Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av mikroRNA fra Tick Ex Vivo spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63618
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

Denne protokollen beskriver isoleringen av mikroRNA fra flåttspyttkjertler og rensede ekstracellulære vesikler. Dette er en universell prosedyre som kombinerer ofte brukte reagenser og forsyninger. Metoden tillater også bruk av et lite antall flått, noe som resulterer i mikroRNA av høy kvalitet som lett kan sekvenseres.

Abstract

Ticks er viktige ektoparasitter som kan vektorere flere patogener. Spyttkjertlene i flått er avgjørende for fôring, da spyttet inneholder mange effektorer med farmasøytiske egenskaper som kan redusere vertsimmunresponser og forbedre patogenoverføringen. En gruppe slike effektorer er mikroRNA (miRNA). miRNA er korte ikke-kodende sekvenser som regulerer vertsgenuttrykk ved tick-host-grensesnittet og i flåttens organer. Disse små RNA-ene transporteres i flåttspytt via ekstracellulære vesikler (EV), som betjener inter- og intracellulær kommunikasjon. Vesikler som inneholder miRNA har blitt identifisert i spytt av flått. Imidlertid er lite kjent om rollene og profilene til miRNA i flåttspyttblærene og kjertlene. Videre krever studiet av vesikler og miRNA i flåttspytt kjedelige prosedyrer for å samle flåttspytt. Denne protokollen tar sikte på å utvikle og validere en metode for å isolere miRNA fra rensede ekstracellulære vesikler produsert av ex vivo organkulturer. Materialene og metodikken som trengs for å trekke ut miRNA fra ekstracellulære vesikler og flåttspyttkjertler er beskrevet her.

Introduction

Flått er ektoparasitter som vektor mange patogener til dyreliv, husdyr, mennesker og deres kjæledyr 1,2. Flåttfôring resulterer i betydelig økonomisk tap ved å forårsake skade på skjul, redusere vekt og melkeproduksjon på grunn av alvorlig anemi, og overføring av potensielt dødelige sykdomsfremkallende patogener 1,3,4,5. Nåværende kontrollpraksis for håndtering av flåttpopulasjoner er fokusert på bruk av akaricider. Likevel har den kontinuerlige fremveksten av akaricidresistens i flått som parasiterer husdyr 5,6, den økte forekomsten av flåttbitt7 og patogenoverføring i boligområde 8,9, ført til et behov for unike flåttkontrollalternativer.

Flåttspyttkjertlene er essensielle organer som sikrer flåttens biologiske suksess. De dannes av forskjellige acinustyper (I, II, III og IV) med ulike fysiologiske funksjoner. Spyttkjertlene er ansvarlige for osmoregulering, både av og på verten, ved å returnere vannoverskudd og jerninnhold til verten via salivasjon 2,10. Type I acini er også involvert i opptak av vann fra atmosfæren ved sekresjon av hygroskopisk spytt10,11. Spytteffektorproteiner, som sement og cystatiner, produseres i sekretoriske celler i type II og III acini10,12. Type I acini påvirker ikke flåttfôring, noe som indikerer at blodmelinntaket ikke utløser morfologiske og fysiologiske endringer i disse acini type13,14. På den annen side aktiveres Acini type II og III under fôring og har svært liten aktivitet før festing. Dermed er fôring nødvendig for å utløse utvidelsen av sekretoriske celler innenfor type II acini og produksjon av bioaktive forbindelser. Type III acini reduseres i størrelse under fôring på grunn av sekresjonen i sekretoriske granulater12.

Spyttkjertlene er også stedet for patogeninfeksjon i krysset og overføringsveien. Under fôring utskiller flått flere forbindelser med farmasøytiske effekter som er nødvendige for vellykket gjennomføring avblodmelet 10,15,16. Disse forbindelsene har antiinflammatoriske, immunsuppressive og vasodilatoriske egenskaper 10,15,17. Nylige studier har vist at ekstracellulære vesikler (EV) avledet fra flåttspyttkjertler har flere av disse forbindelsene, noe som induserer antiinflammatoriske og immunmodulerende effekter 18,19,20. "Ekstracellulære vesikler" er et paraplybegrep som brukes til å beskrive vesikler klassifisert som eksosomer og mikrovesikler basert på deres størrelse og biogenese. Samlet sett er elbiler lipidblester med dobbeltlagsmembraner som er ~ 40 nm-1 μm i størrelse21; Generelt er eksosomer beskrevet som 40-150 nm i størrelse, mens mikrovesikler er mellom 150 nm-1 μm i størrelse 21,22,23. Størrelsen er imidlertid ikke en indikasjon på elbilens biogenesebane22.

Biogenesen av eksosomer starter med sekvensiell invaginering av plasmamembranen. Denne invaginasjonen fører til dannelsen av multivesikulære legemer og resulterer til slutt i deformasjon av vesikulærmembranen ved virkningen av ESCRT-komplekser eller sfingomyelinaser (sMases)24,25. Eksosomene kan enten lyses i lysosomene for å opprettholde cellulær homeostase eller gå ut via vesikulær fusjon til plasmamembranen for å levere cellulære bestanddeler til mottakercellene21,24. På den annen side dannes mikrovesikler ved virkningen av flopasses og flipasses, og endrer konformasjonen av lipider i plasmamembranen26. Elbiler er avgjørende for celle-til-celle-kommunikasjon, og fungerer som et transportsystem for intracellulær last, for eksempel lipider, proteiner, nukleinsyrer og mikroRNA (miRNA)21,27,28. Når de er transportert, leverer disse vesiklene lasten sin inn i cytoplasmaet til mottakercellene, og genererer fenotypiske endringer i mottakscellen22,29. På grunn av viktigheten av ekstracellulære vesikler i kryssfôring og manipulering av vertsimmun- og sårhelingsresponser18,20, presenterer lasten i ekstracellulære vesikler potensielle mål for utvikling av anti-tick-terapi og en unik mekanisme for å forstyrre kryssfôring. Dette inkluderer miRNA i flåttspyttkjertler og spyttkjertelavledede ekstracellulære vesikler.

miRNA er korte ikke-kodende sekvenser, ~18-22 nukleotid (nt) i lengde, som etter transkripsjonelt kan regulere, degradere eller dempe mRNA-sekvenser30,31. Under transkripsjon spaltes pri-miRNA av Dicer (RNA-polymerase III) for å danne en særegen hårnålslignende struktur, og blir et pre-miRNA. Pre-miRNA kuttes igjen av Drosha (RNA-polymerase III) for å danne en moden miRNA-dupleks. Den modne sekvensen blir integrert i det RNA-induserte silencingkomplekset (RISC) komplementært til mRNA-sekvensen, noe som forårsaker translasjonsundertrykkelse eller mRNA-nedbrytning 28,30,32. Under vertsfôring kan miRNA i flåttspytt modulere vertsgenuttrykk for å undertrykke immunresponser og forbedre patogenoverføring 33,34,35,36,37. Selv om det finnes omfattende studier på elbiler og miRNA-er, er deres roller under fôring ved tick-host-grensesnittet fortsatt dårlig forstått. Optimalisering av protokoller som lett kan resultere i isolering og rensing av miRNA av høy kvalitet er avgjørende for å fremme vår kunnskap om disse emnene.

Flere alternativer kan brukes til å isolere elbiler, for eksempel ultrasentrifugering, eksosomutfelling, polymerutfelling, immunoaffinitetskromatografi og størrelsesbaserte eksklusjonsteknikker38. Imidlertid kan disse teknikkene ikke skille mellom eksosomer eller mikrovesikler. Således, som nevnt tidligere, brukes EV som et paraplybegrep når du isolerer elbiler fra forskjellige prøver. Vesiklene isolert i forsøkene beskrevet her representerer en blanding av vesikler avledet fra forskjellige biogeneseveier. Ytterligere rensing av en spesifikk populasjon av ekstracellulære vesikler kan oppnås ved immunprecipitasjon ved bruk av perler belagt med antistoffer mot markører (dvs. eksosomale markører, tumormarkører) som er unike for vesikkelpopulasjonen av interesse39,40. miRNA kan også ekstraheres via forskjellige kommersielt tilgjengelige isolasjonssett 7,41,42.

Målet med dette prosjektet var å utvikle en protokoll som kombinerer vanlige metoder for å isolere elbiler og trekke ut miRNA fra både elbiler og spyttkjertler. Fordi sekresjonen av bioaktive forbindelser aktiveres ved å mate12, bør flått få lov til å mate for å identifisere miRNA som kan være viktige for å manipulere vertens immun- og sårhelingsresponser. Den nåværende protokollen krever et lite antall flått (20 flått) for å isolere elbiler og deres respektive miRNA, sammenlignet med andre tidligere beskrevne studier som krevde 2000 flått43. Videre unngår det forurensning av spyttsekretjoner med pilokarpin44, noe som kan påvirke eksperimenter som studerer effekten av EV og deres miRNA på vertsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført etter dyrebruksprotokoll (AUP # 2020-0026) godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (AICUC) ved Texas A &M University. Flåttartene Ixodes scapularis og Rhipicephalus (Boophilus) microplus, og New Zealand Male White Rabbits, 42-72 dager gamle, ble brukt i denne studien. I. scapularis ble mottatt fra Center for Disease Control (CDC) og Oklahoma State University, sertifisert som patogenfri. R. microplus ble oppdrettet ved Cattle Fever Tick Research Laboratory i Edinburg, Tx. Kaninene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell). Denne protokollen kan universelt isolere ekstracellulære vesikler og miRNA fra forskjellige flåttarter, livsstadier og vev.

1. Oppdrett av kvinnelig I . scapularis og kapselpreparat

  1. Forbered en etylen-vinylacetat skumkapsel etter prosedyrene for harde flåttfôrende kaniner45. Plasser en kapsel på hvert skulderblad på kaninen for totalt to kapsler per angrep.
    MERK: Kort sagt, disse kapslene består av to firkanter av etylen-vinylacetatskum med et innvendig tomt rom. En firkant limes på baksiden av dyret (i dette tilfellet kaniner) med et vevlim (se Materialtabell). Fint nett limes til den andre firkanten for å unngå rømning av flått. De to rutene lukkes med selvklebende kroktape.
  2. La kapslene stivne i 24 timer før kapselen festes på kaninene. Oppbevar skumkapslene ved romtemperatur.
    MERK: Kapslene kan oppbevares på ubestemt tid ved romtemperatur.
  3. Fest kapselen til barberte kaniner og la stå i 24 timer før flåttinfeksjon.

2. Fremstilling av vesikkelfrie medier

  1. For å forberede vesikkelfrie medier13, kombiner 0,5 ml føtalt bovint serum, 0,5 ml tryptosefosfatbuljong, 0,1 ml 10% lipoproteinkolesterolkonsentrat, 0,5 ml 5% natriumbikarbonat (NaHCO3), 0,25 ml 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) og 8,125 ml L15C300 medium (se materialtabell). Juster volumet på mediet etter behov. Plasser mediet i en 26,3 ml polykarbonat sentrifugeflaske.
  2. Balanser flaskene med en vektforskjell på maksimalt 0,01 g for å sikre at ultracentrifugen fungerer som den skal.
  3. Ultracentrifuge mediet i 18 timer ved 100 000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten via pipette, og sørg forsiktig for ikke å forstyrre pellet som dannes.
  4. Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør og ultracentrifuge en gang til i 18 timer ved 100 000 x g ved 4 °C, med riktig balanse.
  5. Isoler den gjenværende supernatanten og pass gjennom et 0,22 μm sprøytefilter for å fjerne forurensninger. Pipetter supernatanten i et sentrifugerør på 50 ml.
  6. Oppbevar supernatanten i en -20 °C fryser ved behov eller opptil 3 år.

3. Kaninangrep

  1. Klipp toppen av en 10 ml sprøyte og legg voksne I. scapularis kvinner med en standard pensel.
  2. Dekk sprøyteåpningen med sterilt gasbind (figur 1).
  3. Plasser kaninen på en bordplate eller en arbeidsflate horisontalt; Pakk kaninen tett med et håndkle og dekk begge øynene, slik at den tilberedte kapselen (trinn 1.1) blir utsatt for å angripe kaninen med flått.
  4. Åpne kapselen og sett inn flått ved å trykke på sprøytehåndtaket. Sett flåttene nær kaninhuden. Lukk kapslene raskt for å forhindre at flåttene slipper ut.
  5. Ifølge den eksperimentelle designen, la de kvinnelige flåttene mate så lenge som nødvendig. Ikke la hannen Ixodes scapularis forbli i kapselen i mer enn 24 timer for å unngå uttørking.
    MERK: Antall flått som skal infiseres i dyrene er etter etterforskerens skjønn. Denne protokollen brukte ~ 100 flått per angrep for å redegjøre for dødelighet og nok materiale til replikasjoner. De foreløpige forsøkene fastslo at minst 20 flått/replikasjon var nødvendig for å skaffe nok materiale til sekvensering av miRNA.

4. Fjerning av de matede kvinnene

  1. Plasser de infiserte kaninene under 2% isofluran i oksygen ved hjelp av en gassdiffusor. Still oksygenhastigheten mellom 700-1000 l / min.
    MERK: Andre bedøvelsesmidler kan brukes til å unngå nød eller smerte.
  2. Fjern de matede hunnene ved å gripe flåttene ved deres capitulum, ved hjelp av fine tang, så nær huden som mulig. Sørg for at munndelene er helt fjernet for å unngå bakteriell infeksjon.
  3. Plasser flåttene i et 15 ml sentrifugerør.
  4. Rengjør bittstedet med 70% etanol og tilsett en liten mengde trippel antibiotika (fingertupp verdt, se materialtabell) for å forhindre infeksjon på flåttbittstedet.
  5. Bær flåtten til laboratoriet for disseksjoner (trinn 5). Utfør disseksjonene innen 24-48 timer etter fjerning av flått for å unngå nedbrytning av spyttkjertlene15,43.

5. Spyttkjerteldisseksjon og ekstracellulær vesikkelsekresjon

  1. Tilsett 500 μL vesikkelfritt medium (trinn 2) med 5 μL 100x penicillin, 5 μL 100x streptomycin, 5 μL 10 mg/ml rifampicin og 5 μL 100x amfotericin til hver brønn (se materialtabell). Tilsett 1x PBS med rifampicin til brønner som ikke inneholder vesikkelfritt medium for å forhindre bakterievekst.
  2. Plasser flåttene på et klart mikroskopisk glassglass med dobbeltsidig teppetape under et dissekeringsmikroskop. For å forhindre organtørking, tilsett 10 μL 1x PBS til hvert kryss før disseksjon.
  3. Bruk 4 mm vannas saks (se Materialtabell), gjør et lite snitt på ~ 1 mm på siden av hver kvinne. Fjern den dorsale siden av flåtten helt (figur 2) og fjern begge spyttkjertlene.
  4. Sett 20-40 flåttspyttkjertler i 500 μL vesikkelfritt medium tilsatt til en enkelt brønn i en 24-brønns vevskulturbehandlet plate (figur 3).
  5. Inkuber spyttkjertelprøvene ved 32 °C i 24 timer for å tillate sekresjon av elbilene.

6. Isolering av ekstracellulære vesikler

  1. Etter 24 timers inkubasjon pipetterer du alt mediet som inneholder spyttkjertlene i et mikrosentrifugerrør på 1,5 ml.
  2. Sentrifuger prøven ved 300 x g ved 4 °C i 10 minutter for å isolere spyttkjertlene. To faser vil bli separert i dette trinnet: (1) supernatanten som inneholder elbilene og (2) spyttkjertlene (pellet).
  3. For å fortsette isoleringen av elbilene, pipetter supernatanten inn i et nytt mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Resuspender pelleten som inneholder spyttkjertlene (trinn 6.2) i 500 μL RNAlater (se materialtabellen) og oppbevar ved -80 °C til den er brukt eller på ubestemt tid.
    MERK: Disse spyttkjertlene vil bli brukt til miRNA-isolering i trinn 8.
  4. Sentrifuger supernatanten ved 2000 x g ved 4 °C i 10 minutter for å fjerne cellulært rusk. Pipetter supernatanten inn i et nytt mikrosentrifugerrør på 1,5 ml. Kast pelleten.
  5. Sentrifuger supernatanten ved 10 000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne apoptotiske kropper og større elbiler. Kast pelleten, og pipetter supernatanten inn i et nytt mikrosentrifugerrør på 1,5 ml.
  6. Fest en 10 ml sprøyte til et 1 μm nylon sprøytefilter. Plasser sprøyten og filteret over et ultracentrifugerør (figur 4A). Tilsett deretter prøven (figur 4B) og fyll sprøyten med 10 ml 1x PBS (figur 4C), og balanser røret tilsvarende (figur 4D).
  7. Plasser rørene i en 70Ti rotor (se materialtabell) og spinn ved 100 000 x g i 18 timer ved 4 °C.
  8. Etter 18 timer med ultrasentrifugering, observer en pellet i den nedre enden av røret (figur 5). Pelleten er de konsentrerte ekstracellulære vesiklene.
  9. Fjern 90%-100% av supernatanten uten å gjenopplive EV-pelleten. Resuspender pelleten med 1x PBS. Hvis ikke all supernatanten kunne fjernes, bruk den gjenværende supernatanten til å resuspendere pelleten.
  10. Pipetter 500 μL av EV-pelleten/supernatanten til et 300 K sentrifugalfilter (se materialtabell).
    MERK: Dette vil fjerne eventuelle ikke-vesikkelassosierte proteiner, miRNA og andre molekyler, mens vesiklene ikke vil passere gjennom filteret.
  11. Sentrifuge ved 8000 x g i 10 minutter ved omgivelsestemperatur. Gjenta trinn 6.10 til alle EV-pellets/supernatant har passert filteret.
  12. Tilsett 400 μL sterilisert 1x PBS i kolonnen og bland godt via pipette for å fjerne elbiler festet til membranen. Sett prøven i en 1,5 ml DNase-/RNase-fri slange. Prøvene kan lagres ved -80 °C på ubestemt tid eller til de brukes. Unngå overdreven prøvetining for å forhindre nedbrytning av prøver.
    MERK: Plasser rør på is når de tas ut av ultracentrifuge for å forhindre ev-nedbrytning. Den endelige prøven vil være EV-pelleten i 400 μL på 1x PBS. 25 μL av denne prøven vil bli brukt til nanopartikkelsporingsanalyse (NTA, trinn 7) og 375 μL for miRNA-isolasjon (trinn 8).

7. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA)

  1. Ta 25 μL av den endelige prøven (trinn 6.12) og tilsett 375 μL av 1x PBS.
  2. Legg den fortynnede prøven i en 1 ml nålfri sprøyte og skru godt fast på den optiske linsen til NTA.
  3. Juster innstillingene deretter og ta opp videoer basert på innstillingspreferanser.
    MERK: I denne studien ble det tatt tre avlesninger på 60 s hver. Hver NTA-lesing representerer en teknisk replikasjon. Ulike prøver fra flåttfôring over like lang tid representerer individuelle biologiske replikasjoner. Kameraet ble satt på nivå 7 og deteksjonsterskelen ble satt til nivå 5.
  4. Beregn de endelige EV-tallene med følgende formel:
    ((startkonsentrasjon av elbiler (fortynningsfaktor)) * (totalt volum igjen i prøverøret)/1000) = totale elbiler i prøven
    MERK: Volumet må deles på 1000 fordi NTA leser prøvene som konsentrasjon/ml.

8. miRNA ekstraksjon fra spyttkjertler og ekstracellulære vesikler

  1. Tilsett 100 μL av lysisreagenset (se Materialtabell) til den gjenværende prøven fra trinn 6.12 og homogeniser med steriliserte pestler (figur 6).
  2. Tilsett de resterende 600 μL av lysisreagenset og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
  3. Tilsett 140 μL kloroform, rist kraftig i 15 s og inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  4. Spinn ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  5. Pipetter den klare toppfasen, unngå interfase, i et nytt rør på 1,5 ml. Dette vil resultere i ~525 μL forventet prøvevolum. Deretter legger du til et 1: 1 volum 100% molekylær etanol.
  6. Tilsett 700 μL av prøven i en RNA-isolasjonsspinnkolonne (se Materialtabell).
  7. Spinn ved 8000 x g i 30 s ved omgivelsestemperatur, kast gjennomstrømningen.
  8. Vask prøven med 700 μL RTE-buffer (se materialtabell), spinn ved 8 000 x g i 30 s, kast gjennomstrømningen.
  9. Vask prøven med 500 μL RPE-buffer (se materialtabell), spinn ved 8 000 x g i 30 s, kast gjennomstrømningen.
  10. Tilsett 500 μL 80% etanol av molekylær kvalitet og spinn ved 8000 x g i 2 minutter, kast gjennomstrømningen.
  11. Spinn kolonnen med maksimal hastighet i 5 minutter for å tørke membranen. Kast oppsamlingsrøret og plasser kolonnen på et nytt mikrofugerør på 1,5 ml.
  12. Tilsett 14 μL RNase-/DNase-fritt vann til membranen og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
  13. Sentrifuge ved 21 000 x g i 1 min ved romtemperatur.
  14. Tilsett 1 μL RNase-hemmer (se materialtabell) til de eluterte miRNA-ene og bland godt via pipette.
    MERK: Før miRNA-ekstraksjon fra spyttkjertler, fjern eventuelle RNAlater ved å tilsette 1 ml 1x PBS (1: 1 volum) og spinn ned spyttkjertlene med maksimal hastighet i 15 minutter ved 4 ° C. Dette må gjentas tre ganger eller til spyttkjertlene har sunket nok til å fjerne supernatanten. På dette tidspunktet representerer prøven en blanding av små RNA på ~ 20-150 bp i størrelse (supplerende figur 1).

9. Måling av miRNA-konsentrasjon

  1. Mål konsentrasjonen av lite RNA via et kommersielt tilgjengelig RNA-analysesett41 (se Materialtabell).
  2. I hvert rør blander du 199 μL fortynningsbuffer (komponent A og B som følger med i settet per prøve), 1 μL fluorescerende fargestoff som er spesifikt for påvisning av miRNA (målebølgelengde 260 nm) (per prøve) og 2 μL lite RNA (trinn 8) for hver prøve, i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Før du leser prøverørene, må du lese forhåndsfortynnet miRNA-standard 1 og standard 2 (følger med i settet) for å lage en standardkurve før prøvemåling.
    MERK: Standardene brukes som et sammenligningsverktøy for å bestemme den målte miRNA-konsentrasjonen i prøvene.
  4. Plasser hver standard og prøverør i det dedikerte fluorometeret (se materialtabell) for å måle konsentrasjonen som ng / μL.

10. Bestemme miRNA-kvaliteten

  1. Bestem kvaliteten på miRNA og andre små RNA via gelelektroforese ved hjelp av en bioanalysator46, etter produsentens instruksjoner (se Materialtabell).
  2. Før prøveavlesning, normaliser prøvene til å være den samme konsentrasjonen.
  3. Les prøvene gjennom en liten RNA-brikke 41,46, etter produsentens instruksjoner (se Materialtabell).
    MERK: For å bestemme miRNA-kvaliteten er de gellignende bildene (båndene) og elektroferogrammene (toppene) indikatorer på prøvekvaliteten. Jo mørkere båndet i gelen er, desto bedre er miRNA-kvaliteten. Jo lettere båndet (eller hvis det ikke er noe bånd), desto dårligere er kvaliteten eller beviser prøveforringelse 46,47.

11. microRNA berikelse

  1. Berik miRNA ved hjelp av et lite RNA-sekvenseringssett, etter produsentens instruksjoner fra det lille RNA-prøveprepareringssettet (se Materialtabell).
  2. Ligate hver prøve med en 3 'adenylert adapter og fjern overflødig adapter via perle opprydding. Deretter legger du til en 5 'adapter og fjerner overflødig adapter med en perleopprydding48.
    MERK: Både adaptere og perler for opprydding ble levert i det lille RNA-sekvenseringssettet fra seksjon 11.1 (se Materialtabell).
  3. For å syntetisere den første strengen, lag en masterblanding av prøvene ligert med begge adaptere, RT-buffer og M-MuLV Revers transkriptase som følger med i settet (se Materialtabell). Deretter ruges blandingen i 30 minutter ved 42 °C og 10 minutter ved 90 °C. Oppfølging med en prøveopprydding som angitt i instruksjonene.
  4. Forsterk 1. tråd ved hjelp av RT fremoverprimer og omvendt universalprimer som følger med i settet (se Materialtabell) via en konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR) i 2 minutter ved 95 ° C, deretter i 12-25 sykluser i 20 s ved 95 ° C, 30 s ved 60 ° C og 15 s ved 72 ° C. Til slutt, 2 min ved 72 °C.
    MERK: PCR-produktstørrelsen forventes å være ~ 150 bp (figur 7).
  5. Mål kvaliteten på PCR-produktet via båndstasjon ved å følge produsentens instruksjoner (se materialtabell).
  6. Sekvenser prøvene ved hjelp av et neste generasjons sekvenseringssystem (75 sykluser), etter produsentens instruksjoner (se materialtabell).
    MERK: For miRNA-berikelse må prøvemengde og kvalitet kontrolleres (trinn 9-10) før biblioteket klargjøres.

12. Bioinformatisk analyse

  1. Identifiser de konserverte og unike miRNA-ene ved hjelp av et integrert applikasjonsverktøy for miRNA-identifikasjon.
    MERK: I denne studien ble miRNA-identifikasjon utført via miRDeep249,50. miRDeep2 er en gratis online katalog over alle identifiserte konserverte og nye miRNA som finnes i forskjellige arter49,50 (se Materialtabell).
  2. Juster lesingene til det tilsvarende genomet ved hjelp av kartverket som er integrert med programvaren.
  3. Skriv inn følgende parametere i mapper-modulen.
    1. Trim adaptersekvensene som er lagt til fra trinn 11.2, og fjern sekvenser som er mindre enn 18 nukleotider lange. Fjern de overflødige lesesekvensene.
    2. Konverter filene ved hjelp av parameteren parse til FASTA-format, bare hvis filen ikke er i FASTA-format49.
    3. Juster de filtrerte og trimmede sekvensene til det tilsvarende genomet. Hvis det ikke er noe genom for arten av interesse, juster til nærmeste homologe art.
    4. Vis utdatafilene som "reads.fa" og "reads_vs_genome.arf". "Read.fa" vil bare inneholde de ikke-overflødige leser, og "reads_vs_genome.arf" vil inkludere de kartlagte leser justert til genomet.
  4. Bruk begge utdatafilene fra trinn 12.2 til å utføre miRNA-uttrykksprofileringen ved hjelp av kvantifikatoren som er integrert med programvaren.
    1. Last ned arter av interesse miRNA forløper sekvenser og modne miRNA sekvenser fra miRBase 51,52,53,54,55,56. Hvis det ikke er noen forløper eller modne sekvenser for arten av interesse, last ned "hairpin.fa.gz" og "mature.fa.gz" som inneholder alle forløperne og modne sekvenser for alle organismer som er tilgjengelige på miRBase.
    2. Dekomprimer filene "hairpin.fa.gz" og "mature.fa.gz".
    3. Skriv inn filene "reads.fa" og "read_vs_genome.arf" fra seksjon 12.3.4 og de ukomprimerte filene fra 12.4.2.
    4. Les utdatafilene som "outputname.csv","outputname.html" og "outputname.pdf". Utdatafilnavnet kan angis i henhold til etterforskeren.
      MERK: Filen "outputname.csv" vil inneholde uttrykksprofilene. Nærmere bestemt vil uttrykksprofilen ha miRNA-ID, summen av avlesninger for alle prøver som er kartlagt til miRNA, antall avlesninger tilordnet til et bestemt miRNA for hver prøve, og forløper-ID-en som tilsvarer de modne miRNA-ene. "Outputname.html" fra trinn 12.4.4 vil inneholde koblingene til University of Santa Cruz Genome Browser (USCS), National Center for Biotechnology Information (NCBI) og miRBase. USCS og NCBI vil inneholde spørringssekvensene til de nåværende forløperne mot den ikke-redundante nukleotiddatabasen, og miRBase vil ha informasjonen om den nåværende miRNA-forløperen. "Outputname.pdf" vil ha RNA sekundær struktur av miRNA som uttrykkes og justeringen av forløpersekvensen.
  5. For å identifisere unike og bevarte miRNA-er, bruk miRDeep2.
    1. Bruk utdatafilene fra trinn 12.3.4 og trinn 12.4.2 som inndatafiler.
      MERK: Utdatafilene som leses som "outputname.html", vil inneholde prediksjonene for de unike og bevarte miRNA-ene i eksemplet.
    2. Bruk score >1 for miRNA-profilering og score >4 for videre eksperimentell analyse, for eksempel miRNA-hemming og etterligning av endogenemiRNA-er 34,36,57.
    3. Velg og identifiser de unike miRNA-ene fra miRbasen basert på følgende: miRDeep2-poengsum (trinn 12.5.3), estimering av sann sannsynlighet (>90 %), signifikant randfold p-verdi (<0,05)49,50,56.
      MERK: Bioinformatikkanalysen ble gjort via miRDeep2 i Cyverse Discovery Environment58,59, en gratis online plattform for bioinformatikkanalyse. De konserverte og unike miRNA-ene identifisert gjennom miRDeep2 ble sammenlignet mot alle arter fra miRbasen. Fremtidig miRDeep2-identifikasjon kan sammenlignes med det tilsvarende genomet til arten av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nåværende protokollen gir en detaljert metodikk for å trekke ut miRNA fra spyttkjertler og elbiler. Ifølge resultatene er denne protokollen effektiv for isolering av miRNA fra voksne av to forskjellige flåttarter, I. scapularis og R. microplus, og kan potensielt også brukes i andre flåttarter. Elbilkonsentrasjonen (partikler/ml) ble målt via NTA. For R. microplus inneholdt hvert kjønn og livsstadium tre biologiske replikasjoner målt i tre tekniske replikasjoner. Utvalgene ble separert etter kjønn og livsstadium (figur 8) for å vise variasjonen innenfor hvert utvalg. Deretter ble prøvene kombinert for å vise variasjonen og statistiske forskjeller ved hjelp av en toveis ANOVA og Tukeys flere sammenligningstester20 (p-verdi = < 0,05) (figur 9). Hver prøve besto av ~ 40 spyttkjertler dissekert fra 20 kvinner, menn og nymfer. Etter isoleringen og kvantifiseringen av elbilene ble prøvene brukt til liten RNA-rensing.

Konsentrasjonen av det lille RNA i hver prøve ble målt via Qubit (tabell 1), og kvaliteten ble målt via en bioanalyse ved bruk av standard gelelektroforese46,47. Konsentrasjonene er i nanogram (tabell 1) i et volum på 14 μL for begge flåttartene. Gjennomsnittlig total av små RNA-konsentrasjoner fra I. scapularis organer varierte fra 45,92-6,356 ng. RNA-konsentrasjonen av I. scapularis vesikler varierte fra 72,24-2,128 ng. For R. microplus varierte organkonsentrasjonen fra 259-2,142 ng, og vesiklene varierte fra 59,22-1,848 ng. Prøvene ble normalisert til samme konsentrasjon, og kvaliteten ble deretter målt via en bioanalysator (figur 10). En referansestige ble brukt i gelen som en markør for kvalitetsvurdering. Båndets integritet, intensitet og topper var representanter for potensiell nedbrytning eller total konsentrasjon i hver prøve. Bånd tilsvarende 5 s og 5,8 s ribosomale RNA var kun til stede i spyttkjertelorganprøvene (figur 10, lanes A-D) og fraværende i vesiklet fra spyttkjertelprøvene (figur 10, baner E,F), noe som viser forskjellene i små RNA-profiler mellom organer og ekstracellulære vesikler. Prøvenedbrytning ble utledet av fravær av bånd i gelen; dette betydde at det var betydelig nedbrytning av prøver. Det anbefales at prøver som har betydelig nedbrytning kasseres.

For å demonstrere tilstedeværelsen av miRNA-prøver i preparatene, ble små RNA-cDNA-biblioteker utarbeidet fra RNA-prøver som har blitt lagret i 3-4 måneder etter liten RNA-isolasjon. Merkelig nok ble det funnet høyere prøvenedbrytning i disse prøvene. Banene A-D og G viste tegn til nedbrytning; tvert imot viste E, F og H-K minimal nedbrytning og tilstrekkelig konsentrasjon for miRNA cDNA bibliotek prep (Supplerende figur 1). Bare én prøve ble degradert da prøvene ble brukt umiddelbart etter rensing (figur 10), noe som tyder på at miRNA-prøver var mer utsatt for nedbrytning når de ble renset fra elbiler. Dermed ble prøvene E, F, H og I valgt for anrikningsanalyse. Stjernene viser båndstørrelsene på ~150 bp, som var de forventede størrelsene etter cDNA-bibliotekpreparering (figur 7). De nedre svake båndene indikerer primer dimer.

Under EV-isolasjon kan sentrifugeringshastigheten og tiden påvirke den endelige EV-konsentrasjonen. Ved pipettering av EV-pelleten inn i 300 k-kolonnene, som nevnt tidligere i trinn 6.10, er lavt volum og hastighet avgjørende for å forhindre at elbiler passerer gjennom membranen. Tidligere studier viste at 700 μL ved 12 000 x g i 20 minutter ved bruk av en annen sentrifugalkonsentrator var tilstrekkelig for riktig separering av EV fra de løselige proteinene20; Imidlertid ble lave EV-konsentrasjoner vist i NTA ved hjelp av et annet filter. Dermed er det viktig å optimalisere filtrene og andre tilgjengelige materialer. Ved første gangs bruk av 300 k-søylene ble det testet forskjellige hastighetsintervaller for å bestemme hvilken som ga den høyeste EV-konsentrasjonen. Antall vesikler som går tapt under sentrifugering ble målt ved NTA-analyse; det ble konkludert med at lavere hastigheter resulterte i høyere vesikkelkonsentrasjon i gjennomstrømningen (ikke vist). Det ble konkludert med at 500 μL ved 6 000-8 000 x g var tilfredsstillende for å isolere elbilene. Når dette ble bestemt, ble denne protokollen brukt til å isolere vesikler fra I. scapularis og R. microplus. Konsentrasjonen av vesiklene isolert fra hver flåttart ble målt via NTA (figur 8). EV-konsentrasjonene varierte mellom 7,07 x 107 til 7,94 x 109 partikler/ml. EV-mengden korrelerte med miRNA-konsentrasjonene, hvor større mengde EV resulterte i en høyere konsentrasjon av miRNA ekstrahert.

Figure 1
Figur 1: 1 ml nålefrie sprøyter lastet med kvinnelig voksen I. scapularis og dekket med sterilisert gasbind.

Figure 2
Figur 2: Dorsalsiden av en engorged kvinne ble fjernet med 4 mm vannas saks. Hunnen ble nedsenket i 1x PBS for å forhindre organtørking. De gule pilene peker mot de eksponerte spyttkjertlene. Figuren ble tatt med 50x forstørrelse med en høyoppløselig objektivlinse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: En cellekulturplate etter 24 timers inkubasjon ved 32 °C. Den første raden av brønner inneholder vesikkelfrie medier og dissekerte spyttkjertler. Resten av brønnene inneholder 1x PBS med Rifampicin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: En prøveprepareringsprosess for en ultracentrifugesyklus. (A) En 10 ml sprøyte uten kanyler toppet med et 1 μm sprøytefilter. (B) Supernatanten etter tre runder sentrifugering pipetteres inn i sprøyten. (C) Resten av sprøyten fylles til 10 ml med 1x sterilisert PBS. (D) Sprøyten er tildekket, og supernatanten med 1x PBS filtreres inn i ultracentrifugerøret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Etter 18 timer med ultrasentrifugering dannes en pellet av ekstracellulære vesikler i bunnen av ultracentrifugerøret.

Figure 6
Figur 6: En sterilisert pestle brukes til å homogenisere spyttkjertelorganer og de ekstracellulære vesiklene.

Figure 7
Figur 7: En gelelektroforese målt via båndstasjon som viser miRNA-preppede biblioteker etter en anrikningsanalyse. Prøvene fra kvinnelige R. microplus spyttkjertelorganer og EV var basert på minimal nedbrytning og tilstrekkelig miRNA-konsentrasjon for cDNA-biblioteksyntese. Stigen (L) viser referansepunktene i nukleotider og øvre og nedre markører. Stjernene indikerer båndene med størrelsesprodukt ~ 150 bp, som betyr de små RNA-cDNA-bibliotekene. De nedre båndene viser primer dimer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Et representativt tall for variasjonen mellom de biologiske replikasjonene (A) hunner, (B) hanner og (C) nymfer. X-aksen viser EV-størrelsen (nm), og y-aksen viser EV-konsentrasjonen (partikler/ml). En toveis ANOVA og Tukeys sammenligningstest viste statistiske forskjeller (P-verdi = < 0,05). Feilfeltene representerer standardfeilen for å ta hensyn til variasjon. Hver prøve inneholdt 20 flått med tre biologiske replikasjoner. Prøvene ble registrert i 60 s, tre ganger hver. Kameraet ble satt på nivå 7, og deteksjonsterskelen ble satt til nivå 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Et representativt figur av variasjonen for alle kombinerte biologiske replikasjoner for nymfer (rød), kvinner (blå) og menn (svart). X-aksen viser EV-størrelsen (nm), og y-aksen viser EV-konsentrasjonen (partikler/ml). En toveis ANOVA og Tukeys sammenligningstest viste statistiske forskjeller (P-verdi = < 0,05). Feilfeltene representerer standardfeilen for å ta hensyn til variasjon. Hver prøve inneholdt 20 flått med tre biologiske replikasjoner. Stjernene symboliserer en signifikant forskjell på p < 0, 05. Hvert opptak ble gjort i 60 s, tre ganger hver. Kameraet ble satt på nivå 7, og deteksjonsterskelen ble satt til nivå 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: En representativ gel via bioanalysatoren. Gelelektroforesen ble utført med en bunnstige som referanse. En moden miRNA-sekvens er ~ 18-22 nt lang, hvor svake bånd vises i det angitte størrelsesområdet. Andre små RNA, som små kjernefysiske RNA, overføringsbud-RNAer og regulatoriske RNA, er også til stede i prøvene. Størrelsene på de små RNA varierte fra ~ 20-150 nt. Prøvene varierer fra flåttart, vev og kjønn. For kjørefelt G viser et eksempel på prøveforringelse ingen bånd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: En gelelektroforese ble målt via bioanalysatoren, som viser de ekstraherte miRNA-enes kvalitet fra R. microplus kvinnelige spyttkjertelorganer og EV- er. Stigen (L) viser referansestørrelsene i nukleotider, hvor modne miRNA måler ~ 18-22 nt i lengde. Banene A-D og G viser nedbrytning, og banene E, F og H-K viser minimal nedbrytning. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Art Kjønn Orgel/ Vesikkel EV konsentrasjon miRNA konsentrasjon (ng)
R. mikropluss Kvinnelig Orgel N/a 259
R. mikropluss Kvinnelig Orgel N/a 2,142
R. mikropluss Kvinnelig Vesikkel 1,64 E + 08 59.22
R. mikropluss Kvinnelig Vesikkel 1,64 E + 09 1,848
I. Scapularis Kvinnelig Orgel N/a 45.92
I. Scapularis Kvinnelig Orgel N/a 6,356
I. Scapularis Kvinnelig Vesikkel 1,73E+08 65.66
I. Scapularis Kvinnelig Vesikkel 3,14 E + 09 2,128

Tabell 1: Et eksempel på miRNA-konsentrasjoner for både spyttkjertler og ekstracellulære vesikler. Kolonnen med miRNA-konsentrasjoner representerer de laveste til høyeste konsentrasjonene for hver flåttart.

mikroRNA I. Scapularis I. Ricinus R. mikropluss H. longicornis Referanser
MiR-8 En P P P 33, 36, 37, 43
MiR-71 P P P En 33, 36, 37, 43
MiR-279 P En En P 33, 36, 37, 43
la-7 En P P P 33, 36, 37, 43

Tabell 2: De konserverte miRNA-ene i ulike flåttarter. (P) indikerer at miRNA ofte ble uttrykt, eller til stede, og (A) betyr at miRNA ikke ble uttrykt eller oppdaget.

Type utvalg Antall poeng >1* Antall poeng >4γ Antall bevarte Antall romaner
Mannlig 17 0 48,885 23
Kvinnelig 25 0 48,885 21
Nymfer 38 0 48,885 38

Tabell 3. De konserverte og unike miRNA-ene ble oppdaget i elbilene for R. microplus-hunner , hanner og nymfer. *miRNA-skår brukt til profilering. γmiRNA-score som brukes til funksjonelle eksperimenter.

Supplerende tabell 1: En tabell som viser neste generasjons sekvenseringsresultaterfor R. microplus menn EV utskilt fra spyttkjertler. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: En tabell som viser neste generasjons sekvenseringsresultaterfor R. microplus kvinnelige elbiler utskilt fra spyttkjertler. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: En tabell som viser neste generasjons sekvenseringsresultaterfor R. microplus nymfe-elbiler utskilt fra spyttkjertler. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nåværende protokollen gir en detaljert metodikk for å trekke ut miRNA fra spyttkjertler og elbiler. Det er imidlertid viktige hensyn, som alle er beskrevet i notatene for hver del av denne protokollen. Kapselen og netting må sikres under flåttfôring for å forhindre at flått slipper ut. Kapselprepareringen og plasseringen er beskrevet i Koga et al.40. Flere replikasjoner av flåttdisseksjonene må gjøres hvis en uegnet prøve kasseres. I tillegg kan flere utfordringer være til stede ved bruk av EV-isolasjonsteknikker fra kryssvev 18,20,43. For eksempel bør vev holdes fuktig under disseksjon for å unngå uttørking. Dette gjøres ved å legge til PBS gjennom hele disseksjonen. Både PBS og media som brukes til disseksjon og kultur av organene, bør opprettholdes med antibiotika for å unngå bakteriell forurensning fra kryssmikrobiomet. Disse bør inkludere antibiotika som retter seg mot gramnegative og grampositive bakterier, da begge finnes i flåttvev60. På samme måte må det tas hensyn under disseksjon for å redusere forurensning med vev fra andre organer. Dermed må disseksjoner gjøres sakte, og etter hvert som brukeren får erfaring, kan flere flått dissekeres. Til slutt, fordi elbiler skilles ut fra alle celler, inkludert patogeninfiserte celler, må flåttstudier som utfører EV-isolasjon bruke EV-frie medier og buffere for å unngå krysskontaminering25,61.

Likevel tillater denne protokollen reduksjon av antall flått som trengs for å produsere flåttspytt-ELBILER. Tidligere protokoller krevde salivasjon av et betydelig større antall flått. For eksempel trengte miRNA utskilt i spytt-ELBILER i Haemaphysalis longicornis salivasjon av 2000 voksne flått43. Dette kan være ekstremt dyrt for laboratorier som mangler kapasitet til å bak flått. På samme måte ble Amblyomma maculatumvev brukt til EV-isolasjon delvis frosset før isolering og behandlet med 75 U /ml kollagenase type 3, noe som kunne påvirke ektheten av EV-sekresjonen19. Videre krevde disse studiene 80-100 par spyttkjertler18.

Til sammenligning kan denne protokollen brukes på flere flåttarter, og krever et lavt antall flått for å isolere elbiler og trekke ut kvalitetskonserverte og nye miRNA (tabell 2)33,36,37,43. MiRNA-konsentrasjonene varierte sterkt, men var tilstrekkelige for neste generasjons sekvensering (tabell 3 og supplerende tabell 1-3). Denne protokollen kan justeres for å imøtekomme en større prøvestørrelse hvis det er behov for større miRNA-konsentrasjoner. Materialer som brukes i denne protokollen kan også erstattes avhengig av materialtilgjengelighet. Prøvevolumer og sentrifugeringshastighet må imidlertid justeres i henhold til produsentens instruksjoner for settene og kolonnene som brukes.

En ulempe med denne metoden er at miRNA og elbiler lett kan nedbrytes gjennom trinnene med ekstraksjon og isolasjon. Derfor må protokollen oppnås raskt og effektivt. Når det er oppgitt, må prøvene holdes på is, og miRNA-ekstraksjonen må utføres i et sterilisert miljø. I tillegg kan en RNase-behandling gjøres på de isolerte elbilene for å eliminere store RNA-er festet til EV-membranen. Dette kan forhindre at store RNA forurenser prøven under miRNA-ekstraksjoner. Til slutt er det et viktig forebyggende tiltak for nedbrytning å legge til en RNAse-hemmer til miRNA-prøven etter isolering fra elbiler eller organer. Denne protokollen kan endres og brukes parallelt med eksperimentets mål som utføres.

Fremtidige applikasjoner for denne protokollen kan omfatte studier av patogen-vektor-interaksjoner for å forstå hvordan patogener påvirker miRNA og annen genomisk last i flåttspytt-EV. På samme måte kan denne protokollen definere spesifikke proteiner og cellulære prosesser involvert i pakking av miRNA i kryss-EV, og den spesifikke effekten disse EV-ene og miRNA-ene har på sårheling og immunresponser. På grunn av den økende kryssresistensen mot akaricider, er det et desperat behov for unike kontrollmetoder. Elbiler har potensial for en alternativ kontrollmetode sammenlignet med akaricider. Elbiler kan brukes som nanotransportører i terapeutiske applikasjoner 18,23,61. Hos mennesker har elbiler som transporterer miRNA blitt brukt til å undertrykke tumorvekst under kreftimmunterapi62,63. På samme måte kan elbiler i flått bære genmodifiserte miRNA-er som har vist seg å påvirke vitale flåttbiologiske funksjoner og patogenoverføring 36,57,64. Den fremtidige retningen er å bruke denne protokollen til å bestemme miRNA-profilene til flere flåttarter for å identifisere miRNA av interesse for funksjonelle studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi setter stor pris på hjelpen fra Cattle Fever tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vil takke Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado og Homer Vasquez. Vi ønsker også å anerkjenne hjelp fra Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario og Stephanie Guzman Valencia gjennom hele prosjektet. Vi vil gjerne takke Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group for deres hjelp og råd under skrivingen av dette manuskriptet. Følgende reagenser ble levert av Centers for Disease Control and Prevention for distribusjon av BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvinne I. scapularis flått ble også mottatt fra Tick Rearing Facility ved Oklahoma State University. Dette prosjektet ble finansiert av Texas A &M University T3: triader for transformasjonstilskudd og samarbeidsavtalen # 58-3094-1-003 av USDA-ARS til AOC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
  2. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
  3. de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
  4. Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , Elsevier. 603-672 (2019).
  5. Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
  7. Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
  8. Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
  9. Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
  10. Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
  11. Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
  12. Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
  13. Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
  14. Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
  15. Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
  16. Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
  17. Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
  18. Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
  19. Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
  20. Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  21. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  22. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  23. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  24. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
  25. Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
  26. Chávez, A. S. O., O'Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
  27. Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
  28. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  29. Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
  30. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  31. Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
  32. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  33. Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
  34. Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
  35. Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
  36. Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
  37. Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
  38. Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
  39. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. Proteomic Profiling. , Springer. 179-209 (2015).
  40. Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
  41. Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  42. Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
  43. Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
  44. Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
  45. Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
  46. Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
  47. Tissot, C. Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Agilent Technologies. , Palo Alto, Calif, USA. Available from: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-7870EN.pdf (2008).
  48. Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
  49. Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
  50. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
  51. Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl_1 109-111 (2004).
  52. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl_1 140-144 (2006).
  53. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl_1 154-158 (2007).
  54. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 152-157 (2011).
  56. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
  57. Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
  58. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
  59. Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
  60. Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
  61. Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
  62. Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
  63. Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
  64. Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).

Tags

Biologi utgave 182 ekstracellulære vesikler mikroRNA tick-host grensesnitt flått
Isolering av mikroRNA fra Tick <em>Ex Vivo</em> spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, … More

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter