Summary
本方案描述了从蜱唾液腺和纯化的细胞外囊泡中分离microRNA。这是一种通用程序，结合了常用试剂和耗材。该方法还允许使用少量的蜱虫，从而产生易于测序的高质量microRNA。
Abstract
蜱虫是重要的外寄生虫，可以传播多种病原体。蜱虫的唾液腺对于进食至关重要，因为它们的唾液中含有许多具有药物特性的效应子，这些效应子可以降低宿主免疫反应并增强病原体的传播。一组这样的效应子是微RNA（miRNA）。miRNA是短的非编码序列，用于调节蜱-宿主界面和蜱器官内的宿主基因表达。这些小RNA 通过 细胞外囊泡（EV）在蜱虫唾液中运输，其服务于细胞间和细胞内通讯。含有miRNA的囊泡已经在蜱虫的唾液中被鉴定出来。然而，人们对miRNA在蜱唾液囊泡和腺体中的作用和特征知之甚少。此外，研究蜱唾液中的囊泡和miRNA需要繁琐的程序来收集蜱虫唾液。该协议旨在开发和验证一种从 离体 器官培养产生的纯化细胞外囊泡中分离miRNA的方法。本文描述了从细胞外囊泡和蜱唾液腺中提取miRNA所需的材料和方法。
Introduction
蜱虫是外寄生虫，将许多病原体传播给野生动物，牲畜，人类及其宠物1，2。蜱饲喂养会对兽皮造成损害，由于严重贫血而导致体重和产奶量减少，以及潜在致命致病病原体的传播，从而导致重大的经济损失1，3，4，5。目前管理蜱虫种群的控制措施侧重于杀螨剂的使用。然而，寄生于5，6的蜱虫中不断出现杀螨剂耐药性，蜱叮咬7的发病率增加，以及居民区内的病原体传播8，9，导致需要独特的蜱虫控制替代方案。
蜱唾液腺是确保蜱虫生物学成功的重要器官。它们由具有不同生理功能的不同腺类型（I，II，III和IV）形成。唾液腺负责输卵，无论是通过流涎2，10将过量的水和铁含量返回宿主，从而在宿主身上和宿主身上。I型腺泡也通过吸湿性唾液10，11的分泌参与大气中水的吸收。唾液效应蛋白，如水泥和胱抑素，在II型和III型acini10，12的分泌细胞内产生。I型阿西尼不影响蜱虫喂养，表明血粉摄入不会触发这些阿西尼型13，14的形态和生理变化。另一方面，Acini II型和III型在喂养过程中被激活，并且在附着前几乎没有活动。因此，喂养对于触发II型acini内分泌细胞的增大和生物活性化合物的产生是必要的。III型腺泡菌在喂养过程中由于分泌颗粒内的分泌物而减小12。
唾液腺也是蜱虫和传播途径中病原体感染的部位。在喂养过程中，蜱虫分泌几种具有药物作用的化合物，这些化合物是成功完成血粉10，15，16所必需的。这些化合物具有抗炎、免疫抑制和血管舒张特性10、15、17。最近的研究表明，来自蜱唾液腺的细胞外囊泡（EV）含有几种这些化合物，诱导抗炎和免疫调节作用18，19，20。“细胞外囊泡”是一个总称，用于描述根据其大小和生物发生被归类为外泌体和微囊泡的囊泡。总体而言，EV是具有双层膜的脂质气泡，其尺寸为21的~40 nm-1μm;通常，外泌体被描述为40-150nm大小，而微囊泡在21，22，23大小为150nm-1μm之间。然而，其大小并不表示EV生物发生途径22。
外泌体的生物发生始于质膜的顺序侵入。这种侵入导致多泡体的形成，并最终通过ESCRT复合物或鞘磷脂酶（sMases）的作用导致囊泡膜变形24，25。外泌体既可以在溶酶体内裂解以维持细胞稳态，也可以 通过 水泡融合流出到质膜以将细胞成分递送到受体细胞21，24。另一方面，微囊泡由浮盘和翻转的作用形成，改变质膜26中脂质的构象。EV对于细胞间通讯至关重要，可作为细胞内货物的运输系统，例如脂质，蛋白质，核酸和microRNA（miRNA）21，27，28。一旦运输，这些囊泡将其货物输送到受体细胞的细胞质中，在接收细胞22，29中产生表型变化。由于细胞外囊泡在蜱虫喂养中的重要性以及宿主免疫和伤口愈合反应的操纵18，20，细胞外囊泡内的货物为抗蜱疗法的发展提供了潜在的靶标和破坏蜱喂养的独特机制。这包括蜱唾液腺内的miRNA和唾液腺来源的细胞外囊泡。
miRNA是短的非编码序列，长度约为18-22个核苷酸（nt），可以在转录后调节，降解或沉默mRNA序列30，31。在转录过程中，pri-miRNA被成丁器（RNA聚合酶III）切割以形成独特的发夹状结构，成为前miRNA。前半核糖核酸再次被德罗沙（RNA聚合酶III）切割，形成成熟的小核酸双链体。成熟序列被整合到与mRNA序列互补的RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，导致翻译抑制或mRNA降解28，30，32。在宿主进食期间，蜱唾液中的miRNA可以调节宿主基因表达以抑制免疫反应并增强病原体的传播33，34，35，36，37。尽管存在对EV和miRNA的广泛研究，但它们在蜱宿主界面进食过程中的作用仍然知之甚少。优化方案可以很容易地分离和纯化高质量的miRNA，这对于提高我们对这些主题的知识至关重要。
可以使用多种选项来分离EV，例如超速离心，外泌体沉淀，聚合物沉淀，免疫亲和色谱和基于尺寸的排阻技术38。然而，这些技术无法区分外泌体或微囊泡。因此，如前所述，EV在将EV与不同样品隔离时用作总称。本文描述的实验中分离的囊泡代表衍生自不同生物发生途径的囊泡的混合物。通过免疫沉淀可以使用涂有针对目标囊泡群体特有的抗体（即外泌体标记物、肿瘤标记物）的微球进行免疫沉淀来实现特定细胞外囊泡群的进一步纯化39，40。miRNA也可以 通过 不同的市售分离试剂盒7，41，42提取。
该项目的目标是开发一种方案，该协议结合了常用的方法，以分离EV并从EV和饲料蜱唾液腺中提取miRNA。由于生物活性化合物的分泌是通过喂养12来激活的，因此应允许蜱虫进食以识别可能对操纵宿主免疫和伤口愈合反应很重要的miRNA。本方案需要少量蜱（20个蜱）来分离EV及其各自的miRNA，而先前描述的其他研究需要2000个蜱43。此外，它避免了毛果芸香碱44污染唾液分泌物，这可能会影响研究EV及其miRNA对宿主细胞影响的实验。
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Protocol
所有动物实验均按照德克萨斯A&M大学机构动物护理和使用委员会（AICUC）批准的动物使用方案（AUP#2020-0026）进行。蜱虫种类， 肩胛骨蜱和小蜱虫 （Boophilus）以及新西兰雄性白兔，42-72天，用于本研究。 肩胛肌I. 从疾病控制中心（CDC）和俄克拉荷马州立大学获得无病原体认证。R. microplus 在德克萨斯州爱丁堡的牛热蜱研究实验室饲养。这些兔子是从商业来源获得的（见 材料表）。该方案可以普遍分离来自不同蜱的物种，生命阶段和组织的细胞外囊泡和miRNA。
1. 肩 胛 尾母的饲养及胶囊制剂
- 按照喂食硬蜱虫的程序准备乙烯 - 醋酸乙烯酯泡沫胶囊45。将一粒胶囊放在兔子的每个肩胛骨上，每次感染总共两粒胶囊。
注意：简而言之，这些胶囊由两个正方形的乙烯 - 醋酸乙烯酯泡沫组成，内部有一个空白空间。用组织粘合剂将一个正方形粘在动物（在本例中为兔子）的背部（参见 材料表）。细网粘在第二个正方形上，以避免蜱虫逸出。两个正方形使用自粘钩带闭合。 - 让胶囊凝固24小时，然后将胶囊粘附在兔子身上。将泡沫胶囊储存在室温下。
注意：胶囊可以在室温下无限期储存。 - 将胶囊粘附在剃光皮的兔子身上，并在蜱虫侵扰之前放置24小时。
2. 无囊泡培养基的制备
- 为了制备无囊泡培养基13，将0.5 mL胎牛血清，0.5mL磷酸色氨酸肉汤，0.1mL 10%脂蛋白 - 胆固醇浓缩物，0.5mL 5%碳酸氢钠（NaHCO3），0.25 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）和8.125mLLL L15C300培养基（见 材料表）。根据需要调整培养基的音量。将培养基放入26.3 mL聚碳酸酯离心瓶中。
- 将瓶子的重量差最大平衡为0.01 g，以确保超速离心机的正常运行。
- 在4°C下以100，000× g 超速离心培养基18小时。 通过 移液管除去上清液，小心确保不会干扰形成的任何沉淀。
- 将上清液转移到新的离心管中，并在4°C下以100，000× g 第二次超速离心18小时，具有适当的平衡。
- 分离剩余的上清液并通过0.22μm注射器过滤器以除去污染物。将上清液移入50 mL离心管中。
- 将上清液储存在-20°C冰箱中，直到需要或长达3年。
3. 兔子侵扰
- 将顶部切下10 mL注射器，并使用标准画笔加载成年肩 胛骨 雌性。
- 使用无菌纱布盖住注射器开口（图1）。
- 将兔子水平放在桌面或工作表面上;用毛巾紧紧包裹兔子并盖住双眼，使准备好的胶囊（步骤1.1）暴露在蜱虫感染兔子。
- 打开胶囊并通过推动注射器手柄插入蜱虫。将蜱虫存放在兔子皮附近。快速关闭胶囊，防止蜱虫逸出。
- 根据实验设计，让雌性蜱虫根据需要喂食。不要让雄性 肩胛骨异胛 骨在胶囊中停留超过24小时，以避免干燥。
注意：感染动物的蜱虫数量由调查人员自行决定。该协议每次感染使用约100个蜱虫来解释死亡率和足够的重复材料。初步实验确定，至少需要20次蜱/重复才能获得足够的材料来对miRNA进行测序。
4. 切除喂养的雌性
- 使用气体扩散器将受感染的兔子置于2%异氟醚下的氧气中。将氧气速率设置在700-1000 L/min之间。
注意：可以使用其他麻醉剂来避免任何痛苦或疼痛。 - 用镂子用细镊子抓住蜱虫，尽可能靠近皮肤，以除去喂食的雌性。确保完全去除口器以避免细菌感染。
- 将蜱虫放入15 mL离心管中。
- 用70%乙醇清洁咬伤部位，并加入少量三重抗生素（指尖价值，见 材料表），以防止蜱叮咬部位感染。
- 将蜱虫带到实验室进行解剖（步骤5）。在去除蜱虫的24-48小时内进行这些解剖，以避免唾液腺降解15，43。
5. 唾液腺夹层及细胞外囊泡分泌
- 向每个孔中加入500μL无囊泡培养基（步骤2）和5μL100x青霉素，5μL100x链霉素，5μL10mg / mL利福平和5μL100x两性霉素（参见 材料表）。将1x PBS与利福平加入任何不含囊泡培养基的孔中，以防止细菌生长。
- 在解剖显微镜下，将蜱虫放在透明显微镜下带有双面地毯胶带的透明显微镜载玻片上。为防止器官干燥，在解剖前向每只蜱虫中加入10 μL 1x PBS。
- 使用4毫米的叶片剪刀（见 材料表），在每个女性的侧面做一个约1毫米的小切口。完全去除蜱虫的背侧（图2）并去除两个唾液腺。
- 将20-40蜱唾液腺放入500μL无囊泡培养基中，加入到24孔组织培养处理的板中的单个孔中（图3）。
- 将唾液腺样品在32°C下孵育24小时以允许EV的分泌。
6. 细胞外囊泡的分离
- 孵育24小时后，将所有含有唾液腺的培养基移液到1.5mL微量离心管中。
- 在4°C下以300× g 离心样品10分钟以分离唾液腺。在此步骤中将分离两个相：（1）含有EV的上清液和（2）唾液腺（颗粒）。
- 为了继续分离EV，将上清液移入新的1.5 mL微量离心管中。将含有唾液腺的沉淀（步骤6.2）重悬于500μL RNAlater（参见 材料表）中，并储存在-80°C直至使用或无限期。
注意：这些唾液腺将用于步骤8中的miRNA分离。 - 在4°C下以2000× g 离心上清液10分钟以除去细胞碎片。将上清液移入新的1.5 mL微量离心管中。丢弃颗粒。
- 在4°C下以10，000× g 离心上清液30分钟，以除去凋亡体和较大的EV。将沉淀物倾倒，并将上清液移入新的1.5 mL微量离心管中。
- 将 10 mL 注射器连接到 1 μm 尼龙注射器过滤器上。将注射器和过滤器放在超速离心管上方（图4A）。然后加入样品（图4B）并用10mL 1x PBS（图4C）填充注射器，并相应地平衡管（图4D）。
- 将管放入70Ti转子中（参见 材料表），并在4°C下以100，000× g 旋转18小时。
- 超速离心18小时后，观察管下端的沉淀（图5）。颗粒是浓缩的细胞外囊泡。
- 去除90%-100%的上清液，而不重复使用EV沉淀。用1x PBS重悬颗粒。如果不能除去所有上清液，则使用剩余的上清液重悬沉淀。
- 将500μLEV沉淀/上清液移入300 K离心过滤器中（参见 材料表）。
注意：这将去除任何非囊泡相关的蛋白质，miRNA和其他分子，而囊泡不会通过过滤器。 - 在环境温度下以8，000× g 离心10分钟。重复步骤6.10，直到所有EV沉淀/上清液都通过过滤器。
- 向色谱柱中加入400μL灭菌的1x PBS， 并通过 移液管彻底混合以除去附着在膜上的EV。将样品放入1.5 mL无DNA酶/无RN酶的管中。样品可以无限期地储存在-80°C或直到使用。避免样品过度解冻，以防止样品降解。
注意：从超速离心机中取出时，将管子放在冰上，以防止EV降解。最终样品将是400μL1x PBS中的EV沉淀。25 μL该样品将用于纳米颗粒跟踪分析（NTA，步骤7），375μL用于miRNA分离（步骤8）。
7. 纳米颗粒跟踪分析
- 取25μL最终样品（步骤6.12）并加入375μL 1x PBS。
- 将稀释的样品装入1 mL无针注射器中，并拧紧到NTA的光学透镜上。
- 相应地调整设置并根据设置首选项捕获视频。
注：在本研究中，进行了三次读数，每次60秒。每个NTA读数都代表了一个技术重复。蜱虫喂食时间长度相同的不同样品代表了个体的生物重复。相机设置为7级，检测阈值设置为5级。 - 通过以下公式估计最终的 EV 数：
（（起始 EV 浓度（稀释因子））*（样品管中剩余的总体积）/1000） = 样品中的 EV 总数
注意：体积必须除以1000，因为NTA以浓度/mL读取样品。
8. 从唾液腺和细胞外囊泡中提取miRNA
- 将100μL裂解试剂（参见 材料表）加入步骤6.12的剩余样品中，并用灭菌的杵匀均质（图6）。
- 加入剩余的600μL裂解试剂，并在室温下孵育5分钟。
- 加入140μL氯仿，剧烈摇动15秒，并在室温下孵育3分钟。
- 在4°C下以12，000 x g 旋转15分钟。
- 将透明顶相移液，避免相间，移入新的1.5 mL管中。这将产生约525μL的预期样品体积。接下来，加入1：1体积的100%分子级乙醇。
- 将700μL样品加入RNA分离离心柱中（参见 材料表）。
- 在环境温度下以8，000 x g 旋转30秒，丢弃流过。
- 用700μLRTE缓冲液洗涤样品（参见 材料表），以8，000× g 旋转30秒，丢弃流过。
- 用500μLRPE缓冲液洗涤样品（参见 材料表），以8，000× g 旋转30秒，丢弃流过。
- 加入500μL80%分子级乙醇，并以8，000× g 旋转2分钟，弃去流过。
- 以最大速度旋转色谱柱5分钟以干燥膜。丢弃收集管，将色谱柱置于新的1.5 mL微量离心管中。
- 向膜中加入14μL无RN酶/脱氢核糖酶的水，并在室温下孵育5分钟。
- 在室温下以21，000× g 离心1分钟。
- 向洗脱的miRNA中加入1μL RNase抑制剂（参见 材料表）， 并通过 移液管充分混合。
注意：在从唾液腺中提取miRNA之前，通过加入1ml 1x PBS（1：1体积）除去任何RNAlater，并在4°C下以最大速度旋转唾液腺15分钟。 这需要重复三次，或者直到唾液腺已经消退到足以去除上清液。此时，样品代表大小约为20-150 bp的小RNA的混合物（补充图1）。
9. 测量微核酸浓度
- 通过市售的RNA测定试剂盒41测量小RNA的浓度（参见材料表）。
- 在每个试管中，根据制造商的说明，混合199μL稀释缓冲液（每个样品在试剂盒中提供的组分A和B），1μL特异性于检测miRNA的荧光染料（测量波长260nm）（每个样品）和2μL小RNA（步骤8）。
- 在读取样品管之前，读取预稀释的miRNA标准品1和标准品2（试剂盒中提供）以在样品测量之前创建标准曲线。
注意：标准品用作比较工具，以确定样品中测量的miRNA浓度。 - 将每个标准品和样品管放入专用荧光计（参见 材料表）中，以ng / μL测量浓度。
10. 确定微核酸质量
- 按照制造商的说明，使用生物分析仪46通过凝胶电泳确定miRNA和其他小RNA的质量（参见材料表）。
- 在样品读数之前，将样品归一化为相同的浓度。
- 按照制造商的说明，通过小型RNA芯片41，46读取样品（参见 材料表）。
注意：为了确定miRNA质量，凝胶状图像（条带）和电泳图（峰）是样品质量的指标。凝胶中的条带越暗，miRNA质量越好。条带越轻（或者如果不存在条带），质量越差或证明样品降解46，47。
11. 微量核糖核酸富集
- 使用小型RNA测序试剂盒，按照制造商对小型RNA样品制备试剂盒的说明（参见 材料表）富集miRNA。
- 用3'腺苷酸化适配器连接每个样品， 并通过 磁珠清理去除多余的适配器。接下来，添加一个 5' 适配器，并通过磁珠清理48 移除多余的适配器。
注：用于纯化的适配器和磁珠均在第11.1节中的小型RNA测序试剂盒中提供（参见 材料表）。 - 为了合成第一条链，制备用试剂盒中提供的两个适配器，RT缓冲液和M-MuLV逆转录酶连接样品的预混液（参见 材料表）。接下来，将混合物在42°C下孵育30分钟，在90°C下孵育10分钟。 按照说明中说明进行示例清理。
- 使用试剂盒中提供的RT正向引物和反向通用引物（参见 材料表）在95°C下 通过 常规聚合酶链反应（PCR）扩增第一链2分钟，然后在95°C下循环12-25秒，在60°C下30秒，在72°C下15秒。 最后，在72°C下2分钟。
注：PCR产物大小预计约为150 bp（图7）。 - 按照制造商的说明 ，通过 胶带站测量PCR产品的质量（参见 材料表）。
- 使用下一代测序系统（75个周期）对样品进行测序，遵循制造商的说明（参见 材料表）。
注意：对于miRNA富集，必须在文库制备前检查样品数量和质量（步骤9-10）。
第12章 生物信息学分析
- 使用用于 miRNA 鉴定的集成应用工具鉴定保守且唯一的 miRNA。
注意：在本研究中， miRNA鉴定是通过 miRDeep249，50进行的。miRDeep2是一个免费的在线目录，收录了在各种物种49，50 中发现的所有已鉴定的保守和新型miRNA（参见 材料表）。 - 使用与软件集成的映射器将读数与相应的基因组对齐。
- 在映射器模块中输入以下参数。
- 修剪从步骤11.2添加的适配器序列，并删除长度小于18个核苷酸的序列。删除冗余读取序列。
- 仅当文件不是 FASTA 格式49 时，才使用解析将文件转换为 FASTA 格式参数。
- 将过滤和修剪的序列与相应的基因组对齐。如果感兴趣的物种没有基因组，请与最接近的同源物种对齐。
- 将输出文件显示为“读取.fa”和“reads_vs_genome.arf”。“read.fa”将仅包含非冗余读取，“reads_vs_genome.arf”将包括与基因组对齐的映射读取。
- 使用步骤12.2中的两个输出文件，使用与软件集成的量词器执行miRNA表达谱分析。
- 从 miRBase 51、52、53、54、55、56 下载感兴趣的物种 miRNA 前体序列和成熟的 miRNA 序列。如果感兴趣的物种没有前体或成熟序列，请下载“发夹.fa.gz”和“成熟.fa.gz”，其中包含miRBase上所有生物的所有前体和成熟序列。
- 解压缩“发夹.fa.gz”和“成熟.fa.gz”文件。
- 输入第 12.3.4 节中的“reads.fa”和“read_vs_genome.arf”文件以及 12.4.2 中的未压缩文件。
- 将输出文件读取为“输出名称.csv”、“输出名称.html”和“输出名称.pdf”。输出文件名可以根据调查员进行设置。
注意：“输出名称.csv”文件将包含表达式配置文件。具体而言，表达谱将具有miRNA ID，映射到miRNA的所有样品的读数总和，每个样品映射到特定miRNA的读数次数以及与成熟miRNA相对应的前体ID。步骤12.4.4中的“输出名称.html”将包含指向圣克鲁斯大学基因组浏览器（USCS），国家生物技术信息中心（NCBI）和miRBase的链接。USCS和NCBI将包含针对非冗余核苷酸数据库的当前前体的查询序列，并且miRBase将具有当前miRNA前体的信息。“输出名称.pdf”将具有表达的miRNA的RNA二级结构和前体序列的比对。
- 要识别唯一且保守的米诺尔纳，请使用米瑞德 2。
- 使用步骤 12.3.4 和步骤 12.4.2 中的输出文件作为输入文件。
注意：读取为“输出名称.html”的输出文件将包含样本中唯一且保守的 miRNA 的预测。 - 使用评分>1进行miRNA分析，使用评分>4进行进一步的实验分析，例如miRNA抑制和模拟内源性miRNA34，36，57。
- 根据以下内容从 miRbase 中选择并识别唯一的 miRNA：miRDeep2 评分（步骤 12.5.3）、真实概率估计值 （>90%）、显著的 randfold p 值 （<0.05）49，50，56。
注意：生物信息学分析 是通过 Cyverse发现环境58，59中的miRDeep2完成的，这是一个免费的生物信息学分析在线平台。通过miRDeep2鉴定出的保守和独特的miRNA与miRbase的所有物种进行了比较。未来的miRDeep2鉴定可以与感兴趣的物种的相应基因组进行比较。
- 使用步骤 12.3.4 和步骤 12.4.2 中的输出文件作为输入文件。
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Representative Results
本方案提供了从唾液腺和EV中提取miRNA的详细方法。根据结果，该方案对于从两种不同蜱的蜱虫物种（肩蜱芽孢杆菌和微加蜱虫）的成虫中分离miRNA是有效的，并且还可能用于其他蜱虫物种。通过NTA测量EV浓度（颗粒/毫升）。对于R.microplus，每个性别和生命阶段都包含三个生物重复，在三个技术重复中测量。按性别和生命阶段（图8）将样本分开，以显示每个样本内的变化。接下来，使用双向方差分析（20）和Tukey的多重比较检验20（p值= <0.05）组合样本以显示变异和统计差异（图9）。每个样本由约40个唾液腺组成，从20个雌性，雄性和若虫中解剖。在对EV进行分离和定量后，将样品用于小RNA纯化。
通过Qubit测量每个样品中小RNA的浓度（表1），并使用标准凝胶电泳46，47通过生物分析仪测量质量。两种蜱物质的浓度均为14μL体积的纳克（表1）。肩胛肌小颗粒物的平均总浓度为45.92-6，356 ng。肩胛囊泡的RNA浓度范围为72.24-2，128 ng。对于微加弧菌，器官浓度范围为259-2，142 ng，囊泡范围为59.22-1，848 ng。将样品归一化至相同浓度，然后通过生物分析仪测量其质量（图10）。在凝胶中使用参比分子量标准品作为质量评估的标记。带完整性、强度和峰是每个样品中潜在降解或总浓度的代表。对应于5 s和5.8 s核糖体RNA的条带仅存在于唾液腺器官样品中（图10，泳道A-D），并且在唾液腺样品的囊泡中不存在（图10，泳道E，F），表明器官和细胞外囊泡之间小RNA谱的差异。样品降解是通过凝胶中没有条带推断的;这表明样品有明显的降解。建议丢弃任何有明显降解的样品。
为了证明制剂中存在miRNA样品，从小RNA分离后储存3-4个月的RNA样品制备了小RNA cDNA文库。奇怪的是，在这些样品中发现了更高的样品降解。车道A-D和G显示出退化的迹象;相反，E，F和H-K显示出miRNA cDNA文库制备的最小降解和足够的浓度（补充图1）。纯化后立即使用样品时，只有一个样品被降解（图10），这表明miRNA样品一旦从EV中纯化出来就更容易降解。因此，样品E，F，H和I被选中进行富集分析。星号显示~150 bp的条带大小，这是cDNA文库制备后的预期大小（图7）。较低的微弱条带表示引物二聚体。
在EV隔离期间，离心速度和时间会影响最终的EV浓度。如前所述，将EV沉淀移液到300 k色谱柱中时，低体积和低速度对于防止EV通过膜至关重要。先前的研究表明，使用不同的离心浓缩器在12，000 x g下700μL，持续20分钟，足以将EV从可溶性蛋白质中正确分离20;然而，使用不同的过滤器在NTA中显示低EV浓度。因此，优化过滤器和其他可用材料至关重要。首次使用300 k色谱柱时，测试不同的速度间隔以确定哪个具有最高的EV浓度。通过NTA分析测量离心过程中丢失的囊泡数量;得出的结论是，较低的速度导致流过中的囊泡浓度较高（未显示）。结论是，500 μL在6，000-8，000 x g下分离EV是令人满意的。一旦确定，该方案就用于从肩胛支原体和微加线虫中分离囊泡。通过NTA测量从每个蜱物种分离的囊泡的浓度（图8）。EV浓度在7.07 x 10 7至7.94 x 109颗粒/mL之间变化。转化率数量与 miRNA 浓度相关，其中较高的 EV 量导致提取的 miRNA 浓度较高。
图 1：1 mL 无针注射器，装有女性成人肩胛肌，并用无菌纱布覆盖。
图2：用4毫米的叶片剪刀切除充血雌性的背侧。 雌性被淹没在1x PBS中以防止器官干燥。黄色箭头指向暴露的唾液腺。该图是用高分辨率物镜以50倍放大倍率拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：在32°C下孵育24小时后的细胞培养板。 第一排井包含无囊泡培养基和解剖的唾液腺。其余的孔含有1x PBS与利福平。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：超速离心机循环的样品制备过程。（A） 一个 10 mL 无针注射器，顶部装有 1 μm 注射器过滤器。（B）将离心三轮后的上清液移液到注射器中。（C）将注射器的其余部分填充到10 mL，并装有1x灭菌的PBS。（D）将注射器覆盖，将具有1x PBS的上清液过滤到超速离心管中。 请点击此处查看此图的大图。
图5：超速离心18小时后，在超速离心管的底部形成细胞外囊泡沉淀。
图 7： 通过 磁带站测量的凝胶电泳，显示富集分析后制备的 miRNA 文库。 来自雌性 微加 唾液腺器官和EV的样品基于最小的降解和足够的miRNA浓度用于cDNA文库合成。梯形图（L）显示核苷酸中的参考点以及上下标记。星号表示大小为~150 bp的产物条带，表示小的RNA cDNA文库。下部条带显示引物二聚体。 请点击此处查看此图的大图。
图8：生物重复（A）雌性，（B）雄性和（C）若虫之间变异的代表性数字。 x 轴显示 EV 大小 （nm），y 轴显示 EV 浓度（颗粒/mL）。双向方差分析与Tukey比较检验显示统计差异（P值 =<0.05）。误差线表示要考虑变化的标准误差。每个样本含有20个蜱虫，有三个生物重复。样本记录60秒，每次三次。相机设置为级别 7，检测阈值设置为级别 5。 请点击此处查看此图的大图。
图9：若虫（红色）、雌性（蓝色）和雄性（黑色）所有组合生物重复的变异的代表性数字。 x 轴显示 EV 大小 （nm），y 轴显示 EV 浓度（颗粒/mL）。双向方差分析与Tukey比较检验显示统计差异（P值 =<0.05）。误差线表示要考虑变化的标准误差。每个样本含有20个蜱虫，有三个生物重复。星号表示 p < 0.05 的显著差异。每次录音进行了60秒，每次三次。相机设置为级别 7，检测阈值设置为级别 5。 请点击此处查看此图的大图。
图10： 通过 生物分析仪的代表性凝胶。 使用基础分子量标准进行凝胶电泳。成熟的miRNA序列长约18-22 nt，其中微弱条带显示在指定的大小范围内。其他小RNA，如小核RNA，转移信使RNA和调节RNA，也存在于样品中。小RNA的大小范围为~20-150 nt。样本因蜱的种类、组织和性别而异。对于泳道G，样品降解的示例显示没有条带。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1： 通过 生物分析仪测量凝胶电泳，显示从 微大于R.雌性 唾液腺器官和EV中提取的miRNA的质量。分子量标准（L）显示了核苷酸的参考尺寸，其中成熟的miRNA长度约为18-22 nt。泳道 A-D 和 G 显示退化，泳道 E、F 和 H-K 显示最小退化。 请按此下载此档案。
| 物种 | 性 | 管风琴/囊泡 | 电动汽车浓度 | 微核酸浓度（纳克） |
| R. 微加 | 女性 | 风琴 | 不适用 | 259 |
| R. 微加 | 女性 | 风琴 | 不适用 | 2,142 |
| R. 微加 | 女性 | 囊泡 | 1.64 E+08 | 59.22 |
| R. 微加 | 女性 | 囊泡 | 1.64 E+09 | 1,848 |
| 肩胛骨I. | 女性 | 风琴 | 不适用 | 45.92 |
| 肩胛骨I. | 女性 | 风琴 | 不适用 | 6,356 |
| 肩胛骨I. | 女性 | 囊泡 | 1.73E+08 | 65.66 |
| 肩胛骨I. | 女性 | 囊泡 | 3.14 E+09 | 2,128 |
表1：唾液腺和细胞外囊泡的miRNA浓度示例。miRNA浓度列代表每种蜱虫物种的最低至最高浓度。
| 微核酸 | 肩胛骨I. | 蓖麻属 | R. 微加 | 长角兽 | 引用 |
| 米瑞-8 | 一个 | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
| 军用-71 | P | P | P | 一个 | 33, 36, 37, 43 |
| 军用飞机-279 | P | 一个 | 一个 | P | 33, 36, 37, 43 |
| 让-7 | 一个 | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
表2：不同蜱虫物种中的保守miRNA。（P）表示miRNA通常表达或存在，并且（A）表示miRNA未被普遍表达或检测到。
| 样品类型 | 分数数量 >1* | 分数数量 >4γ | 保存数量 | 小说数量 |
| 雄 | 17 | 0 | 48,885 | 23 |
| 女性 | 25 | 0 | 48,885 | 21 |
| 若虫 | 38 | 0 | 48,885 | 38 |
表 3.在EV中检测到保守和独特的miRNA，用于 微加R， 雄性和若虫。*用于分析的微粒细胞核酸评分。 γ用于功能实验的miRNA评分。
补充表1：显示从唾液腺分泌的微加型雄性EV的下一代测序结果的表格。请按此下载此表格。
补充表2：显示唾液腺分泌的微加型雌性EV的下一代测序结果的表格。请按此下载此表格。
补充表3：显示从唾液腺分泌的微加若虫EV的下一代测序结果的表格。请按此下载此表格。
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Discussion
目前的方案提供了从唾液腺和EV中提取miRNA的详细方法。但是，有一些重要的注意事项，所有这些注意事项都在本协议每个部分的说明中进行了详细说明。在蜱虫喂食期间，必须固定胶囊和网状网，以防止蜱虫逸出。胶囊的制备和放置在Koga等人40中进行了描述。如果丢弃不合适的样品，则需要进行几次蜱解剖的重复。此外，在利用来自蜱组织18，20，43的EV隔离技术时，可能会存在一些挑战。例如，在解剖过程中应保持组织湿润，以避免干燥。这是通过在整个解剖过程中添加PBS来完成的。PBS和用于器官解剖和培养的培养基均应使用抗生素进行维护，以避免蜱微生物组的细菌污染。这些应包括靶向革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗生素，因为两者都可以在蜱组织60中找到。同样，在解剖过程中必须小心，以减少其他器官组织的污染。因此，解剖需要缓慢完成，随着用户获得经验，可以解剖更多的蜱虫。最后，由于EV是从所有细胞分泌的，包括病原体感染的细胞，因此进行EV分离的蜱研究需要使用无EV培养基和缓冲液来避免交叉EV污染25，61。
然而，该协议允许减少产生蜱唾液EV所需的蜱虫数量。以前的协议要求垂涎大量蜱虫。例如，在 长角 血吸虫唾液EV中分泌的miRNA需要2，000只成年蜱43的唾液分泌。对于缺乏追踪蜱虫能力的实验室来说，这可能是非常昂贵的。同样，用于EV分离的 黄斑弱 小板组织在分离前被部分冷冻，并用75 U / mL的3型胶原酶处理，这可能会影响EV分泌物19的真实性。此外，这些研究需要80-100对唾液腺18。
相比之下，该协议可应用于多种蜱物种，并且需要低数量的蜱来分离EV并提取质量保守的新型miRNA（表2）33，36，37，43。miRNA浓度差异很大，但足以进行下一代测序（表3和补充表1-3）。如果需要更大的miRNA浓度，可以调整该方案以适应更大的样品量。此外，根据材料的可用性，该协议中使用的材料是可替代的。但是，样品体积和离心速度必须按照制造商对所用试剂盒和色谱柱的说明进行调整。
这种方法的缺点是miRNA和EV很容易在整个提取和分离步骤中降解。因此，该协议必须快速有效地完成。说明时，样品必须保存在冰上，并且miRNA提取必须在灭菌环境中进行。此外，可以在分离的EV上进行RNase处理，以消除附着在EV膜上的大RNA。这可以防止大型RNA在miRNA提取过程中污染样品。最后，从EV或器官分离后向miRNA样品中添加RN酶抑制剂是降解的重要预防措施。该协议可以改变并与正在进行的实验目标并行应用。
该协议的未来应用可能包括研究病原体 - 载体相互作用，以了解病原体如何影响蜱唾液EV内的miRNA和其他基因组货物。同样，该协议可以定义miRNA包装成蜱类EV所涉及的特定蛋白质和细胞过程，以及这些EV和miRNA对伤口愈合和免疫反应的特定影响。由于蜱虫对杀螨剂的抗性增加，迫切需要独特的控制方法。与杀螨剂相比，电动汽车具有替代控制方法的潜力。电动汽车可用作治疗应用中的纳米转运蛋白18，23，61。在人类中，运输miRNA的EV已被用于在癌症免疫治疗期间抑制肿瘤生长62，63。同样，在蜱虫中，EV可以携带转基因miRNA，这些miRNA已被证明会影响重要的蜱生物功能和病原体传播36，57，64。未来的方向是使用该协议来确定多种蜱物种的miRNA谱，以鉴定功能研究感兴趣的miRNA。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢德克萨斯州爱丁堡牛瘟蜱虫实验室的协助。我们要感谢迈克尔·摩西、杰森·蒂德威尔、詹姆斯·赫勒姆斯、塞萨里奥·阿加多和荷马·瓦斯奎兹。我们还要感谢莎拉·夏普顿、伊丽莎白·洛斯特罗、艾米·菲利普、凯尔西·约翰逊、凯利·科赫坎、安德鲁·希尔豪斯、查卢兹·阿罗乔·罗萨里奥和斯蒂芬妮·古兹曼·瓦伦西亚在整个项目中的协助。我们要感谢德克萨斯州A&M Aggie昆虫学女性（AWE）写作小组在撰写本文期间提供的帮助和建议。以下试剂由疾病控制和预防中心提供，由BEI资源，NIAID，NIH分发：肩 胛骨成 虫（活），NR-42510。还从俄克拉荷马州立大学的蜱虫饲养设施接收了雌性肩 胛 。该项目由德克萨斯A&M大学T3资助：转型赠款的三位一体和美国农业部-ARS向AOC的合作协议#58-3094-1-003。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
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