Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af mikroRNA'er fra Tick Ex Vivo spytkirtelkulturer og ekstracellulære vesikler

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63618
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

Den nuværende protokol beskriver isoleringen af mikroRNA'er fra flåtspytkirtler og rensede ekstracellulære vesikler. Dette er en universel procedure, der kombinerer almindeligt anvendte reagenser og forsyninger. Metoden tillader også brugen af et lille antal flåter, hvilket resulterer i mikroRNA'er af høj kvalitet, der let kan sekventeres.

Abstract

Flåter er vigtige ektoparasitter, der kan vektor flere patogener. Spytkirtlerne i flåter er afgørende for fodring, da deres spyt indeholder mange effektorer med farmaceutiske egenskaber, der kan mindske værtsimmunrespons og forbedre patogenoverførsel. En gruppe af sådanne effektorer er mikroRNA'er (miRNA'er). miRNA'er er korte ikke-kodende sekvenser, der regulerer værtsgenekspression ved tick-host-grænsefladen og i flåtens organer. Disse små RNA'er transporteres i flåtspyt via ekstracellulære vesikler (EV'er), som tjener inter- og intracellulær kommunikation. Vesikler indeholdende miRNA'er er blevet identificeret i spyt af flåter. Imidlertid er der lidt kendt om roller og profiler af miRNA'erne i kryds spytvesikler og kirtler. Desuden kræver undersøgelsen af vesikler og miRNA'er i krydsspyt kedelige procedurer for at indsamle flåtspyt. Denne protokol har til formål at udvikle og validere en metode til isolering af miRNA'er fra rensede ekstracellulære vesikler produceret af ex vivo-organkulturer . De materialer og metoder, der er nødvendige for at udtrække miRNA'er fra ekstracellulære vesikler og flåtspytkirtler, er beskrevet heri.

Introduction

Flåter er ektoparasitter, der vektor mange patogener til dyreliv, husdyr, mennesker og deres kæledyr 1,2. Tick fodring resulterer i betydelige økonomiske tab ved at forårsage skade at skjule, reducere vægt og mælkeproduktion på grund af alvorlig anæmi og overførsel af potentielt dødelige sygdomsfremkaldende patogener 1,3,4,5. Den nuværende kontrolpraksis til forvaltning af flåtpopulationer er fokuseret på brugen af acaricider. Ikke desto mindre har den kontinuerlige fremkomst af acaricidresistens i flåter, der parasiterer husdyr 5,6, den øgede forekomst af flåtbid7 og patogenoverførsel inden for boligområder 8,9, ført til et behov for unikke krydskontrolalternativer.

Flåten spytkirtler er vigtige organer, der sikrer en flåts biologiske succes. De er dannet af forskellige acinustyper (I, II, III og IV) med forskellige fysiologiske funktioner. Spytkirtlerne er ansvarlige for osmoregulering, både fra og på værten, ved at returnere vandoverskud og jernindhold til værten via salivation 2,10. Type I acini er også involveret i optagelsen af vand fra atmosfæren ved udskillelse af hygroskopisk spyt10,11. Spyteffektorproteiner, såsom cement og cystatiner, produceres i sekretoriske celler i type II og III acini10,12. Type I acini påvirker ikke flåtfodring, hvilket indikerer, at blodmelsindtaget ikke udløser morfologiske og fysiologiske ændringer i disse acini type13,14. På den anden side aktiveres Acini type II og III under fodring og præsenterer meget lidt aktivitet forud for fastgørelse. Fodring er således nødvendig for at udløse udvidelsen af sekretoriske celler inden for type II acini og produktionen af bioaktive forbindelser. Type III acini reduceres i størrelse under fodring på grund af sekretionen i sekretoriske granuler12.

Spytkirtlerne er også stedet for patogeninfektion i tæsken og transmissionsvejen. Under fodring udskiller flåter flere forbindelser med farmaceutiske virkninger, der er nødvendige for en vellykket gennemførelse afblodmelet 10,15,16. Disse forbindelser har antiinflammatoriske, immunosuppressive og vasodilatoriske egenskaber 10,15,17. Nylige undersøgelser har vist, at ekstracellulære vesikler (EV'er) afledt af flåtspytkirtler har flere af disse forbindelser, hvilket inducerer antiinflammatoriske og immunmodulerende virkninger 18,19,20. "Ekstracellulære vesikler" er et paraplyudtryk, der bruges til at beskrive vesikler klassificeret som exosomer og mikrovesikler baseret på deres størrelse og biogenese. Samlet set er elbiler lipidblebs med dobbeltlagsmembraner, der er ~ 40 nm-1 μm i størrelse21; generelt beskrives exosomer som værende 40-150 nm i størrelse, mens mikrovesiler er mellem 150 nm-1 μm i størrelse 21,22,23. Størrelsen er dog ikke vejledende for elbilernes biogenesevej22.

Biogenesen af exosomer starter med den sekventielle invagination af plasmamembranen. Denne invagination fører til dannelse af multivesikulære legemer og resulterer endelig i deformation af vesikulærmembranen ved virkningen af ESCRT-komplekser eller sphingomyelinases (sMases)24,25. Exosomerne kan enten lyses i lysosomerne for at opretholde cellulær homeostase eller udgang via vesikulær fusion til plasmamembranen for at levere cellulære bestanddele til modtagercellerne21,24. På den anden side dannes mikrovesikler ved virkningen af flopasser og flipasses, hvilket ændrer konformationen af lipider i plasmamembranen26. Elbiler er afgørende for celle-til-celle-kommunikation, der fungerer som et transportsystem til intracellulær last, såsom lipider, proteiner, nukleinsyrer og mikroRNA'er (miRNA'er)21,27,28. Når de er transporteret, leverer disse vesikler deres last ind i cytoplasmaet i modtagercellerne og genererer fænotypiske ændringer i modtagercellen22,29. På grund af betydningen af ekstracellulære vesikler i krydsfodring og manipulation af værtsimmun- og sårhelingsrespons18,20 præsenterer lasten inden for ekstracellulære vesikler potentielle mål for udviklingen af anti-tick-terapi og en unik mekanisme til at forstyrre krydsfodring. Dette omfatter miRNA'er inden for flåtspytkirtler og spytkirtelafledte ekstracellulære vesikler.

miRNA'er er korte ikke-kodende sekvenser, ~ 18-22 nukleotid (nt) i længden, der efter transkriptionelt kan regulere, nedbryde eller tavse mRNA-sekvenser30,31. Under transkription spaltes pri-miRNA'erne af Dicer (RNA-polymerase III) for at danne en karakteristisk hårnållignende struktur, der bliver et præ-miRNA. Pre-miRNA'et skæres igen af Drosha (RNA-polymerase III) for at danne en moden miRNA-duplex. Den modne sekvens bliver integreret i det RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC) komplementært til mRNA-sekvensen, hvilket forårsager translationsundertrykkelse eller mRNA-nedbrydning 28,30,32. Under værtsfodring kan miRNA'er i flåtspytmodulere værtsgenekspression for at undertrykke immunresponser og forbedre patogenoverførsel 33,34,35,36,37. Selvom der findes omfattende undersøgelser af elbiler og miRNA'er, er deres roller under fodring på tick-host-grænsefladen stadig dårligt forstået. Optimering af protokoller, der let kan resultere i isolering og rensning af miRNA'er af høj kvalitet, er afgørende for at fremme vores viden om disse emner.

Flere muligheder kan bruges til at isolere elbiler, såsom ultracentrifugering, exosomudfældning, polymerudfældning, immunoaffinitetskromatografi og størrelsesbaserede udelukkelsesteknikker38. Disse teknikker kan imidlertid ikke skelne mellem exosomer eller mikrovesikler. Som tidligere nævnt bruges ev således som en paraplybetegnelse, når elbiler isoleres fra forskellige prøver. Vesikler isoleret i de eksperimenter, der er beskrevet heri, repræsenterer en blanding af vesikler afledt af forskellige biogeneseveje. Yderligere oprensning af en specifik population af ekstracellulære vesikler kan opnås ved immunprecipitation ved anvendelse af perler belagt med antistoffer mod markører (dvs. exosomale markører, tumormarkører), der er unikke for vesikelpopulationen af interesse39,40. miRNA'er kan også udvindes via forskellige kommercielt tilgængelige isolationssæt 7,41,42.

Formålet med dette projekt var at udvikle en protokol, der kombinerer almindeligt anvendte metoder til at isolere elbiler og udtrække miRNA fra både elbiler og fodrede spytkirtler. Fordi udskillelsen af bioaktive forbindelser aktiveres ved fodring af12, bør flåter have lov til at fodre for at identificere miRNA'er, der kan være vigtige for at manipulere værtsimmun- og sårhelingsresponser. Den nuværende protokol kræver et lille antal flåter (20 flåter) for at isolere elbiler og deres respektive miRNA'er sammenlignet med andre tidligere beskrevne undersøgelser, der krævede 2000 flåter43. Desuden undgår det forurening af spytsekretioner med pilocarpin44, hvilket kan påvirke eksperimenter, der studerer effekten af elbiler og deres miRNA'er på værtsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført efter dyrebrugsprotokol (AUP # 2020-0026) godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité (AICUC) ved Texas A&M University. Flåtarterne Ixodes scapularis og Rhipicephalus (Boophilus) microplus og newzealandske hvide hankaniner, 42-72 dage gamle, blev brugt til denne undersøgelse. I. scapularis blev modtaget fra Center for Disease Control (CDC) og Oklahoma State University, certificeret som patogenfri. R. microplus blev opdrættet på Cattle Fever Tick Research Laboratory i Edinburg, Tx. Kaninerne blev opnået fra kommercielle kilder (se Materialetabel). Denne protokol kan universelt isolere ekstracellulære vesikler og miRNA'er fra forskellige krydsarter, livsstadier og væv.

1. Opdræt af hundyr I. scapularis og kapselpræparat

  1. Forbered en ethylen-vinylacetat skumkapsel efter procedurerne for hårde flåter-fodring kaniner45. Anbring en kapsel på hvert skulderblad af kaninen for i alt to kapsler pr. Angreb.
    BEMÆRK: Kort fortalt består disse kapsler af to firkanter ethylen-vinylacetatskum med et indvendigt tomt rum. En firkant limes på bagsiden af dyret (i dette tilfælde kaniner) med et vævsklæbemiddel (se Materialetabel). Fint mesh limes til den anden firkant for at undgå flugt af flåter. De to firkanter lukkes ved hjælp af selvklæbende krogtape.
  2. Kapslerne sættes i 24 timer, før kapslen klæbes på kaninerne. Opbevar skumkapslerne ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Kapslerne kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur.
  3. Hold kapslen til barberede kaniner og lad den stå i 24 timer før krydsangreb.

2. Forberedelse af vesikelfrie medier

  1. For at forberede vesikelfrie medier13 kombineres 0,5 ml føtalt bovint serum, 0,5 ml tryptosephosphat bouillon, 0,1 ml 10% lipoprotein-kolesterolkoncentrat, 0,5 ml 5% natriumbicarbonat (NaHCO3), 0,25 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre (HEPES) og 8,125 ml L15C300-medium (se materialetabel). Juster mediets lydstyrke efter behov. Anbring mediet i en 26,3 ml polycarbonatcentrifugeflaske.
  2. Balancer flaskerne med en vægtforskel på maksimalt 0,01 g for at sikre, at ultracentrifuge fungerer korrekt.
  3. Ultracentrifuge mediet i 18 timer ved 100.000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten via pipette, og sørg omhyggeligt for ikke at forstyrre nogen dannet pellet.
  4. Supernatanten overføres til et nyt centrifugerør og ultracentrifuge en anden gang i 18 timer ved 100.000 x g ved 4 °C med korrekt balance.
  5. Isoler den resterende supernatant og passér gennem et 0,22 μm sprøjtefilter for at fjerne forurenende stoffer. Pipetter supernatanten i et 50 ml centrifugerør.
  6. Opbevar supernatanten i en -20 °C fryser, indtil det er nødvendigt eller op til 3 år.

3. Kaninangreb

  1. Skær toppen af en 10 ml sprøjte og læg voksen I. scapularis hunner ved hjælp af en standard pensel.
  2. Dæk sprøjteåbningen med sterilt gasbind (figur 1).
  3. Placer kaninen på en bordplade eller en arbejdsflade vandret; pakk kaninen tæt med et håndklæde og dæk begge øjne, og lad den forberedte kapsel (trin 1.1) udsættes for at angribe kaninen med flåter.
  4. Åbn kapslen, og indsæt flåter ved at skubbe til sprøjtehåndtaget. Indbetal flåterne tæt på kaninhuden. Luk kapsler hurtigt for at forhindre flåterne i at slippe ud.
  5. Ifølge det eksperimentelle design skal du lade de kvindelige flåter fodre så længe som nødvendigt. Lad ikke mandlig ixodes scapularis forblive i kapslen i mere end 24 timer for at undgå udtørring.
    BEMÆRK: Antallet af flåter, der skal inficeret i dyrene, er efter efterforskerens skøn. Denne protokol brugte ~ 100 flåter pr. Angreb for at tage højde for dødelighed og nok materiale til replikater. De indledende eksperimenter fastslog, at der var behov for mindst 20 flåter /replikater for at opnå nok materiale til sekventering af miRNA'erne.

4. Fjernelse af de fodrede hunner

  1. Placer de angrebne kaniner under 2% isofluran i ilt ved hjælp af en gasdiffusor. Indstil ilthastigheden mellem 700-1000 l / min.
    BEMÆRK: Andre anæstetika kan bruges til at undgå nød eller smerte.
  2. Fjern de fodrede hunner ved at gribe flåterne ved deres capitulum ved hjælp af fine tang, så tæt på huden som muligt. Sørg for, at munddelene fjernes helt for at undgå bakteriel infektion.
  3. Anbring flåterne i et 15 ml centrifugerør.
  4. Rengør bidstedet med 70% ethanol og tilsæt en lille mængde tredobbelt antibiotikum (fingerspidsværdi, se Materialetabel) for at forhindre infektion på flåtbidsstedet.
  5. Bær flåterne til laboratoriet for dissektioner (trin 5). Udfør disse dissektioner inden for 24-48 timer efter fjernelse af flåterne for at undgå nedbrydning af spytkirtlerne15,43.

5. Spytkirtel dissektion og ekstracellulær vesikelsekretion

  1. Der tilsættes 500 μL vesikelfrit medium (trin 2) med 5 μL 100x penicillin, 5 μL 100x streptomycin, 5 μL 10 mg/ml rifampicin og 5 μL 100x amphotericin til hver brønd (se materialetabel). Der tilsættes 1x PBS med rifampicin til alle brønde, der ikke indeholder vesikelfrit medium, for at forhindre bakterievækst.
  2. Placer flåterne på et klart mikroskopisk glasglas med dobbeltsidet tæppetape under et dissekeringsmikroskop. For at forhindre organudtørring tilsættes 10 μL 1x PBS til hvert kryds inden dissektion.
  3. Brug en 4 mm vannas saks (se Materialetabel) til at lave et lille snit på ~1 mm på siden af hver hun. Fjern helt den dorsale side af tæsken (figur 2) og fjern begge spytkirtler.
  4. Sæt 20-40 flåt spytkirtler i 500 μL vesikelfrit medium tilsat til en enkelt brønd i en 24-brønd vævskulturbehandlet plade (figur 3).
  5. Spytkirtelprøverne inkuberes ved 32 °C i 24 timer for at muliggøre udskillelsen af elbilerne.

6. Isolering af ekstracellulære vesikler

  1. Efter 24 timers inkubation pipetteres alt medium indeholdende spytkirtlerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Prøven centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter for at isolere spytkirtlerne. To faser adskilles i dette trin: (1) supernatanten indeholdende elbilerne og (2) spytkirtlerne (pellet).
  3. For at fortsætte isoleringen af elbilerne pipetteres supernatanten i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelleten indeholdende spytkirtlerne (trin 6.2) resuspenderes i 500 μL RNAlater (se materialetabel) og opbevares ved -80 °C, indtil den anvendes eller på ubestemt tid.
    BEMÆRK: Disse spytkirtler vil blive brugt til miRNA-isolering i trin 8.
  4. Supernatanten centrifugeres ved 2000 x g ved 4 °C i 10 minutter for at fjerne celleaffald. Pipetter supernatanten i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kassér pelleten.
  5. Supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne apoptotiske legemer og større elbiler. Kast pelleten, og pipetter supernatanten i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  6. Fastgør en 10 ml sprøjte til et 1 μm nylonsprøjtefilter. Placer sprøjten og filteret over et ultracentrifugerør (figur 4A). Derefter tilsættes prøven (figur 4B), og sprøjten fyldes med 10 ml 1x PBS (figur 4C), og røret afbalanceres i overensstemmelse hermed (figur 4D).
  7. Anbring rør i en 70Ti rotor (se materialetabel) og drej ved 100.000 x g i 18 timer ved 4 °C.
  8. Efter 18 timers ultracentrifugering observeres en pellet i den nedre ende af røret (figur 5). Pelleten er de koncentrerede ekstracellulære vesikler.
  9. Fjern 90%-100% af supernatanten uden at genoplive EV-pelleten. Resuspender pelleten med 1x PBS. Hvis ikke hele supernatanten kunne fjernes, skal du bruge den resterende supernatant til at genoplive pelleten.
  10. Pipetter 500 μL af EV-pelleten/supernatanten i et 300 K centrifugalfilter (se materialetabel).
    BEMÆRK: Dette fjerner eventuelle ikke-vesikelassocierede proteiner, miRNA'er og andre molekyler, mens vesiklerne ikke passerer gennem filteret.
  11. Centrifuger ved 8.000 x g i 10 minutter ved omgivelsestemperatur. Trin 6.10 gentages, indtil alle EV-pellets/supernatant har passeret gennem filteret.
  12. Der tilsættes 400 μL steriliseret 1x PBS til søjlen, og der blandes grundigt via pipette for at fjerne elbiler, der er fastgjort til membranen. Prøven anbringes i et 1,5 ml DNase-/RNase-frit rør. Prøverne kan opbevares ved -80 °C på ubestemt tid eller indtil de anvendes. Undgå overdreven optøning af prøver for at forhindre nedbrydning af prøven.
    BEMÆRK: Anbring rør på is, når de tages ud af ultracentrifuge for at forhindre nedbrydning af EV. Den endelige prøve vil være EV-pelleten i 400 μL 1x PBS. 25 μL af denne prøve vil blive anvendt til nanopartikelsporingsanalyse (NTA, trin 7) og 375 μL til miRNA-isolering (trin 8).

7. Analyse af nanopartikelsporing (NTA)

  1. Der udtages 25 μL af slutprøven (trin 6.12), og der tilsættes 375 μL 1x PBS.
  2. Læg den fortyndede prøve i en 1 ml nålefri sprøjte, og skru den tæt på NTA's optiske linse.
  3. Juster indstillingerne i overensstemmelse hermed, og optag videoer baseret på indstillingspræferencer.
    BEMÆRK: I den foreliggende undersøgelse blev der foretaget tre aflæsninger på hver 60 s. Hver NTA-aflæsning repræsenterer en teknisk replikat. Forskellige prøver fra krydsfodring i samme tidsrum repræsenterer individuelle biologiske replikater. Kameraet blev indstillet til niveau 7, og detektionstærsklen blev indstillet til niveau 5.
  4. Estimer de endelige EV-numre ved hjælp af følgende formel:
    ((udgangskoncentration af elbiler (fortyndingsfaktor)) * (samlet volumen tilbage i prøverøret)/1000) = samlede elektriske køretøjer i prøven
    BEMÆRK: Volumenet skal divideres med 1000, fordi NTA læser prøverne som koncentration / ml.

8. miRNA-ekstraktion fra spytkirtler og ekstracellulære vesikler

  1. Der tilsættes 100 μL lysisreagens (se materialetabel) til den resterende prøve fra trin 6.12 og homogeniseres med steriliserede pistiller (figur 6).
  2. Tilsæt de resterende 600 μL lysisreagens og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Tilsæt 140 μL chloroform, ryst kraftigt i 15 s, og inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
  4. Centrifugering ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  5. Pipetter den klare topfase, undgå interfase, i et nyt 1,5 ml rør. Dette vil resultere i ~ 525 μL af det forventede prøvevolumen. Derefter tilsættes et 1: 1 volumen ethanol af 100% molekylær kvalitet.
  6. Der tilsættes 700 μL af prøven i en RNA-isolationsspinkolonne (se Materialetabel).
  7. Spin ved 8.000 x g i 30 s ved omgivelsestemperatur, kassér gennemstrømning.
  8. Prøven vaskes med 700 μL RTE-buffer (se materialetabel), drejes ved 8.000 x g i 30 s, og gennemstrømningen kasseres.
  9. Prøven vaskes med 500 μL RPE-buffer (se materialetabel), drejes ved 8.000 x g i 30 s, og gennemstrømningen kasseres.
  10. Tilsæt 500 μL 80% ethanol af molekylær kvalitet og spin ved 8.000 x g i 2 minutter, kassér gennemstrømning.
  11. Drej søjlen med den maksimale hastighed i 5 minutter for at tørre membranen. Kassér opsamlingsrøret, og anbring søjlen på et nyt 1,5 ml mikrofugerør.
  12. Der tilsættes 14 μL RNase-/DNase-frit vand til membranen og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
  13. Centrifuger ved 21.000 x g i 1 min ved stuetemperatur.
  14. Der tilsættes 1 μL RNase-hæmmer (se materialetabel) til de eluterede miRNA'er, og der blandes godt via pipette.
    BEMÆRK: Før miRNA-ekstraktion fra spytkirtler fjernes enhver RNAlater ved tilsætning af 1 ml 1x PBS (1: 1 volumen) og spind ned spytkirtlerne ved maksimal hastighed i 15 minutter ved 4 ° C. Dette skal gentages tre gange, eller indtil spytkirtlerne er faldet nok til at fjerne supernatanten. På dette tidspunkt repræsenterer prøven en blanding af små RNA'er på ~ 20-150 bp i størrelse (supplerende figur 1).

9. Måling af miRNA-koncentration

  1. Mål koncentrationen af lille RNA via et kommercielt tilgængeligt RNA-assay kit41 (se materialetabel).
  2. I hvert rør blandes 199 μL fortyndingsbuffer (komponent A og B, der er angivet i sættet pr. prøve), 1 μL fluorescerende farvestof, der er specifikt for påvisning af miRNA'er (målebølgelængde 260 nm) (pr. prøve) og 2 μL lille RNA (trin 8) for hver prøve i henhold til producentens anvisninger.
  3. Før du læser prøverørene, skal du læse forfortyndet miRNA-standard 1 og standard 2 (angivet i sættet) for at skabe en standardkurve inden prøvemåling.
    BEMÆRK: Standarderne bruges som et sammenligningsværktøj til at bestemme den målte miRNA-koncentration i prøverne.
  4. Hvert standard- og prøverør anbringes i det dedikerede fluorometer (se materialetabel) for at måle koncentrationen som ng/μL.

10. Bestemmelse af miRNA-kvaliteten

  1. Bestem kvaliteten af miRNA og andre små RNA'er via gelelektroforese ved hjælp af en bioanalysator46 ved at følge producentens anvisninger (se materialetabel).
  2. Før prøveaflæsning normaliseres prøverne til at være den samme koncentration.
  3. Aflæs prøverne gennem en lille RNA-chip 41,46 ved at følge producentens anvisninger (se Materialetabel).
    BEMÆRK: For at bestemme miRNA-kvaliteten er de gellignende billeder (bånd) og elektroferogrammer (toppe) indikatorer for prøvekvaliteten. Jo mørkere båndet i gelen er, desto bedre er miRNA-kvaliteten. Jo lettere båndet (eller hvis der ikke er noget bånd til stede), jo dårligere er kvaliteten eller beviser prøveforringelse 46,47.

11. MikroRNA-berigelse

  1. Berig miRNA'et ved hjælp af et lille RNA-sekventeringssæt efter producentens anvisninger i det lille RNA-prøveforberedelsessæt (se Materialetabel).
  2. Ligat hver prøve med en 3 'adenyleret adapter og fjern overskydende adapter via perleoprydning. Tilføj derefter en 5 'adapter og fjern overskydende adapter ved en perleoprydning48.
    BEMÆRK: Både adaptere og perler til oprydning blev leveret i det lille RNA-sekventeringssæt fra afsnit 11.1 (se Materialetabel).
  3. For at syntetisere den første streng skal du forberede en masterblanding af prøverne ligeret med begge adaptere, RT-buffer og M-MuLV Reverse transkriptase, der findes i sættet (se Materialetabel). Derefter inkuberes blandingen i 30 minutter ved 42 °C og 10 minutter ved 90 °C. Opfølgning med en prøveoprydning som angivet i instruktionerne.
  4. Forstærk 1. streng ved hjælp af RT forward primer og reverse universal primer, der leveres i sættet (se Materialetabel) via en konventionel polymerasekædereaktion (PCR) i 2 minutter ved 95 °C, derefter i 12-25 cyklusser i 20 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 15 s ved 72 °C. Endelig 2 min ved 72 °C.
    BEMÆRK: PCR-produktstørrelsen forventes at være ~ 150 bp (figur 7).
  5. Mål kvaliteten af PCR-produktet via tapestation ved at følge producentens anvisninger (se Materialetabel).
  6. Sekventer prøverne ved hjælp af et næste generations sekventeringssystem (75 cyklusser) efter producentens anvisninger (se Materialetabel).
    BEMÆRK: For miRNA-berigelse skal prøvemængde og kvalitet kontrolleres (trin 9-10) inden bibliotekets forberedelse.

12. Bioinformatisk analyse

  1. Identificer de bevarede og unikke miRNA'er ved hjælp af et integreret applikationsværktøj til miRNA-identifikation.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev miRNA-identifikation udført via miRDeep249,50. miRDeep2 er et gratis online katalog over alle identificerede konserverede og nye miRNA'er, der findes i forskellige arter49,50 (se Materialetabel).
  2. Juster læsningerne til det tilsvarende genom ved hjælp af mapperen integreret med softwaren.
  3. Indtast følgende parametre i mappermodulet.
    1. Trim adaptersekvenserne tilføjet fra trin 11.2, og fjern sekvenser, der er mindre end 18 nukleotider lange. Fjern de overflødige læsesekvenser.
    2. Konverter filerne ved hjælp af parse til FASTA-formatparameter, kun hvis filen ikke er i FASTA-format49.
    3. Juster de filtrerede og trimmede sekvenser til det tilsvarende genom. Hvis der ikke er noget genom for arten af interesse, skal du justere til den nærmeste homologe art.
    4. Vis outputfilerne som "reads.fa" og "reads_vs_genome.arf". "Read.fa" vil kun indeholde de ikke-overflødige læsninger, og "reads_vs_genome.arf" vil omfatte de kortlagte læsninger, der er justeret til genomet.
  4. Brug begge outputfiler fra trin 12.2 til at udføre miRNA-ekspressionsprofilering ved hjælp af kvantifikatoren integreret med softwaren.
    1. Download arterne af interesse miRNA forløber sekvenser og de modne miRNA sekvenser fra miRBase 51,52,53,54,55,56. Hvis der ikke er nogen forløber eller modne sekvenser for arten af interesse, skal du downloade "hairpin.fa.gz" og "mature.fa.gz", der indeholder alle forstadier og modne sekvenser for alle de organismer, der er tilgængelige på miRBase.
    2. Fjern komprimering af filerne "hairpin.fa.gz" og "mature.fa.gz".
    3. Indtast filerne "reads.fa" og "read_vs_genome.arf" fra afsnit 12.3.4 og de ukomprimerede filer fra 12.4.2.
    4. Læs outputfilerne som "outputname.csv", "outputname.html" og "outputname.pdf". Outputfilnavnet kan indstilles i henhold til efterforskeren.
      BEMÆRK: Filen "outputname.csv" indeholder udtryksprofilerne. Specifikt vil ekspressionsprofilen have miRNA-id'et, summen af læsninger for alle prøver, der er kortlagt til miRNA'et, antallet af aflæsninger kortlagt til et specifikt miRNA for hver prøve og forløber-ID'et svarende til de modne miRNA'er. "Outputname.html" fra trin 12.4.4 vil indeholde links til University of Santa Cruz Genome Browser (USCS), National Center for Biotechnology Information (NCBI) og miRBase. USCS og NCBI vil indeholde forespørgselssekvenserne for de nuværende forløbere mod den ikke-redundante nukleotiddatabase, og miRBase vil have oplysningerne om den aktuelle miRNA-forløber. "Outputnavnet.pdf" vil have RNA-sekundærstrukturen af de miRNA'er, der udtrykkes, og justeringen af forløbersekvensen.
  5. For at identificere unikke og bevarede miRNA'er skal du bruge miRDeep2.
    1. Brug outputfilerne fra trin 12.3.4 og trin 12.4.2 som inputfiler.
      BEMÆRK: Outputfilerne, der læses som "outputname.html", indeholder forudsigelserne af de unikke og bevarede miRNA'er i prøven.
    2. Brug scorer >1 til miRNA-profilering og scorer >4 til yderligere eksperimentel analyse, såsom miRNA-hæmning og efterligning af endogene miRNA'er 34,36,57.
    3. Vælg og identificer de unikke miRNA'er fra miRbasen baseret på følgende: miRDeep2-score (trin 12.5.3), estimering af sand sandsynlighed (>90%), signifikant randfold p-værdi (<0,05)49,50,56.
      BEMÆRK: Bioinformatikanalysen blev udført via miRDeep2 i Cyverse Discovery Environment58,59, en gratis online platform til bioinformatikanalyse. De bevarede og unikke miRNA'er identificeret gennem miRDeep2 blev sammenlignet med alle arter fra miRbasen. Fremtidig miRDeep2-identifikation kan sammenlignes med det tilsvarende genom for arten af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nuværende protokol giver en detaljeret metode til at udtrække miRNA'er fra spytkirtler og elbiler. Ifølge resultaterne er denne protokol effektiv til isolering af miRNA fra voksne af to forskellige flåtarter, I. scapularis og R. microplus, og kan potentielt også anvendes i andre flåtarter. Ev'ernes koncentration (partikler/ml) blev målt via NTA. For R. microplus indeholdt hvert køn og livsstadium tre biologiske replikater målt i tre tekniske replikater. Prøverne blev adskilt efter køn og livsstadium (figur 8) for at vise variationen inden for hver prøve. Derefter blev prøverne kombineret for at vise variationen og statistiske forskelle ved hjælp af en tovejs ANOVA og Tukeys multiple sammenligningstest20 (p-værdi = < 0,05) (figur 9). Hver prøve bestod af ~ 40 spytkirtler dissekeret fra 20 kvinder, mænd og nymfer. Efter isolering og kvantificering af elbilerne blev prøverne anvendt til lille RNA-oprensning.

Koncentrationen af det lille RNA i hver prøve blev målt via Qubit (tabel 1), og kvaliteten blev målt via en bioanalysator ved hjælp af standard gelelektroforese46,47. Koncentrationerne er i nanogram (tabel 1) i et volumen på 14 μL for begge flåtarter. Den gennemsnitlige total af små RNA-koncentrationer fra I. scapularis-organer varierede fra 45,92-6,356 ng. RNA-koncentrationen af I. scapularis vesikler varierede fra 72,24-2,128 ng. For R. microplus varierede organkoncentrationen fra 259-2.142 ng, og vesiklerne varierede fra 59,22-1.848 ng. Prøverne blev normaliseret til samme koncentration, og deres kvalitet blev derefter målt via en bioanalytiker (figur 10). En referencestige blev brugt i gelen som markør til kvalitetsvurdering. Båndets integritet, intensitet og toppe var repræsentanter for potentiel nedbrydning eller total koncentration i hver prøve. Bånd svarende til 5 s og 5,8 s ribosomale RNA'er var kun til stede i spytkirtelorganprøverne (figur 10, baner A-D) og fraværende i vesiklen fra spytkirtelprøverne (figur 10, baner E, F), hvilket viser forskellene i små RNA-profiler mellem organer og ekstracellulære vesikler. Prøvenedbrydning blev udledt af fraværet af bånd i gelen; dette betød, at der var signifikant prøveforringelse. Det anbefales, at prøver med betydelig nedbrydning kasseres.

For at demonstrere tilstedeværelsen af miRNA-prøver i præparaterne blev små RNA-cDNA-biblioteker fremstillet ud fra RNA-prøver, der er blevet opbevaret i 3-4 måneder efter lille RNA-isolering. Mærkeligt nok blev der fundet højere prøvenedbrydning i disse prøver. Banerne A-D og G viste tegn på nedbrydning; tværtimod viste E, F og H-K minimal nedbrydning og tilstrækkelig koncentration til miRNA cDNA-biblioteksforberedelse (supplerende figur 1). Kun en prøve blev nedbrudt, da prøverne blev brugt umiddelbart efter rensning (figur 10), hvilket tyder på, at miRNA-prøver var mere tilbøjelige til nedbrydning, når de blev renset fra elbiler. Således blev prøve E, F, H og I udvalgt til berigelsesanalyse. Stjernerne viser båndstørrelserne på ~ 150 bp, som var de forventede størrelser efter cDNA-biblioteksforberedelse (figur 7). De nederste svage bånd angiver primerdimeren.

Under EV-isolering kan centrifugeringshastigheden og tiden påvirke den endelige EV-koncentration. Ved pipettering af EV-pelleten i 300 k-søjlerne, som tidligere nævnt i trin 6.10, er et lavt volumen og hastighed afgørende for at forhindre elbiler i at passere gennem membranen. Tidligere undersøgelser viste, at 700 μL ved 12.000 x g i 20 minutter ved anvendelse af en anden centrifugalkoncentrator var tilstrækkelig til korrekt adskillelse af elbiler fra de opløselige proteiner20; imidlertid blev lave EV-koncentrationer vist i NTA ved hjælp af et andet filter. Derfor er optimering af filtre og andre tilgængelige materialer afgørende. Ved første brug af 300 k-kolonnerne blev forskellige hastighedsintervaller testet for at bestemme, hvilken der gav den højeste EV-koncentration. Antallet af vesikler, der går tabt under centrifugering, blev målt ved NTA-analyse; det blev konkluderet, at lavere hastigheder resulterede i højere vesikelkoncentration i gennemstrømningen (ikke vist). Det blev konkluderet, at 500 μL ved 6.000-8.000 x g var tilfredsstillende til at isolere elbilerne. Når dette var bestemt, blev denne protokol brugt til at isolere vesikler fra I. scapularis og R. microplus. Koncentrationen af vesikler isoleret fra hver flåtart blev målt via NTA (figur 8). EV-koncentrationerne varierede mellem 7,07 x 107 til 7,94 x 109 partikler / ml. EV-mængden korrelerede med miRNA-koncentrationerne, hvor den større mængde EV resulterede i en højere koncentration af miRNA ekstraheret.

Figure 1
Figur 1: 1 ml nåleløse sprøjter fyldt med kvindelig voksen I. scapularis og dækket med steriliseret gaze. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Den dorsale side af en engorged kvinde blev fjernet med 4 mm vannas saks. Kvinden blev nedsænket i 1x PBS for at forhindre organudtørring. De gule pile peger på de udsatte spytkirtler. Figuren blev taget ved 50x forstørrelse med en objektiv linse i høj opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: En cellekulturplade efter en inkubationstid på 24 timer ved 32 °C. Den første række brønde indeholder de vesikelfrie medier og dissekerede spytkirtler. Resten af brøndene indeholder 1x PBS med Rifampicin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: En prøveforberedelsesproces for en ultracentrifugecyklus. (A) En 10 ml nålefri sprøjte toppet med et 1 μm sprøjtefilter. (B) Supernatanten pipetteres efter tre centrifugeringsrunder i sprøjten. (C) Resten af sprøjten fyldes til 10 ml med 1x steriliseret PBS. (D) Sprøjten er dækket, og supernatanten med 1x PBS filtreres ind i ultracentrifugerøret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Efter 18 timers ultracentrifugering dannes en pille af ekstracellulære vesikler i bunden af ultracentrifugerøret.

Figure 6
Figur 6: En steriliseret pistil bruges til at homogenisere spytkirtelorganer og de ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: En gelelektroforese målt via båndstation, der viser miRNA-præpederede biblioteker efter en berigelsesanalyse. Prøverne fra kvindelige R. microplus spytkirtelorganer og elbiler var baseret på minimal nedbrydning og tilstrækkelig miRNA-koncentration til cDNA-biblioteksyntese. Stigen (L) viser referencepunkterne i nukleotider og de øvre og nedre markører. Stjernerne angiver båndene af størrelsesprodukt ~ 150 bp, hvilket betyder de små RNA cDNA-biblioteker. De nederste bånd viser primer dimer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Et repræsentativt tal for variationen mellem de biologiske replikater (A) hunner, (B) hanner og (C) nymfer. X-aksen viser EV-størrelsen (nm), og y-aksen viser EV-koncentrationen (partikler / ml). En tovejs ANOVA og Tukeys sammenligningstest viste statistiske forskelle (P-værdi = < 0,05). Fejllinjerne repræsenterer standardfejlen for at tage højde for variation. Hver prøve indeholdt 20 flåter med tre biologiske replikater. Prøverne blev registreret for 60 s, tre gange hver. Kameraet blev indstillet til niveau 7, og detektionstærsklen blev indstillet til niveau 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Et repræsentativt tal for variationen for alle kombinerede biologiske replikater for nymfer (rød), hunner (blå) og hanner (sort). X-aksen viser EV-størrelsen (nm), og y-aksen viser EV-koncentrationen (partikler / ml). En tovejs ANOVA og Tukeys sammenligningstest viste statistiske forskelle (P-værdi = < 0,05). Fejllinjerne repræsenterer standardfejlen for at tage højde for variation. Hver prøve indeholdt 20 flåter med tre biologiske replikater. Stjernerne symboliserer en signifikant forskel på p < 0,05. Hver optagelse blev udført i 60 s, tre gange hver. Kameraet blev indstillet til niveau 7, og detektionstærsklen blev indstillet til niveau 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: En repræsentativ gel via bioanalysatoren. Gelelektroforesen blev udført ved hjælp af en basisstige som reference. En moden miRNA-sekvens er ~ 18-22 nt lang, hvor svage bånd vises i det angivne størrelsesområde. Andre små RNA'er, såsom små nukleare RNA'er, transfer-messenger RNA'er og regulatoriske RNA'er, er også til stede i prøverne. Størrelserne på de små RNA'er varierede fra ~ 20-150 nt. Prøverne varierer fra flåtarter, væv og køn. For bane G viser et eksempel på prøveforringelse ingen bånd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: En gelelektroforese blev målt via bioanalysatoren, der viste de ekstraherede miRNA'ers kvalitet fra R. microplus kvindelige spytkirtelorganer og elbiler. Stigen (L) viser referencestørrelserne i nukleotider, hvor modne miRNA'er måler ~18-22 nt i længden. Banerne A-D og G viser nedbrydning, og bane E, F og H-K viser minimal nedbrydning. Klik her for at downloade denne fil.

Art Køn Orgel/ Vesikel EV koncentration miRNA-koncentration (ng)
R. mikroplus Kvindelig Orgel Nielsen 259
R. mikroplus Kvindelig Orgel Nielsen 2,142
R. mikroplus Kvindelig Vesikel 1.64 E+08 59.22
R. mikroplus Kvindelig Vesikel 1.64 E+09 1,848
I. scapularis Kvindelig Orgel Nielsen 45.92
I. scapularis Kvindelig Orgel Nielsen 6,356
I. scapularis Kvindelig Vesikel 1,73E+08 65.66
I. scapularis Kvindelig Vesikel 3.14 E+09 2,128

Tabel 1: Et eksempel på miRNA-koncentrationerne for både spytkirtler og ekstracellulære vesikler. Kolonnen af miRNA-koncentrationer repræsenterer de laveste til højeste koncentrationer for hver flåtart.

mikroRNA I. scapularis I. Ricinus R. mikroplus H. langicornis Referencer
MiR-8 En P P P 33, 36, 37, 43
MiR-71 P P P En 33, 36, 37, 43
MiR-279 P En En P 33, 36, 37, 43
lad-7 En P P P 33, 36, 37, 43

Tabel 2: De konserverede miRNA'er i forskellige flåtarter. (P) angiver, at miRNA'et almindeligvis blev udtrykt eller til stede, og (A) betyder, at miRNA'erne ikke blev udtrykt eller påvist.

Prøve type Antal scoringer >1* Antal scoringer >4γ Antal bevarede Antal romaner
Mandlig 17 0 48,885 23
Kvindelig 25 0 48,885 21
Nymfer 38 0 48,885 38

Tabel 3. De konserverede og unikke miRNA'er blev påvist i elbilerne for R. microplus hunner, hanner og nymfer. *miRNA-score, der bruges til profilering. γmiRNA-score, der bruges til funktionelle eksperimenter.

Supplerende tabel 1: En tabel, der viser næste generations sekventeringsresultaterfor R. microplus-mænds elbiler udskilt fra spytkirtler. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: En tabel, der viser næste generations sekventeringsresultaterfor R. microplus kvindelige elbiler udskilt fra spytkirtler. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: En tabel, der viser næste generations sekventeringsresultaterfor R. microplus nymfe-elbiler udskilt fra spytkirtler. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol giver en detaljeret metode til ekstraktion af miRNA fra spytkirtler og elbiler. Der er dog vigtige overvejelser, som alle er beskrevet i noterne for hvert afsnit i denne protokol. Kapslen og netmaskernet skal sikres under krydsfodring for at forhindre flåter i at slippe ud. Kapselpræparatet og placeringen er beskrevet i Koga et al.40. Flere replikater af flåtdissektionerne skal udføres, hvis en uegnet prøve kasseres. Derudover kan flere udfordringer være til stede, når man bruger EV-isoleringsteknikker fra flåtvæv 18,20,43. For eksempel skal væv holdes fugtigt under dissektion for at undgå udtørring. Dette gøres ved at tilføje PBS under hele dissektionen. Både PBS og medier, der anvendes til dissektion og dyrkning af organerne, bør vedligeholdes med antibiotika for at undgå bakteriel forurening fra flåtmikrobiomet. Disse bør omfatte antibiotika, der er målrettet mod gramnegative og grampositive bakterier, da begge kan findes i flåtvæv60. Ligeledes skal man sørge for under dissektion at mindske forurening med væv fra andre organer. Således skal dissektioner udføres langsomt, og efterhånden som brugeren får erfaring, kan flere flåter dissekeres. Endelig, fordi elbiler udskilles fra alle celler, inklusive patogeninficerede celler, skal krydsundersøgelser, der udfører EV-isolering, bruge EV-fri medier og buffere for at undgå kryds-EV-forurening25,61.

Ikke desto mindre giver denne protokol mulighed for at reducere antallet af flåter, der er nødvendige for at producere flåt spyt elbiler. Tidligere protokoller krævede salivation af et betydeligt større antal flåter. For eksempel havde miRNA'er udskilt i spyt-elbiler i Haemaphysalis longicornis brug for spytdannelse af 2.000 voksne flåter43. Dette kan være ekstremt dyrt for laboratorier, der mangler kapacitet til at opdrætte flåter. Tilsvarende blev Amblyomma maculatumvæv , der blev anvendt til EV-isolering, delvist frosset før isolering og behandlet med 75 U / ml collagenase type 3, hvilket kunne påvirke ægtheden af EV-sekretionen19. Endvidere krævede disse undersøgelser 80-100 par spytkirtler18.

Til sammenligning kan denne protokol anvendes på flere flåtarter og kræver et lavt antal flåter for at isolere elbiler og udtrække kvalitetsbevarede og nye miRNA'er (tabel 2)33,36,37,43. MiRNA-koncentrationerne varierede meget, men var tilstrækkelige til næste generations sekventering (tabel 3 og supplerende tabel 1-3). Denne protokol kan justeres til at rumme en større prøvestørrelse, hvis der er behov for større miRNA-koncentrationer. Materialer, der anvendes i denne protokol, kan også erstattes afhængigt af materialetilgængelighed. Prøvevolumen og centrifugeringshastighed skal dog justeres i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger for de anvendte sæt og kolonner.

En ulempe ved denne metode er, at miRNA'er og elbiler let kan nedbrydes gennem ekstraktions- og isoleringstrinnene. Derfor skal protokollen udføres hurtigt og effektivt. Når det er angivet, skal prøverne opbevares på is, og miRNA-ekstraktionen skal udføres i et steriliseret miljø. Derudover kan en RNase-behandling udføres på de isolerede elbiler for at eliminere store RNA'er, der er fastgjort til EV-membranen. Dette kan forhindre store RNA'er i at forurene prøven under miRNA-ekstraktioner. Endelig er tilsætning af en RNAse-hæmmer til miRNA-prøven efter isolering fra elbiler eller organer en vigtig forebyggende foranstaltning til nedbrydning. Denne protokol kan ændres og anvendes parallelt med eksperimentets mål, der udføres.

Fremtidige anvendelser til denne protokol kan omfatte undersøgelse af patogen-vektorinteraktioner for at forstå, hvordan patogener påvirker miRNA og anden genomisk last inden for flåtspyt-elbiler. Ligeledes kan denne protokol definere specifikke proteiner og cellulære processer, der er involveret i emballering af miRNA'er i flåt-elbiler, og den specifikke effekt, disse elbiler og miRNA'er har på sårheling og immunrespons. På grund af den stigende krydsresistens over for acaricider er der et desperat behov for unikke kontrolmetoder. Elbiler har potentiale for en alternativ kontrolmetode sammenlignet med acaricider. Elbiler kan bruges som nanotransportører i terapeutiske applikationer 18,23,61. Hos mennesker er elbiler, der transporterer miRNA'er, blevet brugt til at undertrykke tumorvækst under kræftimmunterapi62,63. Tilsvarende kan elbiler i flåter bære genetisk modificerede miRNA'er, der har vist sig at påvirke vitale krydsbiologiske funktioner og patogenoverførsel 36,57,64. Den fremtidige retning er at bruge denne protokol til at bestemme miRNA-profilerne for flere flåtarter for at identificere miRNA'er af interesse for funktionelle undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for hjælpen fra Cattle Fever Tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vil gerne takke Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado og Homer Vasquez. Vi vil også gerne anerkende hjælpen fra Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario og Stephanie Guzman Valencia gennem hele projektet. Vi vil gerne takke Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group for deres hjælp og råd under skrivningen af dette manuskript. Følgende reagenser blev leveret af Centers for Disease Control and Prevention til distribution af BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvindelige I. scapularis flåter blev også modtaget fra Tick Rearing Facility ved Oklahoma State University. Dette projekt blev finansieret af Texas A&M University T3: triads for transformationstilskud og samarbejdsaftalen #58-3094-1-003 af USDA-ARS til AOC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
  2. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
  3. de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
  4. Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , Elsevier. 603-672 (2019).
  5. Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
  7. Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
  8. Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
  9. Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
  10. Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
  11. Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
  12. Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
  13. Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
  14. Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
  15. Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
  16. Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
  17. Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
  18. Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
  19. Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
  20. Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  21. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  22. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  23. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  24. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
  25. Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
  26. Chávez, A. S. O., O'Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
  27. Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
  28. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  29. Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
  30. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  31. Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
  32. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  33. Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
  34. Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
  35. Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
  36. Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
  37. Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
  38. Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
  39. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. Proteomic Profiling. , Springer. 179-209 (2015).
  40. Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
  41. Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  42. Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
  43. Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
  44. Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
  45. Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
  46. Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
  47. Tissot, C. Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Agilent Technologies. , Palo Alto, Calif, USA. Available from: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-7870EN.pdf (2008).
  48. Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
  49. Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
  50. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
  51. Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl_1 109-111 (2004).
  52. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl_1 140-144 (2006).
  53. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl_1 154-158 (2007).
  54. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 152-157 (2011).
  56. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
  57. Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
  58. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
  59. Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
  60. Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
  61. Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
  62. Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
  63. Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
  64. Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).

Tags

Biologi udgave 182 ekstracellulære vesikler mikroRNA'er tick-host interface flåter
Isolering af mikroRNA'er fra Tick <em>Ex Vivo</em> spytkirtelkulturer og ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, … More

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter