Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Bruke et syklisk ionmobilitetsmåler for tandemionmobilitetseksperimenter

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

Ion mobility spectrometry (IMS) er et interessant supplement til massespektrometri for karakterisering av biomolekyler, spesielt fordi det er følsomt for isomerisme. Denne protokollen beskriver et tandem-IMS-eksperiment (IMS/IMS), som tillater isolering av et molekyl og genereringen av mobilitetsprofilene til fragmentene.

Abstract

Nøyaktig karakterisering av kjemiske strukturer er viktig for å forstå deres underliggende biologiske mekanismer og funksjonelle egenskaper. Massespektrometri (MS) er et populært verktøy, men er ikke alltid tilstrekkelig til å fullstendig avduke alle strukturelle egenskaper. For eksempel, selv om karbohydrater er biologisk relevante, er karakteriseringen komplisert av mange nivåer av isomerisme. Ion mobility spectrometry (IMS) er et interessant supplement fordi det er følsomt for ionkonformasjoner og dermed til isomerisme.

Videre har de siste fremskrittene forbedret teknikken betydelig: den siste generasjonen av sykliske IMS-instrumenter tilbyr tilleggsfunksjoner sammenlignet med lineære IMS-instrumenter, for eksempel økt løsningskraft eller muligheten til å utføre tandem ionmobilitetseksperimenter (IMS / IMS). Under IMS/IMS velges en ion basert på ionmobilitet, fragmentert og reanalysert for å få informasjon om iionmobilitet om fragmentene. Nyere arbeid viste at mobilitetsprofilene til fragmentene i slike IMS/ IMS-data kan fungere som et fingeravtrykk av en bestemt glykan og kan brukes i en molekylær nettverksstrategi for å organisere glykomiske datasett på en strukturelt relevant måte.

Målet med denne protokollen er dermed å beskrive hvordan man genererer IMS/IMS-data, fra prøvepreparering til endelig CCS-kalibrering (Collision Cross Section) av ionmobilitetsdimensjonen som gir reproduserbar spektra. Ved å ta eksempel på en representativ glykan, vil denne protokollen vise hvordan du bygger en IMS/ IMS-kontrollsekvens på et syklisk IMS-instrument, hvordan du tar hensyn til denne kontrollsekvensen for å oversette IMS-ankomsttid til drifttid (dvs. den effektive separasjonstiden som brukes på ionene), og hvordan du trekker ut relevant mobilitetsinformasjon fra rådataene. Denne protokollen er utformet for å tydelig forklare de kritiske punktene i et IMS/IMS-eksperiment og dermed hjelpe nye sykliske IMS-brukere med å utføre enkle og reproduserbare anskaffelser.

Introduction

Den komplette kjemiske karakteriseringen av biomolekyler er nøkkelen til å forstå deres underliggende biologiske og funksjonelle egenskaper. For dette formål har "omics" vitenskap utviklet seg de siste årene, med sikte på storskala karakterisering av kjemiske strukturer ved biologiske konsentrasjoner. I proteomikk og metabolomikk har MS blitt et kjerneverktøy for å avdekke den strukturelle heterogeniteten som finnes i biologiske medier , spesielt takket være følsomheten og evnen til å gi strukturell informasjon gjennom tandem MS (MS / MS). I MS / MS-strategier velges en ion i henhold til massen, deretter fragmentert, og til slutt blir massene av fragmentene anskaffet for å etablere et fingeravtrykk av molekylet. Spesielt MS/MS-spektra kan brukes til å samsvare med spektraldatabaser1,2, eller foreløpig rekonstruere de overordnede strukturene3,4. Under forutsetning av at lignende spektra tilhører lignende forbindelser, kan MS/MS-data også brukes til å bygge molekylære nettverk (MNer) som forbinder relaterte arter gjennom en likhetsscore5,6.

Men på grunn av den iboende egenskapen til MS for å oppdage masse-til-lading-forholdet (m / z) av ioner, er teknikken blind for en rekke strukturelle egenskaper som faller innenfor området (stereo)isomerisme. For eksempel er karbohydrater laget av flere monosakkaridunderenheter, hvorav mange er stereoisomerer eller til og med epimers (f.eks. Glc vs. Gal eller Glc vs. Man). Disse underenhetene er forbundet med glykosidiske bindinger, som kan variere ved koblingens posisjon (regioisomerisme) og den steriske konfigurasjonen av det anomeriske karbonet (anomerisme). Disse egenskapene gjør det vanskelig for frittstående MS å skille mellom karbohydrat isomers7, og bare regioisomerisme kan løses ved hjelp av høyenergiaktiveringsmetoder8,9,10. Selv om avledning er et alternativ for å forstyrre ekvivalensen av stereoisomeriske grupper11, krever det omfattende prøvepreparering. Et annet, enklere alternativ er å koble MS med en analytisk dimensjon som er følsom for isomerisme, for eksempel IMS.

Fordi denne protokollen er utformet for brukere som allerede er kjent med de grunnleggende konseptene i IMS, og fordi detaljerte gjennomganger er tilgjengelige andre steder12,13, er bare en kort oversikt over prinsippene for IMS gitt her. IMS er en gassfase separasjonsmetode som er avhengig av samspillet mellom ioner med buffergass og et elektrisk felt, og til slutt skiller ioner i henhold til deres gassfasekonformasjoner. Ulike prinsipper for IMS koblet til MS finnes på kommersielle instrumenter: noen opererer ved vekslende høye og lave elektriske felt (feltasymmetrisk IMS, FAIMS), mens de fleste opererer innenfor grensen for lavt felt – spesielt drivrøret IMS (DTIMS, lineært avtagende elektrisk felt), reisebølge IMS (TWIMS, symmetriske potensielle bølger) og fanget IMS (TIMS, høy strømning av gassfangstioner mot elektriske felt)13 . Lavfeltsmetodene gir tilgang til en såkalt CCS, en egenskap av iongassparet som representerer overflaten (i Å2 eller nm2) av ionen som samhandler med buffergassen under separasjonen. CCS er teoretisk instrumentuavhengig og er derfor nyttig for å generere data som kan reproduseres mellom ulike laboratorier14. Ionmobilitetsseparasjoner kan påvirkes av ulike parametere og spesielt av svingninger i gasstrykket og gasstemperaturen i mobilitetscellen. CCS-kalibreringen er en måte å bøte på dette på, da både kalibrering og art av interesse vil bli påvirket på samme måte13. Det er imidlertid obligatorisk å installere instrumentet i et temperaturkontrollert rom og å ha et pålitelig gasstrykkkontrollsystem.

En interessant utvikling av IMS er IMS/IMS, som først ble introdusert i 2006 av Clemmers gruppe som en analog av MS/MS15,16. I IMS/IMS er en interesseion selektivt isolert basert på ionmobiliteten. Den aktiveres deretter (inntil mulig fragmentering), og en ny IMS-analyse av den aktiverte ionen eller fragmentene utføres. I den første instrumentelle designen ble to IMS-celler satt i serie, skilt av en iontrakt der aktiveringen stod. Siden da, selv om en rekke IMS / IMS-oppsett ble foreslått (for en gjennomgang, se Eldrid og Thalassinos17), ble det første kommersielle massespektrometeret med IMS / IMS-kapasitet bare tilgjengelig i 201918. Dette instrumentet forbedret det opprinnelige konseptet betydelig ved å kombinere det med et annet teknologisk gjennombrudd: en syklisk design av IMS-cellen.

Den sykliske IMS-cellen tillater teoretisk å øke nesten uendelig driftbanelengden og dermed løse kraften til instrumentet19. Dette ble oppnådd ved hjelp av en bestemt instrumentgeometri, hvor den sykliske TWIMS-cellen er plassert ortogonalt til hovedionoptisk akse. Et multifunksjonsmatriseområde ved inngangen til IMS-cellen gjør det mulig å kontrollere retningen på ionbanen: (i) sende ioner sidelengs for IMS-separasjon, (ii) fremover for MS-gjenkjenning, eller (iii) bakover fra IMS-cellen som skal lagres i en prearraycelle. Fra denne prearray butikkcellen kan ionene aktiveres og fragmentene reinjiseres i IMS-cellen for ionmobilitetsmåling, en tilnærming som har blitt brukt til å karakterisere stereoisomerer20. Til syvende og sist inneholder de innsamlede dataene ionmobilitet og m / z-informasjon for forløperen og dens fragmenter.

I en nylig publikasjon som brukte denne sykliske designen for glykananalyser (Ollivier et al.21), viste vi at mobilitetsprofilen til fragmentene i slike IMS/IMS-data fungerer som et fingeravtrykk av en biomolekyl som kan brukes i en molekylær nettverksstrategi. Det resulterende nettverket, kalt IM-MN, førte til organisering av glycomics-datasett på en strukturelt relevant måte, mens nettverket bygget utelukkende fra MS / MS-data (MS-MN) avslørte lite informasjon. For å utfylle denne publikasjonen og hjelpe sykliske IMS-brukere med å implementere denne arbeidsflyten, gir denne protokollen en fullstendig beskrivelse av protokollen som brukes til å samle inn dataene. Denne protokollen fokuserer bare på genereringen av IMS/IMS-dataene som brukere deretter kan bruke til å bygge IM-MN-nettverk (se21) – eller for andre programmer etter eget valg. Bygging av IM-MN vil ikke bli vurdert heri, da protokoller for molekylært nettverk allerede er tilgjengelige22. De avgjørende punktene som må følges for å generere verdifulle og reproduserbare IMS/IMS-oppkjøp, fremheves. Tar eksempelet på en av oligosakkaridene studert av Ollivier et al. 21, er følgende trinn detaljert: (i) prøvepreparering, (ii) justering av det sykliske IMS-instrumentet, (iii) automatisert toppplukking av dataene og (iv) CCS-kalibrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: En oversikt over protokollen finnes i figur 1. Parametrene som brukes for forsøkene beskrevet i denne protokollen finnes i Supplerende tabell S1 og supplerende tabell S2.

1. Klargjøring av prøveløsningen

MERK: Protokollen er beskrevet ved hjelp av en arabinoxylan pentasaccharide (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose eller XA2XX; se materialtabellen) som et eksempel.

  1. Klargjøring av løsningsmidlet: 500 μM LiCl i 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Forbered en 100 mM lagerløsning av litiumklorid (LiCl) i H2O ved å veie 212 mg LiCl og tilsett 50 ml av høy renhet deionisert vann (H2O) i et 50 ml polypropylen konisk rør. Rist til den er helt oppløst.
      MERK: Løsningsmidlet er dopet med et litiumsalt for å fremme dannelsen av [M+Li]+ addukter i ionkilden til spektrometeret, da det vanligvis gir fragmenteringsspektra av bedre kvalitet sammenlignet med andre alkali-addukter. Bruken av LiCl anbefales fordi organiske syrer (og dermed saltene deres) tidligere har vist seg å påvirke IMS-profiler23.
    2. I en glassflaske, fortynn LiCl-lagerløsningen 200x: til 250 μL av lagerløsningen, tilsett 24,75 ml H2O. Tilsett 25 ml metanol (MeOH) for å nå en endelig konsentrasjon av LiCl på 500 μM i 50:50 H2O:MeOH (v/v). Soniker i 2 min for å avfette løsningsmidlet.
      MERK: MeOH utgjør en helsefare (H225, H301, H311, H331, H370); manipulere under en avtrekkshette iført labfrakk, hansker og øyebeskyttelse. En andel på 50:50 MeOH/H2O (v/v) ser ut til å være det beste løsningsmidlet for iionisering av oligosakkarider; MeOH kan imidlertid erstattes med acetonitril (ACN) om nødvendig.
  2. I et 1,5 ml polypropylenrør, vei 1 mg karbohydrat. Løs opp med et passende volum på 500 μM LiCl for å nå en konsentrasjon på 1 mg / ml. Fortynn til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml i 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl. Oppbevars ved 4 °C.
    MERK: Konsentrasjonen på 10 μg/ml ble valgt for å optimalisere signalet over alle fragmentioner under IMS/IMS-MS (dette er for en ren forbindelse; øke konsentrasjonen når du arbeider med blandinger). For innsamling av referanse-IMS/IMS-spektra må du ikke fortynne prøven ytterligere: Metning av MS-detektoren før fragmentering forventes, selv om instrumentet tilbyr alternativer for å korrigere den (se trinn 3.2.).

2. Justering av det sykliske IMS-massespektrometeret

MERK: Programvarerelaterte instruksjoner (vinduer, menyer og kommandoer) er uthevet med fet skrift.

  1. Åpne instrumentkonsollen fra instrumentkontrollprogramvaren (MS-tune-siden , se programvaredetaljene i materialtabellen), og sett instrumentet i driftsmodus . Vent i minst 3 timer til høyspenningene stabiliserer seg i IMS-cellen.
    MERK: For best mulig reproduserbarhet må spenningene i IMS-cellen stabiliseres helt. Slå på høyspenningene og la instrumentet stabilisere seg over natten før noen syklisk IMS-analyse. Videre må trykket og temperaturen i ionmobilitetscellen holdes så konstant som mulig. Selv om en tilbakelesning for trykket er tilgjengelig i vakuumfanen , er det ingen tilbakelesning tilgjengelig for temperaturen. Oppbevar instrumentet i et termostatlaboratorium. Instrumentet som brukes i dette arbeidet opererer på 1,75 mbar i et laboratorium termostatert ved 20 °C.
  2. Oppsett av syklisk IMS-instrument
    MERK: Standardløsninger må infunderes ved hjelp av det innebygde fluidikksystemet for instrumentoppsettet.
    1. Plasser væskebeholderne fylt med de riktige produsentleverte standardene på fluidikksystemet: Reservoar B ('Lockmass'): 10 pg/μL leucin enkephaline (LEU ENK) i 50:50 ACN/H2O + 0,1% maursyre; Reservoar C ('Calibrant'): MajorMix.
      MERK: I denne protokollen brukes MajorMix-kalibreringsløsningen til å kalibrere både m/z - og CCS-dimensjonene. Av praktiske årsaker vil en ekstern CCS-kalibrering bli utført (se trinn 5 i protokollen); Derfor er det også mulig å bruke en intern kalibrantblanding for CCS og en annen kalibrant for m / z (f.eks. natriumformat eller natriumjodid).
    2. Gå til Flyt-fanen på Tune-siden i Quartz-konsollen. Sett prøvevæskene til reservoar C og referansevæskene til reservoar B. Tilsett begge løsningene fortløpende i ionkilden for å kontrollere MS-signalet.
    3. Utfør ADC-oppsettet, detektoroppsettet (ved hjelp av LEU ENK) og massekalibrering (se materialtabellen for kalibreringsløsningen) fra instrumentoppsettsiden i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Registrer et IMS-oppkjøp av kalibreringsløsningen med en enkelt passseparasjon (bruk denne til ekstern IMS-kalibrering).
    MERK: Ionkilden og parametrene for reisebølge (TW) (statisk bølgehøyde og bølgehastighet) må holdes konstant under alle oppkjøpene (kalibrering og oppkjøp). Hvis brukeren ikke har forkunnskaper om de optimale parametrene for prøven, kan dette trinnet utføres etter trinn 3 i protokollen (for [M +Li]+ adducts av nøytrale oligosakkarider, bruker de representative resultatene en TW-høyde på 16 V og TW-hastighet på 350 m / s, noe som gir de beste resultatene).
    1. Fra Fluidics-fanen velger du hvelvposisjonsprøve og tilfører kalibratoren (se materialtabellen) i ionkilden (ved hjelp av det innebygde fluidikksystemet) gjennom 'Prøve'-sonden med en strømningshastighet på 10 μL/min.
    2. Sett opp en IMS-sekvens med én omgang. Sett instrumentet i mobilitetsmodus på Tune-siden, og åpne vinduet Syklisk sekvenskontroll. Velg Avansert modus. Velg Legg til bunt på fanen Sykliske funksjoner i dette nye vinduet, og velg deretter Enkel/multipass. Vent til en sekvens med mobilitetshendelser vises i kategorien Sekvens i samme vindu.
      MERK: For å aktivere sanntidsvisningen må brukeren bruke instrumentparametrene: Klikk på Tune i TOF-modus eller Kjør i mobilitetsmodus. Før du bytter instrumentet mellom TOF- og mobilitetsmodus, er det nødvendig å avbryte alle løpende anskaffelser (inkludert Tune-sidevisningen). Den relative overfloden av ioner kan variere mellom TOF-modus og mobilitetsmodus på grunn av endringer i ionoverføringsparametrene.
    3. Tilpass sekvensen slik at alle kalibrantionene gjør en enkelt pasning rundt den sykliske IMS-racerbanen. Ikke endre innsettingstiden eller utløsingen og skaff deg tid; Senk imidlertid separate klokkeslettet til 1 ms (i kategorien Sekvens ). Hvis noen ioner av kalibreringsblandingen ikke passer i det viste ankomsttidsvinduet, endrer du synkroniseringen av IMS med stapperen til den ortogonale akselerasjons-TOF-analysatoren ved å øke antall pushs Per Bin i kategorien ADC-innstillinger .
      MERK: Tidene i kontrollsekvensen kontrollerer bare multifunksjonsmatrisen for iongitter. Så lenge ionene er engasjert i sin første (eller nth) pass rundt racerbanen, vil de fullføre nevnte pass selv om retningen på TW har endret seg i matrisen i mellomtiden. Hvis du senker separasjonstiden til 1 ms, betyr det at matrisen bytter til utløsingsmodus etter 1 ms. Dette sikrer at de raskere ionene ikke vil ha nok tid til å passere gjennom matrisen og engasjere seg i en andre pasning før de langsommere ionene fullfører sin første pasning. Derfor vil alle ioner bli utsatt for samme antall passeringer (dvs. ett pass), som er nødvendig for å utføre IMS-kalibrering.
    4. Registrer et 2-minutters oppkjøp. I vinduet Syklisk sekvenskontroll klikker du på Hent for å åpne popup-vinduet For anskaffelsesinnstillinger . Skriv inn filnavnet, beskrivelsen og lengden på anskaffelsen (minutter), og klikk Lagre.
  4. Registrer ytterligere 2 min oppkjøp av kalibreringsløsningen under samme forhold som trinn 2.3 (bruk denne til å kontrollere kvaliteten på CCS-kalibreringen). I vinduet Syklisk sekvenskontroll klikker du på Hent for å åpne popup-vinduet For anskaffelsesinnstillinger . Skriv inn filnavnet, beskrivelsen og lengden på anskaffelsen (minutter), og klikk Lagre.
  5. Vask fluidikksystemet grundig med 50:50 H2O/ACN for å unngå krystallisering av kalibren i kikkslangen.

3. IMS/IMS-MS-anskaffelse

  1. Bruk en sprøytepumpe til å tilføre (litiumduged) prøven ved 10 μg/ml gjennom prøvesonden med en strømningshastighet på 10 μL/min.
  2. Bytt instrumentet til TOF-modus (fra MS-innstilt side) for å kontrollere stabiliteten til signalet. Registrer et fullstendig MS-oppkjøp (1 min) av prøven, som vil være nyttig for å sjekke det isotopiske mønsteret og tilstedeværelsen av potensielle forurensninger.
    MERK: Fordi prøvekonsentrasjonen er valgt for å oppnå et godt ionsignal for fragmentene, kan det observeres en TOF-metning på dette trinnet. TOF-metning kan identifiseres ved hjelp av følgende artefakter: (i) en kunstig økt MS-oppløsning, (ii) en endring i isotopforhold, og (iii) en rekke lav-overflodstopper mellom isotoper. Bruk DRE-objektivet (dynamisk områdeforbedring, kategorien Quad/MS-profil/DRE på hovedsiden for melodi ) til å dempe overføringen av ioner og forkaste metningen i TOF-modus (figur 2A, B).
  3. Sett instrumentet i MSMS-modus (Quad / MS Profile-fanen på hoved tune-siden ) og velg massen av den målrettede ionen i MSMS Mass-feltet for isolasjon i quadrupole (i eksemplet: m / z av 685.2, som tilsvarer [M + Li]+ ioniske arter av arabinoxylan pentasaccharide). Registrer et 1 min oppkjøp for å sjekke forløperisolasjonen når du behandler dataene.
    MERK: Litiumaddukter har en isotop på -1 Da av den monoisotopiske toppen, som må fjernes fra MS / MS-valgvinduet slik at det ikke forstyrrer behandlingstrinnene. Den kan fjernes ved å begrense valgområdet ved hjelp av parameterne LM-oppløsning og HM-oppløsning i kategorien Quad/MS-profil (figur 2C).
  4. Sett opp en "kuttende" IMS-sekvens for å utføre et mobilitetsbasert utvalg av isomer av interesse.
    1. Sett instrumentet i mobilitetsmodus (se trinn 2.3.2). Velg Legg til bunt og deretter Kutting i kategorien Sykliske funksjoner i vinduet Syklisk sekvenskontroll. Vent til en kompleks sekvens med mobilitetshendelser vises i kategorien Sekvens (figur 3).
      MERK: Det er mulig å visualisere hvert trinn i IMS/IMS-prosessen: Klikk på Løs ut og hent-hendelsen i Sekvens-fanen. Når den er uthevet i rødt, flytter du den til riktig posisjon i sekvensen ved hjelp av Opp- og Ned-knappene.
    2. Plasser hendelsen Løs ut og Hent rett etter den første Separate-hendelsen (dvs. flytt den i rad 3 i stedet for rad 8 i sekvensen som vist i figur 3), og klikk deretter Kjør. Se etter resultatene av den første separasjonen som skal vises i sanntid. Øk varigheten for den første Separate-hendelsen for en multipass-separasjon ved å endre tidsverdien for denne hendelsen i sekvensen til oppløsningen til IMS-toppene er tilfredsstillende. Registrer en 1 min anskaffelse for referanse.
      MERK: Legg merke til ADC Start Delay-verdien i ADC Setup-fanen : det vil være nyttig å sjekke kvaliteten på isolasjonen.
    3. Klikk Stans midlertidig. Legg merke til at resultatene av den første separasjonen vises, selv om endringer i kontrollsekvensen ikke vil bli brukt før brukeren klikker Kjør på nytt. Plasser utløsings- og anskaffelseshendelsen under hendelsene Løs ut, Løs ut til forlager og Hold og løs ut . Juster varigheten til hendelsene slik at den målrettede toppen er i området Løs ut til forhåndslager , og alle andre ioner er enten i området Løs ut eller Hold og løs ut .
      MERK: Varigheten av disse tre hendelsene sammenlignet med ankomsttidsdistribusjonene (ATD-er) kan visualiseres ved hjelp av den fargekodede linjen under mobilitetsspekteret i Mobilogram-fanen (figur 3).
    4. Plasser utløsings- og anskaffelseshendelsen på slutten av sekvensen, under ny prosjekt fra pre-store og de andre separate hendelsene. Klikk Kjør for å vise den valgte populasjonen.
      MERK: Fordi den valgte populasjonen har forlatt IMS-cellen, har all tidligere separasjon gått tapt, og den er tilbake til en enkeltpasssseparasjon (som er ønsket).
    5. Kontroller kvaliteten på isolasjonen. Hvis du vil kontrollere at bare toppen av interessen er valgt, utfører du samme separasjon etter nyinnføring som før reinjeksjon (dvs. samme separate tid) som vist i figur 4. Registrer en 1 min anskaffelse for referanse.
      MERK: Brukerne oppfordres til å sjekke den utkastede populasjonen; Vinduet Løs ut til førlagertid bør være grunnlinjenivå (figur 4B). Hvis du vil kontrollere dette, setter du ADC-startforsinkelsen i manuell modus i kategorien ADC-innstillinger og angir forsinkelsestiden som er angitt i trinn 3.4.2. Registrer en 1 min anskaffelse for referanse.
    6. Se etter de summerte tidspunktene for alle hendelser i kolonnen ved siden av de brukerdefinerte hendelsestidene (Time Abs -kolonnen, uthevet i rødt) i kategorien Sekvens . Vær oppmerksom på Time Abs som finnes på linjen til Reinject fra Pre-Store-hendelsen for å utføre CCS-kalibreringen.
  5. Fragmenter den målrettede toppen mellom de to rundene med IMS. Endre spenningene i reinjeksjonstrinnet for å øke den kinetiske energien til ionene, og fragmenter dem ved kollisjon med ionmobilitetsgassen.
    1. Angi varigheten for Separate-hendelsen rett før utløsing og Hent til 1 ms (se forklaring i trinn 2.3.3).
    2. Merk av for Aktiver aktivering på linjen Sett på nytt fra pre-store, og optimaliser fragmenteringen med den innebygde kontrollen. Hvis spekteret er tilfredsstillende (for eksempel at grunntoppen er et fragment), går du direkte til trinn 3.5.4.
      MERK: Når aktiveringen aktiveres, blir tre spenninger på linjen grå: dette er spenningene som brukeren må endre hvis manuell optimalisering av spenningene er nødvendig (se neste trinn). Disse tre spenningene (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias og Array Offset) danner gradienten som brukes til å aktivere ionene. Den kinetiske energien til ionene vil øke med hellingen mellom Pre-Array Bias og Array Offset (se figur 5). Standardverdiene for verdiene for Graderings- → Bias-→forskyvning er: uten aktivering 85 → 70 → 45 V; maksimal aktivering av den innebygde funksjonen 185 → 170 → -5 V (+150 V). Etter fragmentering, ikke glem å justere ionoverføringen ved hjelp av DRE-objektivet (reduser dempingen av signalet) (se trinn 3.2.).
    3. Hvis fragmenteringen ikke er tilfredsstillende med den innebygde kontrollen, fjerner du merket for Aktiver aktivering og fortsetter å optimalisere reinjeksjonsspenningene manuelt. Øk gradientspenningen før matrisen ( biasspenningen før array må alltid holdes 15 V under gradienten før matrisen), og senk matriseforskyvningsspenningen (som kan stilles inn som negativ) til resultatene er tilfredsstillende.
      MERK: Når du justerer spenningene i multifunksjonsrekken manuelt, kan brukeren bytte fra "Mobilogram"-visningen til interaktive skjemaer for spenningene som brukes i multifunksjonsmatrisen (PE-diagrammet) for bedre å visualisere spenningsinnstillingene (figur 5A).
    4. Registrer et 2 min oppkjøp. I popup-vinduet for anskaffelse merker du av for Behold drifttid for å generere en fil som bare inneholder ankomsttidene vs m/z (anskaffelsestiden som brukes til kromatografiske analyser – oppbevaringstiden fjernes fra filen). Legg merke til at denne filen er merket *_dt. RÅ.
      MERK: Hvis brukeren glemmer å sjekke alternativet Behold drifttid , er det fortsatt mulig å trekke ut IMS-dimensjonen ved hjelp av Driftscope 2.9-programvaren (Fil | Eksporter til MassLynx | Behold drifttid).
  6. Vri instrumentet tilbake til TOF-modus på hovedsiden for tune , og skyll systemet grundig med 50:50 MeOH/H2O før du fortsetter med neste prøve.

4. IMS/IMS-MS-behandling med MZmine 224

MERK: MZmine 2 er tilgjengelig fra nettadressen som er angitt i materialtabellen. Bruk av MZmine 2.51 anbefales. På tidspunktet for utarbeidelsen av dette manuskriptet kan ikke de senere versjonene åpne RAW-filer fra sykliske IMS-instrumenter på grunn av en endring i importfunksjonen.

  1. Importer råfilen(e) som bare inneholder dimensjonene IMS og m/z (*_dt. RAW) ved hjelp av rådatametoder | Import av rådata.
    MERK: Raw-filer vises på venstre side av hovedvinduet i MZmine. Ikke importer originalen *. RAW-filer som fremdeles inneholder tidsdimensjonen for oppbevaring. MZmine skiller ikke oppbevaringstid fra IMS-ankomsttid, og datapunktene for begge dimensjonene vil overlappe.
  2. Optimaliser arbeidsflytparameterne for en representativ fil ved å velge den i Rå datafiler liste.
    1. Evaluer støynivået i dataene. Høyreklikk filen i listen Raw-datafiler , velg Vis TIC og vis grunntoppen "chromatogram" (BPC). Dobbeltklikk på den minste toppen observerbar for øyet for å vise massespekteret. Vurder støynivået i dataene for å være rundt den andre isotopen til grunntoppen i dette spekteret, og bruk den samme verdien for alle intensitetsterskler i følgende behandlingstrinn.
      MERK: Dataene ble innhentet ved hjelp av quadrupole-isolasjon og vurderes dermed av MZmine som MS/MS. Gjennom hele MZmine-behandlingen må du sørge for å jobbe på et MS-nivå = 2.
    2. Utfør massedeteksjonen ved hjelp av rådatametoder | | for funksjonsgjenkjenning Massedeteksjon. For data som er samlet inn i profilmodus, bruker du transformasjonsalgoritmen Wavelet . For å sette opp parametrene til algoritmene i MZmine, klikk på [...] -knappen ved siden av algoritmen og bruk Vis forhåndsvisning-alternativet for å visualisere dataene mens du optimaliserer parametrene.
      MERK: På dette stadiet vises toppene valgt av algoritmen i rødt i forhåndsvisningsvinduet. Når du bruker wavelet transform-algoritmen på proprietære RAW-filer, vil MZmine noen ganger forveksle profildatapunktene for centroided topper. Programvaren vil vise en melding om at brukeren kjører en profilalgoritme på centroided spectra: ignorer denne meldingen og klikk OK.
    3. Rekonstruere det ekstraherte ionmobilitetsspektraet (EIM) for hver fragmentmasse ved hjelp av rådatametoder | | for funksjonsgjenkjenning ADAP Chromatogram builder på masse masselisten generert av forrige trinn. Siden m/z-toleranseinngangen på dette stadiet er en skanne-til-skanning-toleranse, må du sørge for å la den være minst 3-4 ganger høyere enn den totale forventede nøyaktigheten.
    4. Siden det forrige trinnet ikke har et forhåndsvisningsalternativ, må du sjekke kvaliteten på toppplukkingen direkte ved hjelp av funksjonslisten som dukket opp på høyre panel i hovedvinduet i MZmine. Åpne Funksjons-listen, merk alle rader, høyreklikk, og velg Vis/XIC (dialog). Klikk Alle for å vise alle ioner på mobilitetsspekteret. Inspiser de valgte toppene som vises i farger for å sikre at det ikke er noen åpenbare tapte topper.
    5. Dekonvolve EIM-ene for å dele m/z som inneholder forskjellige topper i flere funksjoner. Bruke funksjonslistemetoder | | for funksjonsgjenkjenning Kromatogramdekonvolusjon, og velg algoritmen Wavelets (ADAP). Optimaliser algoritmen for dataene ved hjelp av alternativet Vis forhåndsvisning og følgende nøkkelparametere: S/N-terskel, koeffisient/områdeterskel og RT-bølgeområde.
      MERK: Det anbefales å sjekke aspektet av det dekonvolverte spekteret. Bruk visualiseringsverktøyet for kromatogram, som beskrevet i trinn 4.2.4. De dekonvolverte toppene vil vises i farge, og topper av samme masse skal deles, som presentert i figur 6A.
    6. Deisotope de dekonvolverte EIM-ene ved hjelp av funksjonslistemetoder | Isotoper | Isotopic topper grouper. Bruk den forventede nøyaktigheten til instrumentet for m/z-toleranseverdien , og sett toleransen for ankomsttid til 0,1 ms (vises i MZmine som toleranse for oppbevaringstid 0,1 min), da isotoper ikke løses under IMS-separasjonen. Sjekk funksjonslisten: Hvis noen isotoper gjenstår, øk toleranseverdiene.
      MERK: Selv om deisotoping teoretisk sett kan utføres når som helst i funksjonslistebehandlingen, er det viktig å gjøre det sist slik at ladeverdiene kan eksporteres (algoritmene som brukes til de andre trinnene, vil noen ganger fjerne ladetilstandsinformasjonen).
  3. Hvis du behandler flere IMS/IMS-MS-spektra, gjentar du behandlingen med disse optimaliserte parameterne. Behold de samme parameterne for alle spektra.
  4. Når det gjelder flere spektra, grupperer du dem i en enkelt tabell for å eksportere dem. Hvis ikke, hopper du direkte til trinn 4.5. Hvis du vil gruppere spektra, bruker du | Justere | Føye sammenjustering. Siden målet ikke er å justere toppene, bruker du restriktive toleranseverdier for både m/z og ankomsttid. Gi samme vekt til begge dimensjonene.
  5. Eksporter den endelige funksjonslisten til en *.csv-fil . Bruke | for funksjonslistemetoder Eksportere/importere | Eksporter til CSV-fil og eksporter følgende verdier: Eksporter rad m/z, Eksporter radoppbevaringstid (faktisk IMS-ankomsttid), Topp m/z og Topphøyde. Bruk komma som feltskilletegn.

5. TWCCSN2 av det sentroiderte IMS/IMS-spektraet

MERK: I denne protokollen vil en logaritmisk passform kalibrering25,26 bli brukt, som har en tendens til å gi bedre resultater enn lineær kalibrering og er lett å implementere i et regneark eller et internt behandlingsskript. Et internt skript (skrevet i R) er tilgjengelig på URL-adressen som er angitt i materialfortegnelser.

  1. Velg verdiene for referanseankomsttid fra kalibrantanskaffelsen (se trinn 2.3). Gjør dette manuelt ved hjelp av konstruktørprogramvaren (se materialtabellen) for å kontrollere aspektet av alle IMS-kalibreringstopper.
    1. Åpne *_dt i kromatogramvinduet. RAW-fil som tilsvarer kalibrereren.
    2. For hvert kalibreringspunkt genererer du EIM ved hjelp av Display | Massealternativ .
    3. Kontroller profilen til EIC-ene. Hvis noen er dårlig definert, glatter du dem ut ved hjelp av Prosess-| Glatt alternativ (som de beste resultatene oppnås vanligvis med Savitzky-Golay-algoritmen, glatt 2 ganger over 3 skuffer). Rapportere apex-verdiene i et regneark.
      MERK: Fordi referansepunktene vanligvis anskaffes ved hjelp av DTIMS-enheter med lav oppløsning, kan noen multimodale distribusjoner vises i syklisk IMS avhengig av kalibrantene. Fjern alle topper som presenterer en slik fordeling fra kalibreringslisten.
  2. Beregn de logaritmiske tilpasningsparameterne fra kalibrantene.
    1. Beregn følgende for alle kalibreringspunkter.
      1. Beregn driftstiden ved hjelp av Eq (1):
        Equation 1 (1)
        driftstiden, tA den målte ankomsttiden og tinj injeksjonstidspunktet i IMS-cellen (alt i ms).
        MERK: For små molekyler, for eksempel oligosakkaridfragmenter, er dødtiden (flytid mellom utgangen fra IMS-cellen og detektoren) variasjon mellom forskjellige masser innenfor feilområdet til CCS-kalibreringen og kan ignoreres.
      2. Beregn den nøytrale massen av ionene ved hjelp av Eq (2):
        Equation 2 (2)
        med z ladningstilstanden til ion, og mion massen av motionen (i Da). Bruk eksakte masser for å unngå å innføre usikkerhet. Hvis det er et atomtap i stedet for en motion, bruk negative mionverdier (f.eks. for [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Beregn CCS-parameteren ved hjelp av Eq (3):
        Equation 3 (3)
        med CCS refererer drivrøret DTCCSN2 verdi (i nm2), og mgas massen av drivgassen (i Da; ex. for nitrogen: mgas = 28.01 Da).
      4. Beregn td'-parameteren ved hjelp av Eq (4):
        Equation 4 (4)
        med d detektorstartforsinkelsen som brukes eksperimentelt for å korrigere for dødtid (vanligvis ~ 1,5 ms).
      5. Beregn logaritme for parameterne ovenfor:
        ln (CCS)) og ln (t'd)
    2. Utfør en lineær regresjon for å bestemme R2-koeffisienten og x- og y-parameterne for logaritmisk passform (med x hellingen og ln(y) skjæringspunktet) ved hjelp av Eq (5):
      Equation 5 (5)
      MERK: Brukeren kan plotte inn ln(CCS') vs ln(td')-verdiene for å visuelt kontrollere resultatene av kalibreringen, selv om dette er valgfritt.
  3. Bruk kalibreringen på de eksperimentelle dataene for å kalibrere toppene valgt av MZmine for hvert IMS/IMS-spektrum som eksporteres til *.csv-filen. For hvert punkt beregner du følgende.
    1. Beregn driftstiden ved hjelp av Eq (6):
      Equation 6 (6)
      med tseq tiden før den endelige IMS-separasjonen (Verdien "Time Abs" som er angitt i trinn 3.4.6).
      MERK: Hvis du kalibrerer flere IMS/IMS-spektra som er anskaffet med forskjellige sekvenser, må du kontrollere tseq-verdiene nøye.
    2. Beregn den nøytrale massen av ionene ved hjelp av Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Beregn parameterne td' og td ved hjelp av Eq (8) og Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Beregn de endelige kalibrerte CCS-verdiene (TWCCSN2 i nm2) ved hjelp av Eq (10):
      Equation 10 (10)
      MERK: Selv om trinn 5.2.2. gir ln(y) som skjæringspunkt, må y brukes til å hente den endelige CCS-verdien. Ikke glem å bruke en eksponentiell funksjon.
  4. Kontroller nøyaktigheten til kalibreringen ved å bruke kalibreringen på det andre oppkjøpet av kalibreringsløsningen som ble anskaffet i trinn 2.4.
    MERK: Kalibreringen skal gi resultater med en feil på ~1-2%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En arabinoxylan pentasaccharide, XA2XX, ble valgt som et eksempel for å illustrere denne protokollen. Denne forbindelsen er kommersielt tilgjengelig, men bare som en blanding med en annen arabinoxylan pentasaccharide, XA3XX (ren XA3XX er også kommersielt tilgjengelig). Strukturene i XA2XX og XA3XX er gitt i supplerende figur S1. Siden forholdet mellom XA2XX og XA3XX i den kommersielle blandingen er ~ 50:50, ble en løsning på 20 μg / ml av blandingen forberedt på å nå en XA2XX konsentrasjon på ~ 10 μg / ml i 50: 50 MeOH / H2O + 500 μM LiCl.

For det første ble en MS-analyse av XA2XX + XA3XX-blandingen utført ved hjelp av høyoppløselig MS. Ettersom de to forbindelsene er isomerer, ble det observert en enkelt topp ved [M+Li]+m/z 685,24. Denne MS-toppen ble valgt med quadrupole og valgvinduet justert for å fjerne -1 Da litiumisotoper, som kan forveksles som den monoisotopiske toppen ved å behandle algoritmer (figur 2).

[M+Li]+ adducts av pentasaccharides ble deretter sendt til den første fasen av IMS-separasjon: etter 3 passerer rundt den sykliske IMS-cellen, ble 3 topper skilt med ankomsttider på 83, 90 og 94 ms. Denne profilen ble sammenlignet med ren XA3XX (infundert ved 10 μg/ml), som viste at toppene på 83 og 90 ms korresponderte med XA3XX, mens toppen på 94 ms tilsvarte XA2XX (figur 4A). Toppen på 94 ms ble valgt for IMS/IMS-analyse: ionene som tilhører XA3XX ble kastet ut (figur 4B), og toppen av interesse ble sendt til butikkcellen førarray. En 3-pass separasjon ble utført etter å ha reinjecting ion uten aktivering for å sikre at bare XA2XX toppen forble etter valget (ankommer på 199 ms i figur 4C).

Deretter ble ionen fragmentert ved reinjeksjon fra prestoreområdet, og en IMS-separasjon med én pass ble utført på alle fragmentene. To forskjellige aktiveringer ble forsøkt: den maksimale innstillingen for den innebygde prestore-aktiveringsfunksjonen ble først forsøkt (figur 5B,C); Forløperen forble imidlertid grunntoppen i spekteret. Dette er ikke ønskelig fordi fragmenter under en bestemt intensitetsterskel vanligvis vil bli fjernet for referansespektra. Dermed ble det valgt en manuelt definert prearray-gradient → pre-array bias → matriseforskyvningsspenningsgradient (figur 5D, E).

De genererte IMS/IMS-MS-dataene ble dekonvolvert med MZmine 2.51, ved hjelp av ankomsttid og m/z-dimensjoner (figur 6A), for å gi IMS/IMS-spektra som bare inneholder mobilitetsinformasjonen til fragmentene. Toppene over 0,2% relativ intensitet ble eksportert for CCS-kalibrering (de detaljerte MZmine-parametrene er gitt i Supplemental Table S1). CCS-kalibreringen ble utført ved hjelp av kalibreringsløsningen (R2 = 0,995, gjennomsnittlig absolutt kontrollavvik = 1,63 %, se supplerende tabell S3). Denne behandlingen ga endelig et sentroidert, CCS-kalibrert, IMS/IMS-spektrum (figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over IMS/IMS-datagenereringsprosessen. Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Isotopisk mønster av en XA3XX + XA2XX arabinoxylan pentasaccharide blanding. (A) Mettet signal uten DRE; (B) signal korrigert ved hjelp av DRE med en 5% ionoverføring (dvs. 95% demping); og (C)-profil etter quadrupole-valg for å fjerne -1 Da-toppen som tilsvarer en litiumisotoper. I lilla: området der artefakttopper kan vises på grunn av metning, forstørres 6 ganger. Forkortelser: DRE = dynamisk områdeforbedring; MS = massespektrometri; MSMS = tandem MS; LM Res = lav masseoppløsning; HM Res = høy masseoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oversikt over det sykliske IMS-kontrollvinduet, der brukeren definerer IMS/IMS-sekvensen. Sekvensen som vises, viser hvordan du kontrollerer kvaliteten på isolasjonen i IMS/IMS, med et utvalg av XA2XX etter 3 passeringer (spekteret som vises tilsvarer innstillingen av utvalgshendelsene etter separasjonen i første fase). Sekvensen består i å kjøre en første 3-pass IMS-separasjon over 58 ms, deretter løser du ut de to raskere isoformene fra IMS-cellen (segment 3), og løser ut den langsommere isoformen (ATD mellom 92 og 96 ms) i forbutikken (segment 4), og reinjecting den i IMS-cellen uten aktivering (segment 6), slik at ionene kan gjennomgå en ytterligere 3-pass (58-ms) separasjon (segment 7), deretter løse ut ioner fra IMS-cellen og hente data (segment 8). Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; cIMS = syklisk IMS; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = analog-til-digital omformer; TW = reisebølge; PE = potensiell energi; ATD = distribusjon av ankomsttid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Valg av XA2XX fra blandingen av XA2XX og XA3XX. (A) Separasjon av arabinoxylan pentasaccharides, XA3XX og XA2XX, etter 3 passeringer (tilsvarende en separasjonstid satt til 58 ms) rundt den sykliske IMS-cellen. (B) Brøk løst ut rett etter første fase av IMS-separasjon. (C) Brøk valgt for IMS/IMS der en annen 3-pass separasjon ble utført etter reinjeksjon. XA2XX-toppen av interesse er uthevet i grått. Ionmobilitetsspektraet vises i databeholdere og kommenteres med ankomsttid (ms). Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Prinsipper for kollisjonsindusert dissosiasjon ved hjelp av prearray-butikkområdet. (A) Skjemaer i multifunksjonsmatriseområdet som beskriver nøkkelspenninger (i rødt) som brukes til valg, reinjeksjon og aktivering under IMS/IMS-eksperimenter. De blå pilene viser retningen på reisebølgen i multifunksjonsmatrisen. (B, C) IMS/IMS- og MS/MS-spektra oppnådd for XA2XX ved hjelp av den innebygde prestore-aktiveringsfunksjonen (+150 V). Fargelinjen representerer ionintensitetsskalaen (blå = lav, rød = høy). (D, E) IMS/IMS- og MS/MS-spektra oppnådd for XA2XX med manuell optimalisering av spenningene (prearray gradient 195 V, prearray bias 180 V, array offset -10 V). Forløperioner er indikert av stjerner på spektra. Ionmobilitetsspektraet vises i databeholdere og kommenteres med ankomsttid (ms). Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = flytid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Illustrasjon av behandlingstrinnene. Resultater av (A) MZmine peak pick og (B) CCS-kalibrering av arabinoxylan pentasaccharide XA2XX. A viser massedekonvolusjonen av IMS/IMS-spekteret gjennom en fargekode. B viser det endelige IMS/IMS-spekteret etter sentrering og CCS-kalibrering. Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisjonstrsnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: En sammenligning av to IMS/IMS-spektra av XA2XX illustrerer metodens reproduserbarhet. Det endelige kalibrerte spekteret fra dette papiret (øverst) sammenlignes med spekteret fra Ollivier et al. 21 (nederst, vendt). Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = kollisjonstrsnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Strukturer av XA2XX og XA3XX arabinoxylan pentasaccharides. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Evaluering av repetisjonsevnen mellom dagen ved bruk av XA2XX. IMS/IMS-oppkjøp ble gjentatt på dag 1 (øverst) og dag 95 (nederst). Forkortelser: IMS = ion mobilitet spektrometri; IMS/IMS = tandem IMS. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S1: Detaljerte MZmine-parametere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S2: Instrumentparametere endret for å evaluere reproduserbarheten. Forkortelse: ESI = elektrosprayionisering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S3: Kontroll av CCS-kalibreringen ved hjelp av en ny anskaffelse av kalibreringsløsning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELECT SERIES Syklisk IMS er et kraftig verktøy som gjør det mulig å velge en definert ionpopulasjon – av en gitt m/z - og ion-mobilitet – uten behov for oppstrøms kromatografisk separasjon. Instrumentet gir mulighet for å generere et bidimensional fragmenteringskart over denne ionpopulasjonen, hvorfra både MS / MS og IMS / IMS-spektra kan trekkes ut. Brukeren må imidlertid merke seg flere kritiske punkter som krever oppmerksomhet under den eksperimentelle prosessen.

Først bør brukeren nøye sjekke MS-isolasjonsvinduet for tilstedeværelse av mulige isobariske forurensninger. Faktisk er isolasjonsvinduet til en quadrupole relativt bredt, og å vite ioner av en litt annen m / z som kan velges i quadrupole, vil hjelpe brukeren med å tildele toppen av interesse for ionmobilitet.

For det andre, når du utfører den første separasjonen, må brukeren sørge for at alle ioner gjennomgår samme antall passeringer rundt den sykliske ionmobilitetscellen. Dette er et viktig og vanskelig aspekt av ionmobilitetsseparasjon i en syklisk enhet. En feilaktig evaluering av antall passeringer for en gitt ion kan føre til feil identifisering og tolkning av toppene. Å kontrollere antall passeringer av forskjellige ionpopulasjoner kan være vanskelig på grunn av den relativt korte enkeltpasslengden (~ 1 m), og arter med svært forskjellige mobiliteter kan raskt overlappe.

Spesielt kan en topp deles mellom to forskjellige passeringer hvis matrisen bytter retning når denne ionpopulasjonen passerer gjennom (dette er relativt enkelt å identifisere: den delte toppen vil virke skarpere med en populasjon helt i begynnelsen av hendelsen Løs ut og hent ). For å angi antall passeringer riktig, bør brukeren starte med en kort separasjonstid (1-5 ms) som vil gi 1-pass-profilen. Deretter bør brukeren gradvis øke separasjonstiden til hele befolkningen har flyttet til høyere ankomsttider, noe som vil gi 2-pass-profilen. 2-pass-profilen skal se ut som 1-pass-profilen, men med bedre løste topper. Tiden en gitt ionpopulasjon tar å få en til å passere rundt den sykliske cellen, er en konstant som brukeren kan bruke til å beregne antall passeringer som en funksjon av separasjonstiden. For eksempel, hvis det er en 10 ms forskjell mellom første og andre pass, vil det også være en 10 ms forskjell mellom den andre og den tredje.

For det tredje, under IMS-valgstadiet, bør brukeren nøye kontrollere kvaliteten på isolasjonen, som vist i figur 4. Det er spesielt viktig å sjekke profilen som settes inn på nytt, fordi hvis innstillingene for TW-høyde og hastighet er for lave, kan det hende at utkastelsen av de andre populasjonene ikke er fullført. Avanserte brukere kan korrigere dette ved å justere Driftcell RF-radiofrekvensspenningen i KATEGORIEN RF på Tune-siden .

For det fjerde bør brukeren være forsiktig med å generere fragmenteringsspekteret og spesielt ved valg av riktig kollisjonsenergi, spesielt hvis spenningene er innstilt manuelt. Faktisk kan overdreven senking av Array Offset-spenningen påvirke den totale ionintensiteten negativt ved å hindre reinjeksjonen. I tillegg kan forløperen og fragmentene strekke seg over et bredt spekter av mobiliteter. Dermed vil de raskt gjennomgå et annet antall passeringer hvis den endelige separasjonstiden er høy, så det er viktig å holde en 1-ms Separat hendelse som forklart i protokolltrinn 2.3.3. Dette er en stor begrensning siden lengden på enkeltpass er relativt kort, noe som begrenser enkeltpassets løsningskraft til ~ 100 for oligosakkarider27. I denne forbindelse vil en økt banelengde i et enkelt pass være gunstig (dvs. de TWIMS-baserte strukturer for tapsfri ionmanipulering eller SLIM, med en banelengde på 13 m28). SLIM-oppsettet ble lansert kommersielt nylig29.

Til slutt bør brukeren være forsiktig med å definere det endelige mobilitetsområdet for anskaffelse ved hjelp av Pushes per bin-kommandoen , spesielt hvis du arbeider med multiplisert ladede ioner. Ionmobilitet er faktisk en funksjon av charge12, og for eksempel vil enkeltladede fragmenter generert fra en dobbeltladet forløper sannsynligvis være tregere enn forløperen (selv om de er mindre forbindelser).

En stor begrensning ved bruk av bare MS- og IMS-separasjoner for å velge forløperen (og ikke for eksempel et oppstrøms trinn i kromatografi) er at en gitt m/z kan gi flere topper i IMS, og at flere topper kan komme fra samme forbindelse. Dette illustreres av fordelingen av m/z 685,2, både for XA2XX+XA3XX-blandingen og ren XA3XX, i figur 4A. Multimodale IMS-distribusjoner av en enkelt m/z er et resultat av ulike gassfasekonformasjoner. For arter analysert som kationaddukter (i positiv modus) oppstår de forskjellige konformasjonene muligens av forskjeller i koordinering med motionen30,31,32.

For oligosakkarider kan de også oppstå ved separasjon av reduksjons-end anomers, selv om separasjon av reduksjon-end anomers vanligvis krever høyere IMS løse makt enn det som brukes her33,34,35. I dette tilfellet er den multimodale IMS-fordelingen i figur 4A delvis et resultat av de individuelle bidragene fra XA2XX og XA3XX. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at XA3XX gir to topper, som sannsynligvis er kation-koordinasjonskonformeringer. Det var lett å identifisere hvilken topp som tilsvarte XA2XX (dvs. arten av interesse) fordi ren XA3XX er tilgjengelig kommersielt, og mobilitetsprofilen kunne registreres separat. For å jobbe med komplekse blandinger som biologiske medier, kan det være viktig å vurdere å legge til et kromatografisk separasjonsstadium.

Det må notes to punkter om behandlingsarbeidsflyten som brukes til å oppnå massedekonvolvert IMS/IMS-spektra. Først, i denne protokollen, foreslås det å bruke MZmine 224 til å dekonvolve IMS / IMS-spekteret ved hjelp av MS-dimensjonen og, spesielt, bruke ADAP-algoritmen36 til å dele EIM-ene i forskjellige topper. Selv om den gir ganske gode resultater, som illustrert i figur 6, ble ADAP-algoritmen designet for kromatografiske analyser og står dermed for asymmetrifaktorer som er forbundet med væskefasekromatografi, for eksempel topp tailing. Adap-algoritmen kan derfor føre til at noen av funksjonene ikke identifiseres når de brukes på IMS-topper (f.eks. skuldre). I hovedsak er IMS-data enklere enn kromatografiske data: fordi det ikke er noen kjemisk interaksjon mellom forbindelsene med en kolonne, forventes IMS-data som er samlet inn under passende forhold (dvs. uten å mette IMS-cellen) å følge gaussiske distribusjoner37,38. Ideelt sett vil ADAP-dekonvolusjonstrinnet best erstattes av en gaussisk tilpasningsfunksjon, for eksempel den som brukes av programvare som er bestemt for IMS som CUISuite 239. Men som det står, ble gaussisk dekonvolusjon ikke direkte tilpasset hele behandlingskjeden som er beskrevet i denne protokollen. Derfor så det ut til å være et godt kompromiss for sluttbrukere å bruke den gratis, åpen kildekode-programvaren MZmine.

Den andre delen av behandlingen som garanterer diskusjon er CCS-kalibreringen. Denne protokollen foreslår å bruke en logaritmisk passformkalibrering25,26 og en kommersiell kalibrantblanding fra samme leverandør som spektrometeret (se materialtabellen). Denne prosedyren er den mest enkle å implementere i laboratoriet. Når det gjelder valget av kalibrantblandingen, bør brukeren vurdere at, som nevnt i flere studier, forbedres nøyaktigheten av CCS-kalibreringen ved bruk av kalibranter av samme molekylære klasse og ladetilstand som analytten26,40,41. Feilen som ble innført ved kalibrering med relativt like typer forbindelser (f.eks. karbohydrater vs. peptider) er moderat. Det anbefales imidlertid ikke å bruke svært forskjellige ioner som for eksempel å bruke saltklynger som kalibranter når du måler karbohydrater41. Når det gjelder valg av kalibreringsmetode, rapporterte Richardson et al.42 nylig en ny kalibreringsmetode som tar hensyn til fysikken til TWIMS for å forbedre nøyaktigheten av kalibreringen (med en gitt programvare). Tilnærmingen krever imidlertid evaluering av svært spesifikke parametere gjennom analyse av ulike typer forbindelser - alt fra metabolitter til innfødte proteiner. Fordi ingen blanding av et slikt utvalg av forbindelser kan bli funnet kommersielt, ble denne metoden ikke implementert i den nåværende protokollen.

Til slutt, for å evaluere metodens reproduserbarhet, evaluerte vi reproduserbarheten mellom dagen ved å gjenta IMS/IMS-MS-oppkjøpet på dag 1 og dag 95 (Supplerende figur S2). Eksperimentet viste at IMS/IMS-MS-data er svært reproduserbare, uten at IMS-toppen skifter med mer enn 0,2 ms i løpet av denne utvidede perioden. IMS/IMS-spekteret som ble generert i dette arbeidet ble videre sammenlignet med et annet spekter av XA2XX oppnådd under forskjellige forhold for tidligere arbeid med ionmobil-molekylært nettverk21. Noen instrumentelle parametere som kan påvirke ionstrukturen og ionmobilitetsprofilen13 ble bevisst endret – kildeparametrene og aktiveringsspenningsgradienten (en sammenligning av de varierende instrumentelle forholdene er gitt i Supplerende tabell S2). Deretter ble de to spektraene sammenlignet med cosinuslikhetspoengsummen – som er populært for sammenligningen av MS/MS-spektra i metabolomics – på GNPS-plattformen5 (CCS-toleranse for matchende fragmenter = 0,015 nm2).

Sammenligningen viste en cosinus likhetsscore på 0,87 (figur 7), som kan betraktes som høy med hensyn til de viktige instrumentelle variasjonene som brukes. Dette fører til ideen om at IMS / IMS spektralbiblioteker kan brukes til å dereplicate glykaner i komplekse blandinger med høy tillit, noe som ikke ville være tilfelle med MS / MS-spektra. Vær oppmerksom på at selv om den gjeldende tilnærmingen bare bruker CCS-dimensjonen til fragmenteringsspekteret, inneholder IMS/IMS-MS-dataene også MS-informasjon, som ikke er overflødig med CCS. For å optimalisere den derepliserende kraften til IMS/IMS, må det utvikles et bidimensional scoring-system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

S.O. er takknemlig til det franske nasjonale forskningsbyrået for å finansiere sin ph.d. (bevilgning ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Tags

Kjemi utgave 179
Bruke et syklisk ionmobilitetsmåler for tandemionmobilitetseksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter