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Chemistry

अग्रानुक्रम आयन गतिशीलता प्रयोगों के लिए एक चक्रीय आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करना

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) बायोमोलेक्यूल्स के लक्षण वर्णन के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक दिलचस्प पूरक है, विशेष रूप से क्योंकि यह आइसोमेरिज्म के प्रति संवेदनशील है। यह प्रोटोकॉल एक अग्रानुक्रम आईएमएस (आईएमएस / आईएमएस) प्रयोग का वर्णन करता है, जो एक अणु के अलगाव और इसके टुकड़ों की गतिशीलता प्रोफाइल की पीढ़ी की अनुमति देता है।

Abstract

रासायनिक संरचनाओं का सटीक लक्षण वर्णन उनके अंतर्निहित जैविक तंत्र और कार्यात्मक गुणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक लोकप्रिय उपकरण है लेकिन हमेशा सभी संरचनात्मक विशेषताओं को पूरी तरह से अनावरण करने के लिए पर्याप्त नहीं होता है। उदाहरण के लिए, हालांकि कार्बोहाइड्रेट जैविक रूप से प्रासंगिक हैं, उनका लक्षण वर्णन आइसोमेरिज्म के कई स्तरों से जटिल है। आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) एक दिलचस्प पूरक है क्योंकि यह आयन संरचनाओं के प्रति संवेदनशील है और इस प्रकार, आइसोमेरिज्म के लिए।

इसके अलावा, हाल की प्रगति ने तकनीक में काफी सुधार किया है: चक्रीय आईएमएस उपकरणों की अंतिम पीढ़ी रैखिक आईएमएस उपकरणों की तुलना में अतिरिक्त क्षमताएं प्रदान करती है, जैसे कि बढ़ी हुई समाधान शक्ति या अग्रानुक्रम आयन गतिशीलता (आईएमएस / आईएमएस) प्रयोगकरने की संभावना। आईएमएस / आईएमएस के दौरान, एक आयन को इसकी आयन गतिशीलता के आधार पर चुना जाता है, खंडित किया जाता है, और इसके टुकड़ों के बारे में आयन गतिशीलता जानकारी प्राप्त करने के लिए पुन: विश्लेषण किया जाता है। हाल के काम से पता चला है कि इस तरह के आईएमएस / आईएमएस डेटा में निहित टुकड़ों की गतिशीलता प्रोफाइल एक विशेष ग्लाइकन के फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य कर सकती है और इसका उपयोग संरचनात्मक रूप से प्रासंगिक तरीके से ग्लाइकोमिक्स डेटासेट को व्यवस्थित करने के लिए आणविक नेटवर्किंग रणनीति में किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस प्रकार यह वर्णन करना है कि आईएमएस / आईएमएस डेटा कैसे उत्पन्न किया जाए, नमूना तैयारी से आयन गतिशीलता आयाम के अंतिम टकराव क्रॉस सेक्शन (सीसीएस) अंशांकन तक जो पुनरुत्पादक स्पेक्ट्रा उत्पन्न करता है। एक प्रतिनिधि ग्लाइकन का उदाहरण लेते हुए, यह प्रोटोकॉल दिखाएगा कि चक्रीय आईएमएस उपकरण पर एक आईएमएस / आईएमएस नियंत्रण अनुक्रम कैसे बनाया जाए, आईएमएस आगमन समय को बहाव समय में अनुवाद करने के लिए इस नियंत्रण अनुक्रम के लिए कैसे खाता है (यानी, आयनों पर लागू प्रभावी पृथक्करण समय), और कच्चे डेटा से प्रासंगिक गतिशीलता जानकारी कैसे निकाली जाए। यह प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक आईएमएस / आईएमएस प्रयोग के महत्वपूर्ण बिंदुओं को समझाने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इस प्रकार नए चक्रीय आईएमएस उपयोगकर्ताओं को सीधे और पुन: प्रस्तुत करने योग्य अधिग्रहण करने में मदद करता है।

Introduction

बायोमोलेक्यूल्स का पूरा रासायनिक लक्षण वर्णन उनके अंतर्निहित जैविक और कार्यात्मक गुणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस अंत तक, "ओमिक्स" विज्ञान हाल के वर्षों में विकसित हुए हैं, जैविक सांद्रता में रासायनिक संरचनाओं के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए लक्ष्य। प्रोटिओमिक्स और मेटाबोलोमिक्स में, एमएस जैविक मीडिया में पाए जाने वाले संरचनात्मक विषमता को उजागर करने के लिए एक मुख्य उपकरण बन गया है- विशेष रूप से इसकी संवेदनशीलता और अग्रानुक्रम एमएस (एमएस / एमएस) के माध्यम से संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने की क्षमता के लिए धन्यवाद। एमएस / एमएस रणनीतियों में, एक आयन को इसके द्रव्यमान के अनुसार चुना जाता है, फिर खंडित किया जाता है, और अंत में, अणु के फिंगरप्रिंट को स्थापित करने के लिए इसके टुकड़ों के द्रव्यमान का अधिग्रहण किया जाता है। एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा, विशेष रूप से, वर्णक्रमीय डेटाबेस 1, 2 से मेल खाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, या अस्थायी रूप से मूल संरचनाओं 3,4 का पुनर्निर्माण किया जा सकता है। इस धारणा के तहत कि समान स्पेक्ट्रा समान यौगिकों से संबंधित हैं, एमएस / एमएस डेटा का उपयोग आणविक नेटवर्क (एमएन) बनाने के लिए भी किया जा सकता है जो एक समानता स्कोर 5,6 के माध्यम से संबंधित प्रजातियों को जोड़ता है।

हालांकि, आयनों के द्रव्यमान-से-चार्ज अनुपात (एम / जेड) का पता लगाने के लिए एमएस की अंतर्निहित संपत्ति के कारण, तकनीक कई संरचनात्मक विशेषताओं के लिए अंधा है जो (स्टीरियो) आइसोमेरिज्म की सीमा के भीतर आते हैं। उदाहरण के लिए, कार्बोहाइड्रेट कई मोनोसेकेराइड सबयूनिट्स से बने होते हैं, जिनमें से कई स्टीरियोआइसोमर्स या यहां तक कि एपिमर (उदाहरण के लिए, जीएलसी बनाम गैल या जीएलसी बनाम मैन) हैं। ये सबयूनिट्स ग्लाइकोसिडिक बांड से जुड़े होते हैं, जो लिंकेज (रीजियोआइसोमेरिज्म) की स्थिति और एनोमेरिक कार्बन (एनोमेरिज्म) के स्टेरिक कॉन्फ़िगरेशन से भिन्न हो सकते हैं। ये विशेषताएं स्टैंडअलोन एमएस के लिए कार्बोहाइड्रेट आइसोमर्स 7 के बीच अंतर करना मुश्किल बनाती हैं, और उच्च ऊर्जा सक्रियण विधियों 8,9,10 का उपयोग करके केवल रेजियोआइसोमेरिज्म को संबोधित किया जा सकता है। यद्यपि व्युत्पत्तिकरण स्टीरियोआइसोमेरिक समूह 11 की तुल्यता को बाधित करने का एक विकल्प है, इसके लिए व्यापक नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। एक और, अधिक सीधा विकल्प आईएमएस को आइसोमेरिज्म के प्रति संवेदनशील एक विश्लेषणात्मक आयाम के साथ जोड़ना है, जैसे कि आईएमएस।

क्योंकि यह प्रोटोकॉल उन उपयोगकर्ताओं के लिए डिज़ाइन किया गया है जो पहले से ही आईएमएस की मूल अवधारणाओं से परिचित हैं, और क्योंकि विस्तृत समीक्षाएं कहीं और उपलब्ध हैं12,13, केवल आईएमएस के सिद्धांतों का एक संक्षिप्त अवलोकन यहां दिया गया है। आईएमएस एक गैस-चरण पृथक्करण विधि है जो एक बफर गैस और एक विद्युत क्षेत्र के साथ आयनों की बातचीत पर निर्भर करती है, अंततः आयनों को उनके गैस-चरण संरचनाओं के अनुसार अलग करती है। एमएस के लिए युग्मित आईएमएस के विभिन्न सिद्धांतों को वाणिज्यिक उपकरणों पर पाया जा सकता है: कुछ वैकल्पिक उच्च और निम्न विद्युत क्षेत्रों (क्षेत्र असममित आईएमएस, एफएआईएमएस) पर काम करते हैं, जबकि अधिकांश कम क्षेत्र सीमा के भीतर काम करते हैं - विशेष रूप से बहाव ट्यूब आईएमएस (डीटीआईएमएस, रैखिक रूप से कम बिजली के क्षेत्र), यात्रा तरंग आईएमएस (टीडब्ल्यूआईएमएस, सममित संभावित तरंगें), और फंसे हुए आईएमएस (टीआईएमएस, विद्युत क्षेत्रों के खिलाफ बफर गैस ट्रैपिंग आयनों का उच्च प्रवाह) 13 . कम क्षेत्र के तरीके एक तथाकथित सीसीएस तक पहुंच की अनुमति देते हैं, आयन-गैस जोड़ी की एक संपत्ति जो आयन की सतह (Å2 या nm2 में) का प्रतिनिधित्व करती है जो अलगाव के दौरान बफर गैस के साथ बातचीत करती है। सीसीएस सैद्धांतिक रूप से साधन-स्वतंत्र है और इस प्रकार डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है जिसे विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच पुन: पेश किया जा सकता है। आयन गतिशीलता पृथक्करण को विभिन्न मापदंडों से प्रभावित किया जा सकता है और, विशेष रूप से, गतिशीलता सेल में गैस दबाव और गैस के तापमान के उतार-चढ़ाव से। सीसीएस अंशांकन इसे ठीक करने का एक तरीका है, क्योंकि कैलिब्रेंट और ब्याज की प्रजातियां दोनों समान रूप से प्रभावित होंगी। हालांकि, तापमान-नियंत्रित कमरे में उपकरण स्थापित करना और एक विश्वसनीय गैस दबाव नियंत्रण प्रणाली होना अनिवार्य है।

आईएमएस का एक दिलचस्प विकास आईएमएस / आईएमएस है, जिसे पहली बार 2006 में क्लेमर के समूह द्वारा एमएस / एमएस 15,16 के एनालॉग के रूप में पेश किया गया था। आईएमएस / आईएमएस में, ब्याज के एक आयन को इसकी आयन गतिशीलता के आधार पर चुनिंदा रूप से अलग किया जाता है; यह तब सक्रिय है (संभव विखंडन तक), और सक्रिय आयन या टुकड़ों का एक नया आईएमएस विश्लेषण किया जाता है। पहले वाद्य डिजाइन में, दो आईएमएस कोशिकाओं को श्रृंखला में रखा गया था, जो एक आयन फ़नल द्वारा अलग किया गया था जहां सक्रियण खड़ा था। तब से, हालांकि कई आईएमएस / आईएमएस सेटअप प्रस्तावित किए गए थे (समीक्षा के लिए, एल्ड्रिड और थैलेसिनोस 17 देखें), आईएमएस / आईएमएस क्षमता के साथ पहला वाणिज्यिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर केवल 201918 में उपलब्ध हुआ। इस उपकरण ने एक और तकनीकी सफलता के साथ संयोजन करके प्रारंभिक अवधारणा में काफी सुधार किया: आईएमएस सेल का एक चक्रीय डिजाइन।

चक्रीय आईएमएस सेल सैद्धांतिक रूप से बहाव पथ की लंबाई को बढ़ाने की अनुमति देता है और इस प्रकार, साधन 19 की समाधान शक्ति। यह एक विशेष उपकरण ज्यामिति के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जहां चक्रीय TWIMS सेल को मुख्य आयन ऑप्टिकल अक्ष पर ऑर्थोगोनल रूप से रखा जाता है। आईएमएस सेल के प्रवेश द्वार पर एक मल्टीफंक्शन सरणी क्षेत्र आयन पथ की दिशा को नियंत्रित करने की अनुमति देता है: (i) आईएमएस पृथक्करण के लिए आयनों को बग़ल में भेजना, (ii) एमएस डिटेक्शन के लिए आगे, या (iii) आईएमएस सेल से पीछे की ओर एक प्रीएरे सेल में संग्रहीत किया जाना है। इस प्रीएरे स्टोर सेल से, आयनों को सक्रिय किया जा सकता है और आयन गतिशीलता माप के लिए आईएमएस सेल में टुकड़ों को फिर से इंजेक्ट किया जा सकता है, एक दृष्टिकोण जिसका उपयोग स्टीरियोआइसोमर्स 20 को चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। आखिरकार, एकत्र किए गए डेटा में अग्रदूत और इसके टुकड़ों के लिए आयन गतिशीलता और एम / जेड जानकारी होती है।

हाल के एक प्रकाशन में जिसने ग्लाइकन विश्लेषण (Ollivier et al.21) के लिए इस चक्रीय डिजाइन का उपयोग किया, हमने दिखाया कि इस तरह के आईएमएस / आईएमएस डेटा में निहित टुकड़ों की गतिशीलता प्रोफ़ाइल एक बायोमोलेक्यूल के फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य करती है जिसका उपयोग आणविक नेटवर्किंग रणनीति में किया जा सकता है। परिणामी नेटवर्क, जिसे आईएम-एमएन कहा जाता है, ने संरचनात्मक रूप से प्रासंगिक तरीके से ग्लाइकोमिक्स डेटासेट के संगठन का नेतृत्व किया, जबकि एमएस / एमएस डेटा (एमएस-एमएन) से पूरी तरह से निर्मित नेटवर्क ने बहुत कम जानकारी का खुलासा किया। इस प्रकाशन के पूरक और चक्रीय IMS उपयोगकर्ताओं को इस वर्कफ़्लो को कार्यान्वित करने में मदद करने के लिए, यह प्रोटोकॉल डेटा एकत्र करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का पूर्ण विवरण प्रदान करता है. यह प्रोटोकॉल केवल IMS/IMS डेटा की पीढ़ी पर केंद्रित है जिसका उपयोग उपयोगकर्ता तब IM-MN नेटवर्क (see21) बनाने के लिए कर सकते हैं - या उनकी पसंद के किसी भी अन्य अनुप्रयोग के लिए। IM-MN के निर्माण पर यहां विचार नहीं किया जाएगा, क्योंकि आणविक नेटवर्किंग के लिए प्रोटोकॉल पहले से ही उपलब्ध हैं22। मूल्यवान और पुनरुत्पादक आईएमएस /आईएमएस अधिग्रहण उत्पन्न करने के लिए जिन महत्वपूर्ण बिंदुओं का पालन किया जाना चाहिए, उन्हें हाइलाइट किया गया है। ओलिवियर एट अल द्वारा अध्ययन किए गए ओलिगोसेकेराइड्स में से एक का उदाहरण लेते हुए। 21, निम्नलिखित चरणों को विस्तृत किया गया है: (i) नमूना तैयारी, (ii) चक्रीय आईएमएस साधन की ट्यूनिंग, (iii) डेटा का स्वचालित पीक-पिकिंग, और (iv) सीसीएस अंशांकन।

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Protocol

नोट:: प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रदान किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर पूरक तालिका S1 और पूरक तालिका S2 में पाए जा सकते हैं।

1. नमूना समाधान की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल एक arabinoxylan pentasaccharide (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose या XA2XX; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक उदाहरण के रूप में वर्णित किया गया है।

  1. विलायक की तैयारी: 500 μM LiCl में 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. LiCl के 212 मिलीग्राम वजन द्वारा H2O में लिथियम क्लोराइड (LiCl) का 100 mM स्टॉक समाधान तैयार करें और 50 mL पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूब में 50 mL उच्च-शुद्धता विआयनीकृत पानी (H2O) जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक हिलाएं।
      नोट: विलायक को स्पेक्ट्रोमीटर के आयन स्रोत में [एम + ली] + adducts के गठन को बढ़ावा देने के लिए एक लिथियम नमक के साथ डोप किया जाता है, क्योंकि यह आमतौर पर अन्य क्षार adducts की तुलना में बेहतर गुणवत्ता वाले विखंडन स्पेक्ट्रा की पैदावार करता है। LiCl के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि कार्बनिक एसिड (और इस प्रकार उनके लवण) पहले आईएमएस प्रोफाइल 23 को प्रभावित करने के लिए पाए गए हैं।
    2. एक कांच की बोतल में, LiCl स्टॉक समाधान 200x को पतला करें: स्टॉक समाधान के 250 μL तक, H2O का 24.75 mL जोड़ें। 50:50 H2O:MeOH (v/v) में 500 μM की LiCl की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए 25 mL मेथनॉल (MeOH) जोड़ें। विलायक degas करने के लिए 2 मिनट के लिए Sonicate.
      नोट: MeOH एक स्वास्थ्य खतरा प्रस्तुत करता है (H225, H301, H311, H331, H370); एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा पहने हुए एक चिमटा हुड के तहत हेरफेर। 50: 50 MeOH / H2O (v / v) का एक अनुपात ओलिगोसेकेराइड्स के आयनीकरण के लिए सबसे अच्छा विलायक प्रतीत होता है; हालांकि, यदि आवश्यक हो तो MeOH को एसिटोनिट्राइल (एसीएन) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  2. एक 1.5 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में, कार्बोहाइड्रेट का 1 मिलीग्राम वजन। 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 500 μM LiCl की एक उपयुक्त मात्रा के साथ भंग करें। 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl में 10 μg/mL की अंतिम सांद्रता को पतला करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 10 μg / mL की एकाग्रता को आईएमएस / आईएमएस-एमएस के दौरान सभी टुकड़े आयनों पर सिग्नल को अनुकूलित करने के लिए चुना गया था (यह एक शुद्ध यौगिक के लिए है; मिश्रण पर काम करते समय एकाग्रता बढ़ाएं)। संदर्भ आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के लिए, नमूने को और पतला न करें: विखंडन से पहले एमएस डिटेक्टर की संतृप्ति की उम्मीद की जाती है, हालांकि उपकरण इसे सही करने के लिए विकल्प प्रदान करता है (चरण 3.2 देखें)।

2. चक्रीय आईएमएस द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर की ट्यूनिंग

नोट:: सॉफ़्टवेयर से संबंधित निर्देश (Windows, मेनू, और आदेश) बोल्ड में हाइलाइट किए गए हैं।

  1. इंस्ट्रूमेंट कंट्रोल सॉफ़्टवेयर (एमएस ट्यून पेज) से इंस्ट्रूमेंट कंसोल खोलें, सामग्री की तालिका में सॉफ़्टवेयर विवरण देखें, और इंस्ट्रूमेंट को ऑपरेट मोड में रखें। आईएमएस सेल में स्थिर होने के लिए उच्च वोल्टेज के लिए कम से कम 3 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: सर्वोत्तम पुनरुत्पादन के लिए, आईएमएस सेल में वोल्टेज को पूरी तरह से स्थिर करने की आवश्यकता है। उच्च वोल्टेज को चालू करें और किसी भी चक्रीय आईएमएस विश्लेषण से पहले उपकरण को रात भर स्थिर होने दें। इसके अलावा, आयन गतिशीलता सेल में दबाव और तापमान को यथासंभव स्थिर रखा जाना चाहिए। हालांकि दबाव के लिए एक रीडबैक वैक्यूम टैब में उपलब्ध है, तापमान के लिए कोई रीडबैक उपलब्ध नहीं है। उपकरण को थर्मोस्टैटेड प्रयोगशाला में रखें। इस काम में उपयोग किया जाने वाला उपकरण 20 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोस्टैटेड प्रयोगशाला में 1.75 mbar पर संचालित होता है।
  2. चक्रीय आईएमएस साधन सेटअप
    नोट:: मानक समाधान साधन सेटअप के लिए अंतर्निहित fluidics सिस्टम का उपयोग कर infused होना चाहिए।
    1. Fluidics सिस्टम पर उपयुक्त निर्माता-प्रदान किए गए मानकों से भरे तरल पदार्थ कंटेनरों को रखें: जलाशय बी ('लॉकमास'): 50:50 एसीएन / एच 2 ओ + 0.1% फॉर्मिक एसिड में 10 पीजी / μL ल्यूसीन एनकेफेलिन (एलईयू ईएनके); जलाशय सी ('कैलिब्रंट'): MajorMix.
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में, MajorMix अंशांकन समाधान m/z और CCS आयाम दोनों कैलिब्रेट करने के लिए उपयोग किया जाएगा। व्यावहारिक कारणों से, एक बाहरी सीसीएस अंशांकन किया जाएगा (प्रोटोकॉल के चरण 5 देखें); इसलिए, सीसीएस के लिए इन-हाउस कैलिब्रेंट मिश्रण और एम / जेड (जैसे, सोडियम फॉर्मेट या सोडियम आयोडाइड) के लिए एक और कैलिब्रेंट का उपयोग करना भी संभव है।
    2. क्वार्ट्ज कंसोल के ट्यून पृष्ठ पर, Fluidics टैब पर जाएँ। नमूना fluidics जलाशय C और संदर्भ fluidics जलाशय B करने के लिए सेट करें एमएस संकेत की जांच करने के लिए आयन स्रोत में लगातार दोनों समाधान infuse.
    3. ADC सेटअप, डिटेक्टर सेटअप (LEU ENK का उपयोग करके), और बड़े पैमाने पर अंशांकन (अंशांकन समाधान के लिए सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार इंस्ट्रूमेंट सेटअप पृष्ठ से निष्पादित करें।
  3. एक एकल पास पृथक्करण के साथ अंशांकन समाधान का एक IMS अधिग्रहण रिकॉर्ड करें (बाहरी IMS अंशांकन के लिए इसका उपयोग करें)।
    नोट: आयन स्रोत और यात्रा तरंग (TW) पैरामीटर (स्थैतिक तरंग ऊंचाई और तरंग वेग) सभी अधिग्रहण (अंशांकन और अधिग्रहण) के दौरान स्थिर रखा जाना चाहिए। यदि उपयोगकर्ता को अपने नमूने के लिए इष्टतम मापदंडों का पूर्व ज्ञान नहीं है, तो यह चरण प्रोटोकॉल के चरण 3 के बाद किया जा सकता है (तटस्थ ओलिगोसेकेराइड्स के [M + Li]+ adducts के लिए, प्रतिनिधि परिणाम 16 V की TW ऊंचाई और 350 m / s के TW वेग का उपयोग करते हैं, जो सबसे अच्छा परिणाम देते हैं)।
    1. Fluidics टैब से, चकित स्थिति नमूना का चयन करें और 10 μL / मिनट की प्रवाह दर पर 'नमूना' जांच के माध्यम से आयन स्रोत (अंतर्निहित fluidics प्रणाली का उपयोग करके) में कैलिब्रेंट (सामग्री की तालिका देखें) infuse।
    2. एक एकल-पास IMS अनुक्रम सेट करें। ट्यून पृष्ठ से, इंस्ट्रूमेंट को गतिशीलता मोड में रखें, और चक्रीय अनुक्रम नियंत्रण विंडो खोलें। उन्नत मोड का चयन करें। इस नई विंडो के चक्रीय फ़ंक्शंस टैब से, बंडल जोड़ें का चयन करें, फिर एकल/मल्टीपास. एक ही विंडो के अनुक्रम टैब में प्रकट होने के लिए गतिशीलता ईवेंट के अनुक्रम के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट:: वास्तविक समय प्रदर्शन को सक्रिय करने के लिए, उपयोगकर्ता को साधन पैरामीटर लागू करना होगा: TOF मोड में ट्यून पर क्लिक करें या गतिशीलता मोड में चलाएँ। TOF और Mobility मोड के बीच साधन स्विच करने से पहले, किसी भी चल रहे अधिग्रहण (ट्यून पृष्ठ प्रदर्शन सहित) को निरस्त करना आवश्यक है। आयनों की सापेक्ष बहुतायत आयन संचरण मापदंडों में परिवर्तन के कारण TOF मोड और गतिशीलता मोड के बीच भिन्न हो सकती है।
    3. अनुक्रम को अनुकूलित करें ताकि सभी कैलिब्रेंट आयन चक्रीय आईएमएस रेसट्रैक के चारों ओर एक ही पास बना सकें। इंजेक्ट समय या बाहर निकालें को न बदलें और समय प्राप्त करें; हालांकि, अलग समय को 1 ms (अनुक्रम टैब में) तक कम करें। अंशांकन मिश्रण के कुछ आयनप्रदर्शित आगमन समय विंडो में फिट नहीं होते हैं, तो ADC सेटिंग्स टैब में पुश प्रति बिन की संख्या बढ़ाकर ओर्थोगोनल त्वरण TOF विश्लेषक के पुशर के साथ IMS का सिंक्रनाइज़ेशन परिवर्तित करें।
      नोट:: नियंत्रण अनुक्रम में समय केवल आयन गेटिंग के लिए multifunction सरणी को नियंत्रित करते हैं। जब तक आयनों को रेसट्रैक के चारों ओर अपने पहले (या nth) पास में लगे हुए हैं, तब तक वे कहा पास समाप्त कर देंगे, भले ही TW की दिशा इस बीच सरणी में बदल गई हो। पृथक्करण समय को 1 एमएस तक कम करने का मतलब है कि सरणी 1 एमएस के बाद इजेक्शन मोड पर स्विच करेगी। यह सुनिश्चित करता है कि तेज आयनों के पास सरणी के माध्यम से गुजरने और धीमे आयनों को अपना पहला पास समाप्त करने से पहले दूसरे पास में संलग्न होने के लिए पर्याप्त समय नहीं होगा। इसलिए, सभी आयनों को पास (यानी, एक पास) की समान संख्या के अधीन किया जाएगा, जो आईएमएस अंशांकन करने के लिए आवश्यक है।
    4. एक 2 मिनट अधिग्रहण रिकॉर्ड करें। चक्रीय अनुक्रम नियंत्रण विंडो में, अधिग्रहण सेटिंग्स पॉपअप विंडो खोलने के लिए प्राप्त करें पर क्लिक करें। फ़ाइल का नाम, वर्णन, और अधिग्रहण की लंबाई (मिनट) इनपुट करें और सहेजेंक्लिक करें।
  4. चरण 2.3 के रूप में समान शर्तों के तहत अंशांकन समाधान का एक और 2 मिनट का अधिग्रहण रिकॉर्ड करें (CCS अंशांकन की गुणवत्ता की जाँच करने के लिए इसका उपयोग करें)। चक्रीय अनुक्रम नियंत्रण विंडो में, अधिग्रहण सेटिंग्स पॉपअप विंडो खोलने के लिए प्राप्त करें पर क्लिक करें। फ़ाइल का नाम, वर्णन, और अधिग्रहण की लंबाई (मिनट) इनपुट करें और सहेजेंक्लिक करें।
  5. झांकना टयूबिंग में कैलिब्रेंट के क्रिस्टलीकरण से बचने के लिए 50:50 H2O / ACN के साथ fluidics प्रणाली को अच्छी तरह से धो लें।

3. आईएमएस /

  1. एक सिरिंज पंप का उपयोग करते हुए, 10 μL / मिनट की प्रवाह दर पर नमूना जांच के माध्यम से 10 μg / mL पर (लिथियम-डोप्ड) नमूने को शामिल करें।
  2. संकेत की स्थिरता की जांच करने के लिए उपकरण को TOF मोड ( एमएस ट्यून पृष्ठ से) पर स्विच करें। नमूने का एक पूर्ण एमएस अधिग्रहण (1 मिनट) रिकॉर्ड करें, जो आइसोटोपिक पैटर्न और संभावित संदूषकों की उपस्थिति की जांच करने के लिए उपयोगी होगा।
    नोट:: नमूना एकाग्रता टुकड़ों के लिए एक अच्छा आयन संकेत प्राप्त करने के लिए चुना गया है, क्योंकि एक TOF संतृप्ति इस चरण में मनाया जा सकता है। टीओएफ संतृप्ति को निम्नलिखित कलाकृतियों का उपयोग करके पहचाना जा सकता है: (i) एक कृत्रिम रूप से बढ़ा हुआ एमएस रिज़ॉल्यूशन, (ii) आइसोटोपिक अनुपात में परिवर्तन, और (iii) आइसोटोप के बीच कम-बहुतायत वाली चोटियों की एक भीड़। आयनों के संचरण को क्षीण करने और टीओएफ मोड (चित्रा 2ए, बी) में संतृप्ति को छोड़ने के लिए DRE लेंस (डायनेमिक रेंज एन्हांसमेंट, क्वाड / एमएस प्रोफ़ाइल / मुख्य ट्यून पृष्ठ के DRE टैब) का उपयोग करें।
  3. MSMS मोड (मुख्य ट्यून पृष्ठ के क्वाड / एमएस प्रोफाइल टैब) में उपकरण रखो और चतुर्भुज में अलगाव के लिए MSMS मास क्षेत्र में लक्षित आयन के द्रव्यमान का चयन करें (उदाहरण में: 685.2 का m / z, arabinoxylan pentasaccharide की [M + Li] + आयनिक प्रजातियों के अनुरूप)। डेटा को संसाधित करते समय अग्रदूत अलगाव की जांच करने के लिए 1 मिनट का अधिग्रहण रिकॉर्ड करें।
    नोट: लिथियम adducts monoisotopic चोटी है, जो MS/MS चयन विंडो से हटाने की आवश्यकता है ताकि यह प्रसंस्करण चरणों के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा के -1 Da पर एक आइसोटोप है। इसे Quad/MS प्रोफ़ाइल टैब (चित्रा 2C) में LM रिज़ॉल्यूशन और HM रिज़ॉल्यूशन पैरामीटर का उपयोग करके चयन श्रेणी को संकीर्ण करके निकाला जा सकता है.
  4. ब्याज के आइसोमर की गतिशीलता-आधारित चयन करने के लिए एक "स्लाइसिंग" आईएमएस अनुक्रम सेट करें।
    1. इंस्ट्रूमेंट को गतिशीलता मोड पर स्विच करें (चरण 2.3.2 देखें)। चक्रीय अनुक्रम नियंत्रण विंडो में, चक्रीय फ़ंक्शंस टैब से, बंडल जोड़ें और फिर स्लाइसिंग का चयन करें. अनुक्रम टैब (चित्र 3) में प्रकट होने के लिए गतिशीलता ईवेंट्स के एक जटिल अनुक्रम के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट:: यह IMS/IMS प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को विज़ुअलाइज़ करने के लिए संभव है: अनुक्रम टैब में Eject और प्राप्त ईवेंट पर क्लिक करें। एक बार लाल रंग में हाइलाइट होने के बाद, इसे ऊपर और नीचे बटन का उपयोग करके अनुक्रम के भीतर उपयुक्त स्थिति में ले जाएं।
    2. पहले अलग ईवेंट के ठीक बाद निकालें और इवेंट प्राप्त करें की स्थिति (यानी, इसे चित्र 3 में प्रदर्शित अनुक्रम में पंक्ति 8 के बजाय पंक्ति 3 पर ले जाएँ) और तब चलाएँ क्लिक करें. वास्तविक समय में प्रदर्शित होने के लिए प्रारंभिक पृथक्करण के परिणामों की तलाश करें। जब तक कि IMS चोटियों का रिज़ॉल्यूशन संतोषजनक न हो, तब तक अनुक्रम में इस ईवेंट के लिए समय मान परिवर्तित करके मल्टीपास पृथक्करण के लिए पहले अलग ईवेंट की अवधि बढ़ाएँ. संदर्भ के लिए एक 1 मिनट का अधिग्रहण रिकॉर्ड करें।
      नोट:: ADC सेटअप टैब में ADC प्रारंभ विलंब मान का ध्यान रखें: यह अलगाव की गुणवत्ता की जाँच करने के लिए उपयोगी होगा।
    3. रोकेंक्लिक करें। ध्यान दें कि प्रारंभिक पृथक्करण के परिणाम प्रदर्शित होते हैं, हालांकि नियंत्रण अनुक्रम में संशोधन तब तक लागू नहीं किए जाएँगे जब तक कि उपयोगकर्ता पुन: चलाएँ क्लिक नहीं करता. बाहर निकालें और इवेंट प्राप्त करें को बाहर निकालें के नीचे रखें, पूर्व-संग्रह करने के लिए बाहर निकालें, और ईवेंट को होल्ड और निकालें. ईवेंट की अवधि को समायोजित करें ताकि लक्षित चोटी पूर्व-स्टोर क्षेत्र में बाहर निकालें में हो, और कोई भी अन्य आयन या तो Eject या होल्ड और इजेक्ट क्षेत्र में हो।
      नोट:: आगमन समय वितरण (ATDs) की तुलना में इन तीन घटनाओं की अवधि Mobilogram टैब (चित्रा 3) में गतिशीलता स्पेक्ट्रम के नीचे रंग-कोडित पट्टी का उपयोग कर visualized किया जा सकता है।
    4. पूर्व-संग्रह और दूसरे अलग-अलग ईवेंट से Reinject के नीचे, अनुक्रम के अंत में निकालें और प्राप्त ईवेंट की स्थिति । चयनित जनसंख्या प्रदर्शित करने के लिए चलाएँ क्लिक करें.
      नोट:: चयनित जनसंख्या IMS कक्ष छोड़ दिया है, क्योंकि सभी पिछले पृथक्करण खो गया है, और यह एक एकल-पास पृथक्करण (जो वांछित है) के लिए वापस आ गया है।
    5. अलगाव की गुणवत्ता की जांच करें। यह सत्यापित करने के लिए कि केवल ब्याज के शिखर का चयन किया गया है, पुन: इंजेक्शन के बाद एक ही पृथक्करण करें जैसा कि पुन: इंजेक्शन से पहले (यानी, एक ही अलग समय) से पहले किया गया है जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। संदर्भ के लिए एक 1 मिनट का अधिग्रहण रिकॉर्ड करें।
      नोट:: उपयोगकर्ताओं को निष्कासित जनसंख्या की जाँच करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है; पूर्व-संग्रह समय विंडो के लिए बाहर निकालें बेसलाइन स्तर (चित्रा 4B) होना चाहिए। इसे जाँचने के लिए, ADC प्रारंभ विलंब में मैन्युअल मोड में ADC सेटिंग्स टैब में रखें, और चरण 3.4.2 में नोट किया गया विलंब समय दर्ज करें। संदर्भ के लिए एक 1 मिनट का अधिग्रहण रिकॉर्ड करें।
    6. अनुक्रम टैब में, उपयोगकर्ता-निर्धारित ईवेंट समय (समय Abs स्तंभ, लाल रंग में हाइलाइट किया गया) के बगल में स्थित स्तंभ में, सभी ईवेंट्स के अभिव्यक्त समय की तलाश करें. CCS अंशांकन करने के लिए पूर्व-संग्रह ईवेंट से Reinject की पंक्ति पर पाए गए समय Abs का ध्यान रखें।
  5. आईएमएस के दो दौरों के बीच लक्षित चोटी को खंडित करें। आयनों की गतिज ऊर्जा को बढ़ाने के लिए reinjection चरण के वोल्टेज को बदलें, और आयन गतिशीलता गैस के साथ टकराव पर उन्हें टुकड़ा करें।
    1. अलग ईवेंट की अवधि सीधे Eject और 1 ms करने के लिए प्राप्त करने से पहले सेट करें (चरण 2.3.3 में स्पष्टीकरण देखें)।
    2. पूर्व-संग्रह पंक्ति से पुन: इंजेक्ट करें पर, सक्रियण सक्षम करें बॉक्स पर टिक करें, और अंतर्निहित नियंत्रण के साथ फ़्रेग्मेंटेशन ऑप्टिमाइज़ करें। यदि स्पेक्ट्रम संतोषजनक है (उदाहरण के लिए, आधार शिखर एक टुकड़ा है), तो सीधे चरण 3.5.4 पर आगे बढ़ें।
      नोट: सक्रियण को सक्षम करते समय, लाइन पर तीन वोल्टेज ग्रे हो जाएंगे: ये वोल्टेज हैं जिन्हें उपयोगकर्ता को बदलने की आवश्यकता होती है यदि वोल्टेज के मैन्युअल अनुकूलन की आवश्यकता होती है (अगला चरण देखें)। ये तीन वोल्टेज (प्री-एरे ग्रेडिएंट, प्री-एरे बायस, और एरे ऑफसेट) आयनों को सक्रिय करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्रेडिएंट का निर्माण करते हैं। आयनों की गतिज ऊर्जा पूर्व-सरणी पूर्वाग्रह और सरणी ऑफसेट के बीच ढलान के साथ बढ़ेगी ( चित्रा 5 देखें)। ग्रेडिएंट → बायस → ऑफसेट मानों के डिफ़ॉल्ट मान हैं: सक्रियण 85 → 70 → 45 V के बिना; अंतर्निहित फ़ंक्शन 185 → 170 → -5 V (+150 V) का अधिकतम सक्रियण. विखंडन के बाद, DRE लेंस का उपयोग करके आयन संचरण को समायोजित करना न भूलें (सिग्नल के क्षीणन को कम करें) (चरण 3.2 देखें)।
    3. फ़्रेग्मेंटेशन अंतर्निहित नियंत्रण के साथ संतोषजनक नहीं है, तो सक्रियकरण सक्षम करें बॉक्स को अनचेक करें और मैन्युअल रूप से reinjection voltages को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए आगे बढ़ें। प्री-एरे ग्रेडिएंट वोल्टेज बढ़ाएं ( प्री-एरे बायस वोल्टेज को हमेशा प्री-एरे ग्रेडिएंट के नीचे 15 वी रखा जाना चाहिए), और परिणाम संतोषजनक होने तक एरे ऑफसेट वोल्टेज (जिसे नकारात्मक के रूप में सेट किया जा सकता है) को कम करें।
      नोट:: मैन्युअल रूप से multifunction सरणी के voltages ट्यूनिंग करते समय, उपयोगकर्ता 'Mobilogram' दृश्य से multifunction सरणी (PE आरेख) में लागू वोल्टेज के इंटरैक्टिव schematics के लिए स्विच कर सकते हैं बेहतर वोल्टेज सेटिंग्स (चित्रा 5A) visualize करने के लिए।
    4. एक 2 मिनट अधिग्रहण रिकॉर्ड करें। अधिग्रहण पॉप-अप विंडो में, केवल आगमन समय बनाम m/z (क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला अधिग्रहण समय-अवधारण समय-फ़ाइल से निकाल दिया जाता है) वाली फ़ाइल जनरेट करने के लिए रिटेन ड्रिफ्ट टाइम विकल्प पर टिक करें. ध्यान दें कि इस फ़ाइल को *_dt लेबल किया गया है। रॉ।
      नोट:: यदि उपयोगकर्ता बहाव समय बनाए रखें विकल्प की जाँच करने के लिए भूल जाता है, यह अभी भी Driftscope 2.9 सॉफ़्टवेयर (फ़ाइल | का उपयोग कर IMS आयाम निकालने के लिए संभव है MassLynx | में निर्यात करें बहाव समय बनाए रखें)।
  6. मुख्य ट्यून पृष्ठ में उपकरण को TOF मोड में वापस करें, और अगले नमूने के साथ आगे बढ़ने से पहले 50:50 MeOH / H2O के साथ सिस्टम को अच्छी तरह से कुल्ला करें।

4. IMS/

नोट: MZmine 2 सामग्री की तालिका में दिए गए URL से उपलब्ध है। MZmine 2.51 के उपयोग की सिफारिश की है. इस पांडुलिपि की तैयारी के समय, बाद के संस्करण आयात फ़ंक्शन में परिवर्तन के कारण चक्रीय IMS उपकरणों से RAW फ़ाइलों को नहीं खोल सकते हैं।

  1. केवल IMS और m/z आयाम (*_dt वाली कच्ची फ़ाइलों) को आयात करें. RAW) कच्चे डेटा विधियों का उपयोग कर | कच्चा डेटा आयात करें.
    नोट:: कच्ची फ़ाइलें मुख्य MZmine विंडो के बाईं ओर दिखाई देंगी। मूल * आयात न करें । RAW फ़ाइलें जो अभी भी अवधारण समय आयाम शामिल हैं। MZmine आईएमएस आगमन समय से अवधारण समय को अलग नहीं करता है, और दोनों आयामों के डेटा बिंदु ओवरलैप होंगे।
  2. किसी प्रतिनिधि फ़ाइल पर वर्कफ़्लो पैरामीटर्स को इसमें चयन करके ऑप्टिमाइज़ करें कच्ची डेटा फ़ाइलें सूची।
    1. डेटा में शोर स्तर का मूल्यांकन करें। कच्चे डेटा फ़ाइलों की सूची में फ़ाइल पर राइट-क्लिक करें, TIC दिखाएँ का चयन करें और आधार शिखर "क्रोमैटोग्राम" (BPC) प्रदर्शित करें। अपने द्रव्यमान स्पेक्ट्रम को प्रदर्शित करने के लिए आंखों द्वारा देखे जाने वाले सबसे छोटे शिखर पर डबल-क्लिक करें। इस स्पेक्ट्रम में आधार चोटी के दूसरे आइसोटोप के आसपास होने के लिए डेटा में शोर स्तर पर विचार करें, और निम्नलिखित प्रसंस्करण चरणों में सभी तीव्रता थ्रेसहोल्ड के लिए इस समान मान का उपयोग करें।
      नोट: डेटा चतुर्भुज अलगाव का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था और इस प्रकार MZmine द्वारा MS/MS के रूप में माना जाता है। पूरे MZmine प्रसंस्करण के दौरान, MS स्तर = 2 पर काम करना सुनिश्चित करें।
    2. | कच्चे डेटा विधियों का उपयोग कर बड़े पैमाने पर पता लगाना निष्पादित करें सुविधा का पता लगाने | बड़े पैमाने पर पता लगाना. प्रोफ़ाइल मोड में अधिग्रहित डेटा के लिए, तरंगिका रूपांतरण एल्गोरिथ्म का उपयोग करें। MZmine में एल्गोरिदम के मापदंडों को सेट करने के लिए, एल्गोरिथ्म के बगल में [...] बटन पर क्लिक करें और पैरामीटर को अनुकूलित करते समय डेटा की कल्पना करने के लिए पूर्वावलोकन दिखाएं विकल्प का उपयोग करें।
      नोट:: इस स्तर पर, एल्गोरिथ्म द्वारा चयनित चोटियों पूर्वावलोकन विंडो में लाल रंग में दिखाई देगा। जब स्वेटर का उपयोग कर मालिकाना रॉ फ़ाइलों पर एल्गोरिथ्म को बदलने , MZmine कभी कभी केन्द्रीकृत चोटियों के लिए प्रोफ़ाइल डेटा अंक गलती होगी. सॉफ़्टवेयर एक संदेश प्रदर्शित करेगा जिसमें कहा गया है कि उपयोगकर्ता केंद्रीकृत स्पेक्ट्रा पर एक प्रोफ़ाइल एल्गोरिथ्म चला रहा है: इस संदेश को अनदेखा करें और ठीक क्लिक करें।
    3. कच्चे डेटा विधियों का उपयोग करके प्रत्येक टुकड़ा द्रव्यमान के लिए निकाले गए आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रा (EIM) का पुनर्निर्माण | सुविधा का पता लगाने | पिछले चरण द्वारा उत्पन्न 'जनता' द्रव्यमान सूची पर ADAP क्रोमैटोग्राम बिल्डर। चूंकि इस स्तर पर एम / जेड सहिष्णुता इनपुट एक स्कैन-टू-स्कैन सहिष्णुता है, इसलिए इसे समग्र अपेक्षित सटीकता से कम से कम 3-4 गुना अधिक छोड़ना सुनिश्चित करें।
    4. पिछले चरण के रूप में पूर्वावलोकन विकल्प नहीं है, मुख्य MZmine विंडो के दाहिने पैनल पर दिखाई देने वाली सुविधा सूची का उपयोग करके सीधे पीक पिकिंग की गुणवत्ता की जांच करें। सुविधा सूची खोलें, सभी पंक्तियों का चयन करें, राइट-क्लिक करें, और दिखाएँ/XIC (संवाद) का चयन करें। गतिशीलता स्पेक्ट्रम पर सभी आयनों को प्रदर्शित करने के लिए सभी क्लिक करें। यह सुनिश्चित करने के लिए रंग में दिखाई देने वाली चुनी गई चोटियों का निरीक्षण करें कि कोई स्पष्ट याद की गई चोटियां नहीं हैं।
    5. कई विशेषताओं में विभिन्न चोटियों वाले m/z को विभाजित करने के लिए EIMs deconvolve करें। | सुविधा सूची विधियों का उपयोग करें सुविधा का पता लगाने | क्रोमैटोग्राम deconvolution, और तरंगिकाओं (ADAP) एल्गोरिथ्म चुनें. पूर्वावलोकन दिखाएँ विकल्प और निम्नलिखित कुंजी पैरामीटर का उपयोग कर डेटा के लिए एल्गोरिथ्म का अनुकूलन करें: S/N थ्रेशोल्ड, गुणांक/क्षेत्र थ्रेशोल्ड, और RT तरंगिका श्रेणी.
      नोट:: deconvolved स्पेक्ट्रम के पहलू की जाँच करने की सिफारिश की है। चरण 4.2.4 में वर्णित के रूप में, क्रोमैटोग्राम विज़ुअलाइज़ेशन उपकरण का उपयोग करें। deconvolved चोटियों रंग में दिखाई देगा, और एक ही द्रव्यमान की चोटियों को विभाजित किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्र 6 A में प्रस्तुत किया गया है।
    6. Deisotope deconvolved EIMs सुविधा सूची विधियों का उपयोग कर | आइसोटोप | आइसोटोपिक चोटियों समूहक. m/z सहिष्णुता मान के लिए उपकरण की अपेक्षित सटीकता का उपयोग करें, और आगमन समय सहिष्णुता को 0.1 ms पर सेट करें ( MZmine में अवधारण समय सहिष्णुता 0.1 मिनट के रूप में प्रदर्शित), क्योंकि आईएमएस पृथक्करण के दौरान आइसोटोप हल नहीं होते हैं। सुविधा सूची की जाँच करें: यदि कोई समस्थानिक बने रहते हैं, तो सहिष्णुता मानों को बढ़ाएं।
      नोट:: यद्यपि deisotoping सैद्धांतिक रूप से सुविधा सूची प्रसंस्करण के किसी भी क्षण में किया जा सकता है, यह पिछले करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि चार्ज मान निर्यात किया जा सकता है (अन्य चरणों के लिए उपयोग किए गए एल्गोरिदम कभी-कभी चार्ज स्थिति जानकारी को हटा देंगे)।
  3. एकाधिक IMS/IMS-MS स्पेक्ट्रा को संसाधित करते हैं, तो इन ऑप्टिमाइज़ किए गए पैरामीटर्स के साथ संसाधन को दोहराएँ। सभी स्पेक्ट्रा के लिए एक ही पैरामीटर रखें।
  4. एकाधिक स्पेक्ट्रा के मामले में, उन्हें निर्यात करने के लिए एक ही तालिका में समूहीकृत करें; यदि नहीं, तो सीधे चरण 4.5 पर जाएँ। स्पेक्ट्रा को समूहीकृत करने के लिए, सुविधा सूची विधियों का उपयोग करें | संरेखण | संरेखक में शामिल हों. क्योंकि उद्देश्य वास्तव में चोटियों को संरेखित नहीं करना है, इसलिए एम / जेड और आगमन समय दोनों के लिए प्रतिबंधात्मक सहिष्णुता मूल्यों का उपयोग करें। दोनों आयामों को समान वजन दें।
  5. अंतिम सुविधा सूची को किसी *.csv फ़ाइल में निर्यात करें. | सुविधा सूची विधियों का उपयोग करें निर्यात/आयात | CSV फ़ाइल में निर्यात करें और निम्न मान निर्यात करें: निर्यात पंक्ति m/z, निर्यात पंक्ति अवधारण समय (वास्तविक IMS आगमन समय), पीक m/z, और पीक ऊँचाई. किसी फ़ील्ड विभाजक के रूप में अल्पविराम का उपयोग करें.

5. केन्द्रीकृत आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रा के TWCCSN2

नोट:: इस प्रोटोकॉल में, एक लॉगरिदमिक फिट अंशांकन 25,26 का उपयोग किया जाएगा, जो रैखिक अंशांकन से बेहतर परिणाम देने के लिए जाता है और स्प्रेडशीट या इन-हाउस प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट में लागू करना आसान है। सामग्री तालिका में दिए गए URL पर एक इन-हाउस स्क्रिप्ट (R में लिखी गई) उपलब्ध है।

  1. कैलिब्रेंट अधिग्रहण से संदर्भ आगमन समय मान चुनें (चरण 2.3 देखें)। सभी आईएमएस कैलिब्रेंट चोटियों के पहलू की जांच करने के लिए कन्स्ट्रक्टर सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मैन्युअल रूप से ऐसा करें।
    1. क्रोमैटोग्राम विंडो में, * _dt खोलें। RAW फ़ाइल calibrant के लिए संगत है।
    2. प्रत्येक अंशांकन बिंदु के लिए, प्रदर्शन | का उपयोग कर EIM जनरेट करें द्रव्यमान विकल्प.
    3. EIMs की प्रोफ़ाइल की जाँच करें। यदि कुछ खराब रूप से परिभाषित हैं, तो प्रक्रिया का उपयोग करके उन्हें चिकना | चिकनी विकल्प (जैसा कि सबसे अच्छे परिणाम आमतौर पर Savitzky-Golay एल्गोरिथ्म के साथ प्राप्त किए जाते हैं, 3 डिब्बे पर 2 बार चिकनी)। किसी स्प्रेडशीट में शीर्ष मानों की रिपोर्ट करें.
      नोट:: संदर्भ बिंदु आमतौर पर कम-रिज़ॉल्यूशन DTIMS डिवाइस का उपयोग कर प्राप्त किए जाते हैं, क्योंकि कुछ multimodal distributions कैलिब्रंट के आधार पर चक्रीय IMS में प्रकट हो सकता है। अंशांकन सूची से इस तरह के वितरण को प्रस्तुत करने वाली किसी भी चोटी को निकालें।
  2. कैलिब्रंट्स से लॉगरिदमिक फ़िट पैरामीटर्स की गणना करें.
    1. सभी अंशांकन बिंदुओं के लिए, निम्न परिकलित करें।
      1. Eq (1) का उपयोग करके बहाव समय की गणना करें:
        Equation 1 (1)
        टीडी बहाव समय के साथ, टीए मापा आगमन समय, और आईएमएस सेल में इंजेक्शन का समय tinj (सभी एमएस में).
        नोट: छोटे अणुओं के लिए, जैसे कि ओलिगोसेकेराइड टुकड़े, मृत समय (आईएमएस सेल और डिटेक्टर से बाहर निकलने के बीच उड़ान का समय) विभिन्न द्रव्यमानों के बीच भिन्नता सीसीएस अंशांकन की त्रुटि सीमा के भीतर है और इसे अनदेखा किया जा सकता है।
      2. Eq (2) का उपयोग करके आयनों के तटस्थ द्रव्यमान की गणना करें:
        Equation 2 (2)
        z के साथ आयन के आवेश राज्य, और mion काउंटर आयन के द्रव्यमान (दा में). अनिश्चितता को पेश करने से बचने के लिए सटीक जनता का उपयोग करें। यदि काउंटर-आयन के बजाय परमाणु हानि होती है, तो ऋणात्मक मियॉन मानों का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276) के लिए)। 
      3. Eq (3) का उपयोग करके CCS पैरामीटर की गणना करें:
        Equation 3 (3)
        सीसीएस के साथ संदर्भ बहाव ट्यूब DTCCSN2 मान (nm2 में), और mgas बहाव गैस के द्रव्यमान (दा में; उदा. नाइट्रोजन के लिए: mgas = 28.01 Da).
      4. Eq (4) का उपयोग कर td' पैरामीटर की गणना करें:
        Equation 4 (4)
        डी डिटेक्टर के साथ शुरू देरी प्रयोगात्मक रूप से मृत समय (आमतौर पर ~ 1.5 एमएस) के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया.
      5. उपर्युक्त पैरामीटर्स के लघुगणक की गणना करें:
        ln (CCS') और ln (t'd)
    2. R2 गुणांक और लॉगरिदमिक फिट के x और y पैरामीटर (x ढलान और ln(y) इंटरसेप्ट के साथ) Eq (5) का उपयोग करके) को निर्धारित करने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन निष्पादित करें:
      Equation 5 (5)
      नोट:: उपयोगकर्ता ln(CCS') बनाम ln(td') मानों को नेत्रहीन अंशांकन के परिणामों की जाँच करने के लिए प्लॉट कर सकते हैं, हालांकि यह वैकल्पिक है।
  3. * .csv फ़ाइल में निर्यात किए गए प्रत्येक IMS/IMS स्पेक्ट्रम के लिए MZmine द्वारा चुनी गई चोटियों को कैलिब्रेट करने के लिए प्रयोगात्मक डेटा पर अंशांकन लागू करें. प्रत्येक बिंदु के लिए, निम्न परिकलित करें।
    1. Eq (6) का उपयोग करके बहाव समय की गणना करें:
      Equation 6 (6)
      tseq के साथ अंतिम आईएमएस पृथक्करण से पहले का समय (चरण 3.4.6 में नोट किया गया 'टाइम एबीएस' मान)।
      नोट:: यदि विभिन्न अनुक्रमों के साथ अधिग्रहित एकाधिक IMS/IMS स्पेक्ट्रा कैलिब्रेट कर रहा है, तो tseq मानों को ध्यान से जाँचें.
    2. Eq (7) का उपयोग करके आयनों के तटस्थ द्रव्यमान की गणना करें:
      Equation 7 (7)
    3. Eq (8) और Eq (9) का उपयोग करके td' और td' पैरामीटर की गणना करें:
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Eq (10) का उपयोग करके अंतिम कैलिब्रेटेड CCS मानों (nm2 में TWCCSN2) की गणना करें:
      Equation 10 (10)
      नोट:: यद्यपि चरण 5.2.2। इंटरसेप्ट के रूप में ln(y) देता है, y का उपयोग अंतिम CCS मान प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए। एक घातीय समारोह लागू करने के लिए मत भूलना।
  4. चरण 2.4 में अधिग्रहीत अंशांकन समाधान के दूसरे अधिग्रहण के लिए अंशांकन लागू करके अंशांकन की सटीकता की जाँच करें।
    नोट:: अंशांकन ~ 1-2% की एक त्रुटि के साथ परिणाम उपज चाहिए।

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Representative Results

एक arabinoxylan pentasaccharide, XA2XX, इस प्रोटोकॉल को स्पष्ट करने के लिए एक उदाहरण के रूप में चुना गया था। यह यौगिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, लेकिन केवल एक अन्य arabinoxylan pentasaccharide, XA3XX (शुद्ध XA3XX भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) के साथ मिश्रण के रूप में। XA2XX और XA3XX की संरचनाएं पूरक चित्र S1 में दी गई हैं। चूंकि वाणिज्यिक मिश्रण में XA2XX और XA3XX का अनुपात ~ 50: 50 है, इसलिए मिश्रण के 20 μg / mL पर एक समाधान 50: 50 MeOH / H2O + 500 μM LiCl में ~ 10 μg / mL की XA2XX एकाग्रता तक पहुंचने के लिए तैयार किया गया था।

सबसे पहले, XA2XX + XA3XX मिश्रण का एक एमएस विश्लेषण उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस का उपयोग करके किया गया था। चूंकि दो यौगिक आइसोमर्स हैं, इसलिए [M+ Li]+m/z 685.24 पर एक एकल शिखर देखा गया था। इस एमएस पीक को चतुर्भुज के साथ चुना गया था और चयन विंडो को -1 डीए लिथियम आइसोटोप को हटाने के लिए समायोजित किया गया था, जिसे एल्गोरिदम को संसाधित करके मोनोआइसोटोपिक पीक के रूप में गलत किया जा सकता है (चित्रा 2)।

पेंटासैकेराइड्स के [एम + ली] + adducts को तब आईएमएस पृथक्करण के पहले चरण में प्रस्तुत किया गया था: चक्रीय आईएमएस सेल के चारों ओर 3 पास के बाद, 3 चोटियों को 83, 90 और 94 एमएस के आगमन समय के साथ अलग किया गया था। इस प्रोफ़ाइल की तुलना शुद्ध XA3XX (10 μg / mL पर infused) से की गई थी, यह दिखाते हुए कि 83 और 90 ms पर चोटियों XA3XX से मेल खाती हैं, जबकि 94 ms पर शिखर XA2XX (चित्रा 4A) से मेल खाता है। 94 एमएस पर चोटी को आईएमएस / आईएमएस विश्लेषण के लिए चुना गया था: XA3XX से संबंधित आयनों को बाहर निकाल दिया गया था (चित्रा 4 बी), और ब्याज की चोटी को प्रीएरे स्टोर सेल में भेजा गया था। सक्रियण के बिना आयन को फिर से इंजेक्ट करने के बाद एक 3-पास पृथक्करण किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चयन के बाद केवल XA2XX शिखर बना रहे ( चित्रा 4 C में 199 ms पर पहुंचना)।

फिर, आयन को प्रीस्टोर क्षेत्र से पुन: इंजेक्शन पर खंडित किया गया था, और सभी टुकड़ों पर एक एकल-पास आईएमएस पृथक्करण किया गया था। दो अलग-अलग सक्रियणों की कोशिश की गई थी: अंतर्निहित प्रीस्टोर सक्रियण फ़ंक्शन की अधिकतम सेटिंग को पहली बार कोशिश की गई थी (चित्रा 5 बी, सी); हालांकि, अग्रदूत स्पेक्ट्रम का आधार शिखर बना रहा। यह वांछित नहीं है क्योंकि, संदर्भ स्पेक्ट्रा के लिए, एक निश्चित तीव्रता सीमा से नीचे के टुकड़े आमतौर पर हटा दिए जाएंगे। इस प्रकार, सरणी ऑफसेट वोल्टेज ग्रेडिएंट → पूर्व-सरणी पूर्वाग्रह → मैन्युअल रूप से परिभाषित प्रीएरे ग्रेडिएंट को चुना गया था (चित्रा 5 डी, ई)।

उत्पन्न आईएमएस /आईएमएस-एमएस डेटा को एमजेडमाइन 2.51 के साथ डीकॉन्वॉल्व किया गया था, आगमन समय और एम / जेड आयामों (चित्रा 6 ए) का उपयोग करके, आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रा देने के लिए जिसमें केवल टुकड़ों की गतिशीलता जानकारी होती है। 0.2% सापेक्ष तीव्रता से ऊपर चोटियों को सीसीएस अंशांकन के लिए निर्यात किया गया था (विस्तृत MZmine पैरामीटर पूरक तालिका S1 में दिए गए हैं)। CCS अंशांकन अंशांकन समाधान का उपयोग करके किया गया था (R2 = 0.995, नियंत्रण का पूर्ण विचलन = 1.63%, पूरक तालिका S3 देखें)। इस प्रसंस्करण ने अंततः एक केंद्रीकृत, सीसीएस-कैलिब्रेटेड, आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रम (चित्रा 6 बी) को वहन किया।

Figure 1
चित्रा 1: IMS/IMS डेटा जनरेशन प्रक्रिया का अवलोकन। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; IMS/IMS = अग्रानुक्रम IMS कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक XA3XX + XA2XX arabinoxylan pentasaccharide मिश्रण का आइसोटोपिक पैटर्न। (A) DRE के बिना संतृप्त संकेत; (बी) 5% आयन संचरण (यानी, 95% क्षीणन) के साथ डीआरई का उपयोग करके सही संकेत; और (सी) चतुर्भुज चयन के बाद प्रोफ़ाइल एक लिथियम आइसोटोप के अनुरूप -1 दा चोटी को हटाने के लिए। बैंगनी में: वह क्षेत्र जहां संतृप्ति के कारण आर्टिफैक्ट चोटियां दिखाई दे सकती हैं, 6 बार आवर्धित होती हैं। संक्षेप: DRE = गतिशील रेंज वृद्धि; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; MSMS = अग्रानुक्रम एमएस; LM Res = कम द्रव्यमान संकल्प; एचएम Res = उच्च द्रव्यमान संकल्प. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चक्रीय IMS नियंत्रण विंडो का अवलोकन, जिसमें उपयोगकर्ता IMS/IMS अनुक्रम को परिभाषित करता है। प्रदर्शित अनुक्रम से पता चलता है कि 3 पास के बाद XA2XX के चयन के साथ आईएमएस / आईएमएस में अलगाव की गुणवत्ता की जांच कैसे करें (प्रदर्शित स्पेक्ट्रम पहले चरण के अलगाव के बाद चयन घटनाओं की सेटिंग से मेल खाता है)। अनुक्रम में 58 एमएस पर पहला 3-पास आईएमएस पृथक्करण चलाना शामिल है, फिर आईएमएस सेल (सेगमेंट 3) से दो तेज आइसोफॉर्म को बाहर निकालना, प्रीस्टोर (सेगमेंट 4) में धीमी आइसोफोर्म (92 और 96 एमएस के बीच एटीडी) को बाहर निकालना, इसे सक्रियण (सेगमेंट 6) के बिना आईएमएस सेल में फिर से इंजेक्ट करना, आयनों को एक और 3-पास (58-एमएस) अलगाव (खंड 7) से गुजरने की अनुमति देता है, फिर आईएमएस सेल से आयनों को बाहर निकालना, और डेटा प्राप्त करना (खंड 8)। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; cIMS = चक्रीय IMS; आईएमएस / आईएमएस = अग्रानुक्रम आईएमएस; एडीसी = एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर; TW = यात्रा लहर; पीई = संभावित ऊर्जा; ATD = आगमन समय वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: XA2XX और XA3XX के मिश्रण से XA2XX का चयन। (ए) चक्रीय आईएमएस सेल के चारों ओर 3 पास (58 एमएस पर सेट पृथक्करण समय के अनुरूप) के बाद arabinoxylan pentasaccharides, XA3XX और XA2XX का पृथक्करण। (बी) आईएमएस पृथक्करण के पहले चरण के बाद सीधे बाहर निकाला गया अंश। (सी) आईएमएस / आईएमएस के लिए चयनित अंश जिस पर पुन: इंजेक्शन के बाद एक और 3-पास पृथक्करण किया गया था। ब्याज के XA2XX शिखर ग्रे में हाइलाइट किया गया है। आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रा डेटा डिब्बे में दिखाया गया है और उनके आगमन के समय (एमएस) के साथ एनोटेट किया गया है। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; IMS/IMS = अग्रानुक्रम IMS कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रीएरे स्टोर क्षेत्र का उपयोग करके टकराव-प्रेरित पृथक्करण के सिद्धांत। (ए) आईएमएस / आईएमएस प्रयोगों के दौरान चयन, पुन: इंजेक्शन और सक्रियण के लिए उपयोग किए जाने वाले कुंजी वोल्टेज (लाल रंग में) का विवरण देने वाले मल्टीफंक्शन सरणी क्षेत्र की योजनाएं। नीले तीर multifunction सरणी में यात्रा लहर की दिशा दिखाते हैं। (B, C) IMS/IMS और MS/MS स्पेक्ट्रा XA2XX के लिए अंतर्निहित प्रीस्टोर सक्रियण फ़ंक्शन (+150 V) का उपयोग करके प्राप्त किया गया। रंग पट्टी आयन तीव्रता पैमाने का प्रतिनिधित्व करती है (नीला = कम; लाल = उच्च)। (D, E) आईएमएस / आईएमएस और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा वोल्टेज के मैनुअल अनुकूलन के साथ XA2XX के लिए प्राप्त किया गया (प्रीएरे ग्रेडिएंट 195 वी, प्रीएरे पूर्वाग्रह 180 वी, सरणी ऑफसेट -10 वी)। अग्रदूत आयनों को स्पेक्ट्रा पर तारांकन द्वारा इंगित किया जाता है। आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रा डेटा डिब्बे में दिखाया गया है और उनके आगमन के समय (एमएस) के साथ एनोटेट किया गया है। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; आईएमएस / आईएमएस = अग्रानुक्रम आईएमएस; TOF = उड़ान का समय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रसंस्करण चरणों का चित्रण। (ए) MZmine चोटी उठा और (बी) arabinoxylan pentasaccharide XA2XX के सीसीएस अंशांकन के परिणाम. ए एक रंग कोड के माध्यम से आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रम के बड़े पैमाने पर deconvolution दिखाता है। बी केंद्रक और सीसीएस अंशांकन के बाद अंतिम आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रम दिखाता है। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; आईएमएस / आईएमएस = अग्रानुक्रम आईएमएस; CCS = टक्कर क्रॉस सेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: XA2XX के दो आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रा की तुलना विधि की पुनरुत्पादकता को दर्शाती है। इस पेपर (शीर्ष) से अंतिम कैलिब्रेटेड स्पेक्ट्रम की तुलना ओलिवियर एट अल द्वारा काम से स्पेक्ट्रम से की जाती है। 21 (नीचे, फ़्लिप)। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; आईएमएस / आईएमएस = अग्रानुक्रम आईएमएस; CCS = टक्कर क्रॉस सेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र S1: XA2XX और XA3XX arabinoxylan pentasaccharides की संरचनाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: XA2XX का उपयोग कर interday repeatability का मूल्यांकन। आईएमएस / आईएमएस अधिग्रहण दिन 1 (शीर्ष) और दिन 95 (नीचे) में दोहराया गया था। संक्षेप: आईएमएस = आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री; IMS/IMS = अग्रानुक्रम IMS कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका S1: विस्तृत MZmine पैरामीटर. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S2: साधन पैरामीटर reproducibility का मूल्यांकन करने के लिए बदल दिया। संक्षिप्त नाम: ईएसआई = इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S3: अंशांकन समाधान के एक दूसरे अधिग्रहण का उपयोग कर CCS अंशांकन का नियंत्रण। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

SELECT SERIES Cyclic IMS एक शक्तिशाली उपकरण है जो एक परिभाषित आयन आबादी का चयन करने की अनुमति देता है - किसी दिए गए m / z और आयन गतिशीलता का - अपस्ट्रीम क्रोमैटोग्राफिक अलगाव की आवश्यकता के बिना। उपकरण इस आयन आबादी के एक द्विआयामी विखंडन मानचित्र उत्पन्न करने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें से एमएस / एमएस और आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रा दोनों को निकाला जा सकता है। हालांकि, उपयोगकर्ता को कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान देना चाहिए जिन्हें प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान ध्यान देने की आवश्यकता होती है।

सबसे पहले, उपयोगकर्ता को संभावित आइसोबेरिक संदूषकों की उपस्थिति के लिए एमएस अलगाव विंडो की सावधानीपूर्वक जांच करनी चाहिए। दरअसल, चतुर्भुज की अलगाव खिड़की अपेक्षाकृत व्यापक है, और थोड़ा अलग एम / जेड के आयनों को जानने से जो चतुर्भुज में coselected हो सकता है, उपयोगकर्ता को आयन गतिशीलता में रुचि के शिखर को ठीक से असाइन करने में मदद करेगा।

दूसरा, प्रारंभिक पृथक्करण करते समय, उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी आयन चक्रीय आयन गतिशीलता सेल के चारों ओर समान संख्या में पास से गुजरते हैं। यह एक चक्रीय उपकरण में आयन गतिशीलता पृथक्करण का एक महत्वपूर्ण और पेचीदा पहलू है। किसी दिए गए आयन के लिए पास की संख्या का एक गलत मूल्यांकन चोटियों की अनुचित पहचान और व्याख्या का कारण बन सकता है। विभिन्न आयन आबादी के पास की संख्या को नियंत्रित करना अपेक्षाकृत कम एकल-पास लंबाई (~ 1 मीटर) के कारण मुश्किल हो सकता है, और बहुत अलग गतिशीलता वाली प्रजातियां जल्दी से ओवरलैप हो सकती हैं।

विशेष रूप से, एक चोटी दो अलग-अलग पास के बीच विभाजित हो सकती है यदि सरणी दिशा को स्विच करती है जब यह आयन आबादी गुजरती है (यह पहचानना अपेक्षाकृत आसान है: विभाजित चोटी इजेक्ट और एक्वायर घटना की शुरुआत में आबादी के साथ तेज दिखाई देगी)। पास की संख्या को ठीक से सेट करने के लिए, उपयोगकर्ता को एक छोटे पृथक्करण समय (1-5 एमएस) के साथ शुरू करना चाहिए जो 1-पास प्रोफ़ाइल देगा। फिर, उपयोगकर्ता को धीरे-धीरे अलगाव के समय को तब तक बढ़ाना चाहिए जब तक कि पूरी आबादी उच्च आगमन समय में नहीं चली जाती है, जो 2-पास प्रोफ़ाइल देगा। 2-पास प्रोफ़ाइल को 1-पास प्रोफ़ाइल के समान दिखना चाहिए, लेकिन बेहतर-हल की गई चोटियों के साथ। किसी दिए गए आयन आबादी को चक्रीय सेल के चारों ओर एक पास करने में लगने वाला समय एक स्थिर है जिसका उपयोग उपयोगकर्ता पृथक्करण समय के एक फ़ंक्शन के रूप में पास की संख्या की गणना करने के लिए कर सकता है। उदाहरण के लिए, यदि पहले और दूसरे पास के बीच 10 एमएस का अंतर है, तो दूसरे और तीसरे के बीच 10 एमएस का अंतर भी होगा।

तीसरा, आईएमएस चयन चरण के दौरान, उपयोगकर्ता को अलगाव की गुणवत्ता की सावधानीपूर्वक जांच करनी चाहिए, जैसा कि चित्र4 में दिखाया गया है। पुन: इंजेक्ट किए गए प्रोफ़ाइल की जांच करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि यदि TW ऊंचाई और वेग सेटिंग्स बहुत कम हैं, तो अन्य आबादी का इजेक्शन पूरा नहीं हो सकता है। उन्नत उपयोगकर्ताओं को धुन पृष्ठ के आरएफ टैब में Driftcell आरएफ radiofrequency वोल्टेज को समायोजित करके यह सही कर सकते हैं।

चौथा, उपयोगकर्ता को विखंडन स्पेक्ट्रम उत्पन्न करने में सावधान रहना चाहिए और विशेष रूप से, उपयुक्त टकराव ऊर्जा का चयन करने में, खासकर यदि वोल्टेज को मैन्युअल रूप से ट्यून किया जाता है। दरअसल, सरणी ऑफसेट वोल्टेज को अत्यधिक कम करने से पुन: इंजेक्शन में बाधा डालकर समग्र आयन तीव्रता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जा सकता है। इसके अलावा, अग्रदूत और टुकड़े गतिशीलता की एक विस्तृत श्रृंखला पर फैल सकते हैं। इस प्रकार, यदि अंतिम पृथक्करण समय अधिक है, तो वे तेजी से एक अलग संख्या में पास से गुजरेंगे, इसलिए प्रोटोकॉल चरण 2.3.3 में वर्णित 1-एमएस अलग-अलग घटना को रखना महत्वपूर्ण है। यह एक प्रमुख सीमा है क्योंकि एकल-पास की लंबाई अपेक्षाकृत कम है, जो ऑलिगोसेकेराइड्स 27 के लिए ~ 100 तक एकल-पास को हल करने की शक्ति को सीमित करती है। इस संबंध में, एक ही पास में एक बढ़ी हुई पथ की लंबाई फायदेमंद होगी (यानी, 13 m28 की पथ लंबाई के साथ दोषरहित आयन हेरफेर या SLIM के लिए TWIMS-आधारित संरचनाएं)। SLIM सेटअप व्यावसायिक रूप से बहुत हाल ही में 29 लॉन्च किया गया था।

अंत में, उपयोगकर्ता को पुश्स प्रति बिन कमांड का उपयोग करके अंतिम अधिग्रहण गतिशीलता सीमा को परिभाषित करने में सावधान रहना चाहिए, खासकर यदि चार्ज किए गए आयनों को गुणा करने पर काम कर रहा है। आयन गतिशीलता वास्तव में चार्ज 12 का एक कार्य है, और, उदाहरण के लिए, एक डबल-चार्ज किए गए अग्रदूत से उत्पन्न एकल-चार्ज किए गए टुकड़े अग्रदूत की तुलना में धीमे होने की संभावना है (हालांकि वे छोटे यौगिक हैं)।

अग्रदूत का चयन करने के लिए केवल एमएस और आईएमएस पृथक्करणों का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा (और नहीं, उदाहरण के लिए, क्रोमैटोग्राफी का एक अपस्ट्रीम चरण) यह है कि एक दिया गया एम / जेड आईएमएस में कई चोटियों को उत्पन्न कर सकता है और यह कि कई चोटियां एक ही यौगिक से आ सकती हैं। यह चित्र 4A में XA2XX+ XA3XX मिश्रण और शुद्ध XA3XX दोनों के लिए m/z 685.2 के वितरण द्वारा सचित्र है। एक एकल m/z के बहुआयामी आईएमएस वितरण विभिन्न गैस-चरण संरचनाओं से उत्पन्न होते हैं। धनायन adducts (सकारात्मक मोड में) के रूप में विश्लेषण की प्रजातियों के लिए, विभिन्न conformations संभवतः काउंटर ion30,31,32 के साथ समन्वय में अंतर से उत्पन्न होते हैं।

ओलिगोसेकेराइड्स के लिए, वे कम करने वाले-अंत एनोमर्स के अलगाव से भी उत्पन्न हो सकते हैं, हालांकि कम करने वाले-अंत एनोमर्स को अलग करने के लिए आमतौर पर यहां उपयोग की जाने वाली शक्ति की तुलना में उच्च आईएमएस को हल करने की आवश्यकता होती है33,34,35। वर्तमान मामले में, चित्रा 4A में बहुआयामी आईएमएस वितरण आंशिक रूप से XA2XX और XA3XX के व्यक्तिगत योगदान से परिणाम देता है। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि XA3XX दो चोटियों की पैदावार करता है, जो संभावित रूप से धनायन-समन्वय संरूपक हैं। यह पहचानना आसान था कि कौन सा शिखर XA2XX (यानी, ब्याज की प्रजातियों) से मेल खाता है क्योंकि शुद्ध XA3XX व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और इसकी गतिशीलता प्रोफ़ाइल को अलग से दर्ज किया जा सकता है। जैविक मीडिया जैसे जटिल मिश्रणों पर काम करने के लिए, क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण चरण को जोड़ने पर विचार करना महत्वपूर्ण हो सकता है।

दो बिंदुओं को बड़े पैमाने पर deconvolved IMS / IMS स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रसंस्करण वर्कफ़्लो के बारे में नोट किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल में, एमएस आयाम का उपयोग करके आईएमएस / आईएमएस स्पेक्ट्रम को डीकॉन्वोल्व करने के लिए एमजेडमाइन 224 का उपयोग करने का प्रस्ताव है और विशेष रूप से, ईआईएम को विभिन्न चोटियों में विभाजित करने के लिए एडीएपी एल्गोरिदम 36 का उपयोग करें। यद्यपि यह काफी अच्छे परिणाम देता है, जैसा कि चित्रा 6 में सचित्र है, एडीएपी एल्गोरिथ्म को क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया था और इस प्रकार तरल चरण क्रोमैटोग्राफी के लिए निहित विषमता कारकों के लिए खाता है, जैसे कि पीक टेलिंग। इसलिए, ADAP एल्गोरिथ्म के परिणामस्वरूप आईएमएस चोटियों (जैसे, कंधों) पर लागू होने पर कुछ सुविधाओं की पहचान नहीं की जा सकती है। संक्षेप में, आईएमएस डेटा क्रोमैटोग्राफिक डेटा की तुलना में सरल हैं: क्योंकि कॉलम के साथ यौगिकों की कोई रासायनिक बातचीत नहीं होती है, उचित परिस्थितियों में प्राप्त आईएमएस डेटा (यानी, आईएमएस सेल को संतृप्त किए बिना) गाऊसी वितरण 37,38 का पालन करने की उम्मीद है। आदर्श रूप से, ADAP deconvolution चरण को एक गाऊसी फिटिंग फ़ंक्शन द्वारा सबसे अच्छा प्रतिस्थापित किया जाएगा, जैसे कि CUISuite 239 जैसे IMS के लिए नियत सॉफ़्टवेयर द्वारा उपयोग किया जाता है। हालांकि, जैसा कि यह खड़ा है, गाऊसी डिकंवोल्यूशन को सीधे इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपचार की पूरी श्रृंखला के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था। इसलिए, मुफ्त, ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर MZmine का उपयोग करना अंत-उपयोगकर्ताओं के लिए एक अच्छा समझौता प्रतीत होता है।

प्रसंस्करण का दूसरा भाग जो चर्चा को वारंट करता है वह सीसीएस अंशांकन है। यह प्रोटोकॉल एक लॉगरिदमिक फिट अंशांकन 25,26 और स्पेक्ट्रोमीटर के रूप में एक ही प्रदाता से एक वाणिज्यिक कैलिब्रेंट मिश्रण का उपयोग करने का प्रस्ताव करता है (सामग्री की तालिका देखें)। यह प्रक्रिया प्रयोगशाला में लागू करने के लिए सबसे सरल है। कैलिब्रेंट मिश्रण की पसंद के बारे में, उपयोगकर्ता को इस बात पर विचार करना चाहिए कि, जैसा कि कई अध्ययनों में उल्लेख किया गया है, सीसीएस अंशांकन की सटीकता में सुधार होता है जब एक ही आणविक वर्ग के कैलिब्रंट का उपयोग किया जाता है और विश्लेषक 26,40,41 के रूप में चार्ज राज्य होता है। अपेक्षाकृत समान प्रकार के यौगिकों (जैसे, कार्बोहाइड्रेट बनाम पेप्टाइड्स) के साथ कैलिब्रेट करते समय पेश की गई त्रुटि मध्यम है। हालांकि, यह सिफारिश की जाती है कि बहुत अलग आयनों का उपयोग न करें, उदाहरण के लिए, कार्बोहाइड्रेट को मापते समय कैलिब्रंट के रूप में नमक समूहों का उपयोग करना। अंशांकन विधि की पसंद के बारे में, रिचर्डसन एट अल.42 ने हाल ही में एक नई अंशांकन विधि की सूचना दी है जो अंशांकन की सटीकता में सुधार करने के लिए TWIMS के भौतिकी को ध्यान में रखती है (एक प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ)। हालांकि, दृष्टिकोण के लिए विभिन्न प्रकार के यौगिकों के विश्लेषण के माध्यम से अत्यधिक विशिष्ट मापदंडों के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है - मेटाबोलाइट्स से लेकर देशी प्रोटीन तक। क्योंकि इस तरह के विभिन्न प्रकार के यौगिकों का कोई मिश्रण व्यावसायिक रूप से नहीं पाया जा सकता है, इसलिए इस विधि को वर्तमान प्रोटोकॉल में लागू नहीं किया गया था।

अंत में, विधि की पुनरुत्पादकता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने दिन 1 और दिन 95 (पूरक चित्रा S2) पर आईएमएस / आईएमएस-एमएस अधिग्रहण को दोहराकर इंटरडे पुनरुत्पादन का मूल्यांकन किया। प्रयोग से पता चला है कि आईएमएस / आईएमएस-एमएस डेटा अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य हैं, इस विस्तारित अवधि में 0.2 एमएस से अधिक कोई आईएमएस पीक शिफ्टिंग नहीं है। इस कार्य में उत्पन्न आईएमएस/आईएमएस स्पेक्ट्रम की तुलना आयन गतिशीलता-आणविक नेटवर्किंग पर पिछले कार्य के लिए विभिन्न परिस्थितियों में अधिग्रहित XA2XX के एक अन्य स्पेक्ट्रम से की गई थी। आयन संरचना और आयन गतिशीलता प्रोफ़ाइल 13 को प्रभावित करने वाले कुछ वाद्य मापदंडों को जानबूझकर बदल दिया गया था- स्रोत पैरामीटर और सक्रियण वोल्टेज ग्रेडिएंट (पूरक तालिका S2 में अलग-अलग वाद्य स्थितियों की तुलना दी गई है)। फिर, दो स्पेक्ट्रा की तुलना कोसाइन समानता स्कोर का उपयोग करके की गई थी - जो मेटाबोलोमिक्स में एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की तुलना के लिए लोकप्रिय है - जीएनपीएस प्लेटफॉर्म 5 पर (मिलान टुकड़े = 0.015 एनएम 2 के लिए सीसीएस सहिष्णुता)।

तुलना ने 0.87 (चित्रा 7) का कोसाइन समानता स्कोर दिखाया, जिसे लागू किए गए महत्वपूर्ण वाद्य विविधताओं के संबंध में उच्च माना जा सकता है। यह इस विचार की ओर जाता है कि आईएमएस / आईएमएस वर्णक्रमीय पुस्तकालयों का उपयोग उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ जटिल मिश्रणों में ग्लाइकन को अपरिकेट करने के लिए किया जा सकता है, जो एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा के साथ मामला नहीं होगा। ध्यान दें कि यद्यपि वर्तमान दृष्टिकोण केवल फ़्रेग्मेंटेशन स्पेक्ट्रम के CCS आयाम का उपयोग करता है, IMS/IMS-MS डेटा में MS जानकारी भी होती है, जो CCS के साथ अनावश्यक नहीं है। आईएमएस /आईएमएस की डिरेप्लिकेटिव पावर को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, एक बिडिमेंशनल स्कोरिंग सिस्टम विकसित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एस.ओ. अपने पीएचडी (अनुदान ANR-18-CE29-0006) वित्त पोषण के लिए फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी के लिए आभारी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

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रसायन विज्ञान अंक 179
अग्रानुक्रम आयन गतिशीलता प्रयोगों के लिए एक चक्रीय आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करना
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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