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Biology

टिक पूर्व विवो लार ग्रंथि संस्कृतियों और बाह्य पुटिकाओं से माइक्रोआरएनए का अलगाव

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63618
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल टिक लार ग्रंथियों और शुद्ध बाह्य पुटिकाओं से माइक्रोआरएनए के अलगाव का वर्णन करता है। यह एक सार्वभौमिक प्रक्रिया है जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और आपूर्ति को जोड़ती है। विधि टिक्स की एक छोटी संख्या के उपयोग की भी अनुमति देती है, जिसके परिणामस्वरूप गुणवत्ता वाले माइक्रोआरएनए होते हैं जिन्हें आसानी से अनुक्रमित किया जा सकता है।

Abstract

टिक्स महत्वपूर्ण एक्टोपारासाइट्स हैं जो कई रोगजनकों को वेक्टर कर सकते हैं। टिक्स की लार ग्रंथियां खिलाने के लिए आवश्यक हैं क्योंकि उनकी लार में फार्मास्यूटिकल गुणों के साथ कई प्रभावक होते हैं जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कम कर सकते हैं और रोगज़नक़ संचरण को बढ़ा सकते हैं। ऐसे प्रभावकों का एक समूह माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) है। एमआईआरएनए छोटे गैर-कोडिंग अनुक्रम हैं जो टिक-होस्ट इंटरफ़ेस पर और टिक के अंगों के भीतर मेजबान जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं। इन छोटे आरएनए को बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) के माध्यम से टिक लार में ले जाया जाता है, जो अंतर-और इंट्रासेल्युलर संचार की सेवा करते हैं। टिक्स की लार में एमआईआरएनए युक्त पुटिकाओं की पहचान की गई है। हालांकि, टिक लार पुटिकाओं और ग्रंथियों में एमआईआरएनए की भूमिकाओं और प्रोफाइल के बारे में बहुत कम जानकारी है। इसके अलावा, टिक लार में पुटिकाओं और एमआईआरएनए के अध्ययन के लिए टिक लार एकत्र करने के लिए थकाऊ प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पूर्व विवो अंग संस्कृतियों द्वारा उत्पादित शुद्ध बाह्य पुटिकाओं से एमआईआरएनए को अलग करने के लिए एक विधि विकसित और मान्य करना है। बाह्य पुटिकाओं और टिक लार ग्रंथियों से एमआईआरएनए निकालने के लिए आवश्यक सामग्री और पद्धति यहां वर्णित है।

Introduction

टिक्स एक्टोपारासाइट्स हैं जो वन्यजीवों, पशुधन, मनुष्यों और उनके पालतू जानवरों 1,2 के लिए कई रोगजनकों को वेक्टर करते हैं। टिक फीडिंग के परिणामस्वरूप छिपाने के लिए नुकसान, गंभीर एनीमिया के कारण वजन और दूध उत्पादन को कम करने और संभावित घातक बीमारी पैदा करने वाले रोगजनकों 1,3,4,5 के संचरण से महत्वपूर्ण आर्थिक नुकसान होता है। टिक आबादी के प्रबंधन के लिए वर्तमान नियंत्रण प्रथाएं एकारिसाइड्स के उपयोग पर केंद्रित हैं। फिर भी, पशुधन 5,6 को परजीवी बनाने वाले टिक्स में एकारिसाइड प्रतिरोध का निरंतर उद्भव, टिक काटने7 की बढ़ती घटना, और आवासीय क्षेत्रों 8,9 के भीतर रोगज़नक़ संचरण ने अद्वितीय टिक नियंत्रण विकल्पों की आवश्यकता को जन्म दिया है।

टिक लार ग्रंथियां आवश्यक अंग हैं जो टिक की जैविक सफलता सुनिश्चित करते हैं। वे विभिन्न शारीरिक कार्यों के साथ विभिन्न एसिनस प्रकारों (I, II, III और IV) द्वारा बनते हैं। लार ग्रंथियां लार 2,10 के माध्यम से मेजबान को पानी की अधिकता और लौह सामग्री लौटाकर, मेजबान पर और दोनों पर ऑस्मोरग्यूलेशन के लिए जिम्मेदार हैं। टाइप 1 एसिनी भी हीड्रोस्कोपिक लार10,11 के स्राव द्वारा वायुमंडल से पानी के उत्थान में शामिल हैं। लार प्रभावक प्रोटीन, जैसे सीमेंट और सिस्टैटिन, टाइप II और III एसिनी10,12 में स्रावी कोशिकाओं के भीतर उत्पन्न होते हैं। टाइप 1 एसिनी टिक फीडिंग को प्रभावित नहीं करता है, यह दर्शाता है कि ब्लडमील का सेवन इन एसिनी प्रकार13,14 में रूपात्मक और शारीरिक परिवर्तनों को ट्रिगर नहीं करता है। दूसरी ओर, एसिनी प्रकार द्वितीय और तृतीय भोजन के दौरान सक्रिय होते हैं और बहुत कम गतिविधि पूर्व-अनुलग्नक प्रस्तुत करते हैं। इस प्रकार, टाइप II एसिनी के भीतर स्रावी कोशिकाओं के विस्तार और बायोएक्टिव यौगिकों के उत्पादन को ट्रिगर करने के लिए भोजन आवश्यक है। स्रावी कणिकाओं के भीतर स्राव के कारण खिलाने के दौरान टाइप III एसिनी आकार में कम हो जाते हैं12.

लार ग्रंथियां टिक और संचरण के मार्ग में रोगज़नक़ संक्रमण की साइट भी हैं। खिलाने के दौरान, टिक्स फार्मास्यूटिकल प्रभावों के साथ कई यौगिकों का स्राव करते हैं जो रक्तवातंत्र 10,15,16 के सफल समापन के लिए आवश्यक हैं। इन यौगिकों में विरोधी भड़काऊ, इम्यूनोसप्रेसिव और वासोडिलेटरी गुण 10,15,17 होते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि टिक लार ग्रंथियों से प्राप्त बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) इनमें से कई यौगिकों को बंद कर देते हैं, जो विरोधी भड़काऊ और इम्यूनो-मॉड्यूलेटरी प्रभाव 18,19,20 को प्रेरित करते हैं। "बाह्य पुटिका" एक छाता शब्द है जिसका उपयोग पुटिकाओं का वर्णन करने के लिए किया जाता है जिन्हें उनके आकार और बायोजेनेसिस के आधार पर एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। कुल मिलाकर, ईवीएस बाइलेयर झिल्ली के साथ लिपिड ब्लेब्स हैं जो आकार21 में ~ 40 एनएम -1 μm हैं; आम तौर पर, एक्सोसोम को आकार में 40-150 एनएम के रूप में वर्णित किया जाता है, जबकि माइक्रोवेसिकल्स आकार21,22,23 में 150 एनएम -1 μm के बीच होते हैं। हालांकि, आकार ईवीएस बायोजेनेसिस मार्ग22 का संकेत नहीं है।

एक्सोसोम का बायोजेनेसिस प्लाज्मा झिल्ली के अनुक्रमिक आक्रमण के साथ शुरू होता है। यह आक्रमण मल्टीवेसिकुलर निकायों के गठन की ओर जाता है और अंत में ईएससीआरटी परिसरों या स्फिंगोमाइलिनेस (एसमासेस) 24,25 की कार्रवाई से पुटिका झिल्ली के विरूपण में परिणाम होता है। एक्सोसोम को या तो सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए लाइसोसोम के भीतर लाइज़ किया जा सकता है या प्राप्तकर्ता कोशिकाओं21,24 को सेलुलर घटकों को वितरित करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली में पुटिका संलयन के माध्यम से बाहर निकल सकता है। दूसरी ओर, माइक्रोवेसिकल्स फ्लोपास और फ्लिपासेस की कार्रवाई से बनते हैं, प्लाज्मा झिल्ली26 में लिपिड के विरूपण को बदलते हैं। सेल-टू-सेल संचार के लिए ईवीएस आवश्यक हैं, जो इंट्रासेल्युलर कार्गो, जैसे लिपिड, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) 21,27,28 के लिए परिवहन प्रणाली के रूप में कार्य करते हैं। एक बार परिवहन के बाद, ये पुटिकाएं प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में अपने कार्गो को वितरित करती हैं, जिससे प्राप्त सेल22,29 में फेनोटाइपिक परिवर्तन उत्पन्न होते हैं। टिक फीडिंग में बाह्य पुटिकाओं के महत्व और मेजबान प्रतिरक्षा और घाव भरने की प्रतिक्रियाओं18,20 के हेरफेर के कारण, बाह्य पुटिकाओं के भीतर कार्गो एंटी-टिक चिकित्सीय के विकास के लिए संभावित लक्ष्य और टिक फीडिंग को बाधित करने के लिए एक अनूठा तंत्र प्रस्तुत करता है। इसमें टिक लार ग्रंथियों और लार ग्रंथि-व्युत्पन्न बाह्य पुटिकाओं के भीतर एमआईआरएनए शामिल हैं।

एमआईआरएनए छोटे गैर-कोडिंग अनुक्रम हैं, लंबाई में ~ 18-22 न्यूक्लियोटाइड (एनटी), जो एमआरएनएअनुक्रम30,31 को पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से विनियमित, नीचा या चुप्पी कर सकते हैं। प्रतिलेखन के दौरान, प्री-एमआईआरएनए को एक विशिष्ट हेयरपिन जैसी संरचना बनाने के लिए डिसर (आरएनए पोलीमरेज़ III) द्वारा क्लीव किया जाता है, जो प्री-एमआईआरएनए बन जाता है। प्री-एमआईआरएनए को एक परिपक्व एमआईआरएनए डुप्लेक्स बनाने के लिए द्रोशा (आरएनए पोलीमरेज़ III) द्वारा एक बार फिर से काट दिया जाता है। परिपक्व अनुक्रम एमआरएनए अनुक्रम के पूरक आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (आरआईएससी) में एकीकृत हो जाता है, जिससे अनुवाद दमन या एमआरएनए गिरावट 28,30,32 हो जाती है। मेजबान भोजन के दौरान, टिक लार के भीतर एमआईआरएनए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने और रोगज़नक़ संचरण 33,34,35,36,37 को बढ़ाने के लिए मेजबान जीन अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकते हैं। यद्यपि ईवीएस और एमआईआरएनए पर व्यापक अध्ययन मौजूद हैं, टिक-होस्ट इंटरफ़ेस पर खिलाने के दौरान उनकी भूमिकाएं अभी भी खराब समझी जाती हैं। प्रोटोकॉल का अनुकूलन जो आसानी से उच्च गुणवत्ता वाले एमआईआरएनए के अलगाव और शुद्धिकरण में परिणाम कर सकता है, इन विषयों पर हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।

ईवी को अलग करने के लिए कई विकल्पों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, एक्सोसोम वर्षा, बहुलक वर्षा, इम्यूनोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी, और आकार-आधारित बहिष्करण तकनीक38. हालांकि, ये तकनीकें एक्सोसोम या माइक्रोवेसिकल्स के बीच अंतर नहीं कर सकती हैं। इस प्रकार, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ईवी का उपयोग विभिन्न नमूनों से ईवी को अलग करते समय एक छाता शब्द के रूप में किया जाता है। यहां वर्णित प्रयोगों में पृथक पुटिकाएं विभिन्न बायोजेनेसिस मार्गों से प्राप्त पुटिकाओं के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करती हैं। बाह्य पुटिकाओं की एक विशिष्ट आबादी की आगे शुद्धि मार्करों (यानी, एक्सोसोमल मार्कर, ट्यूमर मार्कर) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों का उपयोग करके इम्यूनोप्रेसिपिटेशन द्वारा प्राप्त की जा सकती है, जो ब्याज39,40 की पुटिका आबादी के लिए अद्वितीय है। एमआईआरएनए को विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आइसोलेशन किट 7,41,42 के माध्यम से भी निकाला जा सकता है।

इस परियोजना का उद्देश्य एक प्रोटोकॉल विकसित करना था जो आमतौर पर लागू तरीकों को ईवीएस को अलग करने और ईवी और फेड-टिक लार ग्रंथियों दोनों से एमआईआरएनए निकालने के लिए जोड़ता है। क्योंकि बायोएक्टिव यौगिकों का स्राव12 खिलाकर सक्रिय होता है, इसलिए टिक्स को एमआईआरएनए की पहचान करने के लिए खिलाने की अनुमति दी जानी चाहिए जो मेजबान प्रतिरक्षा और घाव भरने की प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल को ईवीएस और उनके संबंधित एमआईआरएनए को अलग करने के लिए कम संख्या में टिक (20 टिक) की आवश्यकता होती है, अन्य पहले वर्णित अध्ययनों की तुलना में जिनके लिए 2000 टिक्स43 की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यहपिलोकार्पिन 44 के साथ लार स्राव के संदूषण से बचा जाता है, जो मेजबान कोशिकाओं पर ईवीएस और उनके एमआईआरएनए के प्रभाव का अध्ययन करने वाले प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है।

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Protocol

टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (एआईसीयूसी) द्वारा अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल (एयूपी # 2020-0026) के बाद सभी पशु प्रयोग किए गए थे। टिक प्रजातियों, इक्सोड्स स्कैपुलरिस और राइपिसेफालस (बूफिलस) माइक्रोप्लस, और न्यूजीलैंड नर सफेद खरगोश, 42-72 दिन की उम्र, वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए गए थे। स्कैपुलरिस रोग नियंत्रण केंद्र (सीडीसी) और ओक्लाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी से प्राप्त किया गया था, जिसे रोगज़नक़ मुक्त के रूप में प्रमाणित किया गया था। माइक्रोप्लस एडिनबर्ग, टेक्सास में कैटल फीवर टिक रिसर्च लेबोरेटरी में पाला गया था। खरगोश वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए गए थे (सामग्री की तालिका देखें)। यह प्रोटोकॉल सार्वभौमिक रूप से विभिन्न टिक प्रजातियों, जीवन चरणों और ऊतकों से बाह्य पुटिकाओं और एमआईआरएनए को अलग कर सकता है।

1. मादा आई स्कैपुलरिस और कैप्सूल की तैयारी का पालन

  1. हार्ड टिक-फीडिंग खरगोशों के लिए प्रक्रियाओं के बाद एक एथिलीन-विनाइल एसीटेट फोम कैप्सूल तैयार करें45. प्रति संक्रमण कुल दो कैप्सूल के लिए खरगोश के प्रत्येक कंधे के ब्लेड पर एक कैप्सूल रखें।
    नोट: संक्षेप में, इन कैप्सूल में एक अंदरूनी खाली जगह के साथ एथिलीन-विनाइल एसीटेट फोम के दो वर्ग होते हैं। एक वर्ग एक ऊतक चिपकने वाला ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ जानवर (इस मामले में, खरगोश) के पीछे चिपका हुआ है। टिक्स के पलायन से बचने के लिए ठीक जाल को दूसरे वर्ग से चिपकाया जाता है। दो वर्गों को स्वयं चिपकने वाला हुक टेप का उपयोग करके बंद कर दिया जाता है।
  2. खरगोशों पर कैप्सूल का पालन करने से पहले कैप्सूल को 24 घंटे के लिए सेट करने की अनुमति दें। फोम कैप्सूल को कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: कैप्सूल कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. मुंडा-से-त्वचा खरगोशों के लिए कैप्सूल का पालन करें और टिक संक्रमण से पहले 24 घंटे के लिए छोड़ दें।

2. पुटिका मुक्त मीडिया की तैयारी

  1. पुटिका मुक्त मीडिया13 तैयार करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम के 0.5 एमएल, ट्रिप्टोज फॉस्फेट शोरबा के 0.5 एमएल, 10% लिपोप्रोटीन-कोलेस्ट्रॉल ध्यान केंद्रित के 0.1 एमएल, 5% सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3) के 0.5 एमएल, 4- (2-हाइड्रॉक्सीथिल) -1-पिपराज़ीन के 0.25 एमएल को मिलाएं आवश्यकतानुसार माध्यम की मात्रा समायोजित करें। माध्यम को 26.3 एमएल पॉली कार्बोनेट अपकेंद्रित्र की बोतल में रखें।
  2. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के उचित कामकाज को सुनिश्चित करने के लिए बोतलों को अधिकतम 0.01 ग्राम के वजन अंतर से संतुलित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 एक्स जी पर 18 घंटे के लिए माध्यम को अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज करें। विंदुक के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला निकालें, ध्यान से किसी भी गोली का गठन परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और उचित संतुलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 एक्स जी पर 18 घंटे के लिए दूसरी बार अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज करें।
  5. शेष सतह पर तैरनेवाला को अलग करें और दूषित पदार्थों को हटाने के लिए 0.22 μm सिरिंज फिल्टर से गुजरें। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला विंदुक।
  6. सतह पर तैरनेवाला को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें जब तक कि आवश्यक न हो या 3 साल तक।

3. खरगोश का संक्रमण

  1. एक मानक पेंटब्रश का उपयोग करके 10 मिलीलीटर सिरिंज से शीर्ष काटें और वयस्क आई स्कैपुलरिस मादाओं को लोड करें।
  2. बाँझ धुंध (चित्रा 1) का उपयोग कर सिरिंज खोलने को कवर करें।
  3. खरगोश को टेबल-टॉप या एक कामकाजी सतह पर क्षैतिज रूप से रखें; खरगोश को एक तौलिया के साथ कसकर लपेटें और दोनों आंखों को कवर करें, तैयार कैप्सूल (चरण 1.1) को टिक्स के साथ खरगोश को संक्रमित करने के लिए उजागर करें।
  4. कैप्सूल खोलें और सिरिंज हैंडल को धक्का देकर टिक्स डालें। खरगोश की त्वचा के करीब टिक्स जमा करें। टिक्स को भागने से रोकने के लिए कैप्सूल को जल्दी से बंद करें।
  5. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार, मादा टिक्स को आवश्यकतानुसार लंबे समय तक खिलाने की अनुमति दें। निर्जलीकरण से बचने के लिए पुरुष इक्सोड्स स्कैपुलरिस को कैप्सूल में 24 घंटे से अधिक समय तक रहने की अनुमति न दें।
    नोट: जानवरों में संक्रमित होने वाले टिक्स की संख्या अन्वेषक के विवेक पर है। इस प्रोटोकॉल ने मृत्यु दर और प्रतिकृति के लिए पर्याप्त सामग्री के लिए खाते में ~ 100 टिक प्रति संक्रमण का उपयोग किया। प्रारंभिक प्रयोगों ने निर्धारित किया कि एमआईआरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए कम से कम 20 टिक /

4. खिलाया मादाओं को हटाने

  1. गैस विसारक का उपयोग करके ऑक्सीजन में 2% आइसोफ्लूरेन के तहत संक्रमित खरगोशों को रखें। 700-1000 एल / मिनट के बीच ऑक्सीजन दर सेट करें।
    नोट: अन्य संवेदनाहारी का उपयोग किसी भी संकट या दर्द से बचने के लिए किया जा सकता है।
  2. ठीक संदंश का उपयोग करके, जितना संभव हो सके त्वचा के करीब, उनके कैपिटुलम द्वारा टिक्स को पकड़कर खिलाया मादाओं को हटा दें। सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया के संक्रमण से बचने के लिए माउथपार्ट्स पूरी तरह से हटा दिए गए हैं।
  3. टिक्स को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ काटने की साइट को साफ करें और टिक काटने की साइट पर संक्रमण को रोकने के लिए ट्रिपल एंटीबायोटिक ( उंगलियों के लायक, सामग्री की तालिका देखें) की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
  5. विच्छेदन (चरण 5) के लिए प्रयोगशाला में टिक्स ले जाएं। लार ग्रंथियों15,43 के क्षरण से बचने के लिए टिक्स को हटाने के 24-48 घंटे के भीतर इन विच्छेदनों को निष्पादित करें।

5. लार ग्रंथि विच्छेदन और बाह्य पुटिका स्राव

  1. प्रत्येक कुएं में 100x पेनिसिलिन के 5 μL के साथ पुटिका मुक्त माध्यम (चरण 2) के 500 μL, 100x स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 μL, रिफैम्पिसिन के 10 मिलीग्राम / एमएल के 5 μL, और 100x एम्फोटेरिसिन के 5 μL के साथ जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए पुटिका मुक्त माध्यम वाले किसी भी कुएं में रिफैम्पिसिन के साथ 1 एक्स पीबीएस जोड़ें।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत डबल पक्षीय कालीन टेप के साथ एक स्पष्ट सूक्ष्म ग्लास स्लाइड पर टिक रखें। अंग निर्जलीकरण को रोकने के लिए, विच्छेदन से पहले प्रत्येक टिक में 1x पीबीएस के 10 μL जोड़ें।
  3. 4 मिमी वन्नास कैंची का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), प्रत्येक महिला के पक्ष में ~ 1 मिमी का एक छोटा चीरा बनाएं। टिक (चित्रा 2) के पृष्ठीय पक्ष को पूरी तरह से हटा दें और दोनों लार ग्रंथियों को हटा दें।
  4. पुटिका मुक्त माध्यम के 500 μL में 20-40 टिक लार ग्रंथियों रखो एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति इलाज प्लेट (चित्रा 3) में एक अच्छी तरह से जोड़ा।
  5. ईवीएस के स्राव की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर लार ग्रंथि के नमूनों सेते हैं।

6. बाह्य पुटिकाओं का अलगाव

  1. 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, पिपेट सभी माध्यम एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में लार ग्रंथियों युक्त।
  2. लार ग्रंथियों को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 एक्स जी पर नमूना अपकेंद्रित्र। इस चरण में दो चरणों को अलग किया जाएगा: (1) ईवीएस युक्त सतह पर तैरनेवाला और (2) लार ग्रंथियां (गोली)।
  3. ईवीएस के अलगाव को जारी रखने के लिए, सतह पर तैरनेवाला को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। आरएनएएलेटर के 500 μL में लार ग्रंथियों (चरण 6.2) युक्त गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और उपयोग किए जाने तक या अनिश्चित काल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इन लार ग्रंथियों चरण 8 में एमआईआरएनए अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2000 एक्स जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। पिपेट सतह पर तैरनेवाला एक नया 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में। गोली को त्यागें।
  5. एपोप्टोटिक निकायों और बड़े ईवीएस को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। गोली टॉस, और एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पिपेट।
  6. एक 1 μm नायलॉन सिरिंज फिल्टर करने के लिए एक 10 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न करें। सिरिंज रखें और एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्रा 4 ए) के ऊपर फ़िल्टर करें। फिर नमूना (चित्रा 4 बी) जोड़ें और 1 एक्स पीबीएस (चित्रा 4 सी) के 10 एमएल के साथ सिरिंज भरें, और तदनुसार ट्यूब को संतुलित करें (चित्रा 4 डी)।
  7. एक 70 टीआई रोटर में ट्यूब रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए 100,000 एक्स जी पर स्पिन करें।
  8. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के 18 घंटे के बाद, ट्यूब के निचले छोर पर एक गोली का निरीक्षण करें (चित्रा 5)। गोली केंद्रित बाह्य पुटिका है।
  9. ईवी गोली को फिर से निलंबित किए बिना सतह पर तैरनेवाला का 90% -100% निकालें। 1x पीबीएस के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। यदि सभी सतह पर तैरनेवाला हटाया नहीं जा सकता है, तो गोली को फिर से निलंबित करने के लिए शेष सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।
  10. पिपेट 500 μL एक 300 कश्मीर केन्द्रापसारक फिल्टर में ईवी गोली/सतह पर तैरनेवाला ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यह किसी भी गैर-पुटिका से जुड़े प्रोटीन, एमआईआरएनए और अन्य अणुओं को हटा देगा, जबकि पुटिकाएं फिल्टर से नहीं गुजरेंगी।
  11. परिवेश के तापमान पर 10 मिनट के लिए 8,000 x g पर अपकेंद्रित्र। चरण 6.10 दोहराएं जब तक कि सभी ईवी छर्रों/सतह पर तैरनेवाला फिल्टर के माध्यम से पारित न हो जाएं।
  12. कॉलम में निष्फल 1 एक्स पीबीएस के 400 μL जोड़ें और झिल्ली से जुड़े ईवीएस को हटाने के लिए पिपेट के माध्यम से अच्छी तरह से मिलाएं। नमूने को 1.5 एमएल डीएनएएसई-/आरएनएएसई-मुक्त ट्यूब में रखें। नमूने अनिश्चित काल तक या उपयोग किए जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। नमूना गिरावट को रोकने के लिए अत्यधिक नमूना विगलन से बचें।
    नोट: ईवी गिरावट को रोकने के लिए अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज से बाहर निकाले जाने पर बर्फ पर ट्यूब रखें। अंतिम नमूना 1x पीबीएस के 400 μL में ईवी गोली होगी। इस नमूने के 25 μL नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA, चरण 7), और एमआईआरएनए अलगाव (चरण 8) के लिए 375 μL के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

7. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)

  1. अंतिम नमूना (चरण 6.12) के 25 μL ले लो और 1x पीबीएस के 375 μL जोड़ें।
  2. पतला नमूना को 1 एमएल सुई-कम सिरिंज में लोड करें और एनटीए के ऑप्टिकल लेंस पर कसकर पेंच करें।
  3. तदनुसार सेटिंग्स समायोजित करें और वरीयताओं को सेट करने के आधार पर वीडियो कैप्चर करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, प्रत्येक 60 एस के तीन रीडिंग लिए गए थे। प्रत्येक एनटीए रीडिंग एक तकनीकी प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करती है। समय की एक ही लंबाई के लिए टिक फीडिंग से विभिन्न नमूने व्यक्तिगत जैविक प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कैमरा स्तर 7 पर सेट किया गया था और पहचान सीमा स्तर 5 पर सेट की गई थी।
  4. निम्नलिखित सूत्र द्वारा अंतिम ईवी संख्याओं का अनुमान लगाएं:
    ((ईवीएस एकाग्रता (कमजोर पड़ने का कारक)) * (नमूना ट्यूब में छोड़ी गई कुल मात्रा)/1000) = नमूने में कुल ईवीएस
    नोट: वॉल्यूम को 1000 से विभाजित किया जाना चाहिए क्योंकि एनटीए नमूनों को एकाग्रता /

8. लार ग्रंथियों और बाह्य पुटिकाओं से एमआईआरएनए निष्कर्षण

  1. चरण 6.12 से शेष नमूने के लिए लाइसिस अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL जोड़ें और निष्फल मूसल (चित्रा 6) के साथ समरूप करें।
  2. लाइसिस अभिकर्मक के शेष 600 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. क्लोरोफॉर्म के 140 μL जोड़ें, 15 एस के लिए सख्ती से हिलाएं, और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर स्पिन।
  5. पिपेट स्पष्ट शीर्ष चरण, इंटरफ़ेज़ से परहेज, एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में। यह अपेक्षित नमूना मात्रा के ~ 525 μL में परिणाम होगा। अगला, 100% आणविक ग्रेड इथेनॉल की 1: 1 मात्रा जोड़ें।
  6. एक आरएनए अलगाव स्पिन कॉलम में नमूने के 700 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. परिवेश के तापमान पर 30 एस के लिए 8,000 एक्स जी पर स्पिन करें, प्रवाह-थ्रू को त्यागें।
  8. आरटीई बफर के 700 μL के साथ नमूना धो लें ( सामग्री की तालिका देखें), 30 एस के लिए 8,000 x g पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  9. आरपीई बफर के 500 μL के साथ नमूना धो लें ( सामग्री की तालिका देखें), 30 एस के लिए 8,000 x g पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  10. 80% आणविक ग्रेड इथेनॉल के 500 μL जोड़ें और 2 मिनट के लिए 8,000 x g पर स्पिन, प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  11. झिल्ली सूखने के लिए 5 मिनट के लिए अधिकतम वेग पर स्तंभ स्पिन। संग्रह ट्यूब को त्यागें और कॉलम को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब पर रखें।
  12. झिल्ली में आरएनएएसई-/डीएनएएसई मुक्त पानी के 14 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  13. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 21,000 x g पर अपकेंद्रित्र।
  14. एल्यूटेड एमआईआरएनए में आरएनएएसई अवरोधक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 μL जोड़ें और पिपेट के माध्यम से अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: लार ग्रंथियों से एमआईआरएनए निष्कर्षण से पहले, 1 एक्स पीबीएस (1: 1 मात्रा) के 1 मिलीलीटर जोड़कर किसी भी आरएनएलेटर को हटा दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अधिकतम वेग पर लार ग्रंथियों को स्पिन करें। इसे तीन बार दोहराया जाना चाहिए या जब तक लार ग्रंथियां सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए पर्याप्त रूप से कम नहीं हो जाती हैं। इस बिंदु पर, नमूना आकार में ~ 20-150 बीपी (पूरक चित्रा 1) के छोटे आरएनए के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करता है।

9. एमआईआरएनए एकाग्रता को मापना

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए परख किट41 के माध्यम से छोटे आरएनए की एकाग्रता को मापें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रत्येक ट्यूब में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कमजोर पड़ने वाले बफर (घटक ए और बी प्रति नमूना किट में प्रदान किए गए घटक ए और बी), एमआईआरएनए (माप तरंग दैर्ध्य 260 एनएम) (प्रति नमूना) का पता लगाने के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई के 1 μL, और प्रत्येक नमूने के लिए छोटे आरएनए (चरण 8) के 2 μL मिश्रण।
  3. नमूना ट्यूबों को पढ़ने से पहले, नमूना माप से पहले एक मानक वक्र बनाने के लिए पूर्व-पतला एमआईआरएनए मानक 1 और मानक 2 (किट में प्रदान किया गया) पढ़ें।
    नोट: नमूनों में मापा एमआईआरएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मानकों का उपयोग तुलना उपकरण के रूप में किया जाता है।
  4. μL के रूप में एकाग्रता को मापने के लिए समर्पित फ्लोरोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) में प्रत्येक मानक और नमूना ट्यूब रखें।

10. एमआईआरएनए गुणवत्ता का निर्धारण

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए बायोएनालाइज़र46 का उपयोग करके जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से एमआईआरएनए और अन्य छोटे आरएनए की गुणवत्ता निर्धारित करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नमूना पढ़ने से पहले, नमूनों को एक ही एकाग्रता होने के लिए सामान्य करें।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक छोटे आरएनए चिप41,46 के माध्यम से नमूने पढ़ें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एमआईआरएनए गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए, जेल जैसी छवियां (बैंड) और इलेक्ट्रोफेरोग्राम (चोटियां) नमूना गुणवत्ता के संकेतक हैं। जेल में बैंड जितना गहरा होगा, एमआईआरएनए क्वालिटी उतनी ही बेहतर होगी। बैंड जितना हल्का होगा (या यदि कोई बैंड मौजूद नहीं है), गुणवत्ता उतनी ही खराब होगी या नमूना गिरावट46,47 साबित होगी।

11. माइक्रोआरएनए संवर्धन

  1. छोटे आरएनए नमूना तैयारी किट के निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, एक छोटे आरएनए अनुक्रमण किट का उपयोग करके एमआईआरएनए को समृद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रत्येक नमूने को 3 'एडेनिलेटेड एडाप्टर के साथ लिगेट करें और मनका सफाई के माध्यम से अतिरिक्त एडाप्टर को हटा दें। अगला, एक 5 'एडाप्टर जोड़ें और एक मनका क्लीनअप48 द्वारा अतिरिक्त एडाप्टर को हटा दें।
    नोट: सफाई के लिए एडाप्टर और मोती दोनों धारा 11.1 से छोटे आरएनए अनुक्रमण किट में प्रदान किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. पहले स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए, किट में प्रदान किए गए एडाप्टर, आरटी बफर और एम-एमयूएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस दोनों के साथ लिगेटेड नमूनों का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अगला, 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 90 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं। निर्देशों में बताए गए अनुसार नमूना सफाई के साथ अनुवर्ती।
  4. 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए पारंपरिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से किट में प्रदान किए गए आरटी फॉरवर्ड प्राइमर और रिवर्स यूनिवर्सल प्राइमर का उपयोग करके 1 स्ट्रैंड को बढ़ाएं (सामग्री की तालिका देखें), फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए 12-25 चक्रों के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस। अंत में, 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट।
    नोट: पीसीआर उत्पाद का आकार ~ 150 बीपी (चित्रा 7) होने की उम्मीद है।
  5. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए टेप स्टेशन के माध्यम से पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रणाली (75 चक्र) का उपयोग करके नमूनों को अनुक्रमित करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एमआईआरएनए संवर्धन के लिए, पुस्तकालय की तैयारी से पहले नमूना मात्रा और गुणवत्ता (चरण 9-10) की जांच की जानी चाहिए।

12. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

  1. एमआईआरएनए पहचान के लिए एक एकीकृत अनुप्रयोग उपकरण का उपयोग करके संरक्षित और अद्वितीय एमआईआरएनए की पहचान करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, एमआईआरएनए पहचान एमआईआरडीईपी 249,50 के माध्यम से की गई थी। एमआईआरडीईपी 2 विभिन्न प्रजातियों 49,50 में पाए जाने वाले सभी पहचाने गए संरक्षित और उपन्यास एमआईआरएनए की एक मुफ्त ऑनलाइन सूची है (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सॉफ्टवेयर के साथ एकीकृत मैपर का उपयोग करके संबंधित जीनोम के लिए रीड्स को संरेखित करें।
  3. मैपर मॉड्यूल में निम्नलिखित पैरामीटर इनपुट करें।
    1. चरण 11.2 से जोड़े गए एडाप्टर अनुक्रमों को ट्रिम करें और 18 न्यूक्लियोटाइड से कम लंबे अनुक्रमों को हटा दें। अनावश्यक पठन अनुक्रम निकालें।
    2. पार्स का उपयोग कर फ़ाइलों को फास्टा प्रारूप पैरामीटर में कनवर्ट करें, केवल अगर फ़ाइल FASTA प्रारूप49 में नहीं है।
    3. फ़िल्टर किए गए और छंटनी किए गए अनुक्रमों को संबंधित जीनोम में संरेखित करें। यदि ब्याज की प्रजातियों के लिए कोई जीनोम नहीं है, तो निकटतम समरूप प्रजातियों को संरेखित करें।
    4. आउटपुट फ़ाइलों को "रीड्स.एफए" और "reads_vs_genome.एआरएफ" के रूप में दिखाएं। "Read.fa" में केवल गैर-अनावश्यक रीड्स होंगे, और "reads_vs_genome.arf" में जीनोम से संरेखित मैप किए गए रीड्स शामिल होंगे।
  4. चरण 12.2 से दोनों आउटपुट फ़ाइलों का उपयोग करके, सॉफ़्टवेयर के साथ एकीकृत क्वांटिफायर का उपयोग करके एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग करें।
    1. ब्याज एमआईआरएनए अग्रदूत अनुक्रमों की प्रजातियों और एमआईआरबेस 51,52,53,54,55,56 से परिपक्व एमआईआरएनए अनुक्रम डाउनलोड करें। यदि ब्याज की प्रजातियों के लिए कोई अग्रदूत या परिपक्व अनुक्रम नहीं हैं, तो "हेयरपिन.एफए.gz" और "परिपक्व.एफए.gz" डाउनलोड करें जिसमें एमआईआरबेस पर उपलब्ध सभी जीवों के लिए सभी अग्रदूत और परिपक्व अनुक्रम शामिल हैं।
    2. "हेयरपिन.एफए.gz" और "परिपक्व.एफए.gz" फ़ाइलों को अनकंप्रेस करें।
    3. अनुभाग 12.3.4 से "रीड्स.एफए" और "read_vs_genome.arf" फ़ाइलें और 12.4.2 से असम्पीडित फ़ाइलें इनपुट करें।
    4. आउटपुट फ़ाइलों को "आउटपुट नाम.csv", आउटपुट नाम.html", और "आउटपुट नाम.pdf" के रूप में पढ़ें। आउटपुट फ़ाइल नाम अन्वेषक के अनुसार सेट किया जा सकता है।
      नोट:: "आउटपुट नाम.csv" फ़ाइल अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल शामिल होंगे। विशेष रूप से, अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में एमआईआरएनए आईडी होगी, एमआईआरएनए में मैप किए गए सभी नमूनों के लिए पढ़ने का योग, प्रत्येक नमूने के लिए एक विशिष्ट एमआईआरएनए में मैप किए गए रीड्स की संख्या, और परिपक्व एमआईआरएनए के अनुरूप अग्रदूत आईडी। चरण 12.4.4 से "आउटपुटनाम.html" में सांताक्रूज जीनोम ब्राउज़र विश्वविद्यालय (यूएससीएस), नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (एनसीबीआई), और एमआईआरबेस के लिंक होंगे। यूएससीएस और एनसीबीआई में गैर-अनावश्यक न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस के खिलाफ वर्तमान अग्रदूतों के क्वेरी अनुक्रम होंगे, और एमआईआरबेस में वर्तमान एमआईआरएनए अग्रदूत की जानकारी होगी। "आउटपुट नाम.pdf" में एमआईआरएनए की आरएनए माध्यमिक संरचना होगी जो व्यक्त की जाती है और अग्रदूत अनुक्रम का संरेखण होता है।
  5. अद्वितीय और संरक्षित एमआईआरएनए की पहचान करने के लिए, एमआईआरडीईपी 2 का उपयोग करें।
    1. इनपुट फ़ाइलों के रूप में चरण 12.3.4 और चरण 12.4.2 से आउटपुट फ़ाइलों का उपयोग करें।
      नोट: "आउटपुट नाम.html" के रूप में पढ़ने वाली आउटपुट फ़ाइलों में नमूने में अद्वितीय और संरक्षित एमआईआरएनए की भविष्यवाणियां होंगी।
    2. एमआईआरएनए प्रोफाइलिंग के लिए स्कोर >1 का उपयोग करें और आगे प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए स्कोर >4, जैसे कि एमआईआरएनए निषेध और अंतर्जात एमआईआरएनए 34,36,57 की नकल करना।
    3. निम्नलिखित के आधार पर एमआईआरबेस से अद्वितीय एमआईआरएनए का चयन करें और पहचानें: एमआईआरडी2 स्कोर (चरण 12.5.3), सही संभावना का अनुमान (>90%), महत्वपूर्ण रैंडफोल्ड पी-वैल्यू (<0.05)49,50,56।
      नोट: जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण साइवर्स डिस्कवरी पर्यावरण58,59 में एमआईआरडीईपी 2 के माध्यम से किया गया था, जो जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए एक मुफ्त ऑनलाइन मंच है। एमआईआरडीईपी 2 के माध्यम से पहचाने गए संरक्षित और अद्वितीय एमआईआरएनए की तुलना एमआईआरबेस की सभी प्रजातियों के खिलाफ की गई थी। भविष्य के एमआईआरडीईपी 2 पहचान की तुलना ब्याज की प्रजातियों के संबंधित जीनोम के खिलाफ की जा सकती है।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल लार ग्रंथियों और ईवीएस से एमआईआरएनए निकालने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है। परिणामों के अनुसार, यह प्रोटोकॉल दो अलग-अलग टिक प्रजातियों, आई स्कैपुलरिस और आर माइक्रोप्लस के वयस्कों से एमआईआरएनए के अलगाव के लिए प्रभावी है, और संभावित रूप से अन्य टिक प्रजातियों में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। ईवीएस एकाग्रता (कणों / एमएल) को एनटीए के माध्यम से मापा गया था। माइक्रोप्लस के लिए, प्रत्येक लिंग और जीवन चरण में तीन तकनीकी प्रतिकृतियों में मापा गया तीन जैविक प्रतिकृतियां थीं। नमूने प्रत्येक नमूने के भीतर भिन्नता दिखाने के लिए लिंग और जीवन चरण (चित्रा 8) द्वारा अलग किए गए थे। अगला, नमूनों को दो-तरफ़ा एनोवा और तुकी के कई तुलना परीक्षण20 (पी-वैल्यू = <0.05) (चित्रा 9) का उपयोग करके भिन्नता और सांख्यिकीय मतभेदों को प्रदर्शित करने के लिए जोड़ा गया था। प्रत्येक नमूने में ~ 40 लार ग्रंथियां शामिल थीं जो 20 महिलाओं, पुरुषों और अप्सराओं से विच्छेदित थीं। ईवीएस के अलगाव और मात्रा का ठहराव के बाद, नमूनों का उपयोग छोटे आरएनए शुद्धिकरण के लिए किया गया था।

प्रत्येक नमूने के भीतर छोटे आरएनए की एकाग्रता को क्यूबिट (तालिका 1) के माध्यम से मापा गया था, और गुणवत्ता को मानक जेल वैद्युतकणसंचलन46,47 का उपयोग करके बायोएनालाइज़र के माध्यम से मापा गया था। सांद्रता दोनों टिक प्रजातियों के लिए 14 μL मात्रा में नैनोग्राम (तालिका 1) में हैं। स्कैपुलेरिस अंगों से छोटे आरएनए सांद्रता का औसत कुल 45.92-6,356 एनजी से था। स्कैपुलरिस पुटिकाओं की आरएनए एकाग्रता 72.24-2,128 एनजी से लेकर थी। माइक्रोप्लस के लिए, अंग एकाग्रता 259-2,142 एनजी से लेकर, और पुटिकाएं 59.22-1,848 एनजी तक थीं। नमूनों को एक ही एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और उनकी गुणवत्ता को तब बायोएनालाइज़र (चित्रा 10) के माध्यम से मापा गया था। गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए मार्कर के रूप में जेल में एक संदर्भ सीढ़ी का उपयोग किया गया था। बैंड अखंडता, तीव्रता और चोटियां प्रत्येक नमूने में संभावित गिरावट या कुल एकाग्रता के प्रतिनिधि थे। 5 एस और 5.8 एस राइबोसोमल आरएनए के अनुरूप बैंड केवल लार ग्रंथि अंग नमूनों (चित्रा 10, लेन ए-डी) में मौजूद थे और लार ग्रंथि के नमूनों (चित्रा 10, लेन ई, एफ) से पुटिका में अनुपस्थित थे, अंगों और बाह्य पुटिकाओं के बीच छोटे आरएनए प्रोफाइल में अंतर का प्रदर्शन करते हैं। जेल में बैंड की अनुपस्थिति से नमूना गिरावट का अनुमान लगाया गया था; यह दर्शाता है कि महत्वपूर्ण नमूना गिरावट थी। यह अनुशंसा की जाती है कि महत्वपूर्ण गिरावट वाले किसी भी नमूने को त्याग दिया जाए।

तैयारी के भीतर एमआईआरएनए नमूनों की उपस्थिति का प्रदर्शन करने के लिए, छोटे आरएनए सीडीएनए पुस्तकालयों को आरएनए नमूनों से तैयार किया गया था जिन्हें छोटे आरएनए अलगाव के बाद 3-4 महीने तक संग्रहीत किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि इन नमूनों में उच्च नमूना गिरावट पाई गई थी। लेन ए-डी और जी ने गिरावट के संकेत दिखाए; इसके विपरीत, ई, एफ, और एच-के ने एमआईआरएनए सीडीएनए लाइब्रेरी प्रेप (पूरक चित्रा 1) के लिए न्यूनतम गिरावट और पर्याप्त एकाग्रता दिखाई। केवल एक नमूना अपमानित किया गया था जब नमूनों को शुद्धिकरण (चित्रा 10) के तुरंत बाद इस्तेमाल किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि एमआईआरएनए नमूने ईवीएस से शुद्ध होने के बाद गिरावट के लिए अधिक प्रवण थे। इस प्रकार, नमूने ई, एफ, एच, और मुझे संवर्धन विश्लेषण के लिए चुना गया था। तारांकन ~ 150 बीपी के बैंड आकार दिखाते हैं, जो सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी (चित्रा 7) के बाद अपेक्षित आकार थे। निचले बेहोश बैंड प्राइमर डिमर को इंगित करते हैं।

ईवी अलगाव के दौरान, सेंट्रीफ्यूजेशन वेग और समय अंतिम ईवी एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है। ईवी गोली को 300 के कॉलम में पाइप करते समय, जैसा कि चरण 6.10 में पहले उल्लेख किया गया है, ईवीएस को झिल्ली से गुजरने से रोकने के लिए कम मात्रा और वेग आवश्यक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि घुलनशील प्रोटीन 20 से ईवीएस को ठीक से अलग करने के लिए एक अलग केन्द्रापसारक सांद्रक का उपयोग करके 20 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर700 μL घुलनशील प्रोटीन 20 से ईवीएस को ठीक से अलग करने के लिए पर्याप्त था; हालाँकि, एक अलग फ़िल्टर का उपयोग करके एनटीए में कम ईवी सांद्रता प्रदर्शित की गई थी। इस प्रकार, फिल्टर और अन्य उपलब्ध सामग्रियों का अनुकूलन आवश्यक है। जब पहली बार 300 के कॉलम का उपयोग किया जाता है, तो यह निर्धारित करने के लिए विभिन्न वेग अंतराल का परीक्षण किया गया था कि कौन सा उच्चतम ईवी एकाग्रता देता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान खोए जा रहे पुटिकाओं की संख्या एनटीए विश्लेषण द्वारा मापा गया था; यह निष्कर्ष निकाला गया था कि कम गति के परिणामस्वरूप प्रवाह-थ्रू (नहीं दिखाया गया) में उच्च पुटिका एकाग्रता हुई। यह निष्कर्ष निकाला गया था कि 6,000-8,000 x g पर 500 μL ईवीएस को अलग करने के लिए संतोषजनक था। एक बार जब यह निर्धारित किया गया था, तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग पुटिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था मैं स्कैपुलरिस तथा आर। प्रत्येक टिक प्रजातियों से पृथक पुटिकाओं की एकाग्रता एनटीए (चित्रा 8) के माध्यम से मापा गया था। ईवी सांद्रता 7.07 x 10 7 से 7.94 x 109 कणों / एमएल के बीच भिन्न होती है। ईवी मात्रा एमआईआरएनए सांद्रता के साथ सहसंबद्ध है, जहां ईवी की अधिक मात्रा के परिणामस्वरूप एमआईआरएनए की उच्च एकाग्रता निकाली गई।

Figure 1
चित्र 1: 1 मिलीलीटर सुई-कम सिरिंज महिला वयस्क I. स्कैपुलरिस से भरी हुई है और निष्फल धुंध के साथ कवर की गई है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक एन्गर्ज्ड मादा के पृष्ठीय पक्ष को 4 मिमी वन्नास कैंची के साथ हटा दिया गया था। अंग निर्जलीकरण को रोकने के लिए मादा को 1x पीबीएस में डुबो दिया गया था। पीले तीर उजागर लार ग्रंथियों को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा उच्च-रिज़ॉल्यूशन उद्देश्य लेंस के साथ 50x आवर्धन पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 32 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद एक सेल संस्कृति प्लेट। कुओं की पहली पंक्ति में पुटिका मुक्त मीडिया और विच्छेदित लार ग्रंथियां होती हैं। बाकी कुओं में रिफैम्पिसिन के साथ 1x पीबीएस होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज चक्र के लिए एक नमूना तैयारी प्रक्रिया। (ए) एक 10 मिलीलीटर सुई-कम सिरिंज एक 1 μm सिरिंज फिल्टर के साथ सबसे ऊपर है। (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन के तीन राउंड के बाद सतह पर तैरनेवाला सिरिंज में पाइप किया जाता है। (सी) शेष सिरिंज 1एक्स निष्फल पीबीएस के साथ 10 एमएल तक भरजाता है। (डी) सिरिंज को कवर किया जाता है, और 1 एक्स पीबीएस के साथ सतह पर तैरनेवाला अल्ट्रासेंट्रिफुग ट्यूब में फ़िल्टर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के 18 घंटे के बाद, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर बाह्य पुटिकाओं की एक गोली बनती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: लार ग्रंथि अंगों और बाह्य पुटिकाओं को समरूप बनाने के लिए निष्फल मूसल का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एक जेल वैद्युतकणसंचलन एक संवर्धन विश्लेषण के बाद एमआईआरएनए तैयार पुस्तकालयों को प्रदर्शित करने वाले टेप स्टेशन के माध्यम से मापा जाता है। माइक्रोप्लस लार ग्रंथि अंगों और ईवीएस के नमूने न्यूनतम गिरावट और सीडीएनए पुस्तकालय संश्लेषण के लिए पर्याप्त एमआईआरएनए एकाग्रता पर आधारित थे। सीढ़ी (एल) न्यूक्लियोटाइड और ऊपरी और निचले मार्करों में संदर्भ बिंदुओं को दर्शाती है। तारांकन आकार उत्पाद ~ 150 बीपी के बैंड को इंगित करते हैं, जो छोटे आरएनए सीडीएनए पुस्तकालयों को दर्शाता है। निचले बैंड प्राइमर डिमर दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: जैविक प्रतिकृतियों (ए) महिलाओं, (बी) पुरुषों और (सी) अप्सराओं के बीच भिन्नता का एक प्रतिनिधि आंकड़ा। एक्स-अक्ष ईवी आकार (एनएम) दिखाता है, और वाई-अक्ष ईवी एकाग्रता (कणों / एक दो-तरफ़ा एनोवा और तुकी की तुलना परीक्षण ने सांख्यिकीय अंतर (पी-वैल्यू = < 0.05) प्रदर्शित किया। त्रुटि पट्टियाँ भिन्नता के लिए खाते में मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक नमूने में तीन जैविक प्रतिकृतियों के साथ 20 टिक्स थे। नमूने 60 एस के लिए दर्ज किए गए थे, प्रत्येक तीन बार। कैमरा स्तर 7 पर सेट किया गया था, और पहचान सीमा स्तर 5 पर सेट की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: अप्सराओं (लाल), महिलाओं (नीले), और पुरुषों (काले) के लिए सभी संयुक्त जैविक प्रतिकृतियों के लिए भिन्नता का एक प्रतिनिधि आंकड़ा। एक्स-अक्ष ईवी आकार (एनएम) दिखाता है, और वाई-अक्ष ईवी एकाग्रता (कणों / एक दो-तरफ़ा एनोवा और तुकी की तुलना परीक्षण ने सांख्यिकीय अंतर (पी-वैल्यू = < 0.05) प्रदर्शित किया। त्रुटि पट्टियाँ भिन्नता के लिए खाते में मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक नमूने में तीन जैविक प्रतिकृतियों के साथ 20 टिक्स थे। तारांकन पी < 0.05 के एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रतीक है। प्रत्येक रिकॉर्डिंग 60 एस के लिए की गई थी, प्रत्येक तीन बार। कैमरा स्तर 7 पर सेट किया गया था, और पहचान सीमा स्तर 5 पर सेट की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: बायोएनालाइज़र के माध्यम से एक प्रतिनिधि जेल। जेल वैद्युतकणसंचलन एक संदर्भ के रूप में एक आधार सीढ़ी का उपयोग करके किया गया था। एक परिपक्व एमआईआरएनए अनुक्रम ~ 18-22 एनटी लंबा है, जहां बेहोश बैंड निर्दिष्ट आकार सीमा में दिखाए जाते हैं। अन्य छोटे आरएनए, जैसे छोटे परमाणु आरएनए, ट्रांसफर-मैसेंजर आरएनए और नियामक आरएनए भी नमूनों में मौजूद हैं। छोटे आरएनए का आकार ~ 20-150 एनटी से था। नमूने टिक प्रजातियों, ऊतकों और लिंग से भिन्न होते हैं। लेन जी के लिए, नमूना गिरावट का एक उदाहरण कोई बैंड नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एक जेल वैद्युतकणसंचलन को बायोएनालाइज़र के माध्यम से मापा गया था, जो आर माइक्रोप्लस महिला लार ग्रंथि अंगों और ईवीएस से निकाले गए एमआईआरएनए की गुणवत्ता को प्रदर्शित करता है। सीढ़ी (एल) न्यूक्लियोटाइड में संदर्भ आकार दिखाती है, जहां परिपक्व एमआईआरएनए लंबाई में ~ 18-22 एनटी को मापते हैं। लेन ए-डी और जी गिरावट दिखाते हैं, और लेन ई, एफ और एच-के न्यूनतम गिरावट दिखाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रजातियां लिंग अंग / पुटिका ईवी एकाग्रता एमआईआरएनए एकाग्रता (एनजी)
आर. माइक्रोप्लस मादा अंग एन/ए 259
आर. माइक्रोप्लस मादा अंग एन/ए 2,142
आर. माइक्रोप्लस मादा वायुकोश 1.64 ई +08 59.22
आर. माइक्रोप्लस मादा वायुकोश 1.64 ई +09 1,848
I. स्कैपुलरिस मादा अंग एन/ए 45.92
I. स्कैपुलरिस मादा अंग एन/ए 6,356
I. स्कैपुलरिस मादा वायुकोश 1.73ई +08 65.66
I. स्कैपुलरिस मादा वायुकोश 3.14 ई +09 2,128

तालिका 1: लार ग्रंथियों और बाह्य पुटिकाओं दोनों के लिए एमआईआरएनए सांद्रता का एक उदाहरण। एमआईआरएनए सांद्रता का स्तंभ प्रत्येक टिक प्रजातियों के लिए सबसे कम से उच्चतम सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

माइक्रोआरएनए I. स्कैपुलरिस I. रिकिनस आर. माइक्रोप्लस एच. लॉन्गिकोर्निस संदर्भ
एमआईआर -8 एक P P P 33, 36, 37, 43
एमआईआर -71 P P P एक 33, 36, 37, 43
एमआईआर -279 P एक एक P 33, 36, 37, 43
लेट -7 एक P P P 33, 36, 37, 43

तालिका 2: विभिन्न टिक प्रजातियों में संरक्षित एमआईआरएनए। (पी) इंगित करता है कि एमआईआरएनए आमतौर पर व्यक्त किया गया था, या मौजूद था, और (ए) दर्शाता है कि एमआईआरएनए आमतौर पर व्यक्त या पता नहीं लगाया गया था।

नमूना प्रकार स्कोर की संख्या >1* स्कोर की संख्या >4γ संरक्षित की संख्या उपन्यास की संख्या
नर 17 0 48,885 23
मादा 25 0 48,885 21
अप्सराएं 38 0 48,885 38

तालिका 3. संरक्षित और अद्वितीय एमआईआरएनए आर माइक्रोप्लस मादाओं, पुरुषों और अप्सराओं के लिए ईवीएस में पाए गए थे। * प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एमआईआरएनए स्कोर। कार्यात्मक प्रयोगों केलिए उपयोग किए जाने वाले एमआईआरएनए स्कोर γ।

पूरक तालिका 1: लार ग्रंथियों से स्रावित आर माइक्रोप्लस पुरुषों ईवीएस के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण परिणाम दिखाने वाली एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 2: लार ग्रंथियों से स्रावित आर माइक्रोप्लस महिला ईवीएस के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण परिणाम दिखाने वाली एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 3: लार ग्रंथियों से स्रावित आर माइक्रोप्लस अप्सरा ईवीएस के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण परिणाम दिखाने वाली एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल लार ग्रंथियों और ईवीएस से एमआईआरएनए निकालने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है। हालांकि, महत्वपूर्ण विचार हैं, जिनमें से सभी इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक अनुभाग के लिए नोट्स में विस्तृत हैं। टिक्स को बचने से रोकने के लिए टिक फीडिंग के दौरान कैप्सूल और मेष नेटिंग को सुरक्षित किया जाना चाहिए। कैप्सूल की तैयारी और प्लेसमेंट कोगा एट अल .40 में वर्णित किया गया है। यदि एक अनुपयुक्त नमूना छोड़ दिया जाता है तो टिक विच्छेदन के कई प्रतिकृतियां करने की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, टिक ऊतक 18,20,43 से ईवी अलगावतकनीकों का उपयोग करते समय कई चुनौतियां मौजूद हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, विच्छेदन से बचने के लिए विच्छेदन के दौरान ऊतकों को नम रखा जाना चाहिए। यह विच्छेदन के दौरान पीबीएस जोड़कर किया जाता है। अंगों के विच्छेदन और संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले पीबीएस और मीडिया दोनों को टिक माइक्रोबायोम से जीवाणु संदूषण से बचने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बनाए रखा जाना चाहिए। इनमें एंटीबायोटिक्स शामिल होने चाहिए जो ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया को लक्षित करते हैं क्योंकि दोनों टिकऊतकों 60 के भीतर पाए जा सकते हैं। इसी तरह, अन्य अंगों से ऊतकों के साथ संदूषण को कम करने के लिए विच्छेदन के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। इस प्रकार, विच्छेदन को धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, और जैसे-जैसे उपयोगकर्ता अनुभव प्राप्त करता है, अधिक टिक्स को विच्छेदित किया जा सकता है। अंत में, क्योंकि ईवी रोगज़नक़-संक्रमित कोशिकाओं सहित सभी कोशिकाओं से स्रावित होते हैं, ईवी अलगाव का संचालन करने वाले टिक अध्ययनों को क्रॉस-ईवी संदूषण25,61 से बचने के लिए ईवी-मुक्त मीडिया और बफर का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

फिर भी, यह प्रोटोकॉल टिक लार ईवीएस का उत्पादन करने के लिए आवश्यक टिक्स की संख्या में कमी की अनुमति देता है। पिछले प्रोटोकॉल के लिए काफी बड़ी संख्या में टिक्स की लार की आवश्यकता थी। उदाहरण के लिए, हेमाफिसालिस लॉन्गिकोर्निस में लार ईवीएस के भीतर स्रावित एमआईआरएनए को 2,000 वयस्क टिक्स43 की लार की आवश्यकता होती है। यह उन प्रयोगशालाओं के लिए बेहद महंगा हो सकता है जिनमें टिक्स को रियर करने की क्षमता की कमी है। इसी तरह, ईवी अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले एम्ब्लियोम्मा मैकुलेटम ऊतकों को अलगाव से पहले आंशिक रूप से जमे हुए थे और कोलेजनेज टाइप 3 के 75 यू / एमएल के साथ इलाज किया गया था, जो ईवी स्राव19 की प्रामाणिकता को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, इन अध्ययनों में लार ग्रंथियों के 80-100 जोड़े की आवश्यकता होती है18.

तुलनात्मक रूप से, इस प्रोटोकॉल को कई टिक प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है, और ईवीएस को अलग करने और गुणवत्ता संरक्षित और उपन्यास एमआईआरएनए (तालिका 2) 33,36,37,43 निकालने के लिए कम संख्या में टिक्स की आवश्यकता होती है। एमआईआरएनए सांद्रता बहुत भिन्न थी लेकिन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (तालिका 3 और पूरक तालिका 1-3) के लिए पर्याप्त थी। इस प्रोटोकॉल को बड़े नमूना आकार को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है यदि बड़े एमआईआरएनए सांद्रता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री सामग्री की उपलब्धता के आधार पर प्रतिस्थापन योग्य है। हालांकि, नमूना मात्रा और सेंट्रीफ्यूजेशन वेग का उपयोग किट और स्तंभों के लिए निर्माता के निर्देशों के बाद समायोजित किया जाना चाहिए।

इस पद्धति का एक नुकसान यह है कि एमआईआरएनए और ईवी निष्कर्षण और अलगाव के चरणों में आसानी से नीचा दिखा सकते हैं। इसलिए, प्रोटोकॉल को जल्दी और कुशलता से पूरा किया जाना चाहिए। जब कहा जाता है, तो नमूनों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और एमआईआरएनए निष्कर्षण एक निष्फल वातावरण में आयोजित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, ईवी झिल्ली से जुड़े बड़े आरएनए को खत्म करने के लिए पृथक ईवी पर एक आरएनएस उपचार किया जा सकता है। यह एमआईआरएनए निष्कर्षण के दौरान नमूने को दूषित करने से बड़े आरएनए को रोक सकता है। अंत में, ईवीएस या अंगों से अलगाव के बाद एमआईआरएनए नमूने में आरएनएस अवरोधक जोड़ना गिरावट के लिए एक महत्वपूर्ण निवारक उपाय है। इस प्रोटोकॉल को परिवर्तित किया जा सकता है और प्रयोग के उद्देश्यों के समानांतर लागू किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य के अनुप्रयोगों में रोगज़नक़-वेक्टर इंटरैक्शन का अध्ययन शामिल हो सकता है ताकि यह समझा जा सके कि रोगजनक टिक लार ईवीएस के भीतर एमआईआरएनए और अन्य जीनोमिक कार्गो को कैसे प्रभावित करते हैं। इसी तरह, यह प्रोटोकॉल टिक ईवीएस में एमआईआरएनए की पैकेजिंग में शामिल विशिष्ट प्रोटीन और सेलुलर प्रक्रियाओं को परिभाषित कर सकता है, और घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर इन ईवीएस और एमआईआरएनए का विशिष्ट प्रभाव पड़ता है। एकारिसाइड्स के लिए बढ़ते टिक प्रतिरोध के कारण, अद्वितीय नियंत्रण विधियों की सख्त आवश्यकता है। ईवीएस में एकारिसाइड्स की तुलना में एक वैकल्पिक नियंत्रण विधि की क्षमता है। ईवीएस का उपयोग चिकित्सीय अनुप्रयोगों 18,23,61 में नैनो-ट्रांसपोर्टर के रूप में किया जा सकता है। मनुष्यों में, एमआईआरएनए परिवहन करने वाले ईवीएस का उपयोग कैंसर इम्यूनोथेरेपी62,63 के दौरान ट्यूमर के विकास को दबाने के लिए किया गया है। इसी तरह, टिक्स में, ईवी आनुवंशिक रूप से संशोधित एमआईआरएनए ले जा सकते हैं जिन्हें महत्वपूर्ण टिक जैविक कार्यों और रोगज़नक़ संचरण36,57,64 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। भविष्य की दिशा कार्यात्मक अध्ययन के लिए ब्याज के एमआईआरएनए की पहचान करने के लिए कई टिक प्रजातियों के एमआईआरएनए प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम एडिनबर्ग, टेक्सास में मवेशी बुखार टिक प्रयोगशाला से सहायता के लिए बहुत सराहना कर रहे हैं। हम माइकल मूसा, जेसन टिडवेल, जेम्स हेलम्स, सेसारियो आगाडो और होमर वास्केज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पूरे प्रोजेक्ट में सारा शार्पटन, एलिजाबेथ लोहस्ट्रोह, एमी फिलिप, केल्सी जॉनसन, केली कोचन, एंड्रयू हिलहाउस, चार्लुज अरोचो रोसारियो और स्टेफनी गुज़मैन वालेंसिया की सहायता को भी स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस पांडुलिपि के लेखन के दौरान उनकी मदद और सलाह के लिए टेक्सास ए एंड एम एग्गी वुमन इन एंटोमोलॉजी (एडब्ल्यूई) लेखन समूह को धन्यवाद देना चाहते हैं। बीईआई रिसोर्सेज, एनआईएआईडी, एनआईएच द्वारा वितरण के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्रों द्वारा निम्नलिखित अभिकर्मक प्रदान किए गए थे: इक्सोड्स स्कैपुलरिस वयस्क (लाइव), एनआर -42510। ओक्लाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी में टिक पालन सुविधा से महिला आई स्कैपुलरिस टिक्स भी प्राप्त हुए थे। इस परियोजना को टेक्सास ए एंड एम यूनिवर्सिटी टी 3 द्वारा वित्त पोषित किया गया था: परिवर्तन अनुदान के लिए ट्रायड्स और यूएसडीए-एआरएस द्वारा एओसी को सहकारी समझौता # 58-3094-1-003।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300

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जीव विज्ञान अंक 182 बाह्य पुटिकाओं माइक्रोआरएनए टिक-होस्ट इंटरफ़ेस टिक
टिक <em>पूर्व विवो</em> लार ग्रंथि संस्कृतियों और बाह्य पुटिकाओं से माइक्रोआरएनए का अलगाव
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Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, … More

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).

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