Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA's uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA's die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.
Abstract
Teken zijn belangrijke ectoparasieten die meerdere pathogenen kunnen overbrengen. De speekselklieren van teken zijn essentieel voor het voeden, omdat hun speeksel veel effectoren bevat met farmaceutische eigenschappen die de immuunrespons van de gastheer kunnen verminderen en de overdracht van ziekteverwekkers kunnen verbeteren. Een groep van dergelijke effectoren zijn microRNA's (miRNA's). miRNA's zijn korte niet-coderende sequenties die de genexpressie van de gastheer reguleren op de teken-gastheerinterface en in de organen van de teek. Deze kleine RNA's worden in het tekenspeeksel getransporteerd via extracellulaire blaasjes (EV's), die inter- en intracellulaire communicatie dienen. Blaasjes met miRNA's zijn geïdentificeerd in het speeksel van teken. Er is echter weinig bekend over de rollen en profielen van de miRNA's in speekselblaasjes en -klieren. Bovendien vereist de studie van blaasjes en miRNA's in tekenspeeksel vervelende procedures om tekenspeeksel te verzamelen. Dit protocol heeft tot doel een methode te ontwikkelen en te valideren voor het isoleren van miRNA's van gezuiverde extracellulaire blaasjes geproduceerd door ex vivo orgaanculturen. De materialen en methodologie die nodig zijn om miRNA's uit extracellulaire blaasjes en speekselklieren te extraheren, worden hierin beschreven.
Introduction
Teken zijn ectoparasieten die veel ziekteverwekkers overbrengen naar dieren in het wild, vee, mensen en hun huisdieren 1,2. Tekenvoeding resulteert in aanzienlijk economisch verlies door schade aan de huid te veroorzaken, het gewicht en de melkproductie te verminderen als gevolg van ernstige bloedarmoede en de overdracht van potentieel dodelijke ziekteverwekkende pathogenen 1,3,4,5. De huidige bestrijdingspraktijken voor het beheer van tekenpopulaties zijn gericht op het gebruik van acariciden. Niettemin hebben de voortdurende opkomst van acaricideresistentie bij teken die vee parasiteren 5,6, de verhoogde incidentie van tekenbeten7 en de overdracht van ziekteverwekkers binnen woonwijken 8,9, geleid tot een behoefte aan unieke tekenbestrijdingsalternatieven.
De speekselklieren zijn essentiële organen die zorgen voor het biologische succes van een teek. Ze worden gevormd door verschillende acinustypen (I, II, III en IV) met verschillende fysiologische functies. De speekselklieren zijn verantwoordelijk voor osmoregulatie, zowel uit als op de gastheer, door wateroverschot en ijzergehalte terug te geven aan de gastheer via speekselvloed 2,10. Type I acini zijn ook betrokken bij de opname van water uit de atmosfeer door de afscheiding van hygroscopisch speeksel10,11. Speekseleffectoreiwitten, zoals cement en cystatinen, worden geproduceerd in secretoire cellen in type II en III acini 10,12. Type I acini heeft geen invloed op de tekenvoeding, wat aangeeft dat de inname van bloedmeel geen morfologische en fysiologische veranderingen teweegbrengt bij deze acini type13,14. Aan de andere kant worden Acini type II en III geactiveerd tijdens het voeden en vertonen ze zeer weinig activiteit voorafgaand aan de hechting. Voeding is dus noodzakelijk om de vergroting van de secretoire cellen binnen type II acini en de productie van bioactieve stoffen te activeren. Type III acini worden tijdens het voeren verkleind als gevolg van de secretie in de secretoire korrels12.
De speekselklieren zijn ook de plaats van pathogene infectie in de teek en de transmissieroute. Tijdens het voeren scheiden teken verschillende verbindingen af met farmaceutische effecten die nodig zijn voor een succesvolle voltooiing van het bloedmeel 10,15,16. Deze verbindingen hebben ontstekingsremmende, immunosuppressieve en vaatverwijdende eigenschappen 10,15,17. Recente studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes (EV's) afgeleid van teken speekselklieren verschillende van deze verbindingen bevatten, waardoor ontstekingsremmende en immunomodulerende effecten worden opgewekt 18,19,20. "Extracellulaire blaasjes" is een overkoepelende term die wordt gebruikt om blaasjes te beschrijven die zijn geclassificeerd als exosomen en microvesicles op basis van hun grootte en biogenese. Over het algemeen zijn EV's lipide blebs met dubbellaagse membranen die ~ 40 nm-1 μm zijn in grootte21; over het algemeen worden exosomen beschreven als 40-150 nm groot, terwijl microvesicles tussen 150 nm-1 μm zijn in grootte 21,22,23. De grootte is echter niet indicatief voor de EVs biogenese route22.
De biogenese van exosomen begint met de sequentiële invaginatie van het plasmamembraan. Deze invaginatie leidt tot de vorming van multivesiculaire lichamen en resulteert uiteindelijk in de vervorming van het vesiculaire membraan door de werking van ESCRT-complexen of sfingomyelinases (sMases)24,25. De exosomen kunnen ofwel in de lysosomen worden gelyseerd om cellulaire homeostase te behouden of via vesiculaire fusie naar het plasmamembraan worden afgevoerd om cellulaire bestanddelen aan de ontvangende cellen te leveren21,24. Aan de andere kant worden microvesicles gevormd door de werking van flopasses en flipasses, waardoor de conformatie van lipiden in het plasmamembraan verandert26. EV's zijn essentieel voor cel-naar-cel communicatie en dienen als een transportsysteem voor intracellulaire lading, zoals lipiden, eiwitten, nucleïnezuren en microRNA's (miRNA's)21,27,28. Eenmaal vervoerd, leveren deze blaasjes hun lading af in het cytoplasma van de ontvangende cellen, waardoor fenotypische veranderingen in de ontvangende cel worden gegenereerd22,29. Vanwege het belang van extracellulaire blaasjes bij het voeren van teken en de manipulatie van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer18,20, biedt de lading in extracellulaire blaasjes potentiële doelen voor de ontwikkeling van anti-tekentherapieën en een uniek mechanisme om tekenvoeding te verstoren. Dit omvat miRNA's in teken speekselklieren en speekselklier-afgeleide extracellulaire blaasjes.
miRNA's zijn korte niet-coderende sequenties, ~ 18-22 nucleotide (nt) lang, die post-transcriptioneel mRNA-sequenties kunnen reguleren, afbreken of dempen30,31. Tijdens transcriptie worden de pri-miRNA's gesplitst door Dicer (RNA polymerase III) om een onderscheidende haarspeldachtige structuur te vormen en een pre-miRNA te worden. Het pre-miRNA wordt opnieuw gesneden door Drosha (RNA polymerase III) om een volwassen miRNA duplex te vormen. De volwassen sequentie wordt geïntegreerd in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) complementair aan de mRNA-sequentie, waardoor translatierepressie of mRNA-afbraak 28,30,32 ontstaat. Tijdens het voeden van de gastheer kunnen miRNA's in het speeksel van de teek de genexpressie van de gastheer moduleren om immuunresponsen te onderdrukken en de overdracht van pathogenente verbeteren 33,34,35,36,37. Hoewel er uitgebreide studies over EV's en miRNA's bestaan, zijn hun rollen tijdens het voeden op de tick-host-interface nog steeds slecht begrepen. Het optimaliseren van protocollen die gemakkelijk kunnen resulteren in de isolatie en zuivering van hoogwaardige miRNA's is cruciaal voor het bevorderen van onze kennis over deze onderwerpen.
Meerdere opties kunnen worden gebruikt om EV's te isoleren, zoals ultracentrifugatie, exosoomprecipitatie, polymeerprecipitatie, immunoaffiniteitschromatografie en op grootte gebaseerde uitsluitingstechnieken38. Deze technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen exosomen of microvesicles. Dus, zoals eerder vermeld, wordt EV gebruikt als een overkoepelende term bij het isoleren van EV's uit verschillende monsters. De blaasjes die in de hierin beschreven experimenten worden geïsoleerd, vertegenwoordigen een mengsel van blaasjes die zijn afgeleid van verschillende biogeneseroutes. Verdere zuivering van een specifieke populatie van extracellulaire blaasjes kan worden bereikt door immunoprecipitatie met behulp van kralen bedekt met antilichamen tegen markers (d.w.z. exosomale markers, tumormarkers) die uniek zijn voor de blaasjespopulatie van belang 39,40. miRNA's kunnen ook worden geëxtraheerd via verschillende in de handel verkrijgbare isolatiekits 7,41,42.
Het doel van dit project was om een protocol te ontwikkelen dat veelgebruikte methoden combineert om EV's te isoleren en miRNA te extraheren uit zowel EV's als speekselklieren. Omdat de afscheiding van bioactieve stoffen wordt geactiveerd door12 te voeren, moeten teken kunnen voeden om miRNA's te identificeren die belangrijk kunnen zijn voor het manipuleren van immuun- en wondgenezingsreacties van de gastheer. Het huidige protocol vereist een klein aantal teken (20 teken) om EV's en hun respectieve miRNA's te isoleren, vergeleken met andere eerder beschreven studies die 2000 teken43 vereisten. Verder vermijdt het de besmetting van speekselafscheidingen met pilocarpine44, wat van invloed kan zijn op experimenten die het effect van EV's en hun miRNA's op gastheercellen bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens het dierlijke gebruiksprotocol (AUP # 2020-0026) goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik (AICUC) aan de Texas A &M University. De tekensoorten Ixodes scapularis en Rhipicephalus (Boophilus) microplus, en Nieuw-Zeelandse mannelijke witte konijnen, 42-72 dagen oud, werden gebruikt voor de huidige studie. I. scapularis werd ontvangen van het Center for Disease Control (CDC) en Oklahoma State University, gecertificeerd als pathogeenvrij. R. microplus werd grootgebracht in het Cattle Fever Tick Research Laboratory in Edinburg, Tx. De konijnen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). Dit protocol kan universeel extracellulaire blaasjes en miRNA's isoleren van verschillende tekensoorten, levensfasen en weefsels.
1. Opfokken van vrouwelijke I. scapulularis en capsulepreparaten
- Bereid een ethyleen-vinylacetaatschuimcapsule volgens de procedures voor harde teken voedende konijnen45. Plaats één capsule op elk schouderblad van het konijn voor een totaal van twee capsules per besmetting.
OPMERKING: Kortom, deze capsules bestaan uit twee vierkanten ethyleen-vinylacetaatschuim met een lege ruimte aan de binnenkant. Eén vierkant is op de rug van het dier (in dit geval konijnen) gelijmd met een weefsellijm (zie Materiaaltabel). Fijn gaas wordt op het tweede vierkant gelijmd om het ontsnappen van teken te voorkomen. De twee vierkanten zijn afgesloten met zelfklevende haakband. - Laat de capsules 24 uur opstijven voordat u de capsule op de konijnen plakt. Bewaar de schuimcapsules bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De capsules kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. - Hecht de capsule aan geschoren konijnen en laat 24 uur staan voordat de teken wordt aangetast.
2. Bereiding van blaasjesvrije media
- Om vesikelvrije media13 te bereiden, combineert u 0,5 ml foetaal runderserum, 0,5 ml tryptosefosfaatbouillon, 0,1 ml 10% lipoproteïne-cholesterolconcentraat, 0,5 ml 5% natriumbicarbonaat (NaHCO3), 0,25 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) en 8,125 ml L15C300-medium (zie materiaaltabel). Pas het volume van het medium indien nodig aan. Plaats het medium in een 26,3 ml polycarbonaatcentrifugefles.
- Balanceer de flessen met een gewichtsverschil van maximaal 0,01 g om de goede werking van de ultracentrifuge te garanderen.
- Ultracentrifugeer het medium gedurende 18 uur bij 100.000 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant via een pipet en zorg er zorgvuldig voor dat er geen pelletvorming wordt verstoord.
- Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis en ultracentrifugeer een tweede keer gedurende 18 uur bij 100.000 x g bij 4 °C, met de juiste balans.
- Isoleer het resterende supernatant en ga door een spuitfilter van 0,22 μm om verontreinigingen te verwijderen. Pipetteer het supernatant in een centrifugebuis van 50 ml.
- Bewaar het supernatant in een vriezer van -20 °C totdat het nodig is of tot 3 jaar.
3. Konijnenplaag
- Snijd de bovenkant van een spuit van 10 ml en laad volwassen I. scapularis-vrouwtjes met een standaard penseel.
- Bedek de opening van de spuit met steriel gaas (figuur 1).
- Plaats het konijn horizontaal op een tafelblad of een werkoppervlak; wikkel het konijn stevig met een handdoek en bedek beide ogen, waardoor de voorbereide capsule (stap 1.1) wordt blootgesteld om het konijn met teken te besmetten.
- Open de capsule en plaats de teken door op de handgreep van de spuit te drukken. Deponeer de teken dicht bij de konijnenhuid. Sluit snel capsules om te voorkomen dat de teken ontsnappen.
- Volgens het experimentele ontwerp, laat de vrouwelijke teken zo lang als nodig voeden. Laat mannelijke Ixodes scapularis niet langer dan 24 uur in de capsule blijven om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Het aantal teken dat in de dieren moet worden besmet, is ter beoordeling van de onderzoeker. Dit protocol gebruikte ~ 100 teken per plaag om rekening te houden met sterfte en voldoende materiaal voor replicaties. De voorlopige experimenten stelden vast dat er minstens 20 teken/replicatie nodig waren om voldoende materiaal te verkrijgen voor het sequentiëren van de miRNA's.
4. Verwijdering van de gevoederde vrouwtjes
- Plaats de besmette konijnen onder 2% isofluraan in zuurstof met behulp van een gasverspreider. Stel het zuurstofpercentage in tussen 700-1000 L/min.
OPMERKING: Andere anesthetica kunnen worden gebruikt om angst of pijn te voorkomen. - Verwijder de gevoede vrouwtjes door de teken bij hun capitulum te grijpen, met behulp van een fijne tang, zo dicht mogelijk bij de huid. Zorg ervoor dat de monddelen volledig zijn verwijderd om bacteriële infectie te voorkomen.
- Plaats de teken in een centrifugebuis van 15 ml.
- Reinig de bijtplaats met 70% ethanol en voeg een kleine hoeveelheid drievoudig antibioticum toe (vingertopwaarde, zie Materiaaltabel) om infectie op de tekenbeetplaats te voorkomen.
- Breng de teken naar het laboratorium voor dissecties (stap 5). Voer deze dissecties uit binnen 24-48 uur na het verwijderen van de teken om afbraak van de speekselklieren te voorkomen15,43.
5. Speekselklierdissectie en extracellulaire blaasjessecretie
- Voeg 500 μL vesikelvrij medium (stap 2) met 5 μL 100x penicilline, 5 μL 100x streptomycine, 5 μL 10 mg/ml rifampicine en 5 μL 100x amfotericine toe aan elk putje (zie Materiaaltabel). Voeg 1x PBS met rifampicine toe aan putten die geen vesikelvrij medium bevatten om bacteriegroei te voorkomen.
- Plaats de teken op een heldere microscopische glasplaat met dubbelzijdige tapijttape onder een ontleedmicroscoop. Om orgaanuitdroging te voorkomen, voegt u 10 μL 1x PBS toe aan elke teek voorafgaand aan de dissectie.
- Maak met behulp van een 4 mm vannas-schaar (zie materiaaltabel) een kleine incisie van ~ 1 mm aan de zijkant van elk vrouwtje. Verwijder de dorsale zijde van de teek volledig (figuur 2) en verwijder beide speekselklieren.
- Doe 20-40 teken speekselklieren in 500 μL vesikelvrij medium toegevoegd aan een enkele put in een 24-well weefselkweek behandelde plaat (figuur 3).
- Incubeer de speekselkliermonsters bij 32 °C gedurende 24 uur om de afscheiding van de EV's mogelijk te maken.
6. Isolatie van extracellulaire blaasjes
- Pipetteer na 24 uur incubatie al het medium dat de speekselklieren bevat in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Centrifugeer het monster bij 300 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om de speekselklieren te isoleren. In deze stap worden twee fasen gescheiden: (1) het supernatant dat de EV's bevat en (2) de speekselklieren (pellet).
- Om de isolatie van de EV's voort te zetten, pipetteer je het supernatant in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Resuspenseer de pellet die de speekselklieren bevat (stap 6.2) in 500 μL RNAlater (zie materiaaltabel) en bewaar bij -80 °C tot gebruik of voor onbepaalde tijd.
OPMERKING: Deze speekselklieren worden gebruikt voor miRNA-isolatie in stap 8. - Centrifugeer het supernatant bij 2000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om cellulair afval te verwijderen. Pipetteer het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Gooi de pellet weg.
- Centrifugeer het supernatant bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om apoptotische lichamen en grotere EV's te verwijderen. Gooi de pellet en pipetteer het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Bevestig een spuit van 10 ml aan een nylon spuitfilter van 1 μm. Plaats de spuit en het filter boven een ultracentrifugebuis (figuur 4A). Voeg vervolgens het monster toe (figuur 4B) en vul de spuit met 10 ml 1x PBS (figuur 4C) en balanceer de buis dienovereenkomstig (figuur 4D).
- Plaats buizen in een 70Ti-rotor (zie Materiaaltabel) en draai bij 100.000 x g gedurende 18 uur bij 4 °C.
- Neem na 18 uur ultracentrifugatie een pellet aan de onderkant van de buis waar (figuur 5). De pellet is de geconcentreerde extracellulaire blaasjes.
- Verwijder 90%-100% van het supernatant zonder de EV-pellet te resuspenderen. Resuspendeer de pellet met 1x PBS. Als niet al het supernatant kan worden verwijderd, gebruik dan het resterende supernatant om de pellet te resuspenderen.
- Pipetteer 500 μL van de EV-pellet/supernatant in een centrifugaalfilter van 300 K (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Dit verwijdert alle niet-vesikel-geassocieerde eiwitten, miRNA's en andere moleculen, terwijl de blaasjes niet door het filter gaan. - Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij omgevingstemperatuur. Herhaal stap 6.10 totdat alle EV-pellets/supernatant door het filter zijn gegaan.
- Voeg 400 μL gesteriliseerde 1x PBS toe aan de kolom en meng grondig via een pipet om EV's te verwijderen die aan het membraan zijn bevestigd. Doe het monster in een DNase-/RNase-vrije buis van 1,5 ml. De monsters kunnen bij -80 °C voor onbepaalde tijd of tot gebruik worden bewaard. Vermijd overmatig ontdooien van monsters om de afbraak van het monster te voorkomen.
OPMERKING: Plaats buizen op ijs wanneer ze uit de ultracentrifuge worden gehaald om EV-degradatie te voorkomen. Het laatste monster is de EV-pellet in 400 μL van 1x PBS. 25 μL van dit monster zal worden gebruikt voor nanodeeltjes tracking analyse (NTA, stap 7), en 375 μL voor miRNA-isolatie (stap 8).
7. Nanodeeltjes tracking analyse (NTA)
- Neem 25 μL van het eindmonster (stap 6.12) en voeg 375 μL 1x PBS toe.
- Laad het verdunde monster in een naaldloze spuit van 1 ml en schroef stevig op de optische lens van de NTA.
- Pas de instellingen dienovereenkomstig aan en leg video's vast op basis van instellingsvoorkeuren.
OPMERKING: In de huidige studie werden drie metingen gedaan van elk 60 s. Elke NTA-meting vertegenwoordigt een technische replica. Verschillende monsters van tekenvoeding gedurende dezelfde tijd vertegenwoordigen individuele biologische replicaties. De camera was ingesteld op niveau 7 en de detectiedrempel was ingesteld op niveau 5. - Schat de uiteindelijke EV-nummers met de volgende formule:
((begin-EV-concentratie (verdunningsfactor)) * (totaal volume in de monsterbuis)/1000) = totaal EV's in het monster
OPMERKING: Het volume moet worden gedeeld door 1000 omdat de NTA de monsters leest als concentratie / ml.
8. miRNA-extractie uit speekselklieren en extracellulaire blaasjes
- Voeg 100 μL van het lysisreagens (zie materiaaltabel) toe aan het resterende monster vanaf stap 6.12 en homogeniseer met gesteriliseerde stampers (figuur 6).
- Voeg de resterende 600 μL van het lysisreagens toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 140 μL chloroform toe, schud krachtig gedurende 15 s en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Pipetteer de heldere topfase, vermijd interfase, in een nieuwe buis van 1,5 ml. Dit resulteert in ~525 μL verwacht monstervolume. Voeg vervolgens een 1:1 volume van 100% moleculaire ethanol toe.
- Voeg 700 μL van het monster toe aan een RNA-isolatiespinkolom (zie Materiaaltabel).
- Draai op 8.000 x g gedurende 30 s bij omgevingstemperatuur, gooi de doorstroom weg.
- Was het monster met 700 μL RTE-buffer (zie materiaaltabel), draai op 8.000 x g gedurende 30 s, gooi de doorstroom weg.
- Was het monster met 500 μL RPE-buffer (zie materiaaltabel), draai op 8.000 x g gedurende 30 s, gooi de doorstroom weg.
- Voeg 500 μL 80% ethanol van moleculaire kwaliteit toe en draai op 8.000 x g gedurende 2 minuten, gooi de doorstroom weg.
- Draai de kolom op de maximale snelheid gedurende 5 minuten om het membraan te drogen. Gooi de opvangbuis weg en plaats de kolom op een nieuwe microfugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 14 μL RNase-/DNase-vrij water toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 μL RNase-remmer (zie materiaaltabel) toe aan de geëlueerde miRNA's en meng goed via de pipet.
OPMERKING: Verwijder vóór miRNA-extractie uit speekselklieren elke RNAlater door 1 ml 1x PBS (1:1 volume) toe te voegen en draai de speekselklieren met maximale snelheid gedurende 15 minuten bij 4 °C. Dit moet drie keer worden herhaald of totdat de speekselklieren voldoende zijn verdwenen om het supernatant te verwijderen. Op dit punt vertegenwoordigt de steekproef een mix van kleine RNA's van ~ 20-150 bp in grootte (aanvullende figuur 1).
9. MiRNA-concentratie meten
- Meet de concentratie van klein RNA via een in de handel verkrijgbare RNA-testkit41 (zie Materiaaltabel).
- Meng in elke buis 199 μL verdunningsbuffer (component A en B in de kit per monster), 1 μL fluorescerende kleurstof die specifiek is voor de detectie van miRNA's (meetgolflengte 260 nm) (per monster) en 2 μL klein RNA (stap 8) voor elk monster, volgens de instructies van de fabrikant.
- Lees voordat u de monsterbuizen leest, vooraf verdunde miRNA-standaard 1 en standaard 2 (meegeleverd in de kit) om een standaardcurve te maken voorafgaand aan de monstermeting.
OPMERKING: De standaarden worden gebruikt als vergelijkingsinstrument om de gemeten miRNA-concentratie in de monsters te bepalen. - Plaats elke standaard- en monsterbuis in de speciale fluorometer (zie materiaaltabel) om de concentratie als ng/μL te meten.
10. Bepalen van de miRNA-kwaliteit
- Bepaal de kwaliteit van miRNA en andere kleine RNA's via gel-elektroforese met behulp van een bioanalyzer46, volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Voordat u het monster afleest, normaliseert u de monsters tot dezelfde concentratie.
- Lees de monsters door een kleine RNA-chip41,46, volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Om de miRNA-kwaliteit te bepalen, zijn de gelachtige beelden (banden) en elektroferogrammen (pieken) indicatoren van de monsterkwaliteit. Hoe donkerder de band in de gel, hoe beter de miRNA-kwaliteit. Hoe lichter de band (of als er geen band aanwezig is), hoe slechter de kwaliteit of bewijst de monsterdegradatie46,47.
11. microRNA-verrijking
- Verrijk het miRNA met behulp van een kleine RNA-sequencingkit, volgens de instructies van de fabrikant van de kleine RNA-monstervoorbereidingskit (zie Materiaaltabel).
- Lireer elk monster met een 3'-adenylatieadapter en verwijder de overtollige adapter via kraalopruiming. Voeg vervolgens een 5'-adapter toe en verwijder de overtollige adapter door een kraalopruiming48.
OPMERKING: Zowel adapters als kralen voor opschoning werden geleverd in de kleine RNA-sequencingkit uit paragraaf 11.1 (zie Materiaaltabel). - Om de eerste streng te synthetiseren, bereidt u een hoofdmix van de monsters die zijn geligeerd met beide adapters, RT-buffer en M-MuLV Reverse transcriptase in de kit (zie Materiaaltabel). Incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij 42 °C en 10 min bij 90 °C. Follow-up met een monsteropruiming zoals vermeld in de instructies.
- Versterk de 1e streng met behulp van de RT forward primer en reverse universal primer in de kit (zie Materiaaltabel) via een conventionele polymerasekettingreactie (PCR) gedurende 2 minuten bij 95 °C, vervolgens gedurende 12-25 cycli gedurende 20 s bij 95 °C, 30 s bij 60 °C en 15 s bij 72 °C. Ten slotte 2 min bij 72 °C.
OPMERKING: De PCR-productgrootte zal naar verwachting ~150 bp zijn (figuur 7). - Meet de kwaliteit van het PCR-product via een tapestation volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Volg de monsters op met behulp van een sequencingsysteem van de volgende generatie (75 cycli), volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Voor miRNA-verrijking moeten de kwantiteit en kwaliteit van het monster worden gecontroleerd (stappen 9-10) vóór de voorbereiding van de bibliotheek.
12. Bioinformatische analyse
- Identificeer de geconserveerde en unieke miRNA's met behulp van een geïntegreerde applicatietool voor miRNA-identificatie.
OPMERKING: In deze studie werd miRNA-identificatie uitgevoerd via miRDeep249,50. miRDeep2 is een gratis online catalogus van alle geïdentificeerde geconserveerde en nieuwe miRNA's gevonden in verschillende soorten49,50 (zie Tabel van materialen). - Stem de reads af op het overeenkomstige genoom met behulp van de mapper die met de software is geïntegreerd.
- Voer de volgende parameters in de mappermodule in.
- Snijd de adapterreeksen bij die zijn toegevoegd uit stap 11.2 en verwijder sequenties van minder dan 18 nucleotiden lang. Verwijder de redundante leesreeksen.
- Converteer de bestanden met behulp van de parameter parse naar FASTA-formaat, alleen als het bestand niet in FASTA-indeling49 is.
- Lijn de gefilterde en bijgesneden sequenties uit op het overeenkomstige genoom. Als er geen genoom is voor de soort van belang, lijn dan uit met de dichtstbijzijnde homologe soort.
- Toon de uitvoerbestanden als "reads.fa" en "reads_vs_genome.arf". De "read.fa" bevat alleen de niet-redundante reads en de "reads_vs_genome.arf" bevat de toegewezen reads die zijn uitgelijnd met het genoom.
- Gebruik beide uitvoerbestanden uit stap 12.2 om de miRNA-expressieprofilering uit te voeren met behulp van de kwantor die met de software is geïntegreerd.
- Download de miRNA-voorlopersequenties van interessante soorten en de volwassen miRNA-sequenties van miRBase 51,52,53,54,55,56. Als er geen voorloper of volwassen sequenties zijn voor de soort van belang, download dan de "hairpin.fa.gz" en "mature.fa.gz" die alle voorlopers en volwassen sequenties bevatten voor alle organismen die beschikbaar zijn op miRBase.
- Decomprimeer de bestanden "hairpin.fa.gz" en "mature.fa.gz".
- Voer de bestanden "reads.fa" en "read_vs_genome.arf" in sectie 12.3.4 en de ongecomprimeerde bestanden uit 12.4.2.
- Lees de uitvoerbestanden als "uitvoernaam.csv", "uitvoernaam.html" en "uitvoernaam.pdf". De naam van het uitvoerbestand kan worden ingesteld op basis van de onderzoeker.
OPMERKING: Het bestand "uitvoernaam.csv" bevat de expressieprofielen. In het bijzonder heeft het expressieprofiel de miRNA-ID, de som van de reads voor alle monsters die aan het miRNA zijn toegewezen, het aantal reads dat is toegewezen aan een specifiek miRNA voor elk monster en de precursor-ID die overeenkomt met de volwassen miRNA's. De "outputname.html" uit stap 12.4.4 bevat de links naar de University of Santa Cruz Genome Browser (USCS), National Center for Biotechnology Information (NCBI) en miRBase. De USCS en NCBI zullen de querysequenties van de huidige precursoren ten opzichte van de niet-redundante nucleotidedatabase bevatten en miRBase zal de informatie van de huidige miRNA-precursor hebben. De "outputname.pdf" heeft de secundaire RNA-structuur van de miRNA's die tot expressie worden gebracht en de uitlijning van de precursorsequentie.
- Als u unieke en geconserveerde miRNA's wilt identificeren, gebruikt u miRDeep2.
- Gebruik de uitvoerbestanden uit stap 12.3.4 en stap 12.4.2 als invoerbestanden.
OPMERKING: De uitvoerbestanden die als "uitvoernaam.html" worden gelezen, bevatten de voorspellingen van de unieke en bewaarde miRNA's in het voorbeeld. - Gebruik scores >1 voor miRNA-profilering en scores >4 voor verdere experimentele analyse, zoals miRNA-remming en het nabootsen van endogene miRNA's 34,36,57.
- Selecteer en identificeer de unieke miRNA's uit de miRbase op basis van het volgende: miRDeep2-score (stap 12.5.3), schatting van de werkelijke waarschijnlijkheid (>90%), significante randfold p-waarde (<0.05)49,50,56.
OPMERKING: De bioinformatica-analyse werd uitgevoerd via miRDeep2 in Cyverse Discovery Environment58,59, een gratis online platform voor bioinformatica-analyse. De geconserveerde en unieke miRNA's geïdentificeerd via miRDeep2 werden vergeleken met alle soorten uit de miRbase. Toekomstige miRDeep2-identificatie kan worden vergeleken met het overeenkomstige genoom van de betrokken soort.
- Gebruik de uitvoerbestanden uit stap 12.3.4 en stap 12.4.2 als invoerbestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het huidige protocol biedt een gedetailleerde methodologie om miRNA's uit speekselklieren en EV's te extraheren. Volgens de resultaten is dit protocol effectief voor de isolatie van miRNA van volwassenen van twee verschillende tekensoorten, I. scapularis en R. microplus, en kan het mogelijk ook bij andere tekensoorten worden gebruikt. De EV-concentratie (deeltjes/ml) werd gemeten via NTA. Voor R. microplus bevatte elk geslacht en elke levensfase drie biologische replicaties gemeten in drie technische replicaties. De monsters werden gescheiden naar geslacht en levensfase (figuur 8) om de variatie binnen elke steekproef te laten zien. Vervolgens werden de monsters gecombineerd om de variatie en statistische verschillen weer te geven met behulp van een tweeweg ANOVA en Tukey's meervoudige vergelijkingstests20 (p-waarde = < 0,05) (figuur 9). Elk monster bestond uit ~ 40 speekselklieren ontleed van 20 vrouwtjes, mannetjes en nimfen. Na de isolatie en kwantificering van de EV's werden de monsters gebruikt voor kleine RNA-zuivering.
De concentratie van het kleine RNA in elk monster werd gemeten via Qubit (tabel 1) en de kwaliteit werd gemeten via een bioanalyzer met behulp van standaard gel-elektroforese46,47. De concentraties zijn in nanogram (tabel 1) in een volume van 14 μL voor beide tekensoorten. Het gemiddelde totaal van kleine RNA-concentraties van I. scapularis-organen varieerde van 45,92-6.356 ng. De RNA-concentratie van I. scapularis blaasjes varieerde van 72,24-2.128 ng. Voor R. microplus varieerde de orgaanconcentratie van 259-2.142 ng en de blaasjes van 59,22-1.848 ng. De monsters werden genormaliseerd tot dezelfde concentratie en hun kwaliteit werd vervolgens gemeten via een bioanalyzer (figuur 10). Een referentieladder werd in de gel gebruikt als marker voor kwaliteitsbeoordeling. De bandintegriteit, intensiteit en pieken waren vertegenwoordigers van potentiële afbraak of totale concentratie in elk monster. Banden die overeenkomen met 5 s en 5,8 s ribosomale RNA's waren alleen aanwezig in de speekselklierorgaanmonsters (figuur 10, rijstroken A-D) en afwezig in het blaasje van de speekselkliermonsters (figuur 10, banen E, F), wat de verschillen in kleine RNA-profielen tussen organen en extracellulaire blaasjes aantoont. De afbraak van het monster werd afgeleid door de afwezigheid van banden in de gel; dit betekende dat er sprake was van een aanzienlijke degradatie van het monster. Het wordt aanbevolen monsters met een aanzienlijke afbraak weg te gooien.
Om de aanwezigheid van miRNA-monsters in de preparaten aan te tonen, werden kleine RNA cDNA-bibliotheken bereid uit RNA-monsters die 3-4 maanden na kleine RNA-isolatie zijn opgeslagen. Vreemd genoeg werd in deze monsters een hogere monsterdegradatie gevonden. De rijstroken A-D en G vertoonden tekenen van degradatie; integendeel, E, F en H-K vertoonden minimale afbraak en voldoende concentratie voor miRNA cDNA-bibliotheekvoorbereiding (aanvullende figuur 1). Slechts één monster werd afgebroken toen de monsters onmiddellijk na zuivering werden gebruikt (figuur 10), wat suggereert dat miRNA-monsters meer vatbaar waren voor afbraak zodra ze werden gezuiverd van EV's. Zo werden monsters E, F, H en ik geselecteerd voor verrijkingsanalyse. De sterretjes tonen de bandgroottes van ~150 bp, de verwachte maten na cDNA-bibliotheekvoorbereiding (figuur 7). De onderste vage banden geven het primerdaar aan.
Tijdens EV-isolatie kunnen de centrifugatiesnelheid en -tijd de uiteindelijke EV-concentratie beïnvloeden. Bij het pipetteren van de EV-pellet in de kolommen van 300 k, zoals eerder vermeld in stap 6.10, zijn een laag volume en een lage snelheid essentieel om te voorkomen dat EV's door het membraan gaan. Eerdere studies toonden aan dat 700 μL bij 12.000 x g gedurende 20 minuten met behulp van een andere centrifugale concentrator voldoende was om EV's goed te scheiden van de oplosbare eiwitten20; lage EV-concentraties werden echter in de NTA weergegeven met behulp van een ander filter. Het optimaliseren van de filters en andere beschikbare materialen is dus essentieel. Bij het eerste gebruik van de kolommen van 300 k werden verschillende snelheidsintervallen getest om te bepalen welke de hoogste EV-concentratie gaf. Het aantal blaasjes dat verloren ging tijdens centrifugatie werd gemeten door NTA-analyse; er werd geconcludeerd dat lagere snelheden resulteerden in een hogere blaasjesconcentratie in de doorstroom (niet weergegeven). Er werd geconcludeerd dat 500 μL bij 6.000-8.000 x g voldoende was om de EV's te isoleren. Nadat dit was vastgesteld, werd dit protocol gebruikt om blaasjes te isoleren van I. scapularis en R. microplus. De concentratie van de blaasjes geïsoleerd van elke tekensoort werd gemeten via NTA (figuur 8). De EV-concentraties varieerden tussen 7,07 x 107 tot 7,94 x 109 deeltjes/ml. De EV-grootheid correleerde met de miRNA-concentraties, waarbij de grotere hoeveelheid EV resulteerde in een hogere concentratie miRNA-geëxtraheerd.
Figuur 1: 1 ml naaldloze spuiten geladen met vrouwelijke volwassen I. scapularis en bedekt met gesteriliseerd gaas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De dorsale zijde van een opgezwollen vrouwtje werd verwijderd met een 4 mm vannasschaar. Het vrouwtje werd ondergedompeld in 1x PBS om orgaanuitdroging te voorkomen. De gele pijlen wijzen naar de blootgestelde speekselklieren. Het figuur is genomen met een vergroting van 50x met een objectieve lens met hoge resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een celkweekplaat na een incubatie van 24 uur bij 32 °C. De eerste rij putjes bevat de blaasjesvrije media en ontlede speekselklieren. De rest van de putten bevatten 1x PBS met Rifampicine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Een monstervoorbereidingsproces voor een ultracentrifugecyclus. (A) Een naaldloze spuit van 10 ml met daarop een spuitfilter van 1 μm. (B) Het supernatant wordt na drie centrifugatierondes in de spuit gepipetteerd. (C) De rest van de spuit wordt tot 10 ml gevuld met 1x gesteriliseerd PBS. (D) De spuit is afgedekt en het supernatant met 1x PBS wordt in de ultracentrifugebuis gefilterd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Na 18 uur ultracentrifugatie vormt zich een pellet extracellulaire blaasjes aan de onderkant van de ultracentrifugebuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Een gesteriliseerde stamper wordt gebruikt om speekselklierorganen en de extracellulaire blaasjes te homogeniseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Een gel-elektroforese gemeten via een tapestation dat de miRNA-voorbereide bibliotheken weergeeft na een verrijkingsanalyse. De monsters van vrouwelijke R. microplus speekselklierorganen en EV's waren gebaseerd op minimale afbraak en voldoende miRNA-concentratie voor cDNA-bibliotheeksynthese. De ladder (L) toont de referentiepunten in nucleotiden en de bovenste en onderste markers. De sterretjes geven de banden van grootte product ~ 150 bp aan, die de kleine RNA cDNA-bibliotheken betekenen. De onderste banden tonen primer dimer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Een representatief cijfer van de variatie tussen de biologische replicaties (A) vrouwtjes, (B) mannetjes en (C) nimfen. De x-as toont de EV-grootte (nm) en de y-as toont de EV-concentratie (deeltjes/ml). Een tweeweg ANOVA en Tukey's vergelijkingstest toonde statistische verschillen (P-waarde = < 0,05). De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout om rekening te houden met variatie. Elk monster bevatte 20 teken met drie biologische replicaties. De monsters werden gedurende 60 s geregistreerd, elk drie keer. De camera was ingesteld op niveau 7 en de detectiedrempel was ingesteld op niveau 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Een representatief cijfer van de variatie voor alle gecombineerde biologische replicaties voor nimfen (rood), vrouwtjes (blauw) en mannetjes (zwart). De x-as toont de EV-grootte (nm) en de y-as geeft de EV-concentratie (deeltjes /ml) weer. Een tweeweg ANOVA en Tukey's vergelijkingstest toonde statistische verschillen (P-waarde = < 0,05). De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout om rekening te houden met variatie. Elk monster bevatte 20 teken met drie biologische replicaties. De sterretjes symboliseren een significant verschil van p < 0,05. Elke opname werd gedaan gedurende 60 s, drie keer elk. De camera was ingesteld op niveau 7 en de detectiedrempel was ingesteld op niveau 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Een representatieve gel via de bioanalyzer. De gel-elektroforese werd uitgevoerd met behulp van een basisladder als referentie. Een volwassen miRNA-sequentie is ~ 18-22 nt lang, waarbij zwakke banden worden weergegeven in het aangewezen groottebereik. Andere kleine RNA's, zoals kleine nucleaire RNA's, transfer-messenger RNA's en regelgevende RNA's, zijn ook aanwezig in de monsters. De maten van de kleine RNA's varieerden van ~20-150 nt. De monsters variëren van tekensoorten, weefsels en geslacht. Voor baan G toont een voorbeeld van monsterdegradatie geen banden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Een gel-elektroforese werd gemeten via de bioanalyzer, die de kwaliteit van de geëxtraheerde miRNA's uit R. microplus vrouwelijke speekselklierorganen en EV's weergeeft. De ladder (L) toont de referentiegroottes in nucleotiden, waar volwassen miRNA's ~ 18-22 nt lang zijn. De rijstroken A-D en G vertonen degradatie en de rijstroken E, F en H-K vertonen minimale degradatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Soort | Geslacht | Orgel/ Blaasje | EV-concentratie | miRNA-concentratie (ng) |
| R. microplus | Vrouwelijk | Orgel | N.v.t | 259 |
| R. microplus | Vrouwelijk | Orgel | N.v.t | 2,142 |
| R. microplus | Vrouwelijk | Blaasje | 1,64 E+08 | 59.22 |
| R. microplus | Vrouwelijk | Blaasje | 1,64 E+09 | 1,848 |
| I. scapulularis | Vrouwelijk | Orgel | N.v.t | 45.92 |
| I. scapulularis | Vrouwelijk | Orgel | N.v.t | 6,356 |
| I. scapulularis | Vrouwelijk | Blaasje | 1.73E+08 | 65.66 |
| I. scapulularis | Vrouwelijk | Blaasje | 3,14 E+09 | 2,128 |
Tabel 1: Een voorbeeld van de miRNA-concentraties voor zowel speekselklieren als extracellulaire blaasjes. De kolom met miRNA-concentraties vertegenwoordigt de laagste tot hoogste concentraties voor elke tekensoort.
| microRNA | I. scapulularis | I. ricinus | R. microplus | Drs. H. longicornis | Verwijzingen |
| MIR-8 | Een | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
| MIR-71 | P | P | P | Een | 33, 36, 37, 43 |
| MIR-279 | P | Een | Een | P | 33, 36, 37, 43 |
| let-7 | Een | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
Tabel 2: De geconserveerde miRNA's in verschillende tekensoorten. (P) geeft aan dat het miRNA gewoonlijk tot expressie kwam of aanwezig was, en (A) betekent dat de miRNA's niet vaak tot expressie werden gebracht of gedetecteerd.
| Type voorbeeld | Aantal scores >1* | Aantal scores >4γ | Aantal geconserveerden | Aantal romans |
| Mannelijk | 17 | 0 | 48,885 | 23 |
| Vrouwelijk | 25 | 0 | 48,885 | 21 |
| Nimfen | 38 | 0 | 48,885 | 38 |
Tabel 3. De geconserveerde en unieke miRNA's werden gedetecteerd in de EV's voor R. microplus-vrouwtjes , mannetjes en nimfen. *miRNA-score die wordt gebruikt voor profilering. γmiRNA-score die wordt gebruikt voor functionele experimenten.
Aanvullende tabel 1: Een tabel met de sequencingresultaten van de volgende generatievoor R. microplus-ev's die worden uitgescheiden uit speekselklieren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Een tabel met de sequencingresultaten van de volgende generatievoor R. microplus vrouwelijke EV's uitgescheiden uit speekselklieren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Een tabel met de sequencingresultaten van de volgende generatievoor R. microplus nimf-EV's die worden uitgescheiden uit speekselklieren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol biedt een gedetailleerde methodologie voor het extraheren van miRNA uit speekselklieren en EV's. Er zijn echter belangrijke overwegingen, die allemaal worden beschreven in de opmerkingen voor elke sectie van dit protocol. De capsule en het gaas moeten tijdens het voeren van de teken worden vastgezet om te voorkomen dat teken ontsnappen. De voorbereiding en plaatsing van de capsule worden beschreven in Koga et al.40. Verschillende replica's van de tekendissecties moeten worden uitgevoerd als een ongeschikt monster wordt weggegooid. Bovendien kunnen verschillende uitdagingen aanwezig zijn bij het gebruik van EV-isolatietechnieken van tekenweefsel 18,20,43. Weefsels moeten bijvoorbeeld vochtig worden gehouden tijdens de dissectie om uitdroging te voorkomen. Dit wordt gedaan door PBS toe te voegen tijdens de dissectie. Zowel de PBS als de media die worden gebruikt voor de dissectie en kweek van de organen moeten worden onderhouden met antibiotica om bacteriële besmetting door het tekenmicrobioom te voorkomen. Deze moeten antibiotica omvatten die zich richten op Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën, omdat beide kunnen worden gevonden intekenweefsels 60. Evenzo moet tijdens de dissectie voorzichtig worden om besmetting met weefsels van andere organen te verminderen. Dissecties moeten dus langzaam worden uitgevoerd en naarmate de gebruiker ervaring opdoet, kunnen meer teken worden ontleed. Ten slotte, omdat EV's worden uitgescheiden uit alle cellen, inclusief met pathogenen geïnfecteerde cellen, moeten tekenstudies die EV-isolatie uitvoeren EV-vrije media en buffers gebruiken om kruis-EV-besmetting te voorkomen25,61.
Niettemin maakt dit protocol de vermindering mogelijk van het aantal teken dat nodig is om speeksel-EV's te produceren. Eerdere protocollen vereisten de speekselvloed van een aanzienlijk groter aantal teken. MiRNA's die werden uitgescheiden in speeksel-EV's in Haemaphysalis longicornis hadden bijvoorbeeld de speekselvloed van 2.000 volwassen teken nodig43. Dit kan extreem duur zijn voor laboratoria die niet de capaciteit hebben om teken te fokken. Evenzo werden Amblyomma maculatumweefsels die werden gebruikt voor EV-isolatie gedeeltelijk bevroren vóór isolatie en behandeld met 75 U / ml collagenase type 3, wat de authenticiteit van de EV-secretie zou kunnen beïnvloeden19. Verder vereisten deze studies 80-100 paar speekselklieren18.
Relatief gezien kan dit protocol worden toegepast op meerdere tekensoorten en vereist het een laag aantal teken om EV's te isoleren en kwaliteitsconservatieve en nieuwe miRNA's te extraheren (tabel 2) 33,36,37,43. De miRNA-concentraties varieerden sterk, maar waren voldoende voor next-generation sequencing (tabel 3 en aanvullende tabellen 1-3). Dit protocol kan worden aangepast aan een grotere steekproefomvang als grotere miRNA-concentraties nodig zijn. Ook materialen die in dit protocol worden gebruikt, zijn substitueerbaar, afhankelijk van de beschikbaarheid van materiaal. De monstervolumes en de centrifugatiesnelheid moeten echter worden aangepast volgens de instructies van de fabrikant voor de gebruikte kits en kolommen.
Een nadeel van deze methode is dat miRNA's en EV's gemakkelijk kunnen degraderen tijdens de stappen van extractie en isolatie. Daarom moet het protocol snel en efficiënt worden uitgevoerd. Wanneer vermeld, moeten de monsters op ijs worden bewaard en moet de miRNA-extractie worden uitgevoerd in een gesteriliseerde omgeving. Bovendien kan een RNase-behandeling worden uitgevoerd op de geïsoleerde EV's om grote RNA's te elimineren die aan het EV-membraan zijn bevestigd. Dit kan voorkomen dat grote RNA's het monster besmetten tijdens miRNA-extracties. Ten slotte is het toevoegen van een RNAse-remmer aan het miRNA-monster na isolatie van EV's of organen een belangrijke preventieve maatregel voor afbraak. Dit protocol kan worden gewijzigd en toegepast parallel aan de doelstellingen van het experiment die worden uitgevoerd.
Toekomstige toepassingen voor dit protocol kunnen de studie van pathogeen-vectorinteracties omvatten om te begrijpen hoe pathogenen het miRNA en andere genomische lading in teeksel-EV's beïnvloeden. Evenzo kan dit protocol specifieke eiwitten en cellulaire processen definiëren die betrokken zijn bij de verpakking van miRNA's in teken-EV's, en het specifieke effect dat deze EV's en miRNA's hebben op wondgenezing en immuunresponsen. Vanwege de toenemende tekenresistentie tegen acariciden is er een wanhopige behoefte aan unieke bestrijdingsmethoden. EV's hebben het potentieel voor een alternatieve controlemethode in vergelijking met acariciden. EV's kunnen worden gebruikt als nanotransporters in therapeutische toepassingen 18,23,61. Bij mensen zijn EV's die miRNA's transporteren gebruikt om tumorgroei te onderdrukken tijdens kankerimmunotherapie62,63. Evenzo kunnen EV's bij teken genetisch gemodificeerde miRNA's dragen waarvan is aangetoond dat ze vitale biologische functies van teken en pathogene overdracht beïnvloeden 36,57,64. De toekomstige richting is om dit protocol te gebruiken om de miRNA-profielen van meerdere tekensoorten te bepalen om miRNA's te identificeren die van belang zijn voor functionele studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We zijn zeer dankbaar voor de hulp van het Cattle Fever tick Laboratory in Edinburg, Texas. We willen Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado en Homer Vasquez bedanken. We willen ook de hulp van Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario en Stephanie Guzman Valencia tijdens het project bedanken. We willen de Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group bedanken voor hun hulp en advies tijdens het schrijven van dit manuscript. De volgende reagentia werden geleverd door Centers for Disease Control and Prevention voor distributie door BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Vrouwelijke I. scapularis-teken werden ook ontvangen van de Tick Rearing Facility aan de Oklahoma State University. Dit project werd gefinancierd door Texas A&M University T3: triades voor transformatiesubsidie en de samenwerkingsovereenkomst #58-3094-1-003 door de USDA-ARS aan AOC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
References
- Jongejan, F., Uilenberg, G.
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
- de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
- Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , Elsevier. 603-672 (2019).
- Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
- Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
- Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
- Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
- Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
- Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
- Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
- Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
- Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
- Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
- Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
- Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
- Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Pegtel, D. M., Gould, S. J.
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
- Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
- Chávez, A. S. O., O'Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
- Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
- Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Ambros, V.
- Bushati, N., Cohen, S. M.
- Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
- Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
- Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
- Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
- Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. Proteomic Profiling. , Springer. 179-209 (2015).
- Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
- Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
- Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
- Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
- Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
- Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
- Tissot, C. Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Agilent Technologies. , Palo Alto, Calif, USA. Available from: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-7870EN.pdf (2008).
- Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
- Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
- Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl_1 140-144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl_1 154-158 (2007).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 152-157 (2011).
- Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
- Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
- Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
- Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
- Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
- Di Leva, G., Croce, C. M.
- Ganju, A., et al.
- Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).
