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Biology

Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick Ex Vivo e vescicole extracellulari

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63618
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei microRNA dalle ghiandole salivari delle zecche e dalle vescicole extracellulari purificate. Questa è una procedura universale che combina reagenti e forniture comunemente usati. Il metodo consente anche l'uso di un piccolo numero di zecche, con conseguente microRNA di qualità che possono essere facilmente sequenziati.

Abstract

Le zecche sono ectoparassiti importanti che possono veicolare più agenti patogeni. Le ghiandole salivari delle zecche sono essenziali per l'alimentazione in quanto la loro saliva contiene molti effettori con proprietà farmaceutiche che possono diminuire le risposte immunitarie dell'ospite e migliorare la trasmissione degli agenti patogeni. Un gruppo di tali effettori sono i microRNA (miRNA). I miRNA sono brevi sequenze non codificanti che regolano l'espressione del gene ospite all'interfaccia tick-host e all'interno degli organi del tick. Questi piccoli RNA vengono trasportati nella saliva delle zecche attraverso vescicole extracellulari (EV), che servono la comunicazione inter e intracellulare. Vescicole contenenti miRNA sono state identificate nella saliva delle zecche. Tuttavia, si sa poco sui ruoli e sui profili dei miRNA nelle vescicole salivari e nelle ghiandole delle zecche. Inoltre, lo studio delle vescicole e dei miRNA nella saliva delle zecche richiede procedure noiose per raccogliere la saliva delle zecche. Questo protocollo mira a sviluppare e convalidare un metodo per isolare i miRNA da vescicole extracellulari purificate prodotte da colture d'organo ex vivo . I materiali e la metodologia necessari per estrarre i miRNA dalle vescicole extracellulari e dalle ghiandole salivari delle zecche sono descritti qui.

Introduction

Le zecche sono ectoparassiti che trasportano molti agenti patogeni alla fauna selvatica, al bestiame, agli esseri umani e ai loro animali domestici 1,2. L'alimentazione delle zecche provoca una significativa perdita economica causando danni alla pelle, riducendo il peso e la produzione di latte a causa di una grave anemia e la trasmissione di agenti patogeni potenzialmente mortaliche causano malattie 1,3,4,5. Le attuali pratiche di controllo per la gestione delle popolazioni di zecche si concentrano sull'uso di acaricidi. Tuttavia, il continuo emergere di resistenza agli acaricidi nelle zecche che parassitano il bestiame 5,6, l'aumento dell'incidenza di punture di zecche7 e la trasmissione di agenti patogeni all'interno delle aree residenziali 8,9, hanno portato alla necessità di alternative uniche per il controllo delle zecche.

Le ghiandole salivari delle zecche sono organi essenziali che assicurano il successo biologico di una zecca. Sono formati da diversi tipi di acino (I, II, III e IV) con varie funzioni fisiologiche. Le ghiandole salivari sono responsabili dell'osmoregolazione, sia fuori che sull'ospite, restituendo l'eccesso di acqua e il contenuto di ferro all'ospite tramite salivazione 2,10. Gli acini di tipo I sono anche coinvolti nell'assorbimento di acqua dall'atmosfera mediante la secrezione di saliva igroscopica10,11. Le proteine effettrici salivari, come il cemento e le cistatine, sono prodotte all'interno delle cellule secretorie negli acini10,12 di tipo II e III. Gli acini di tipo I non influenzano l'alimentazione delle zecche, indicando che l'assunzione di farina di sangue non innesca cambiamenti morfologici e fisiologici in questi acini di tipo13,14. D'altra parte, gli Acini di tipo II e III si attivano durante l'alimentazione e presentano pochissima attività pre-attaccamento. Pertanto, l'alimentazione è necessaria per innescare l'allargamento delle cellule secretorie all'interno degli acini di tipo II e la produzione di composti bioattivi. Gli acini di tipo III sono di dimensioni ridotte durante l'alimentazione a causa della secrezione all'interno dei granuli secretori12.

Le ghiandole salivari sono anche il sito di infezione patogena nella zecca e nella via di trasmissione. Durante l'alimentazione, le zecche secernono diversi composti con effetti farmaceutici necessari per completare con successo la farina di sangue 10,15,16. Questi composti hanno proprietà antinfiammatorie, immunosoppressive e vasodilatatorie 10,15,17. Studi recenti hanno dimostrato che le vescicole extracellulari (EV) derivate dalle ghiandole salivari delle zecche ospitano molti di questi composti, inducendo effetti antinfiammatori e immunomodulatori 18,19,20. "Vescicole extracellulari" è un termine generico usato per descrivere vescicole classificate come esosomi e microvescicole in base alle loro dimensioni e biogenesi. Nel complesso, i veicoli elettrici sono bleb lipidici con membrane a doppio strato che sono ~ 40 nm-1 μm nella dimensione21; generalmente, gli esosomi sono descritti come di dimensioni 40-150 nm, mentre le microvescicole sono comprese tra 150 nm-1 μm in dimensioni 21,22,23. Tuttavia, la dimensione non è indicativa del percorso di biogenesi dei veicoli elettrici22.

La biogenesi degli esosomi inizia con l'invaginazione sequenziale della membrana plasmatica. Questa invaginazione porta alla formazione di corpi multivescicolari e infine provoca la deformazione della membrana vescicolare per azione di complessi ESCRT o sfingomielinasi (sMasi)24,25. Gli esosomi possono essere lisati all'interno dei lisosomi per mantenere l'omeostasi cellulare o uscire tramite fusione vescicolare alla membrana plasmatica per fornire costituenti cellulari alle cellule riceventi21,24. D'altra parte, le microvescicole sono formate dall'azione di flopassi e flipasses, cambiando la conformazione dei lipidi nella membrana plasmatica26. Gli EV sono essenziali per la comunicazione cellula-cellula, fungendo da sistema di trasporto per il carico intracellulare, come lipidi, proteine, acidi nucleici e microRNA (miRNA)21,27,28. Una volta trasportate, queste vescicole trasportano il loro carico nel citoplasma delle cellule riceventi, generando cambiamenti fenotipici nella cellula ricevente22,29. A causa dell'importanza delle vescicole extracellulari nell'alimentazione delle zecche e della manipolazione delle risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell'ospite18,20, il carico all'interno delle vescicole extracellulari presenta potenziali bersagli per lo sviluppo di terapie anti-zecche e un meccanismo unico per interrompere l'alimentazione delle zecche. Ciò include i miRNA all'interno delle ghiandole salivari delle zecche e delle vescicole extracellulari derivate dalla ghiandola salivare.

I miRNA sono brevi sequenze non codificanti, di lunghezza ~ 18-22 nucleotide (nt), che possono regolare, degradare o silenziare post-trascrizionalmente le sequenze di mRNA30,31. Durante la trascrizione, i pri-miRNA vengono scissi da Dicer (RNA polimerasi III) per formare una struttura distintiva simile a una forcina, diventando un pre-miRNA. Il pre-miRNA viene tagliato ancora una volta da Drosha (RNA polimerasi III) per formare un duplex di miRNA maturo. La sequenza matura si integra nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) complementare alla sequenza di mRNA, causando la repressione della traduzione o la degradazione dell'mRNA 28,30,32. Durante l'alimentazione dell'ospite, i miRNA all'interno della saliva delle zecche possono modulare l'espressione del gene dell'ospite per sopprimere le risposte immunitarie e migliorare la trasmissione dei patogeni 33,34,35,36,37. Sebbene esistano studi approfonditi su veicoli elettrici e miRNA, il loro ruolo durante l'alimentazione all'interfaccia tick-host è ancora poco compreso. L'ottimizzazione dei protocolli che possono facilmente portare all'isolamento e alla purificazione di miRNA di alta qualità è fondamentale per far progredire le nostre conoscenze su questi argomenti.

Molteplici opzioni possono essere utilizzate per isolare i veicoli elettrici, come l'ultracentrifugazione, la precipitazione degli esosomi, la precipitazione dei polimeri, la cromatografia dell'immunoaffinità e le tecniche di esclusione basate sulle dimensioni38. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere tra esosomi o microvescicole. Pertanto, come accennato in precedenza, EV viene utilizzato come termine generico quando si isolano i veicoli elettrici da diversi campioni. Le vescicole isolate negli esperimenti qui descritti rappresentano una miscela di vescicole derivate da diverse vie di biogenesi. Un'ulteriore purificazione di una specifica popolazione di vescicole extracellulari può essere ottenuta mediante immunoprecipitazione utilizzando perline rivestite con anticorpi contro marcatori (cioè marcatori esosomiali, marcatori tumorali) unici per la popolazione di vescicole di interesse39,40. I miRNA possono anche essere estratti tramite diversi kit di isolamento disponibili in commercio 7,41,42.

L'obiettivo di questo progetto era quello di sviluppare un protocollo che combina metodi comunemente applicati per isolare i veicoli elettrici ed estrarre miRNA sia dai veicoli elettrici che dalle ghiandole salivari alimentate. Poiché la secrezione di composti bioattivi viene attivata alimentando12, le zecche dovrebbero essere autorizzate a nutrirsi per identificare i miRNA che possono essere importanti per manipolare le risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell'ospite. Il presente protocollo richiede un piccolo numero di zecche (20 zecche) per isolare i veicoli elettrici e i rispettivi miRNA, rispetto ad altri studi precedentemente descritti che richiedevano 2000 zecche43. Inoltre, evita la contaminazione delle secrezioni salivari con pilocarpina44, che potrebbe influenzare gli esperimenti che studiano l'effetto dei veicoli elettrici e dei loro miRNA sulle cellule ospiti.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo il protocollo di utilizzo degli animali (AUP # 2020-0026) approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (AICUC) presso la Texas A & M University. Le specie di zecche, Ixodes scapularis e Rhipicephalus (Boophilus) microplus, e i conigli bianchi maschi della Nuova Zelanda, di età compresa tra 42 e 72 giorni, sono stati utilizzati per il presente studio. I. scapularis è stato ricevuto dal Center for Disease Control (CDC) e dall'Oklahoma State University, certificato come privo di agenti patogeni. R. microplus è stato allevato presso il Cattle Fever Tick Research Laboratory di Edimburgo, Tx. I conigli sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Questo protocollo può isolare universalmente vescicole extracellulari e miRNA da diverse specie di zecche, stadi di vita e tessuti.

1. Allevamento di I. scapularis femmina e preparazione della capsula

  1. Preparare una capsula di schiuma di etilene-vinil acetato seguendo le procedure per i conigli che si nutrono di zecche dure45. Posizionare una capsula su ogni scapola del coniglio per un totale di due capsule per infestazione.
    NOTA: Brevemente, queste capsule sono costituite da due quadrati di schiuma di etilene-vinil acetato con uno spazio vuoto interno. Un quadrato è incollato sul retro dell'animale (in questo caso, conigli) con un adesivo di tessuto (vedi Tabella dei materiali). La rete fine è incollata al secondo quadrato per evitare la fuga delle zecche. I due quadrati sono chiusi con nastro autoadesivo.
  2. Lasciare riposare le capsule per 24 ore prima di aderire alla capsula sui conigli. Conservare le capsule di schiuma a temperatura ambiente.
    NOTA: Le capsule possono essere conservate a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
  3. Aderire la capsula ai conigli rasati a pelle e lasciare per 24 ore prima dell'infestazione da zecche.

2. Preparazione di supporti privi di vescicole

  1. Per preparare mezzi privi di vescicole13, combinare 0,5 mL di siero bovino fetale, 0,5 mL di brodo di triptosio fosfato, 0,1 mL di concentrato di lipoproteina-colesterolo al 10%, 0,5 mL di bicarbonato di sodio al 5% (NaHCO3), 0,25 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 8,125 mL di terreno L15C300 (vedere Tabella dei materiali). Regolare il volume del supporto in base alle esigenze. Posizionare il mezzo in un flacone per centrifuga in policarbonato da 26,3 ml.
  2. Bilanciare le bottiglie con una differenza di peso di 0,01 g al massimo per garantire il corretto funzionamento dell'ultracentrifuga.
  3. Ultracentrifugare il mezzo per 18 ore a 100.000 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante tramite pipetta, assicurandosi accuratamente di non disturbare il pellet formato.
  4. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo centrifugo e ultracentrificare una seconda volta per 18 ore a 100.000 x g a 4 °C, con il giusto equilibrio.
  5. Isolare il surnatante rimanente e passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm per rimuovere i contaminanti. Pipettare il surnatante in un tubo centrifugo da 50 ml.
  6. Conservare il surnatante in un congelatore a -20 °C fino a quando non è necessario o fino a 3 anni.

3. Infestazione da conigli

  1. Tagliare la parte superiore di una siringa da 10 ml e caricare le femmine adulte I. scapularis usando un pennello standard.
  2. Coprire l'apertura della siringa con una garza sterile (Figura 1).
  3. Posizionare il coniglio su un tavolo o su una superficie di lavoro orizzontalmente; avvolgere saldamente il coniglio con un asciugamano e coprire entrambi gli occhi, lasciando la capsula preparata (passaggio 1.1) esposta per infestare il coniglio con le zecche.
  4. Aprire la capsula e inserire le zecche premendo l'impugnatura della siringa. Deposita le zecche vicino alla pelle del coniglio. Chiudere rapidamente le capsule per evitare che le zecche fuoriescano.
  5. Secondo il disegno sperimentale, consentire alle zecche femminili di nutrirsi per tutto il tempo necessario. Non lasciare che Ixodes scapularis maschio rimanga nella capsula per più di 24 ore per evitare l'essiccazione.
    NOTA: Il numero di zecche da infestare negli animali è a discrezione dello sperimentatore. Questo protocollo utilizzava ~ 100 zecche per infestazione per tenere conto della mortalità e abbastanza materiale per le repliche. Gli esperimenti preliminari hanno determinato che erano necessarie almeno 20 zecche / replicazione per ottenere materiale sufficiente per il sequenziamento dei miRNA.

4. Rimozione delle femmine nutrite

  1. Posizionare i conigli infestati sotto il 2% di isoflurano in ossigeno usando un diffusore di gas. Impostare la velocità di ossigeno tra 700-1000 L / min.
    NOTA: Altri anestetici possono essere utilizzati per evitare qualsiasi angoscia o dolore.
  2. Rimuovi le femmine nutrite afferrando le zecche dal loro capitulum, usando una pinza fine, il più vicino possibile alla pelle. Assicurarsi che le parti della bocca siano completamente rimosse per evitare infezioni batteriche.
  3. Posizionare le zecche in un tubo centrifugo da 15 ml.
  4. Pulire il sito del morso con il 70% di etanolo e aggiungere una piccola quantità di triplo antibiotico (punta delle dita, vedere Tabella dei materiali) per prevenire l'infezione nel sito della puntura di zecca.
  5. Portare le zecche al laboratorio per le dissezioni (passaggio 5). Eseguire queste dissezioni entro 24-48 ore dalla rimozione delle zecche per evitare la degradazione delle ghiandole salivari15,43.

5. Dissezione delle ghiandole salivari e secrezione di vescicole extracellulari

  1. Aggiungere 500 μL di terreno privo di vescicole (fase 2) con 5 μL di penicillina 100x, 5 μL di streptomicina 100x, 5 μL di 10 mg/mL di rifampicina e 5 μL di amfotericina 100x a ciascun pozzetto (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 1x PBS con rifampicina a tutti i pozzetti che non contengono terreno privo di vescicole per prevenire la crescita batterica.
  2. Posizionare le zecche su un vetrino microscopico trasparente con nastro biadesivo sotto un microscopio sezionante. Per prevenire l'essiccazione degli organi, aggiungere 10 μL di 1x PBS a ciascun segno di spunta prima della dissezione.
  3. Usando le forbici vannas da 4 mm (vedi Tabella dei materiali), fai una piccola incisione di ~ 1 mm sul lato di ogni femmina. Rimuovere completamente il lato dorsale del segno di spunta (Figura 2) e rimuovere entrambe le ghiandole salivari.
  4. Mettere 20-40 ghiandole salivari di zecche in 500 μL di terreno privo di vescicole aggiunte a un singolo pozzetto in una piastra trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti (Figura 3).
  5. Incubare i campioni di ghiandole salivari a 32 °C per 24 ore per consentire la secrezione dei veicoli elettrici.

6. Isolamento delle vescicole extracellulari

  1. Dopo 24 ore di incubazione, pipettare tutto il mezzo contenente le ghiandole salivari in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  2. Centrifugare il campione a 300 x g a 4 °C per 10 minuti per isolare le ghiandole salivari. In questa fase verranno separate due fasi: (1) il surnatante contenente i veicoli elettrici e (2) le ghiandole salivari (pellet).
  3. Per continuare l'isolamento dei veicoli elettrici, pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Sospendere il pellet contenente le ghiandole salivari (fase 6.2) in 500 μL di RNAlater (vedere Tabella dei materiali) e conservare a -80 °C fino all'uso o a tempo indeterminato.
    NOTA: Queste ghiandole salivari saranno utilizzate per l'isolamento del miRNA nel passaggio 8.
  4. Centrifugare il surnatante a 2000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Scartare il pellet.
  5. Centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere i corpi apoptotici e i veicoli elettrici più grandi. Gettare il pellet e pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  6. Attaccare una siringa da 10 mL a un filtro a siringa in nylon da 1 μm. Posizionare la siringa e filtrare sopra un tubo ultracentrifuga (Figura 4A). Quindi aggiungere il campione (Figura 4B) e riempire la siringa con 10 mL di 1x PBS (Figura 4C) e bilanciare il tubo di conseguenza (Figura 4D).
  7. Posizionare i tubi in un rotore 70Ti (vedere Tabella dei materiali) e ruotare a 100.000 x g per 18 ore a 4 °C.
  8. Dopo 18 ore di ultracentrifugazione, osservare un pellet all'estremità inferiore del tubo (Figura 5). Il pellet è la vescicola extracellulare concentrata.
  9. Rimuovere il 90%-100% del surnatante senza sospendere nuovamente il pellet EV. Risospesciare il pellet con 1x PBS. Se non è possibile rimuovere tutto il surnatante, utilizzare il surnatante rimanente per risospese il pellet.
  10. Pipettare 500 μL del pellet/surnatante EV in un filtro centrifugo da 300 K (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: Questo rimuoverà tutte le proteine non associate alle vescicole, i miRNA e altre molecole, mentre le vescicole non passeranno attraverso il filtro.
  11. Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 6.10 fino a quando tutti i pellet/surnanti EV non sono passati attraverso il filtro.
  12. Aggiungere 400 μL di PBS 1x sterilizzato alla colonna e mescolare accuratamente tramite pipetta per rimuovere i veicoli elettrici attaccati alla membrana. Inserire il campione in un tubo privo di DNasi/RNasi da 1,5 ml. I campioni possono essere conservati a -80 °C a tempo indeterminato o fino all'uso. Evitare un eccessivo scongelamento del campione per prevenire la degradazione del campione.
    NOTA: Posizionare i tubi sul ghiaccio quando vengono tolti dall'ultracentrifuga per prevenire la degradazione dei veicoli elettrici. Il campione finale sarà il pellet EV in 400 μL di 1x PBS. 25 μL di questo campione saranno utilizzati per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA, fase 7) e 375 μL per l'isolamento dei miRNA (fase 8).

7. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)

  1. Prelevare 25 μL del campione finale (fase 6.12) e aggiungere 375 μL di 1x PBS.
  2. Caricare il campione diluito in una siringa senza ago da 1 mL e avvitare saldamente sulla lente ottica dell'NTA.
  3. Regola le impostazioni di conseguenza e acquisisci video in base alle preferenze di impostazione.
    NOTA: Nel presente studio, sono state prese tre letture di 60 s ciascuna. Ogni lettura NTA rappresenta una replica tecnica. Campioni diversi dall'alimentazione delle zecche per lo stesso periodo di tempo rappresentano singole repliche biologiche. La telecamera è stata impostata al livello 7 e la soglia di rilevamento è stata impostata al livello 5.
  4. Stimare i numeri EV finali con la seguente formula:
    ((concentrazione iniziale di veicoli elettrici (fattore di diluizione)) * (volume totale rimasto nella provetta del campione)/1000) = ev totali nel campione
    NOTA: il volume deve essere diviso per 1000 perché l'NTA legge i campioni come concentrazione/ml.

8. estrazione di miRNA da ghiandole salivari e vescicole extracellulari

  1. Aggiungere 100 μL del reagente di lisi (vedere Tabella dei materiali) al campione rimanente dal punto 6.12 e omogeneizzare con pestelli sterilizzati (Figura 6).
  2. Aggiungere i restanti 600 μL del reagente di lisi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 140 μL di cloroformio, agitare vigorosamente per 15 s e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
  4. Ruotare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  5. Pipettare la fase superiore trasparente, evitando l'interfase, in un nuovo tubo da 1,5 ml. Ciò si tradurrà in ~ 525 μL di volume di campione previsto. Quindi, aggiungere un volume 1: 1 di etanolo di grado molecolare al 100%.
  6. Aggiungere 700 μL del campione in una colonna di spin di isolamento dell'RNA (vedere Tabella dei materiali).
  7. Girare a 8.000 x g per 30 s a temperatura ambiente, scartare il flusso attraverso.
  8. Lavare il campione con 700 μL di tampone RTE (vedere Tabella dei materiali), girare a 8.000 x g per 30 s, scartare il flusso attraverso.
  9. Lavare il campione con 500 μL di tampone RPE (vedere Tabella dei materiali), girare a 8.000 x g per 30 s, scartare il flusso attraverso.
  10. Aggiungere 500 μL di etanolo di grado molecolare all'80% e girare a 8.000 x g per 2 minuti, scartare il flusso attraverso.
  11. Ruotare la colonna alla velocità massima per 5 minuti per asciugare la membrana. Scartare il tubo di raccolta e posizionare la colonna su un nuovo tubo microfuga da 1,5 ml.
  12. Aggiungere 14 μL di acqua priva di RNasi/DNasi alla membrana e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  13. Centrifugare a 21.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
  14. Aggiungere 1 μL di inibitore della RNasi (vedere Tabella dei materiali) ai miRNA eluiti e mescolare bene tramite pipetta.
    NOTA: Prima dell'estrazione del miRNA dalle ghiandole salivari, rimuovere qualsiasi RNAlater aggiungendo 1 ml di 1x PBS (volume 1:1) e ruotare verso il basso le ghiandole salivari alla massima velocità per 15 minuti a 4 °C. Questo deve essere ripetuto tre volte o fino a quando le ghiandole salivari si sono abbassate abbastanza da rimuovere il surnatante. A questo punto, il campione rappresenta un mix di piccoli RNA di ~ 20-150 bp di dimensioni (Figura supplementare 1).

9. Misurazione della concentrazione di miRNA

  1. Misurare la concentrazione di RNA piccolo tramite un kit di analisi dell'RNAdisponibile in commercio 41 (vedere Tabella dei materiali).
  2. In ogni tubo, miscelare 199 μL di tampone di diluizione (componenti A e B forniti nel kit per campione), 1 μL di colorante fluorescente specifico per il rilevamento di miRNA (lunghezza d'onda di misura 260 nm) (per campione) e 2 μL di RNA piccolo (fase 8) per ciascun campione, secondo le istruzioni del produttore.
  3. Prima di leggere le provette campione, leggere i miRNA pre-diluiti standard 1 e standard 2 (forniti nel kit) per creare una curva standard prima della misurazione del campione.
    NOTA: Gli standard sono utilizzati come strumento di confronto per determinare la concentrazione di miRNA misurata nei campioni.
  4. Posizionare ogni provetta standard e campione nel fluorometro dedicato (vedere Tabella dei materiali) per misurare la concentrazione come ng/μL.

10. Determinazione della qualità del miRNA

  1. Determinare la qualità del miRNA e di altri piccoli RNA tramite elettroforesi su gel utilizzando un bioanalizzatore46, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  2. Prima della lettura del campione, normalizzare i campioni in modo che abbiano la stessa concentrazione.
  3. Leggere i campioni attraverso un piccolo chipdi RNA 41,46, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per determinare la qualità del miRNA, le immagini gelatinose (bande) e gli elettroferogrammi (picchi) sono indicatori della qualità del campione. Più scura è la banda nel gel, migliore è la qualità del miRNA. Più leggera è la banda (o se non è presente alcuna banda), minore è la qualità o dimostra la degradazione del campione46,47.

11. arricchimento di microRNA

  1. Arricchire il miRNA utilizzando un piccolo kit di sequenziamento dell'RNA, seguendo le istruzioni del produttore del kit di preparazione del campione di RNA piccolo (vedere Tabella dei materiali).
  2. Ligate ogni campione con un adattatore addenilato da 3' e rimuovete l'adattatore in eccesso tramite pulizia delle perline. Quindi, aggiungere un adattatore da 5 'e rimuovere l'adattatore in eccesso con una pulizia del tallone48.
    NOTA: Sia gli adattatori che le perline per la pulizia sono stati forniti nel piccolo kit di sequenziamento dell'RNA della sezione 11.1 (vedere Tabella dei materiali).
  3. Per sintetizzare il primo filamento, preparare un mix master dei campioni legati con entrambi gli adattatori, il buffer RT e la trascrittasi inversa M-MuLV fornita nel kit (vedere Tabella dei materiali). Quindi, incubare la miscela per 30 minuti a 42 °C e 10 minuti a 90 °C. Follow-up con una pulizia del campione come indicato nelle istruzioni.
  4. Amplificare il 1 ° filamento utilizzando il primer anteriore RT e il primer universale inverso forniti nel kit (vedere Tabella dei materiali) tramite una reazione a catena della polimerasi convenzionale (PCR) per 2 minuti a 95 °C, quindi per 12-25 cicli per 20 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 15 s a 72 °C. Infine, 2 min a 72 °C.
    NOTA: la dimensione del prodotto PCR dovrebbe essere ~ 150 bp (Figura 7).
  5. Misurare la qualità del prodotto PCR tramite stazione nastro seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  6. Sequenziare i campioni utilizzando un sistema di sequenziamento di nuova generazione (75 cicli), seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: per l'arricchimento del miRNA, la quantità e la qualità del campione devono essere controllate (passaggi 9-10) prima della preparazione della libreria.

12. Analisi bioinformatica

  1. Identificare i miRNA conservati e unici utilizzando uno strumento applicativo integrato per l'identificazione dei miRNA.
    NOTA: Nel presente studio, l'identificazione dei miRNA è stata eseguita tramite miRDeep249,50. miRDeep2 è un catalogo online gratuito di tutti i miRNA conservati e nuovi identificati trovati in varie specie49,50 (vedi Tabella dei materiali).
  2. Allineare le letture al genoma corrispondente utilizzando il mappatore integrato con il software.
  3. Immettere i seguenti parametri nel modulo mappatore.
    1. Tagliare le sequenze dell'adattatore aggiunte dal passaggio 11.2 e rimuovere le sequenze lunghe meno di 18 nucleotidi. Rimuovere le sequenze di lettura ridondanti.
    2. Convertire i file utilizzando il parametro di parse in formato FASTA, solo se il file non è in formato FASTA49.
    3. Allineare le sequenze filtrate e tagliate al genoma corrispondente. Se non esiste un genoma per le specie di interesse, allinearsi alle specie omologhe più vicine.
    4. Mostra i file di output come "reads.fa" e "reads_vs_genome.arf". Il "read.fa" conterrà solo le letture non ridondanti e il "reads_vs_genome.arf" includerà le letture mappate allineate al genoma.
  4. Utilizzando entrambi i file di output del passaggio 12.2, eseguire il profilo di espressione del miRNA utilizzando il quantificatore integrato con il software.
    1. Scarica le specie di interesse le sequenze precursori di miRNA e le sequenze di miRNA mature da miRBase 51,52,53,54,55,56. Se non ci sono precursori o sequenze mature per le specie di interesse, scarica le "hairpin.fa.gz" e "mature.fa.gz" che contengono tutti i precursori e le sequenze mature per tutti gli organismi disponibili su miRBase.
    2. Decomprimere i file "hairpin.fa.gz" e "mature.fa.gz".
    3. Immettere i file "reads.fa" e "read_vs_genome.arf" dalla sezione 12.3.4 e i file non compressi dalla sezione 12.4.2.
    4. Leggere i file di output come "outputname.csv",outputname.html" e "outputname.pdf". Il nome del file di output può essere impostato in base allo sperimentatore.
      Nota : il file "nomeprogetto.csv" conterrà i profili di espressione. In particolare, il profilo di espressione avrà l'ID del miRNA, la somma delle letture per tutti i campioni mappati al miRNA, il numero di letture mappate su un miRNA specifico per ciascun campione e l'ID precursore corrispondente ai miRNA maturi. Il "nome di output.html" del passaggio 12.4.4 conterrà i collegamenti al browser del genoma dell'Università di Santa Cruz (USCS), al National Center for Biotechnology Information (NCBI) e a miRBase. USCS e NCBI conterranno le sequenze di query degli attuali precursori contro il database nucleotidico non ridondante e miRBase avrà le informazioni dell'attuale precursore di miRNA. L'"outputname.pdf" avrà la struttura secondaria dell'RNA dei miRNA che vengono espressi e l'allineamento della sequenza precursore.
  5. Per identificare miRNA unici e conservati, utilizzare miRDeep2.
    1. Utilizzare i file di output dei passaggi 12.3.4 e 12.4.2 come file di input.
      Nota : i file di output che vengono letti come "nome di output.html" conterranno le stime dei miRNA univoci e conservati nell'esempio.
    2. Utilizzare i punteggi >1 per il profilo dei miRNA e i punteggi >4 per ulteriori analisi sperimentali, come l'inibizione dei miRNA e l'imitazione dei miRNA endogeni 34,36,57.
    3. Seleziona e identifica i miRNA univoci dalla base miR in base a quanto segue: punteggio miRDeep2 (passaggio 12.5.3), stima della probabilità reale (>90%), valore p significativo del randfold (<0.05) 49,50,56.
      NOTA: L'analisi bioinformatica è stata effettuata tramite miRDeep2 in Cyverse Discovery Environment58,59, una piattaforma online gratuita per l'analisi bioinformatica. I miRNA conservati e unici identificati attraverso miRDeep2 sono stati confrontati con tutte le specie della base miR. La futura identificazione di miRDeep2 può essere confrontata con il genoma corrispondente della specie di interesse.

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Representative Results

Il presente protocollo fornisce una metodologia dettagliata per estrarre i miRNA dalle ghiandole salivari e dai veicoli elettrici. Secondo i risultati, questo protocollo è efficace per l'isolamento dei miRNA da adulti di due diverse specie di zecche, I. scapularis e R. microplus, e può potenzialmente essere utilizzato anche in altre specie di zecche. La concentrazione di veicoli elettrici (particelle/ml) è stata misurata tramite NTA. Per R. microplus, ogni genere e stadio di vita conteneva tre repliche biologiche misurate in tre repliche tecniche. I campioni sono stati separati per genere e fase della vita (Figura 8) per mostrare la variazione all'interno di ciascun campione. Successivamente, i campioni sono stati combinati per visualizzare la variazione e le differenze statistiche utilizzando un ANOVA bidirezionale e i test di confronto multipli di Tukey20 (valore p = < 0,05) (Figura 9). Ogni campione consisteva di ~ 40 ghiandole salivari sezionate da 20 femmine, maschi e ninfe. Dopo l'isolamento e la quantificazione dei veicoli elettrici, i campioni sono stati utilizzati per la purificazione di piccoli RNA.

La concentrazione del piccolo RNA all'interno di ciascun campione è stata misurata tramite Qubit (Tabella 1) e la qualità è stata misurata tramite un bioanalizzatore utilizzando l'elettroforesi su gel standard46,47. Le concentrazioni sono in nanogrammi (Tabella 1) in un volume di 14 μL per entrambe le specie di zecche. Il totale medio delle piccole concentrazioni di RNA dagli organi di I. scapularis variava da 45,92-6.356 ng. La concentrazione di RNA delle vescicole di I. scapularis variava da 72,24-2.128 ng. Per R. microplus, la concentrazione dell'organo variava da 259-2.142 ng e le vescicole variavano da 59,22-1.848 ng. I campioni sono stati normalizzati alla stessa concentrazione e la loro qualità è stata quindi misurata tramite un bioanalizzatore (Figura 10). Una scala di riferimento è stata utilizzata nel gel come marcatore per la valutazione della qualità. L'integrità della banda, l'intensità e i picchi erano rappresentativi della potenziale degradazione o concentrazione totale in ciascun campione. Bande corrispondenti a 5 s e 5,8 s RNA ribosomiali erano presenti solo nei campioni di organi della ghiandola salivare (Figura 10, corsie A-D) e assenti nella vescicola dai campioni di ghiandola salivare (Figura 10, corsie E, F), dimostrando le differenze nei piccoli profili di RNA tra organi e vescicole extracellulari. La degradazione del campione è stata dedotta dall'assenza di bande nel gel; ciò significava che c'era una significativa degradazione del campione. Si raccomanda di scartare tutti i campioni con degradazione significativa.

Per dimostrare la presenza di campioni di miRNA all'interno dei preparati, sono state preparate piccole librerie di cDNA di RNA da campioni di RNA che sono stati conservati per 3-4 mesi dopo un piccolo isolamento di RNA. Curiosamente, in questi campioni è stata trovata una maggiore degradazione del campione. Le corsie A-D e G mostravano segni di degrado; al contrario, E, F e H-K hanno mostrato una degradazione minima e una concentrazione sufficiente per la preparazione della libreria di cDNA di miRNA (Figura supplementare 1). Solo un campione è stato degradato quando i campioni sono stati utilizzati immediatamente dopo la purificazione (Figura 10), suggerendo che i campioni di miRNA erano più inclini alla degradazione una volta purificati dai veicoli elettrici. Pertanto, i campioni E, F, H e I sono stati selezionati per l'analisi di arricchimento. Gli asterischi mostrano le dimensioni della banda di ~ 150 bp, che erano le dimensioni previste dopo la preparazione della libreria cDNA (Figura 7). Le bande deboli inferiori indicano il dimero del primer.

Durante l'isolamento EV, la velocità e il tempo di centrifugazione possono influenzare la concentrazione finale di EV. Quando si pipetta il pellet EV nelle colonne da 300 k, come menzionato in precedenza nel passaggio 6.10, un volume e una velocità ridotti sono essenziali per impedire ai veicoli elettrici di passare attraverso la membrana. Studi precedenti hanno dimostrato che 700 μL a 12.000 x g per 20 minuti utilizzando un concentratore centrifugo diverso era sufficiente per separare correttamente i veicoli elettrici dalle proteine solubili20; tuttavia, basse concentrazioni di EV sono state visualizzate nell'NTA utilizzando un filtro diverso. Pertanto, l'ottimizzazione dei filtri e di altri materiali disponibili è essenziale. Quando si utilizzano per la prima volta le colonne da 300 k, sono stati testati diversi intervalli di velocità per determinare quale ha dato la più alta concentrazione di EV. Il numero di vescicole perse durante la centrifugazione è stato misurato mediante analisi NTA; si è concluso che velocità più basse hanno comportato una maggiore concentrazione di vescicole nel flusso attraverso (non mostrato). Si è concluso che 500 μL a 6.000-8.000 x g erano soddisfacenti per isolare i veicoli elettrici. Una volta determinato questo, questo protocollo è stato utilizzato per isolare le vescicole da I. scapularis e R. microplus. La concentrazione delle vescicole isolate da ciascuna specie di zecche è stata misurata tramite NTA (Figura 8). Le concentrazioni ev variavano tra 7,07 x 107 a 7,94 x 109 particelle/ml. La quantità di EV è correlata con le concentrazioni di miRNA, dove la maggiore quantità di EV ha comportato una maggiore concentrazione di miRNA estratto.

Figure 1
Figura 1: 1 mL di siringhe senza ago caricate con I. scapularis femmina adulta e ricoperte di garza sterilizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il lato dorsale di una femmina ingorgata è stato rimosso con forbici vannas da 4 mm. La femmina è stata immersa in 1x PBS per prevenire l'essiccazione degli organi. Le frecce gialle indicano le ghiandole salivari esposte. La figura è stata scattata con un ingrandimento di 50x con un obiettivo ad alta risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Una piastra di coltura cellulare dopo un'incubazione di 24 ore a 32 °C. La prima fila di pozzetti contiene i mezzi privi di vescicole e le ghiandole salivari sezionate. Il resto dei pozzi contiene 1x PBS con rifampicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Un processo di preparazione del campione per un ciclo di ultracentrifuga. (A) Una siringa senza ago da 10 ml sormontata da un filtro a siringa da 1 μm. (B) Il surnatante dopo tre cicli di centrifugazione viene pipettato nella siringa. (C) Il resto della siringa viene riempito a 10 ml con 1 PBS sterilizzato. (D) La siringa è coperta e il surnatante con 1x PBS viene filtrato nel tubo ultracentrifuga. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Dopo 18 ore di ultracentrifugazione, si forma un pellet di vescicole extracellulari nella parte inferiore del tubo ultracentrifuga. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Un pestello sterilizzato viene utilizzato per omogeneizzare gli organi delle ghiandole salivari e le vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Un'elettroforesi su gel misurata tramite una stazione nastro che visualizza le librerie preparate per i miRNA dopo un'analisi di arricchimento. I campioni provenienti da organi femminili delle ghiandole salivari R. microplus e EV erano basati su una degradazione minima e una concentrazione sufficiente di miRNA per la sintesi della libreria di cDNA. La scala (L) mostra i punti di riferimento nei nucleotidi e i marcatori superiore e inferiore. Gli asterischi indicano le bande di dimensione del prodotto ~ 150 bp, che indicano le piccole librerie di cDNA di RNA. Le bande inferiori mostrano il dimero del primer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Una figura rappresentativa della variazione tra le repliche biologiche (A) femmine, (B) maschi e (C) ninfe. L'asse x mostra la dimensione EV (nm) e l'asse y mostra la concentrazione EV (particelle/mL). Un test di confronto bidirezionale di ANOVA e Tukey ha mostrato differenze statistiche (valore P = < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard per tenere conto della variazione. Ogni campione conteneva 20 zecche con tre repliche biologiche. I campioni sono stati registrati per 60 s, tre volte ciascuno. La telecamera è stata impostata al livello 7 e la soglia di rilevamento è stata impostata al livello 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Una figura rappresentativa della variazione per tutte le repliche biologiche combinate per ninfe (rosso), femmine (blu) e maschi (nero). L'asse x mostra la dimensione EV (nm) e l'asse y visualizza la concentrazione EV (particelle/mL). Un test di confronto bidirezionale di ANOVA e Tukey ha mostrato differenze statistiche (valore P = < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard per tenere conto della variazione. Ogni campione conteneva 20 zecche con tre repliche biologiche. Gli asterischi simboleggiano una differenza significativa di p < 0,05. Ogni registrazione è stata fatta per 60 s, tre volte ciascuna. La telecamera è stata impostata al livello 7 e la soglia di rilevamento è stata impostata al livello 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Un gel rappresentativo tramite il bioanalizzatore. L'elettroforesi su gel è stata eseguita utilizzando una scala di base come riferimento. Una sequenza di miRNA matura è lunga ~ 18-22 nt, dove le bande deboli sono mostrate nell'intervallo di dimensioni designato. Altri piccoli RNA, come piccoli RNA nucleari, RNA messaggeri di trasferimento e RNA regolatori, sono presenti anche nei campioni. Le dimensioni dei piccoli RNA variavano da ~ 20-150 nt. I campioni variano da specie di zecche, tessuti e sesso. Per la corsia G, un esempio di degradazione del campione non mostra bande. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Un'elettroforesi su gel è stata misurata tramite il bioanalizzatore, mostrando la qualità dei miRNA estratti dagli organi delle ghiandole salivari femminili R. microplus e dai veicoli elettrici. La scala (L) mostra le dimensioni di riferimento nei nucleotidi, dove i miRNA maturi misurano ~ 18-22 nt di lunghezza. Le corsie A-D e G mostrano degrado e le corsie E, F e H-K mostrano un degrado minimo. Fare clic qui per scaricare questo file.

Specie Genere Organo/ Vescicola Concentrazione EV concentrazione di miRNA (ng)
R. microplus Femmina Organo N/D 259
R. microplus Femmina Organo N/D 2,142
R. microplus Femmina Vescichetta 1,64 E+08 59.22
R. microplus Femmina Vescichetta 1,64 E+09 1,848
I. scapularis Femmina Organo N/D 45.92
I. scapularis Femmina Organo N/D 6,356
I. scapularis Femmina Vescichetta 1,73E+08 65.66
I. scapularis Femmina Vescichetta 3,14 E+09 2,128

Tabella 1: Un esempio delle concentrazioni di miRNA sia per le ghiandole salivari che per le vescicole extracellulari. La colonna delle concentrazioni di miRNA rappresenta le concentrazioni da più basse a più alte per ogni specie di zecche.

microRNA I. scapularis I. ricinus R. microplus H. longicornis Referenze
miR-8 · Un P P P 33, 36, 37, 43
miR-71 · P P P Un 33, 36, 37, 43
miR-279 · P Un Un P 33, 36, 37, 43
let-7 Un P P P 33, 36, 37, 43

Tabella 2: I miRNA conservati in diverse specie di zecche. (P) indica che i miRNA erano comunemente espressi, o presenti, e (A) indica che i miRNA non erano comunemente espressi o rilevati.

Tipo di campione Numero di punteggi >1* Numero di punteggi >4γ Numero di conservati Numero di romanzi
Maschio 17 0 48,885 23
Femmina 25 0 48,885 21
Ninfe 38 0 48,885 38

Tabella 3. I miRNA conservati e unici sono stati rilevati nei veicoli elettrici per femmine, maschi e ninfe di R. microplus. *punteggio miRNA utilizzato per la profilazione. γpunteggio miRNA utilizzato per esperimenti funzionali.

Tabella supplementare 1: Una tabella che mostra i risultati del sequenziamento di nuova generazioneper i veicoli elettrici dei maschi R. microplus secreti dalle ghiandole salivari. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Una tabella che mostra i risultati del sequenziamento di nuova generazioneper I veicoli elettrici femminili R. microplus secreti dalle ghiandole salivari. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 3: Una tabella che mostra i risultati del sequenziamento di nuova generazioneper gli EV della ninfa R. microplus secreti dalle ghiandole salivari. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

L'attuale protocollo fornisce una metodologia dettagliata per l'estrazione di miRNA dalle ghiandole salivari e dai veicoli elettrici. Tuttavia, ci sono considerazioni importanti, che sono tutte dettagliate nelle note per ogni sezione di questo protocollo. La capsula e la rete a rete devono essere fissate durante l'alimentazione delle zecche per evitare che le zecche fuoriescano. La preparazione e il posizionamento della capsula sono descritti in Koga et al.40. Diverse repliche delle dissezioni delle zecche devono essere eseguite se un campione inadatto viene scartato. Inoltre, possono essere presenti diverse sfide quando si utilizzano tecniche di isolamento EV dal tessuto delle zecche 18,20,43. Ad esempio, i tessuti devono essere mantenuti umidi durante la dissezione per evitare l'essiccazione. Questo viene fatto aggiungendo PBS durante la dissezione. Sia il PBS che i mezzi utilizzati per la dissezione e la coltura degli organi devono essere mantenuti con antibiotici per evitare la contaminazione batterica dal microbioma delle zecche. Questi dovrebbero includere antibiotici che colpiscono i batteri Gram-negativi e Gram-positivi in quanto entrambi possono essere trovati all'interno dei tessuti delle zecche60. Allo stesso modo, durante la dissezione bisogna fare attenzione a diminuire la contaminazione con i tessuti di altri organi. Pertanto, le dissezioni devono essere eseguite lentamente e, man mano che l'utente acquisisce esperienza, è possibile sezionare più zecche. Infine, poiché i veicoli elettrici sono secreti da tutte le cellule, comprese le cellule infette da agenti patogeni, gli studi sulle zecche che conducono l'isolamento dei veicoli elettrici devono utilizzare mezzi e buffer privi di veicoli elettrici per evitare la contaminazione cross-EV25,61.

Tuttavia, questo protocollo consente la riduzione del numero di zecche necessarie per produrre veicoli elettrici salivari di zecche. I protocolli precedenti richiedevano la salivazione di un numero significativamente maggiore di zecche. Ad esempio, i miRNA secreti all'interno dei veicoli elettrici salivari in Haemaphysalis longicornis avevano bisogno della salivazione di 2.000 zecche adulte43. Questo può essere estremamente costoso per i laboratori che non hanno la capacità di allevare le zecche. Allo stesso modo, i tessuti di Amblyomma maculatum utilizzati per l'isolamento EV sono stati parzialmente congelati prima dell'isolamento e trattati con 75 U / mL di collagenasi di tipo 3, che potrebbe influenzare l'autenticità della secrezione EV19. Inoltre, questi studi hanno richiesto 80-100 paia di ghiandole salivari18.

Comparativamente, questo protocollo può essere applicato a più specie di zecche e richiede un basso numero di zecche per isolare i veicoli elettrici ed estrarre miRNA conservati e nuovi di qualità (Tabella 2) 33,36,37,43. Le concentrazioni di miRNA variavano notevolmente, ma erano sufficienti per il sequenziamento di nuova generazione (Tabella 3 e Tabelle supplementari 1-3). Questo protocollo può essere regolato per adattarsi a una dimensione del campione più grande se sono necessarie concentrazioni di miRNA più grandi. Inoltre, i materiali utilizzati in questo protocollo sono sostituibili a seconda della disponibilità del materiale. Tuttavia, i volumi dei campioni e la velocità di centrifugazione devono essere regolati seguendo le istruzioni del produttore per i kit e le colonne utilizzati.

Uno svantaggio di questo metodo è che i miRNA e i veicoli elettrici possono facilmente degradarsi durante le fasi di estrazione e isolamento. Pertanto, il protocollo deve essere realizzato in modo rapido ed efficiente. Quando indicato, i campioni devono essere conservati su ghiaccio e l'estrazione del miRNA deve essere condotta in un ambiente sterilizzato. Inoltre, un trattamento con RNasi può essere effettuato sui veicoli elettrici isolati per eliminare i grandi RNA attaccati alla membrana EV. Ciò può impedire agli RNA di grandi dimensioni di contaminare il campione durante le estrazioni di miRNA. Infine, l'aggiunta di un inibitore della RNAsi al campione di miRNA dopo l'isolamento da veicoli elettrici o organi è un'importante misura preventiva per la degradazione. Questo protocollo può essere modificato e applicato in parallelo agli obiettivi dell'esperimento condotto.

Le applicazioni future per questo protocollo potrebbero includere lo studio delle interazioni patogeno-vettore per capire come i patogeni influenzano il miRNA e altri carichi genomici all'interno dei veicoli elettrici salivari delle zecche. Allo stesso modo, questo protocollo può definire proteine e processi cellulari specifici coinvolti nel confezionamento dei miRNA in EV tick e l'effetto specifico che questi EV e miRNA hanno sulla guarigione delle ferite e sulle risposte immunitarie. A causa della crescente resistenza delle zecche agli acaricidi, c'è un disperato bisogno di metodi di controllo unici. I veicoli elettrici hanno il potenziale per un metodo di controllo alternativo rispetto agli acaricidi. I veicoli elettrici possono essere utilizzati come nano-trasportatori in applicazioniterapeutiche 18,23,61. Nell'uomo, i veicoli elettrici che trasportano miRNA sono stati utilizzati per sopprimere la crescita tumorale durante l'immunoterapia del cancro62,63. Allo stesso modo, nelle zecche, i veicoli elettrici possono trasportare miRNA geneticamente modificati che hanno dimostrato di influenzare le funzioni biologiche vitali delle zecche e la trasmissione di agenti patogeni 36,57,64. La direzione futura è quella di utilizzare questo protocollo per determinare i profili miRNA di più specie di zecche per identificare i miRNA di interesse per gli studi funzionali.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Siamo molto grati per l'assistenza del Cattle Fever tick Laboratory di Edimburgo, in Texas. Vorremmo ringraziare Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado e Homer Vasquez. Vorremmo anche riconoscere l'assistenza di Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario e Stephanie Guzman Valencia durante tutto il progetto. Vorremmo ringraziare il Texas A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group per il loro aiuto e consiglio durante la stesura di questo manoscritto. I seguenti reagenti sono stati forniti dai Centers for Disease Control and Prevention per la distribuzione da BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Le zecche femminili di I. scapularis sono state ricevute anche dalla Tick Rearing Facility dell'Oklahoma State University. Questo progetto è stato finanziato dalla Texas A & M University T3: triads for transformation grant e dall'accordo di cooperazione #58-3094-1-003 dall'USDA-ARS all'AOC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Numero 182 vescicole extracellulari microRNA interfaccia tick-host zecche
Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick <em>Ex Vivo</em> e vescicole extracellulari
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Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, … More

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).

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