Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Preimplantation genetisk testning för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet presenterar de övergripande procedurerna i labbet som krävs vid genetisk testning före implantation för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform. Här presenterar vi de detaljerade stegen för helgenomförstärkning, DNA-fragmentval, bibliotekskonstruktion, mallberedning och sekvensering av arbetsflöde med representativa resultat.

Abstract

Nästa generations sekvensering har fått allt större betydelse i den kliniska tillämpningen vid bestämning av genetiska varianter. I det preimplantatoriska genetiska testet har denna teknik sina unika fördelar i skalbarhet, genomströmning och kostnad. För det preimplantationsgenetiska testet för aneuploidianalys ger det halvledarbaserade nästa generations sekvenseringssystemet (NGS) som presenteras här ett omfattande tillvägagångssätt för att bestämma strukturella genetiska varianter med en minsta upplösning på 8 Mb. Från provförvärv till slutrapport kräver arbetsprocessen flera steg med nära efterlevnad av protokoll. Eftersom olika kritiska steg kan avgöra resultatet av förstärkning, bibliotekets kvalitet, täckning av läsningar och utmatning av data, kan beskrivande information med annan visuell demonstration än ord ge mer detaljer till operationen och manipulationen, vilket kan ha stor inverkan på resultaten av alla kritiska steg. Metoderna som presenteras häri kommer att visa de procedurer som är involverade i helgenomförstärkning (WGA) av biopsierade Trophectoderm (TE) -celler, genomisk bibliotekskonstruktion, sequencerhantering och slutligen generera kopieringsnummervarianters rapporter.

Introduction

Aneuploidi är abnormiteten i antalet kromosomer genom närvaron av en eller flera extra kromosomer eller frånvaron av en eller flera kromosomer. Embryon som bär någon typ av aneuploidi, såsom förlust av en X-kromosom (Turners syndrom), extra kopior av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) och 18 (Edwards syndrom) eller extra könskromosomer som 47, XXY (Klinefelters syndrom) och 47, XXX (Triple X syndrom), kan överleva till termin med fosterskador1. Aneuploidi är den främsta orsaken till missfall i första trimestern och provrörsbefruktning (IVF) misslyckande2. Det rapporteras att aneuploidihastigheten kan variera från 25,4% -84,5% genom de olika åldersskikten i den naturliga cykeln och den medicinska kontrollgruppen i IVF-övning3.

Nästa generations sekvenseringsteknik blir vilt tillämpad vid bestämning av genetisk information kliniskt; Det ger praktisk tillgång till genomsekvens med effektivitet och hög genomströmning. Särskilt nästa generations sekvensering revolutionerade också diagnosen störningar med genetiska faktorer och tester för abnormitet i genomet4. Med hjälp av halvledarsekvenseringsteknik för att direkt överföra kemiska signaler vid sekvensering av bioreaktion till digitala data, ger det halvledarbaserade sekvenssystemet en direkt realtidsdetektering för sekvensdata i 3-7 h 5,6.

I ett IVF-förfarande undersöker preimplantatorisk genetisk testning (PGT) embryots genetiska profil innan det överförs till livmodern för att förbättra IVF-resultatet och minska risken för genetiska störningar hos nyfödda 1,7. I PGT i kombination med NGS-tekniker förstärks genetiskt material extraherat från mindre än 10 celler med helgenomförstärkningssatser eller ett oberoende utvecklat helgenomförstärkningsreagens. Detta kräver bara ett steg i förstärkningsfasen och kräver inte förförstärkning för att erhålla helgenomförstärkningsprodukter. Primers eller paneler för copy number variant och speciell gene loci sekvensering designas och tillämpas i det bibliotek som konstruerats.

Ett typiskt arbetsflöde för preimplantatorisk genetisk testning-aneuploidi (PGT-A) i NGS involverar seriella procedurer och kräver en intensiv arbetsbelastning av laboratoriepersonal8. Vissa feloperationer orsakade proceduråterställning kan leda till oönskad förlust av både tid och resurser för labbet. En kortfattad och tydlig standardprocedur (SOP) för PGS-NGS-arbetsflöde är till hjälp; Word-formatprotokoll kan dock inte presentera mer detaljerad information om provbearbetning, enhetsmanipulation och instrumentinställningar, som kan visualiseras i ett videoprotokoll. I den här artikeln kan ett validerat arbetsflöde i kombination med en visualiserad demonstration av driftsdetaljer erbjuda mer direkta och intuitiva hänvisningsprotokoll i PGT-praxis på en halvledarsekvenseringsplattform.

Protokollet beskriver här en metod som stöder batchning av upp till 16 embryobiopsier parallellt. För större satser rekommenderas att man använder ett kommersiellt kitbaserat protokoll för halvledarsekvensering, till exempel Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla protokoll och trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 avsnitt) som tillämpas i denna studie granskades och godkändes av den mänskliga forskningsetiska kommittén för nr 924 sjukhus den 18 september 2017 (NR: PLA924-2017-59). Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga informerade samtycke till att delta i denna studie.

1. DNA-isolering från human embryobiopsi och helgenomisk förstärkning

  1. Protokoll för förstärkning av hela genomet 9,10
    OBS: Pico PLEX WGA Kit används för att utföra förstärkning av hela genomet.
    1. Insamling och lagring av prover
      1. Trophectoderm biopsi: Dra på i genomsnitt sex till nio celler från herniated TE av D5/6 embryo efter assisterad kläckning för att erhålla en kvalificerad mängd DNA för följande förstärkning.
      2. Överför provcellerna till ett PCR-rör i 5 μl PBS.
      3. Frys omedelbart proverna vid -80 °C om protokollet inte direkt fortsätter till DNA-extraktionen.
    2. Celllys
      OBS: Kompletterande fil 1 listar och fungerar som referens för de rekommenderade volymerna för varje komponent vid beredning av huvudblandningen under celllys och helgenomförstärkning av satser med 1, 8, 16 och 32 prover (med överskott för att rymma pipetteringsfel). Vid formulering av andra huvudblandningar av detta protokoll ökas volymen för varje komponent dessutom för att rymma komponentförbrukningen orsakad av upprepad pipettering. All kort centrifugering utförs på en bordsminicentrifug i 2-10 s vid rumstemperatur (RT), med ett fast varvtal på 10 000 med en centrifugalkraft på 5 300 x g. Centrifugalkraften måste vara mellan 2 000 x g och 12 000 x g.
      1. Bered celllysblandningen med 4,8 μl av extraktionsenzymutspädningsbufferten och 0,2 μL av cellextraktionsenzymet per prov.
      2. Pipettera över 5 μl av den nyberedda celllysblandningen i varje 5 μl cellprov i PCR-rör och centrifugera röret kort vid RT i 5 s. Virvla inte röret.
      3. Inkubera provet i en termisk cykler enligt följande: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Centrifugera kort (5 s) röret efter inkubationen.
    3. Förförstärkning av hela genomets DNA
      1. Bered förförstärkningsblandningen med 4,8 μl av förförstärkarbufferten och 0,2 μl av förförstärkarenzymet per prov.
      2. Pipettera 5 μl av förförstärkningsblandningen i provrören genom rörets väggar och centrifugera kort i 3 sekunder. Undvik att spetsen når botten av röret och virvla inte röret.
      3. Inkubera provet enligt det termiska cyklerprogrammet som nämns i tabell 1.
    4. Dna-förstärkning av hela genomet
      1. Centrifugera provet kort i 5 s och placera inkubationsprodukten före förförstärkaren på is.
      2. Bered hela genomförstärkningsblandningen med 25 μl av amplifieringsbufferten, 0,8 μl av förstärkningsenzymet och 34,2 μl nukleasfritt vatten per prov.
      3. Blanda 60 μl av den nyberedda helgenomförstärkningsblandningen med 15 μl inkubationsprodukt före amp. den totala volymen måste vara 75 μL. Centrifugera kort i 5 s. Undvik att spetsen når botten av röret och virvla inte röret.
      4. Placera PCR-röret på den termiska cykeln och kör det termiska cykelprogrammet som nämns i tabell 2.
      5. Centrifugera rören kort i 5 s och överför produkterna till ett nytt 1,5 ml centrifugrör.
      6. Kvantifiera WGA-produktkoncentrationen med en fluorometer11. Proverna kan förvaras tidsmässigt vid -20 °C i mindre än 2 månader om de inte går vidare till nästa steg.
  2. Protokoll för de oberoende utvecklade WGA-reagenserna.
    1. Insamling och lagring av prover
      1. Dra cellerna från D5/6-embryot efter assisterad kläckning för följande förstärkning.
      2. Överför provcellerna med 1,5 μl PBS till ett PCR-rör som innehåller 2 μl PBS.
        OBS: PBS är fri från Mg 2+ och Ca2+.
      3. Frys proverna omedelbart vid -80 °C om de inte direkt förs vidare till DNA-extraktionsprotokollet.
    2. Celllys
      1. Smält celllysbufferten (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etylenglykoltetraättiksyra (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfat, 2 mM β-glycerofosfat, 0,1% SDS) vid RT och placera den på isen. Tillsätt 2 μl celllysbuffert till varje prov och centrifugera en kort stund (5 s).
        OBS: Virvla inte röret och undvik att pipettspetsen vidrör vätskeytan i röret för att undvika att föra ut celler eller DNA ur reaktionssystemet.
      2. Inkubera provet i en termisk cykler enligt följande: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, håll. Centrifugera röret kort vid RT i 10 s efter inkubationen.
    3. Dna-förstärkning av hela genomet
      1. Centrifugera kortfattat celllysprodukten i 5 s och lägg den på is.
      2. Bered blandningen av förstärkning av hela genomet för varje prov genom att blanda med 16 μl förblandad amplifieringslösning, 1 μl amplifieringsenzym och 28 μl nukleasfritt vatten. Blanda försiktigt, centrifugera kort (5 s) och lägg blandningen på is. Virvla inte röret.
      3. Pipettera över 45 μl av den nyberedda blandningen av förstärkning av hela genomet till den celllysprodukt som framställts i steg 1.2.2.2. Blanda försiktigt och centrifugera kort i 5 s.
        OBS: Virvla inte röret och undvik att pipettspetsen vidrör vätskan i röret.
      4. Placera PCR-röret på den termiska cykeln och kör programmet enligt tabell 3.
      5. Centrifugera rören inom kort i 5 s och överför produkterna till ett nytt 1,5 ml centrifugrör.
      6. Kvantifiera WGA-produktkoncentrationen med en fluorometer11 och registrera resultaten på kvalitetssäkringsarket (kvalitetsanalys). Produkter med kvalificerade koncentrationer kan lagras tidsmässigt vid -20 °C i mindre än 2 månader om de inte går vidare till nästa steg.

2. Val av förstärkningsfragment

OBS: Material som används i det här avsnittet finns i bibliotekets förberedelsekit (materialtabell).

  1. Förberedelse innan du börjar
    1. Balansera magnetpärlorna (n x 100 μL) för rening vid RT i 30 minuter.
    2. Återställ den tidigare WGA-produkten till RT. Vortex produkten vid RT i 30 s innan du centrifugerar den kort.
    3. Förbered färsk 70% etanol.
  2. Förfarande för urval av fragment
    1. Pipettera över 25 μl av WGA-produkterna och överför det till ett centrifugrör på 1,5 ml med 25 μl nukleasfritt vatten förinstallerat.
    2. Vortex och blanda DNA-reningspärlorna väl. Alikvotera 50 μL av det i varje provrör (originalprov: pärlor (volym) = 1:1), virvel och centrifug kort (5 s). Ställ in röret i 5 minuter vid RT för DNA-bindningsprocessen.
    3. Sätt i centrifugröret på 1,5 ml i ett magnetställ och vänta tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt 1,5 ml centrifugrör. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    4. Enligt den ursprungliga provvolymen, pipett 30 μL (originalprov: pärlor (volym) = 1: 0,6) magnetiska pärlor, virvel och centrifug kort (5 s). Ställ in röret i 5 minuter vid RT för DNA-bindningsprocessen.
    5. Sätt i centrifugrören på 1,5 ml i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    6. Pipettera 300 μl 70% etanol i 1,5 ml centrifugröret, rotera försiktigt röret två gånger med en 180 ° vinkel och flytta pärlorna längs rörväggen för en noggrann tvätt. Pipettera och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    7. Upprepa tvättproceduren en gång.
    8. Ta bort centrifugröret på 1,5 ml från magnetstället och centrifugera kort (5 s). Sätt tillbaka rören i magnetstället och vänta tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg.
    9. Pipettera försiktigt ut den återstående vätskan i botten. Håll röret öppet för att torka pärlorna vid RT i 3-5 min. Håll fukt från pärlorna.
      OBS: Stäng locket omedelbart om det uppstår sprickor på pärlpelleten.
    10. Ta bort rören från magnetstället, pipettera 25-30 μL av DNA-elueringsbufferten i ett rör och stäng locket och virveln. Centrifugera kort (5 s) för att få den grumliga vätskan till botten av röret och ställ in röret på RT i 5 min.
    11. Sätt tillbaka rören i magnetställen och vänta tills alla pärlor lockas till rörets sidovägg och supernatanten blir transparent. Överför försiktigt DNA-lösningen till nya 1,5 ml centrifugrör. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    12. Kvantifiera koncentrationen av DNA efter fragmentval med en fluorometer11, förvara den vid -20 °C. Typiskt varierar koncentrationen av det valda DNA-fragmentet från 1,5-2,4 ng / μL.

3. Beredning av DNA-biblioteket12

OBS: Material som används i det här avsnittet finns i bibliotekets förberedelsekit (materialtabell).

  1. Avsluta reparation
    1. Balansera magnetpärlorna vid RT i 30 minuter.
    2. Balansera DNA-produkten av fragmentselektion i steg 2.2.12 till RT. Kontrollera och registrera taggen på varje injektionsflaska som innehåller DNA.
    3. Förbered DNA-slutreparationssystemet med 30 μL DNA-produkter, 10 μL ändreparationsbuffert, 0,5 μL ändreparationsenzym och 9,5 μL nukleasfritt vatten i ett 1,5 ml centrifugrör. Vörda röret i 30 s och centrifugera kort (5 s) vid RT för att få all vätska till rörbotten.
    4. Inkubera vid 25 °C i 30 minuter och centrifugera röret kort (5 s) efter inkubation.
    5. Virvel eller omvänd blandning av magnetpärlorna och överför 75 μL av magnetpärlorna till ett rör som innehåller ändreparerade DNA-prover (originalprov: pärlor (volym) = 1:1.5). Pipettera eller försiktigt virvel för att blanda pärlorna väl och centrifugera kort (5 s) för att snurra hela suspensionen ner till botten av röret. Ställ in röret i 5 minuter vid RT för DNA-bindningsprocessen. Vänd rören försiktigt för att hålla pärlorna dispergerade.
    6. Sätt i centrifugrören i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till sidoväggen och supernatanten blir transparent. Ta bort supernatanten och undvik att pipettera ut pärlorna och håll rören på stället när du pipetterar.
    7. Överför 300 μL av den nyberedda 70% etanolen till rören, rotera försiktigt rören två gånger i 180 ° vinkel och flytta pärlorna längs rörväggen för en noggrann tvätt. Pipettera och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    8. Upprepa tvättproceduren en gång.
    9. Ta bort centrifugrören på 1,5 ml från magnetstället och centrifugera kort (5 s). Sätt tillbaka rören i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg.
    10. Pipettera försiktigt ut den återstående vätskan i botten. Öppna locket på 1,5 ml centrifugrör och torka pärlorna vid RT i 3-5 min. Håll fukt från pärlorna.
      OBS: Stäng locket omedelbart om det uppstår sprickor på pärlpelleten.
    11. Pipettera 33 μL DNA-elueringsbuffert i ett rör, stäng locket och virveln. Centrifugera kort (5 s) för att få den grumliga suspensionen till botten av röret och ställ in röret på RT i 5 min.
    12. Sätt tillbaka rören i magnetställen och vänta tills alla pärlor lockas till sidoväggen och lösningen blir transparent. Överför försiktigt DNA-lösningen till nya 1,5 ml centrifugrör med rätt tagg och undvik att pipettera ut pärlorna.
  2. Streckkodsligering
    1. Placera streckkodsligeringsreagenserna i steg 3.2.2 på is för att smälta alla frysta reagenser.
    2. Bered ligeringssystemet med 32 μL slutreparerade DNA-produkter, 10 μL nukleasfritt vatten, 5 μL ligasbuffert, 1 μL ligas och 1 μL P1-anpassning i ett 1,5 ml centrifugrör. Pipettera ut 1 μL av varje streckkodsreagens i lösningsblandningen i röret för ett prov, virvel i 5 s och centrifugera kort (5 s) för att få all vätska i rörbotten.
      OBS: När du lägger till streckkoderna, bekräfta att antalet streckkoder och prover överensstämmer; öppna endast en streckkodsflaska åt gången för att undvika blandad förorening av streckkoder; Byt handskar för varje fem eller sex streckkoder som läggs till.
    3. Inkubera rören vid 25 °C i 30 minuter.
    4. Pipettera 75 μL (originalprov: pärlor (volym) = 1:1,5) av magnetpärlorna i ett rör och pipettera eller försiktigt virvel för att blanda pärlorna väl. Centrifugera kort (5 s) för att snurra hela suspensionen ner till botten och undvik strängaggregering. Ställ in röret i 5 minuter vid RT för DNA-bindningsprocessen. Vänd försiktigt rören för att hålla pärlorna dispergerade.
    5. Sätt i centrifugrören i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till sidoväggen och supernatanten blir transparent. Ta bort supernatanten och undvik att pipettera ut pärlorna och håll rören på stället när du pipetterar.
    6. Överför 300 μl av den nyberedda 70% etanolen till rören, rotera försiktigt rören två gånger i 180 ° vinkel och flytta pärlorna längs rörväggen för en noggrann tvätt. Pipettera och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    7. Upprepa tvättproceduren en gång.
    8. Ta bort centrifugrören på 1,5 ml från magnetstället och centrifugera en kort stund (5 s). Sätt tillbaka rören i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg. Pipettera försiktigt ut den återstående supernatanten i botten.
    9. Håll rörlocket öppet för att torka pärlorna vid RT i 3-5 min. Håll fukt från pärlorna.
      OBS: Stäng locket omedelbart om det uppstår sprickor på pärlpelleten.
    10. Pipettera 15 μL av DNA-elueringsbufferten i röret. Skölj pärlornas pellet ner till botten av röret, täta locket och virveln. Centrifugera kort (5 s) för att få den grumliga suspensionen till botten av röret och håll röret stadigt vid RT i 5 min.
  3. Förstärkning av fragment
    1. Lägg bibliotekets byggnadsreagenser på is när det frusna reagenset löses upp.
    2. Överför 47,5 μL av enzymblandningen och 2,5 μL av primerblandningen till röret som innehåller eluerat DNA och pärlor, virvel i 5 s och centrifugera kort (5 s) för att få all vätska till rörbotten.
    3. Ställ in röret på RT i 5 minuter. Sätt tillbaka rören i magnetställen och vänta tills alla pärlor lockas till sidoväggen och supernatanten blir transparent. Överför försiktigt DNA-lösningen till 0,2 ml PCR-rör med taggar markerade tydligt och undvik att pipettera ut pärlorna.
    4. Inkubera provet i en termisk cykeluppsättning med följande program: 72 °C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cykler); 70 °C, 5 min. Centrifugera kort (5 s) röret när reaktionen är avslutad och förvara produkterna vid 4 °C.
    5. Överför PCR-produkterna till ett 1,5 ml centrifugrör (lågt fäste). Tillsätt 97,5 μL (ursprunglig provvolym: pärlor (volym) = 1:1,5) magnetiska pärlor i röret när reaktionen slutar, pipettera eller försiktigt virvel för att blanda pärlorna väl och centrifugera kort (5 s) för att snurra all vätska ner till botten. Undvik aggregering av pärlor. Ställ in röret på RT i 5 minuter. Vänd försiktigt rören för att hålla pärlorna dispergerade.
    6. Sätt i centrifugrören i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till sidoväggen och supernatanten blir transparent. Ta bort supernatanten, undvik att pipettera ut pärlorna och håll rören stadiga på stället.
    7. Överför 300 μl av den nyberedda 70% etanolen till rören, rotera försiktigt rören två gånger i 180 ° vinkel och flytta pärlorna längs rörväggen för en noggrann tvätt. Pipettera och kassera supernatanten. Undvik att pipettera ut pärlorna.
    8. Upprepa tvättproceduren en gång.
    9. Ta bort centrifugröret på 1,5 ml från magnetstället och centrifugera en kort stund (5 s). Sätt tillbaka röret i magnetstället och vänta i 5 minuter tills alla magnetiska pärlor lockas till rörets sidovägg. Pipettera försiktigt ut den återstående vätskan i botten.
    10. Håll rörlocket öppet för att torka pärlorna vid RT i 3-5 min. Håll fukt från pärlorna.
      OBS: Stäng locket omedelbart om det uppstår sprickor på pärlornas pellets.
    11. Pipettera 22 μL av DNA-elueringsbufferten i röret, skölj ner pärlornas pellet och stäng locket och virveln. Centrifugera kort (5 s) för att få den grumliga vätskan till botten av röret och ställ in röret på RT i 5 min.
    12. Kvantifiera koncentrationen av konstruerat DNA-bibliotek med en fluorometer11 och lagra det konstruerade DNA-biblioteket vid -20 °C. koncentrationen av det valda DNA-fragmentet varierar från 0,6-10 ng/μL. Koda om biblioteksinformationen i biblioteksdatabasen och lagra proverna därefter.

4. Utarbetande av sekvenseringsmall13,14

OBS: Material som används i detta avsnitt finns tillgängliga i mallberedningssatsen (reagenser / lösningar / material) i sekvenseringsreaktionernas universella kit (materialtabell).

  1. Bibliotek mix
    1. Fyll i formuläret för ett förkört postblad i serversystemet och tagga provröret med bibliotekskoncentration och streckkodsnummer. Undvik att använda samma streckkoder på olika exempel i en körning.
    2. Virvel och blanda biblioteksprovet och centrifugera kort (5 s). Späd alla prover till 100 pM med nukleasfritt vatten, virvel i 30 s och centrifugera provet kort.
      OBS: Med tanke på att DNA har en medellängd på 260 bp och 1 bp är 660 g / mol, beräkna omvandlingen av ng / μL till pM med följande ekvation: 1 ng / μL = 5,827.5 pM / L.
    3. Pipettera 10 μL 100 pM utspätt bibliotek i ett 1,5 ml centrifugrör, virvel i 30 s och centrifugera kort i 2 s. Håll det blandade biblioteket på is.
  2. Förberedelse av mallar
    1. Starta mallförstärkningssystemet och välj det rena programmet. Tillsätt reaktionsoljan till 1/2 av röret och tillsätt emulgeringslösningens brytlösning till 1/3 av röret.
    2. Kontrollera att förstärkningsplattan och tvättadaptern är inställda i läget ON . Rengör avfallsflaskan och sätt en nål i ett nytt 50 ml centrifugrör för att samla avfall. Bekräfta de bearbetade stegen på skärmen i mallförstärkningssystemet. Tryck på NÄSTA för att starta ett rent program, vilket tar cirka 15 minuter.
    3. Byt ut förstärkningsplattan mot en ny efter det rena programmet, sätt in uppsamlingsrören som innehåller 150 μL brytlösning II i rotorn och placera bron på uppsamlingsrören. Tillsätt reaktionsoljan till 1/2 av röret och emulgeringslösningen till 1/3 av röret.
    4. Emulgera PCR-reagensberedning: Balansera den emulgerade PCR-bufferten vid RT tills den löser sig, centrifugera kort (5 s) alla reagens och lägg dem på is före användning.
    5. Pipettera över 120 μl av den emulgerade PCR-enzymblandningen, 100 μl ISP-buffert (Ion Sphere Particle), 170,5 μl nukleasfritt vatten och 9,5 μL av det blandade biblioteket (100 pM) i ett rör som innehåller 2 000 μl emulgerad PCR-buffert. Blanda lösningen väl med upprepad pipettering.
      OBS: Den blandade lösningen måste laddas på mallförstärkningssystemet inom 15 minuter; utföra alla procedurer på RT.
    6. Placera ett nytt filter för mallberedning stadigt på rörstället med provportalen uppåt. Vortex lösningen i 5 s, centrifugera kort (5 s) och överför lösningen till filterets provportal efter upprepade gånger pipettering 800 μL tre gånger. Centrifugera röret för att minska bubblorna före den sista injektionen. Undvik att injicera luft i filtret. Injicera 200 μl reaktionsolja II efter den blandade lösningen.
    7. Vrid filterets provportal nedåt och byt ut tvättanpassningen med filtret. För in provnålen i rotorlockets mitthål och tryck sedan nålen mot botten.
    8. Tryck på RUN-knappen på skärmen, välj programmet enligt motsvarande kit och tryck på ASSISTED för att kontrollera alla steg. Tryck på NÄSTA tills körningen startas; Det tar cirka 4,5 timmar att avsluta.
    9. Tryck på NÄSTA när programmet är klart; Systemet startar en 10 min centrifugering. När centrifugeringen stannar trycker du på knappen Öppna lock och flyttar uppsamlingsrören till rack. Om proceduren inte går till nästa steg på 15 minuter, tryck på Final Spin för att centrifugera igen.
    10. Ta bort supernatanten i uppsamlingsröret och lämna 100 μl lösning i röret. Blanda det återstående provet genom pipettering och överför provet till de nya 1,5 ml centrifugrören märkta OT (One touch 2-systemet).
      OBS: När du pipetterar supernatanten, undvik att röra rörets botten längs sidan.
    11. Pipettera 100 μl nukleasfritt vatten i vart och ett av uppsamlingsrören och överför lösningen till OT-röret tvättat med upprepad pipettering. Tillsätt 600 μl nukleasfritt vatten till OT-röret för att göra den totala volymen 1 ml, virvel i 30 s, och centrifugera vid 15 500 x g i 8 minuter.
    12. Ta försiktigt bort supernatanten i OT-röret med 100 μl kvar och använd spetsen för att kasta oljeskiktet ordentligt. Tillsätt 900 μl nukleasfritt vatten, virvel i 30 s och centrifugera vid 15 500 x g i 8 minuter.
    13. Ta bort supernatanten tills 20 μL är kvar, lägg till mallåtergivningslösning för att göra volymen 100 μL, virvel i 30 s och centrifugera kort i 2 s.
      OBS: Den lösning som erhålls i detta steg måste gå vidare till nästa steg på mindre än 12 timmar.
    14. Kör det rena programmet på mallförstärkningssystemet innan du stänger av strömmen.
  3. Berikning av mallar
    1. Bered smältblandningen med 280 μl tween-80 och 40 μl 1 M NaOH.
    2. Tvätta C1-pärlorna. Vortex C1-pärlorna lösning i 30 s. Överför 100 μL pärlor till ett 1,5 ml centrifugrör, sätt in röret på ett magnetiskt ställ i 2 minuter och kassera supernatanten.
    3. Överför 1 ml av C1-pärlornas tvättlösning till röret och virveln i 30 s. Centrifugera kort (5 s), sätt in röret i magnetstället i 2 minuter och kassera supernatanten. Pipettera 130 μl C1-pärlresuspensionslösning i röret och blanda pärlorna genom upprepad pipettering. Undvik att skapa bubblor.
    4. Ladda 100 μl av det utspädda biblioteket, 130 μl C1-pärlor, 300 μl x 3 malltvättlösning och 300 μl smältlösning till åtta brunnsremsor, som visas i figur 1.
    5. Montera de åtta brunnsremsorna på anrikningsmodulen, ladda pipettspetsen och ställ in 200 μL centrifugröret i uppsamlingsläget. Tryck på START för att köra programmet; Det tar ca 35 min.
    6. Provet samlas automatiskt upp i centrifugröret på 200 μl. Stäng locket och centrifugera det vid 15 500 x g i 5 minuter. Kontrollera rörets botten för att verifiera om några C1-pärlor finns kvar.
    7. Om C1-pärlor finns kvar, pipettera malllösningen upprepade gånger 10x och sätt in röret på magnetstället i 4 minuter. Överför all supernatant till ett nytt 0,2 ml centrifugrör och centrifugera vid 15 500 x g i 5 minuter.
    8. Om inga synliga C1-pärlor finns kvar, kassera supernatanten tills 10 μL är kvar, tillsätt 200 μl nukleasfritt vatten och blanda genom att pipettera 10x. Centrifugera vid 15 500 x g i 5 minuter.
    9. Kassera supernatanten med 10 μl kvar och tillsätt 90 μl nukleasfritt vatten för att nå en total volym på 100 μl. Pipettera upp och ner 10x för att blanda lösningen, virvel i 5 s och centrifugera kort (5 s). Lösningen kan förvaras vid 2–8 °C i mindre än 3 dagar.

5. Nästa generations sekvensering 9,15

OBS: Alla procedurer i det här avsnittet utförs på DA8600-sekvenseringsplattformen. Material som används i detta avsnitt finns tillgängliga i sekvenseringssatsuppsättningen (reagenser/lösningar/material) i sekvenseringsreaktionernas universella kit (materialförteckning).

  1. Kontrollera alla reagenser och material som krävs i en sekvenseringsplattform.
    1. Sekvenseringsreagens: Kontrollera tillgängligheten av sekvenseringsenzymlösning (6 μl), sekvenseringsprimrar (20 μL), mall för kvalitetskontroll (5 μL) och dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), lagrad mellan -30–10 °C.
    2. Sekvenseringslösning: Kontrollera tillgängligheten av sekvenseringslösning II (100 ml), sekvenseringslösning III (50 ml), glödgningsbuffert (1,015 μl), laddningsbuffert (10 μl), skummedel (2 μl), klortablett (1 tablett) och Streptavidinpärlor (100 μl), lagrade vid 4 °C.
    3. Material: Kontrollera tillgängligheten av 250 ml reagensrör (8), 250 reagensrörslock (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reagensflaska (1) och sekvenseringschip (1), förvarat vid RT.
  2. Tvätta chipet före användning.
    1. Ställ ett chip stadigt på en arbetsplatta, injicera 100 μl nukleasfritt vatten i provhålet, ta bort lösningen i utportalen och upprepa proceduren.
    2. Injicera 100 μl 0,1 M NaOH-lösning i chipet och inkubera i 1 min vid RT.
    3. Injicera 100 μl isopropanol i provhålet, ta bort extra lösning i utportalen och upprepa proceduren igen.
    4. Täck utportalen med ett filterpapper, strömma in kvävet för att torka resterande isopropanol i chipets flödescell och förvara det färdiga chipet vid RT.
  3. Initiering av sekvenserare
    1. Slå på kväveventilen och ställ in trycket till 30 psi. Starta sequencern, tryck på CLEAN på huvudskärmen och välj vatten eller klorid för att tvätta maskinen därefter.
      OBS: Tvätta med vatten före varje körning, tvätta med klorid varje vecka eller den tid maskinen står vid med reagens över 48 timmar.
    2. Kloridtvätt: Välj en reagensflaska specificerad för kloridtvätt, tvätta flaskan två gånger med 18 MΩ vatten och fyll flaskan med 1 liter 18 MΩ vatten. Lägg en kloridtablett i flaskan, lös upp tabletten i 10 min, tillsätt 1 ml 1 M NaOH och vänd sedan flaskan för att blanda lösningen. Använd kloridlösningen inom 3 timmar efter beredning.
    3. Filtrera 100 ml kloridlösning med ett 0,45 μm filter och samla med två rör. Montera de två kloridrören i positionerna C1 och C2. Tryck på CLEAN på huvudskärmen och utrusta ett chip för kloridtvätt.
    4. Tryck på NÄSTA och kontrollera alla steg på skärmen för att starta tvättprogrammet; Programmet avslutas om 30 min. Börja tvätta med vatten efter kloridtvätten.
    5. Vattentvätt: Markera två rör som är specifika för vatten med C1 och C2 och tvätta rören med 18 MΩ vatten två gånger. Tillsätt 100 ml 18 MΩ vatten till vart och ett av vattentvättrören och ställ in dem i C1- respektive C2-lägen.
    6. Välj CLEAN-programmet , installera chipet som är förberett för vattentvätt, tryck på NÄSTA och kontrollera sedan alla steg på skärmen för att starta tvättprogrammet.
  4. Initiering
    1. Rengör tvättflaskan med tvättlösning II, markera den som W2 och tvätta den tre gånger med 18 MΩ vatten.
    2. Rengör kväveröret med luftlagt papper, sätt in det i rörets botten och ställ in luftflödet till 0,5 l/min. Släpp ut syret i flaskan och fyll flaskan med 1 920 ml 18 MΩ vatten. Tillsätt sekvenslösning II och 10 μl 1 M NaOH till flaskan, stäng locket och vänd flaskan flera gånger för att blanda lösningen.
    3. Markera två nya rör som W1 och W3. Tillsätt 32 μl 1 M NaOH till W1, tillsätt 40-50 ml 1x sekvenslösning III till W3 och stäng locken.
      OBS: 1x sekvenslösning III måste vara i ett 37 °C vattenbad i 30 minuter när den används första gången. Sekvenslösning II måste skyddas mot ljus och förvaras vid RT. Tvättflaskan måste bytas ut mot en ny efter att ha använts 20 gånger.
    4. Tryck på INITIALIZE på huvudskärmen, ändra sippern på positionerna W1, W2 och W3, ställ in rören i deras läge i enlighet därmed och täta dem tätt genom rotation. Installera ett chip för initialisering och kontrollera maskinens tillståndsparametrar.
    5. Tryck på NÄSTA för att starta initieringsprogrammet; Det tar 40 min i första avsnittet.
      OBS: Handskarna måste bytas innan du byter den nya sippern för att undvika att förorena sipperns kropp. När de väl har använts för vattentvätt och initialisering kan chipsen appliceras på initialisering, men använd inte chipsen som används för kloridtvättchips för initialisering.
    6. Lös upp dGTP, dCTP, dATP och dTTP på is och virvel för att blanda. Markera fyra nya rör som G, C, A och T och pipettera 70 μL av lösningen enligt rörets tagg.
  5. Förbered biblioteket för körning.
    1. Placera kvalitetskontrollmallen, primers och enzymlösning på is.
    2. Förbered DNA-biblioteket när initieringsprogrammet har ca 20 min kvar. Vortex kvalitetskontrollmallen för 30 s att blanda och centrifugera kort i 2 s. Överför 5 μL av kvalitetskontrollmallen till malllösningen, virvel i 5 s, och centrifugera röret i 15 500 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten genom att försiktigt pipettera, undvik att röra vid pelleten och lämna en volym på 10 μL i röret.
    3. Tillsätt 15 μl glödgningsbuffert i röret. den totala volymen av lösningen är 25 μl.
    4. Vortex sekvensprimrarna när den helt löses upp på is och centrifugera kort i 2 s. Överför 20 μL av sekvensprimrarna till röret från det tidigare steget, virvel i 5 s, centrifugera kort i 2 s och förvara sedan vid RT före användning.
  6. Läsa in provet och sekvensera
    1. Pipettera 55 μl av den provlösning som beretts i föregående steg och injicera den i chipets provhål.
    2. Ställ in chipet på centrifugen; Håll skåran mot utsidan och provportalen inuti, balansera den med ett annat använt chip och centrifugera i 10 minuter.
    3. Förbered laddningslösningen.
      1. Blanda 0,5 ml glödgningsbuffert och 0,5 ml nukleasfritt vatten i ett 1,5 ml centrifugrör. Markera det som 50% glödgningsbuffert och använd inom 7 dagar.
      2. Blanda 0,5 ml isopropanollösning och 0,5 ml glödgningsbuffert. Markera den som 50% tvättbuffert och använd inom 24 timmar.
      3. Blanda 6 μl sekvensenzym och 60 μl 50% glödgningsbuffert. Markera det som enzymreaktionsbuffert och placera lösningen på is efter beredning.
      4. Blanda 49 μl 50 % glödgningsbuffert och 1 μl skummedel och markera det som skummande lösning.
    4. Blås 100 μl luft i skumlösningen, pipettera lösningen upprepade gånger tills bubblorna är i ett tätt skummande tillstånd och håll skumvolymen runt 250 μl.
    5. Placera chipet på bänken efter centrifug, injicera 100 μl skum i provhålet och ta bort den extruderade lösningen i utportalen. Sätt tillbaka chipet i centrifugen och centrifugera kort i 30 s.
    6. Upprepa steg 5.6.4-5.6.5.
    7. Injicera 100 μl 50% tvättbuffert två gånger och ta bort den extruderade lösningen i utportalen efter varje injektion.
    8. Injicera 100 μl 50 % glödgningsbuffert tre gånger och ta bort den extruderade lösningen i utportalen efter varje injektion.
    9. Injicera 65 μl 50% enzymreaktionsbuffert, undvik bubblor och ta bort den extruderade lösningen i utportalen.
    10. Stabilisera det laddade chipet vid RT i 5 minuter och installera chipet på sequencerchipportalen. Välj den plan som programmerades i steg 6, kontrollera informationen och starta körningen. Det tar cirka 1,5 timme att avsluta.
    11. Utför vattentvättprogrammet inom 72 timmar efter att körningen slutat. Utför kloridtvätten före vattentvätt när tiden överstiger 72 timmar. Stäng av sekvenseraren och stäng kväveventilen.

6. Planera en instruerad sekvenseringskörning i reporterserversystemet16

OBS: Alla procedurer i detta avsnitt utförs på Ion Proton Sequencer med reporterserversystemet.

  1. Logga in på serversystemet, välj fliken Plan och klicka på Plan Template Run. Välj hela genomet som körningstyp och välj lämplig mall i listan över planerade körningsmallar.
  2. På fliken Plan anger eller gör du följande val:
    1. Ange ett nytt körningsplansnamn enligt batchen med exempel, välj hg19 (Homo sapiens) i listrutan Referensbibliotek och välj Ingen i listrutorna Målregioner och Hotspot-regioner .
    2. Ange antalet streckkoder som används i exempeluppsättningen, välj en streckkod i listrutan för varje exempel och ange ett unikt, beskrivande namn som kan vara användbart för att gruppera och spåra exemplet. Undvik att använda standardexempel 1 och så vidare.
    3. Välj Ingen på fliken Jonreporter , klicka på Nästa och välj DNA i programmet och Hela genomet som målteknik.
    4. På fliken Paket verifierar du valen eller gör ändringar medan det är lämpligt för en körning.
      1. Välj Ion Plus Fragment Library Kit i listrutan Typ av bibliotekspaket . Välj Ion PI HI-Q OT2 200 kit i listrutan Mallpaket och välj OneTouch som standard. Välj Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit i listrutan Sekvenseringssats .
      2. Ange 300 flöden, välj Ion PITM Chip i listrutan Chiptyp och välj IonXpress i listrutan Streckkodsuppsättning .
      3. Avbryt markeringen av Markera som dubbletter läser och markeringen av Aktivera omjustering.
    5. Välj lämpligt plugin på fliken Plugins för att utföra dataanalys i steg 7. Slutför valen i projektsteget, klicka på Nästa och klicka på Plankörning i det nedre högra hörnet för att lista de planerade körningarna.
    6. På fliken Planerade körningar väljer du den nyligen skapade körningen och kontrollerar alla inställningar i granskningsfönstret.

7. Analys av data

  1. Analysera kopieringsnummervarianterna (CNV) med hjälp av ett bioinformatiskt arbetsflöde.
    OBS: CNV: erna analyserades i bioinformatikens arbetsflöde med implementeringen av en algoritm baserad på en dold Markov-modell (HMM)17; Modellen använder lästäckning över genomet för att förutsäga kopieringsnummer eller helnummer ploidistatus (dvs. 0, 1, 2, 3, etc.). Den övergripande bioinformatikpipelinen byggdes i plugin av ett sekvensserversystem, vilket visas i figur 2. Det bioinformatiska analyssteget tar i genomsnitt 4 timmar att slutföra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När sekvensplanen avslutas efter körningsprocessen i maskinen rapporterar sekvensserversystemet sammanfattningen med beskrivande information om genererade data, chipstatus, ISP-laddningshastighet och bibliotekskvalitet, som visas i figur 2. I denna resultatdemonstration erhölls 17,6 G-data i den totala basen och den totala laddningshastigheten för ISP var 88% i chipets totala brunnar; värmekartan visade att provet var jämnt belastat på chipets totala yta (figur 2A). I den representativa körningen erhölls 99 761 079 totala läsningar, där 77% var användbara; i alla brunnar laddade med ISP hade 100% mallar berikade, där 78% var klonala. Av alla klonala mallar var 97% kvalificerade som det slutliga biblioteket (figur 2B). Den genomsnittliga längden på läsningen var 117 bp, 176 bp och 174 bp med medelvärde, median respektive läge (figur 2C). Toppantalet för T, C och A i anpassning av mallar var ~ 76, vilket är över den kvalificerade avstängningslinjen på 50 (figur 2D). I alla adresserbara brunnar med levande internetleverantörer kvalificerades 99,5% som det konstruerade biblioteket och ett 20% polyklonalt och lågkvalitativt bibliotek filtrerades bort. 76,6 % av internetleverantörerna var kvalificerade för ytterligare analys (figur 2E).

Resultatet av varianter av kopieringsnummer från ett enda prov S19030109-3 visas i figur 3; den svarta strecklinjen normaliseras som ett euploidisegment över 22 autosomer och könskromosomer, den röda linjen normaliseras som aneuploidikromosomregion som representerar en 182,16 Mb mosaiktrisomi av p16.3-q35.2 på kromosom 4 och ett 33,13 Mb monosomsegment av q11.1-q13.33 på kromosom 22.

Representativa rapporter om 12 prover med WGA-kit och 13 prover med enstegsmetoden med oberoende utvecklade WGA-reagenser visas i tabell 4 respektive tabell 5, som inkluderar sammanfattande information om streckkods-ID, provnamn, unikt läsantal, justerade läsningar medellängd, medeldjup, procentandel av GC-innehåll och kromosomvarianter. Kromosomvarianternas märke visade könskromosom, plats och storlek på duplicering och radering på kromosomer.

Figure 1
Figur 1: Diagram över provets lastposition på 8-brunnsremsan. Varje brunn med lastningsinnehåll anges respektive. U står för oberikat prov, B står för pärlor och W står för tvättlösning; De tomma brunnarna noteras också i figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Löpande sammanfattning: datastorlek, ISP-inläsning och mått för bibliotekskvalitet. (A) Den övergripande statusen, inklusive totala baser, nyckelsignal och ISP-laddningshastighet med en värmekarta. (B) Totalt antal läsningar, användbar läsfrekvens och sammanfattning av ISP-information i varje reaktionssteg. (C) Histogrammet över läslängden. (D) Konsensusnyckel 1-Mer i handels- och samarbetsavtalet. (E) Adresserbara brunnar och IPS-klonstatus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Exempel på diagram över visualiserade varianter av kopieringsnummer: S19030109-3. Kopieringsnummer (CN) signaler visualiseras i ett diagram med blå och gröna intervall för kromosomer bredvid varandra. Det givna exemplet visar en ökad observation av CN i kromosom 4 och en minskad observation av CN i kromosom 22, eftersom den genomsnittliga CNV-linjen som noteras i rött faller kompenserad från 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Nej. av cykler Temperatur Tid
1 cykel 95 °C 2 minuter
12cykler 95 °C 15 sekunder
15 °C 50 sekunder
25 °C 40 sekunder
35 °C 30 sekunder
65 °C 40 sekunder
75 °C 40 sekunder
1 cykel 4 °C Hålla

Tabell 1: Termiskt cykelprogram för förförstärkning. Termiska reaktionsförhållanden som temperatur, tid och cykler visas.

Steg Temperatur Tid Nej. av cykler
1 95 °C 2 minuter 1
2 95 °C 15 sekunder 14
65 °C 1 minuter
75 °C 1 minuter
3 4 °C hålla 1

Tabell 2: Termiskt cykelprogram för förstärkning av hela genomet med helgenomförstärkningssatser. Termiska reaktionsförhållanden som temperatur, tid och cykler visas.

Steg Temperatur (°C) Tid Nej. av cykler
1 95 °C 2 min 30 s 1
2 95 °C 30 sekunder 6
25°C 2 minuter
0,3 °C/s till 72 °C ——
72 °C 1 min 30 s
3 95 °C 30 sekunder 20
62 °C 30 sekunder
72 °C 1 minuter
4 72 °C 2 minuter 1
5 4 °C hålla 1

Tabell 3: Termiskt cykelprogram för förstärkning av hela genomet med de oberoende utvecklade reagenserna. Termiska reaktionsförhållanden som temperatur, tid och cykler visas.

Exempel på namn Unikt antal läsningar Justerade läsningar Medellängd Medeldjup CG% Sd Markera
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 Xx
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 Xx
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Tabell 4: Exempel på utdata av variationen i kopieringsnummer med hjälp av helgenomförstärkningssatser i serversystemrapporten. Ett typiskt utdatablad innehåller parametrar som provnamn, unikt läsantal, justerade läsningar, medellängd, medeldjup, CG-procent, standardavvikelsen för längd och för de flesta märket för kromosomstatus med könskromosom taggad med XY och avslutad CNV-detalj. En detekterad CNV är markerad med kromosomplats och fragmentstorlek.

Exempel på namn Unikt antal läsningar Justerade läsningar Genomsnittlig längd Medeldjup GC% Sd Markera
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 Xx
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 Xx
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 Xx
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 Xx
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Tabell 5: Exempel på utdata av kopieringsnummervariation per enstegsmetod med de oberoende utvecklade helgenomförstärkningsreagenserna i serversystemrapporten. Ett typiskt utdatablad innehåller parametrar som provnamn, unikt läsantal, justerade läsningar, medellängd, medeldjup, CG-procent, standardavvikelsen för längd och för de flesta märket för kromosomstatus med könskromosom taggad med XY och avslutad CNV-detalj. En detekterad CNV är markerad med kromosomplats och fragmentstorlek.

Tilläggsfil 1: Den rekommenderade volymen för varje komponent när du förbereder en huvudblandning av olika batchstorlekar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kromosomal aneuploidi hos embryon är orsaken till en stor del av graviditetsförlusten, oavsett om den är tänkt naturligt eller in vitro-befruktning (IVF). I klinisk praxis för IVF föreslås att screening av embryot aneuploidi och överföring av euploidiembryot kan förbättra resultatet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering är den tidigaste tekniken som antagits för könsselektion och PGT-A; Denna teknik kräver dock mer teknisk expertis från laboratoriepersonal och är relativt arbetsintensiv. Ökande studier av PGT-A med fluorescens in situ hybridisering visar ingen förbättring av levande födelsetal17,18.

Snabba tekniska framsteg har dock gjorts för att bedöma analysen av kopieringsnummer vid genetisk testning före implantation; Olika metoder har sina fördelar och nackdelar. Nyutvecklade omfattande molekylära tekniker såsom kvantitativ fluorescens PCR, single nucleotide polymorphism (SNP) array, array jämförande genomisk hybridisering (aCGH) och nästa generations sekvensering visade löfte för att förbättra IVF-resultat7. Bland dessa har NGS hög konsistens med array-jämförande genomisk hybridisering trots dess skalbarhet, högre genomströmning, enklare automatisering och mer potential att minska kostnaden 19,20,21.

I kombination med WGA-tekniker kan NGS-analys av embryobiopsi ge mer exakt sekvensinformation och har också en livskraftig förlängning för fler mål för enstaka nukleotidnivå. Med den ökande tillämpningen av nästa generations sekvensering för att upptäcka genetisk abnormitet finns det ett brådskande behov av att bygga standarder för prov/ dataprocess både i laboratoriet och klinisk praxis22,23,24.

I vägen från separation till aneuploidiidentifiering av PGT-A-processen inkluderar de viktigaste stegen separationen, valet av helgenomförstärkningsmetod, valet av nästa generations sekvenseringsplattform och analysen av sekvenseringsdata. Hela genomförstärkningsprocessen är det mest kritiska steget i PGT-A, som bestämmer integriteten och enhetligheten hos sekvenseringsdata. Tre strategier för förstärkning av hela genomet jämfördes i en tidigare studie, och det är bevisat att picoPLEX kvasi-slumpmässig primermetod fungerar nästan lika bra som MDA-metoder (multiple displacement amplification) när det gäller integriteten och enhetligheten hos sekvenseringsdata25. Eftersom klinisk praxis fokuserar på kopieringsnummervariationer (CNV) vid upplösningen ~ 10 Mbp snarare än enstaka nukleotidvariation i PGT-A, valdes picoPLEX WGA-satsen och de oberoende utvecklade WGA-reagenserna på grund av ekonomiska problem. I förstärkningssteget kräver det senare endast ett steg för att slutföra förstärkningen av hela genomet, utan behov av förförstärkning.

Det finns två huvudsakliga kommersiella plattformar på marknaden som för närvarande används för PGT: MiSeq från Illumina26 och Ion Proton från Thermo-Fisher Scientific27. Både Miseq och Proton kan identifiera helkromosomaneuploidi, men Miseq är endast utformad för att identifiera aneuploidi av hela kromosomen, medan protonen också kan identifiera stora deletioner (dels) eller dupliceringar (dups), inklusive kliniskt signifikanta dels eller dups ner till en upplösning på cirka 800 kb till 1 Mb28. Proton-plattformen har kostnadsfördelar och stark lokal teknisk support. Av dessa skäl valdes Proton-plattformen för senare klinisk praxis.

Den bioinformatiska analysen av nästa generations sekvenseringsdata är komplicerad och utmanande för kliniker i kliniska tillämpningar. Med ökningen av data i det offentliga arkivet av mänskliga genetiska varianter och tolkningar som Clinvar29, 1000 genom 30 och Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31, har fler CNV-anteckningsprogram utvecklats och är tillgängliga för offentligt och privat bruk32,33. Här tillämpades ett lokalt utformat informationssystem, Darui-LIMS, för att hjälpa laboratoriepersonal och kliniker att slutföra CNV-dataanalysen med ett klick i klinisk praxis av PGT-A34.

Våra metoder är utformade speciellt för PGT-A och har en bra balans mellan upplösning, noggrannhet och kostnad. Standardprocedurer inom genetisk materialbearbetning och bioinformatik kan producera konsekventa data för klinisk analys. Med nya framsteg inom teknik baserad på NGS-systemet kan ytterligare kromosomstrukturella avvikelser såsom translokation testas och diagnostiseras för klinisk förstärkning i PGT-cykeln35,36. För dessa tester måste mer specialiserade metoder utvecklas och tillämpas. Ändå, som en specifikation för att vägleda den kliniska praktiken av PGT-A, skulle dessa metoder vara till hjälp för laboratoriepersonal och kliniker i laboratoriepraxis för PGT-A på DA8600 nästa generations sekvenseringsplattform.

Denna metod har dock vissa begränsningar. I protokollet är det maximala antalet prover som ett magnetiskt rack kan stödja 16; Naturligtvis, beroende på det faktiska antalet kliniska prover, kan man också välja ett magnetiskt rack för att stödja fler prover åt gången eller öka antalet magnetiska rack för att utföra fler provoperationer. Detta kan dock öka risken för operativa fel. Därför rekommenderas kommersiella kit baserade på halvledarsekvensering vid arbete på satser med 32 prover eller större, såsom Ion ReproSeq PGS-kit från Thermo-Fisher Scientific.

Enligt de tekniska utvärderingsriktlinjerna för kvalitetskontrollteknik för preimplantatorisk kromosomal aneuploididetekteringsreagens (High Throughput Sequencing) som utfärdats av China National Institutes for Food and Drug Control är kravet på giltig datavolym för ett enda prov inte mindre än 1 M. Det finns 60-80 M-läsningar per chip enligt Ion PI-produktöversikten, och baserat på den experimentella erfarenheten är de giltiga unika läsnumren inte mindre än 50% av originaldata. Efter beräkning är den effektiva datavolymen för varje experimentellt prov inte mindre än 2 M. För att säkerställa noggrannheten i de experimentella resultaten rekommenderar vi därför en maximal kapacitet på 16 prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Zhangyong Ming och Mr. Rongji Hou för deras råd om LIMS utökade ansökan. Denna studie stöds av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) och Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

Genetik utgåva 186
Preimplantation genetisk testning för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter