktivering för att säkerställa att endast XA2XX-toppen återstod efter valet (anländer till 199 ms i figur 4C).

Sedan fragmenterades jonen vid reinjection från förhandeln området, och en enda-pass IMS separation utfördes på alla fragment. Två olika aktiveringar provades: den maximala inställningen för den inbyggda aktiveringsfunktionen för förhandeln provades först (figur 5B, C); Föregångaren förblev dock spektrumets bastopp. Detta är inte önskvärt eftersom fragment under ett visst tröskelvärde för referensspektra vanligtvis skulle tas bort. Således valdes en manuellt definierad prearray-gradient → förmatt arrayförskjutning → matrisförskjutningsspänningsgradient (figur 5D,E).

De genererade IMS/IMS-MS-data deconvolved med MZmine 2.51, med hjälp av ankomsttiden och m/z dimensioner (figur 6A), för att ge IMS/IMS spektra som endast innehåller rörlighetsinformation för fragmenten. Topparna över 0,2 % relativ intensitet exporterades för CCS-kalibrering (de detaljerade MZmine-parametrarna anges i kompletterande tabell S1). CCS-kalibreringen utfördes med kalibreringslösningen (R2 = 0,995, genomsnittlig absolut avvikelse från kontrollen = 1,63%, se Kompletterande tabell S3). Denna bearbetning gav slutligen ett centroided, CCS-kalibrerat, IMS/IMS-spektrum (figur 6B).

Figure 1
Bild 1: Översikt över datagenereringsprocessen IMS/IMS. Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Isotopmönster hos en XA3XX + XA2XX arabinoxylan pentasackaridblandning. B) Signal korrigerad med DRE med en jonöverföring på 5 % (dvs. 95 % dämpning). och (C) profil efter fyrdubbelt val för att ta bort -1 Da-toppen som motsvarar en litiumisotop. Lila: regionen där artefakttoppar kan visas på grund av mättnad förstoras 6 gånger. Förkortningar: DRE = dynamisk omfångsförbättring; MS = masspektrometri; MSMS = tandem MS; LM Res = låg massupplösning; HM Res = hög massupplösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Översikt över kontrollfönstret Cykliskt IMS, där användaren definierar IMS/IMS-sekvensen. Sekvensen som visas visar hur du kontrollerar isoleringens kvalitet i IMS/IMS, med ett urval av XA2XX efter 3 pass (spektrumet som visas motsvarar inställningen av urvalshändelserna efter separationen i första steget). Sekvensen består i att köra en första 3-pass IMS-separation över 58 ms, sedan mata ut de två snabbare isoformerna från IMS-cellen (segment 3), mata ut den långsammare isoformen (ATD mellan 92 och 96 ms) i förhandeln (segment 4), återinföra den i IMS-cellen utan aktivering (segment 6), vilket gör att jonerna kan genomgå ytterligare 3-pass (58-ms) separation (segment 7), sedan mata ut joner från IMS-cellen och hämta data (segment 8). Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; cIMS = cykliskt IMS; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = analog till digital omvandlare; TW = resande våg; PE = potentiell energi; ATD = fördelning av ankomsttid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Urval av XA2XX från blandningen av XA2XX och XA3XX. (A) Separation av arabinoxylan pentasackarider, XA3XX och XA2XX, efter 3 pass (motsvarande en separationstid som fastställts till 58 ms) runt den kykiska IMS-cellen. B) Fraktion som matas ut direkt efter den första etappen av IMS-separationen. (C) Bråk som valts för IMS/IMS där ytterligare 3-passseparation utfördes efter återinmatning. XA2XX-toppen av intresse markeras i grått. Jonrörlighetsspektrat visas i datafack och kommenteras med deras ankomsttid (ms). Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Principer för kollisionsinducerad dissociation med hjälp av förarray-lagerområdet. (A) Scheman för multifunktionsmatrisregionen som beskriver nyckelspänningar (i rött) som används för valet, återinmatningen och aktiveringen under IMS/IMS-experiment. De blå pilarna visar färdvågens riktning i multifunktionsmatrisen. (B, C) IMS/IMS och MS/MS-spektra som erhållits för XA2XX med hjälp av den inbyggda aktiveringsfunktionen före lagret (+150 V). Färgfältet representerar jonintensitetsskalan (blå = låg; röd = hög). (D, E) IMS/IMS och MS/MS-spektra erhållna för XA2XX med manuell optimering av spänningarna (prearraygradient 195 V, prearray bias 180 V, matrisförskjutning -10 V). Prekursorjoner indikeras av asterisker på spektrat. Jonrörlighetsspektrat visas i datafack och kommenteras med deras ankomsttid (ms). Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = flygtid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Bild 6: Illustration av bearbetningsstegen. Resultat av (A) MZmine toppplockning och (B) CCS-kalibrering av arabinoxylan pentasackarid XA2XX. A visar massdekonteringen av IMS/IMS-spektrumet genom en färgkod. B visar det slutliga IMS/IMS-spektrumet efter centroiding och CCS-kalibrering. Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisions tvärsnitt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: En jämförelse av två IMS/IMS-spektra av XA2XX illustrerar metodens reproducerbarhet. Det slutliga kalibrerade spektrumet från detta papper (överst) jämförs med spektrumet från ollivier et al.s arbete. 21 (nederkant, vänd). Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisions tvärsnitt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur S1: Strukturer av XA2XX och XA3XX arabinoxylan pentasaccharides. Klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur S2: Utvärdering av repetitionsbarheten mellandagarna med XA2XX. IMS/IMS förvärv upprepades på dag 1 (överst) och dag 95 (nedersta). Förkortningar: IMS = jonrörlighetsspektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Detaljerade MZmine-parametrar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell S2: Instrumentparametrar ändrade för att utvärdera reproducerbarheten. Förkortning: ESI = elektrosprayjonisering. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell S3: Kontroll av CCS-kalibreringen med ett andra förvärv av kalibreringslösningen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELECT SERIES Cykliska IMS är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att välja en definierad jonpopulation – av en given m/z- och jonrörlighet – utan behov av kromatografisk separation uppströms. Instrumentet ger möjlighet att ta fram en tvådimensionell fragmenteringskarta över denna jonpopulation, från vilken både MS/MS och IMS/IMS-spektra kan extraheras. Användaren måste dock notera flera kritiska punkter som kräver uppmärksamhet under den experimentella processen.

För det första bör användaren noggrant kontrollera MS-isoleringsfönstret för förekomst av möjliga isobariska föroreningar. Isoleringsfönstret för en fyrdubbel är faktiskt relativt brett, och att känna till joner av en något annorlunda m / z som kan väljas i fyrdubbla hjälper användaren att korrekt tilldela toppen av intresse för jonrörlighet.

För det andra måste användaren se till att alla joner genomgår samma antal passningar runt den kykiska jonrörlighetscellen när den utför den första separationen. Detta är en viktig och knepig aspekt av jonrörlighetsseparation i en cyklisk enhet. En felaktig bedömning av antalet pass för en viss jon kan leda till en felaktig identifiering och tolkning av topparna. Att kontrollera antalet passningar av olika jonpopulationer kan vara svårt på grund av den relativt korta enpasslängden (~ 1 m), och arter med mycket olika mobiliteter kan snabbt överlappa varandra.

I synnerhet kan en topp delas mellan två olika pass om matrisen växlar riktning när denna jonpopulation passerar igenom (detta är relativt lätt att identifiera: den delade toppen kommer att visas skarpare med en population precis i början av utmatnings- och förvärvshändelsen ). För att korrekt ställa in antalet pass bör användaren börja med en kort separationstid (1-5 ms) som ger 1-pass-profilen. Sedan bör användaren gradvis öka separationstiden tills hela befolkningen har flyttat till högre ankomsttider, vilket ger 2-pass-profilen. 2-pass-profilen bör likna 1-pass-profilen men med bättre lösta toppar. Den tid en given jonpopulation tar att få en att passera runt den cykliska cellen är en konstant som användaren kan använda för att beräkna antalet pass som en funktion av separationstiden. Om det till exempel finns en skillnad på 10 ms mellan det första och det andra passet, kommer det också att finnas en skillnad på 10 ms mellan det andra och det tredje.

För det tredje bör användaren under IMS-urvalsfasen noggrant kontrollera isoleringens kvalitet, vilket framgår av figur 4. Det är särskilt viktigt att kontrollera den återinförda profilen eftersom om TW-höjd- och hastighetsinställningarna är för låga kanske utmatningen av de andra populationerna inte är fullständig. Avancerade användare kan korrigera detta genom att justera Driftcell RF-radiofrekvensspänningen på RF-fliken på tunesidan .

För det fjärde bör användaren vara försiktig med att generera fragmenteringsspektrumet och särskilt vid val av lämplig kollisionsenergi, särskilt om spänningarna justeras manuellt. En alltför hög sänkning av arrayförskjutningsspänningen kan faktiskt påverka den totala jonintensiteten negativt genom att hindra återinmatningen. Dessutom kan föregångaren och fragmenten sträcka sig över ett brett spektrum av mobiliseringar. Således kommer de snabbt att genomgå ett annat antal pass om den slutliga separationstiden är hög, så det är viktigt att behålla en 1-ms Separat händelse som förklaras i protokoll steg 2.3.3. Detta är en stor begränsning eftersom längden med enkelpass är relativt kort, vilket begränsar den enda passnings upplösningskraften till ~ 100 för oligosackarider27. I detta avseende skulle en ökad väglängd i ett enda pass vara fördelaktigt (dvs. de TWIMS-baserade strukturerna för förlustfri jonmanipulation eller SLIM, med en banlängd på 13 m28). SLIM-installationen lanserades kommersiellt mycket nyligen29.

Slutligen bör användaren vara försiktig med att definiera det slutliga mobilitetsintervallet för förvärv med kommandot Pushes per lagerplats , särskilt om du arbetar med multiplicerade joner. Jonrörlighet är verkligen en funktion av charge12, och till exempel är enst laddade fragment som genereras från en dubbelt laddad föregångare sannolikt långsammare än föregångaren (även om de är mindre föreningar).

En viktig begränsning med att endast använda MS- och IMS-separationer för att välja föregångaren (och till exempel inte ett uppströms steg av kromatografi) är att en given m/z kan ge flera toppar i IMS och att flera toppar kan komma från samma förening. Detta illustreras av fördelningen av m/z 685.2, för både blandningen XA2XX+XA3XX och ren XA3XX, i figur 4A. Multimodala IMS-distributioner av en enda m/z är resultatet av olika gasfaskonformationer. För arter som analyseras som katjontillägg (i positivt läge) uppstår de olika konformationerna möjligen från skillnader i samordning med motjonen30,31,32.

För oligosackarider kan de också uppstå från separationen av reducerande anomer, även om separation av reduktionsavslutsavnomer vanligtvis kräver högre IMS-lösningskraft än vad som används här33,34,35. I det aktuella fallet beror den multimodala IMS-fördelningen i figur 4A delvis på de enskilda bidragen från XA2XX och XA3XX. Det är dock anmärkningsvärt att XA3XX ger två toppar, som sannolikt är katjonkoordineringskonformatörer. Det var lätt att identifiera vilken topp som motsvarade XA2XX (dvs. arten av intresse) eftersom ren XA3XX är tillgänglig kommersiellt och dess rörlighetsprofil kunde registreras separat. För att arbeta med komplexa blandningar som biologiska medier kan det vara viktigt att överväga att lägga till ett kromatografiskt separationsstadium.

Två punkter måste noteras när det gäller det bearbetningsarbetsflöde som används för att erhålla massdekonstruerade IMS/IMS-spektra. För det första föreslås i detta protokoll att MZmine 224 ska användas för att dekonvolvera IMS/IMS-spektrumet med hjälp av MS-dimensionen och särskilt använda ADAP-algoritmen36 för att dela upp EVE:erna i olika toppar. Även om det ger ganska bra resultat, vilket illustreras i figur 6, utformades ADAP-algoritmen för kromatografiska analyser och står därmed för asymmetriska faktorer som är inneboende i vätskefaskromatografi, såsom toppsvansning. Därför kan ADAP-algoritmen leda till att vissa av funktionerna inte identifieras när de tillämpas på IMS-toppar (t.ex. axlar). I huvudsak är IMS-data enklare än kromatografiska data: eftersom det inte finns någon kemisk interaktion mellan föreningarna med en kolumn förväntas IMS-data som förvärvats under lämpliga förhållanden (dvs. utan att mätta IMS-cellen) följa gaussiska fördelningar37,38. Helst skulle ADAP-dekonvolutionssteget bäst ersättas av en gaussisk monteringsfunktion, till exempel den som används av programvara avsedd för IMS som CUISuite 239. Men som det ser ut nu var gaussisk dekonvolution inte direkt anpassad till den fullständiga behandlingskedjan som beskrivs i detta protokoll. Därför verkade användningen av den fria programvaran med öppen källkod MZmine vara en bra kompromiss för slutanvändare.

Den andra delen av behandlingen som motiverar diskussion är CCS-kalibreringen. Detta protokoll föreslår användning av en logaritmisk passformskalibrering25,26 och en kommersiell kalibreringsblandning från samma leverantör som spektrometern (se materialförteckningen). Den här proceduren är den enklaste att implementera i labbet. När det gäller valet av calibrantblandningen bör användaren överväga att, som nämnts i flera studier, noggrannheten hos CCS-kalibreringen förbättras vid användning av kalibrar av samma molekylära klass och laddningstillstånd som analyte26,40,41. Felet som införs vid kalibrering med relativt liknande typer av föreningar (t.ex. kolhydrater kontra peptider) är måttligt. Det rekommenderas dock att inte använda mycket olika joner som till exempel att använda saltkluster som kalibrar vid mätning av kolhydrater41. När det gäller valet av kalibreringsmetod rapporterade Richardson et al.42 nyligen en ny kalibreringsmetod som tar hänsyn till TWIMS fysik för att förbättra kalibreringens noggrannhet (med en medföljande programvara). Metoden kräver dock utvärdering av mycket specifika parametrar genom analys av olika typer av föreningar - allt från metaboliter till inhemska proteiner. Eftersom ingen blandning av en sådan mängd föreningar kan hittas kommersiellt, genomfördes inte denna metod i det nuvarande protokollet.

Slutligen, för att utvärdera metodens reproducerbarhet, utvärderade vi reproducerbarheten mellandagarna genom att upprepa IMS/IMS-MS-förvärvet dag 1 och dag 95 (kompletterande figur S2). Experimentet visade att IMS/IMS-MS-data är mycket reproducerbara, utan att IMS-toppförskjutningen med mer än 0,2 ms under denna förlängda period har ändrats. IMS/IMS-spektrumet som genererades i detta arbete jämfördes ytterligare med ett annat spektrum av XA2XX som förvärvats under olika förutsättningar för tidigare arbete med jonrörlighet-molekylärt nätverk21. Vissa instrumentella parametrar som kan påverka jonstrukturen och jonrörlighetsprofilen13 ändrades avsiktligt – källparametrarna och aktiveringsspänningsgradienten (en jämförelse av de olika instrumentella förhållandena ges i kompletterande tabell S2). Sedan jämfördes de två spektra med cosinlikhetspoängen - som är populär för jämförelse av MS / MS-spektra i metabolomik - på GNPS-plattformen5 (CCS-tolerans för matchande fragment = 0,015 nm2).

Jämförelsen visade en cosinlikhetspoäng på 0,87 (figur 7), vilket kan anses vara högt med avseende på de viktiga instrumentella variationer som tillämpas. Detta leder till tanken att IMS/IMS spektralbibliotek skulle kunna användas för att avsönda glykaner i komplexa blandningar med hög förtroendenivå, vilket inte skulle vara fallet med MS/MS-spektra. Observera att även om den aktuella metoden endast använder CCS-dimensionen i fragmenteringsspektrumet, innehåller IMS/IMS-MS-data också MS-information, som inte är redundant med CCS. För att optimera den dereplicerande kraften hos IMS/IMS måste ett tvådimensionellt poängsystem utvecklas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

S.O. är tacksam mot den franska nationella forskningsbyrån för att ha finansierat sin doktorsexamen (anslag ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Tags

Kemi nummer 179
Använda en cyklisk jonrörlighetsspektrometer för tandemjonrörlighetsexperiment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter