Summary
本プロトコールは、ダニ唾液腺および精製された細胞外小胞からのマイクロRNAの単離を記載する。これは、一般的に使用される試薬と消耗品を組み合わせた普遍的な手順です。この方法はまた、少数のダニの使用を可能にし、容易に配列決定することができる高品質のマイクロRNAをもたらす。
Abstract
ダニは、複数の病原体を媒介することができる重要な外部寄生虫である。ダニの唾液腺は、その唾液が宿主の免疫応答を減少させ、病原体の伝達を増強することができる医薬的特性を有する多くのエフェクターを含むので、摂食に不可欠である。このようなエフェクターの1つのグループは、マイクロRNA(miRNA)である。miRNAは、ダニと宿主の界面およびダニの器官内で宿主遺伝子発現を調節する短い非コード配列である。これらの小さなRNAは、細胞間および細胞内のコミュニケーションに役立つ細胞外小胞(EV) を介して ダニの唾液中に輸送される。miRNAを含む小胞は、ダニの唾液中に同定されている。しかし、ダニの唾液小胞および腺におけるmiRNAの役割およびプロファイルについてはほとんど知られていない。さらに、ダニの唾液中の小胞およびmiRNAの研究は、ダニの唾液を収集するための退屈な手順を必要とする。このプロトコルは、 エクスビボ 臓器培養によって産生された精製された細胞外小胞からmiRNAを単離する方法を開発し、検証することを目的としています。細胞外小胞およびダニ唾液腺からmiRNAを抽出するために必要な材料および方法論が本明細書に記載されている。
Introduction
ダニは、多くの病原体を野生生物、家畜、人間、およびそれらのペットに媒介する外部寄生虫である1,2。ダニの摂食は、隠れる損傷を引き起こし、重度の貧血による体重および牛乳生産を減少させ、潜在的に致命的な疾患を引き起こす病原体の伝播を引き起こすことによって、著しい経済的損失をもたらす1,3,4,5。ダニ集団を管理するための現在の制御慣行は、殺ダニ剤の使用に焦点を当てている。それにもかかわらず、家畜5,6を寄生するダニにおける殺ダニ剤耐性の継続的な出現、ダニ刺咬7の発生率の増加、および住宅地8,9内での病原体伝達は、ユニークなダニ防除代替物の必要性につながっている。
ダニの唾液腺は、ダニの生物学的成功を確実にする不可欠な器官である。それらは、様々な生理学的機能を有する異なる腺房タイプ(I、II、III、およびIV)によって形成される。唾液腺は、唾液分泌を介して過剰の水分および鉄含有量を宿主に戻すことによって、宿主のオフおよびオンの両方の浸透圧調節に関与している2,10。I型アチーニはまた、吸湿性唾液10、11の分泌による大気からの水の取り込みにも関与している。セメントおよびシスタチンなどの唾液エフェクタータンパク質は、II型およびIIIアシニ10,12の分泌細胞内で産生される。I型アチーニはダニの摂食に影響を及ぼさず、血粉摂取がこれらのアチーニ型13,14の形態学的および生理学的変化を引き起こさないことを示す。一方、アチーニII型およびIII型は摂食中に活性化され、付着前の活性はほとんど存在しない。したがって、摂食は、II型アチーニ内の分泌細胞の拡大および生理活性化合物の産生を誘発するために必要である。III型腺房は、分泌顆粒12内の分泌のために摂食中にサイズが縮小される。
唾液腺はまた、ダニおよび感染経路における病原体感染の部位でもある。摂食中、ダニは血粉を正常に完了するために必要な薬学的効果を有するいくつかの化合物を分泌する10、15、16。これらの化合物は、抗炎症性、免疫抑制性、および血管拡張性を有する10、15、17。最近の研究は、ダニ唾液腺に由来する細胞外小胞(EV)がこれらの化合物のいくつかを保有し、抗炎症および免疫調節効果を誘導することを示している18、19、20。「細胞外小胞」は、そのサイズおよび生合成に基づいてエキソソームおよび微小小胞として分類される小胞を記述するために使用される包括的な用語である。全体として、EVは、サイズ21で〜40nm-1μmの二重膜を有する脂質ブレブである。一般に、エキソソームはサイズが40〜150nmであると記載されているが、微小小胞はサイズが150nm〜1μmの間である21、22、23。しかしながら、その大きさは、EVs生合成経路22を示すものではない。
エキソソームの生合成は、原形質膜の逐次的な浸潤から始まる。この浸潤は多胞体の形成をもたらし、最終的にESCRT複合体またはスフィンゴミエリナーゼ(sMases)の作用による小胞膜の変形をもたらす24,25。エキソソームは、細胞恒常性を維持するためにリソソーム内で溶解されるか、または原形質膜への小胞融合を介して出て、細胞構成成分をレシピエント細胞に送達することができる21、24。一方、マイクロベシクルは、フローパスやフリップアスの作用により形成され、原形質膜26における脂質の立体構造を変化させる。EVは細胞間通信に不可欠であり、脂質、タンパク質、核酸、マイクロRNA(miRNA)などの細胞内貨物の輸送システムとして機能しています21,27,28。一旦輸送されると、これらの小胞は、それらの貨物をレシピエント細胞の細胞質に送達し、受容細胞22、29に表現型変化を生じる。ダニ摂食における細胞外小胞の重要性および宿主免疫および創傷治癒応答の操作18,20のために、細胞外小胞内の貨物は、抗ダニ治療薬の開発のための潜在的な標的およびダニ摂食を破壊するユニークなメカニズムを提示する。これには、ダニ唾液腺および唾液腺由来の細胞外小胞内のmiRNAが含まれる。
miRNAは、短い非コード配列であり、長さが〜18〜22ヌクレオチド(nt)であり、mRNA配列を転写後的に調節、分解、またはサイレンシングすることができる30、31。転写中、pri-miRNAはDicer(RNAポリメラーゼIII)によって切断され、特徴的なヘアピン様構造を形成し、プレmiRNAとなる。プレmiRNAは、ドロシャ(RNAポリメラーゼIII)によって再び切断され、成熟miRNA二重鎖を形成する。成熟配列は、mRNA配列に相補的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、翻訳抑制またはmRNA分解を引き起こす28、30、32。宿主の摂食中、ダニの唾液中のmiRNAは宿主の遺伝子発現を調節して免疫応答を抑制し、病原体の伝達を増強することができる33、34、35、36、37。EVとmiRNAに関する広範な研究は存在するが、ダニと宿主の界面での摂食中のそれらの役割はまだほとんど理解されていない。高品質のmiRNAの単離と精製を容易に得られるプロトコルを最適化することは、これらのトピックに関する知識を進歩させるために不可欠です。
EVを単離するために、超遠心分離、エキソソーム沈殿、ポリマー沈殿、イムノアフィニティークロマトグラフィー、サイズベースの排除技術など、複数のオプションを利用することができます38。しかしながら、これらの技術は、エキソソームまたは微小小胞を区別することができない。したがって、前述のように、EVは異なるサンプルからEVを分離する際の包括的な用語として使用されます。本明細書に記載される実験において単離された小胞は、異なる生合成経路に由来する小胞の混合物を表す。細胞外小胞の特定の集団のさらなる精製は、目的の小胞集団に固有のマーカー(すなわち、エキソソームマーカー、腫瘍マーカー)に対する抗体でコーティングされたビーズを用いた免疫沈降によって達成することができる39、40。miRNAは、異なる市販の単離キット7、41、42を介して抽出することもできる。
このプロジェクトの目的は、EVを単離し、EVと摂食ダニ唾液腺の両方からmiRNAを抽出するために一般的に適用される方法を組み合わせたプロトコルを開発することでした。生理活性化合物の分泌は摂食12によって活性化されるので、ダニは宿主の免疫および創傷治癒応答を操作するために重要であるかもしれないmiRNAを同定するために摂食を許可されるべきである。現在のプロトコルは、EVおよびそれぞれのmiRNAを単離するために少数のダニ(20ダニ)を必要とするが、2000ダニ43を必要とした他の前述の研究と比較して。さらに、ピロカルピン44による唾液分泌物の汚染を回避し、宿主細胞に対するEVおよびそのmiRNAの効果を研究する実験に影響を与える可能性がある。
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Protocol
すべての動物実験は、テキサスA&M大学の施設動物ケアおよび使用委員会(AICUC)によって承認された動物使用プロトコル(AUP#2020-0026)に従って実施した。ダニ種、 Ixodes scapularisおよび Rhipicephalus(Boophilus)マイクロプラス、ならびに42〜72日齢のニュージーランドオス白ウサギを本研究に使用した。 I. scapularisは 、疾病管理センター(CDC)およびオクラホマ州立大学から受領され、病原体フリーと認定されました。R. microplus は、テキサス州エジンバーグのCattle Fever Tick Research Laboratoryで飼育されました。ウサギは市販の供給源から入手した( 材料表を参照)。このプロトコルは、異なるダニ種、ライフステージ、および組織から細胞外小胞およびmiRNAを普遍的に単離することができる。
1.女性の I.肩甲骨 の飼育とカプセル製剤
- 硬ダニ給餌ウサギ45の手順に従ってエチレン - 酢酸ビニル発泡カプセルを調製する。ウサギの各肩甲骨に1つのカプセルを置き、侵入ごとに合計2つのカプセルを置きます。
注:簡単に言えば、これらのカプセルは、内部に空のスペースを有するエチレン - 酢酸ビニルフォームの2つの正方形からなる。1つの正方形は、組織接着剤(材料表を参照)で動物(この場合はウサギ) の背中に接着されています。細かいメッシュは、ダニの脱出を避けるために2番目の正方形に接着されています。2つの正方形は、自己粘着フックテープを使用して閉じられます。 - カプセルをウサギに接着する前に、カプセルを24時間セットしてください。発泡カプセルを室温で保存する。
注:カプセルは室温で無期限に保存することができます。 - 剃毛された皮膚のウサギにカプセルを付着させ、ダニの侵入の前に24時間放置する。
2. ベシクルフリー培地の調製
- ベシクルフリー培地13を調製するために、0.5mLのウシ胎児血清、0.5mLのリン酸トリプトースブロス、0.1mLの10%リポタンパク質−コレステロール濃縮物、0.5mLの5%炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、0.25mLの4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および8.125mLのL15C300培地を組み合わせる(材料表を参照のこと)。必要に応じて、メディアの音量を調整します。培地を26.3 mLポリカーボネート遠心分離機ボトルに入れます。
- 超遠心分離機の適切な機能を確保するために、最大0.01gの重量差でボトルのバランスを取ります。
- 培地を4°Cで100,000 x g で18時間超遠心分離する。 ピペット を介して 上清を除去し、形成されたペレットを乱さないように注意深く確認する。
- 上清を新しい遠沈管に移し、適切なバランスで4°Cで100,000 x g で18時間超遠心します。
- 残りの上清を分離し、0.22 μmのシリンジフィルターに通して汚染物質を除去します。上清を50mL遠沈管にピペットでつないだ。
- 上清を-20°Cの冷凍庫に必要になるまで、または最大3年間保管します。
3.ウサギの侵入
- 上部を10mLシリンジから切り取り、標準的なペイントブラシを使用して成人 のI.肩甲骨 雌を装填する。
- 滅菌ガーゼを使用してシリンジ開口部を覆います(図1)。
- ウサギをテーブルトップまたは作業面に水平に置きます。ウサギをタオルでしっかりと包み、両目を覆い、準備したカプセル(ステップ1.1)をウサギにダニを蔓延させるようにさらします。
- カプセルを開き、シリンジハンドルを押してダニを挿入します。ダニをウサギの皮膚の近くに預ける。ダニが逃げるのを防ぐためにカプセルを素早く閉じる。
- 実験計画によると、女性のダニが必要なだけ餌をやるのを許してください。乾燥を避けるために、男性の Ixodes肩甲骨が 24時間以上カプセルに留まるのを許さないでください。
注:動物に寄生するダニの数は、研究者の裁量に委ねられています。このプロトコルは、死亡率と複製のための十分な材料を説明するために、侵入ごとに〜100ティックを使用しました。予備実験では、miRNAをシーケンシングするのに十分な材料を得るために、少なくとも20ティック/複製が必要であることが判明しました。
4.給餌された女性の除去
- 出没したウサギをガスディフューザーを使用して酸素中の2%イソフルランの下に置きます。酸素速度を700-1000 L/minに設定してください。
注:他の麻酔薬は、苦痛や痛みを避けるために使用することができます。 - 細かい鉗子を使って、できるだけ皮膚の近くにダニをつかんで、給餌された女性を取り除きます。細菌感染を避けるために、マウスパーツが完全に取り外されていることを確認してください。
- ダニを15mL遠沈管に入れる。
- 咬合部位を70%エタノールで洗浄し、ダニ刺咬部位での感染を防ぐために少量のトリプル抗生物質(指先分、 材料表を参照)を加える。
- 解剖のためにダニを実験室に運ぶ(ステップ5)。唾液腺の分解を避けるために、ダニを除去してから24〜48時間以内にこれらの解剖を行う15,43。
5.唾液腺郭清と細胞外小胞分泌
- 500 μLのベシクルフリー培地(ステップ2)と5 μLの100xペニシリン、5 μLの100xストレプトマイシン、5 μLの10 mg/mLのリファンピシン、および5 μLの100xアンホテリシンを各ウェルに加えます( 材料表を参照)。細菌の増殖を防ぐために、小胞を含まない培地を含まないウェルにリファンピシンを含む1x PBSを追加します。
- 解剖顕微鏡の下で両面カーペットテープで透明な顕微鏡スライドガラスにダニを置きます。臓器乾燥を防ぐために、解剖前に各ダニに10μLの1x PBSを加える。
- 4mmのバンナハサミ( 材料表を参照)を使用して、各女性の側面に〜1mmの小さな切開部を作ります。ダニの背側を完全に取り除き(図2)、両方の唾液腺を除去します。
- 24ウェル組織培養処理プレートのシングルウェルに500 μLの小胞フリー培地を加えて20-40ダニ唾液腺を入れます(図3)。
- 唾液腺サンプルを32°Cで24時間インキュベートし、EVの分泌を可能にします。
6. 細胞外小胞の単離
- 24時間インキュベーション後、唾液腺を含む全ての培地を1.5 mL微量遠心チューブにピペットで入れる。
- サンプルを4°Cで300 x g で10分間遠心分離し、唾液腺を単離する。このステップでは、(1)EVを含む上清と(2)唾液腺(ペレット)の2つの相が分離されます。
- EVの単離を継続するために、上清を新しい1.5mL微量遠心チューブにピペットで入れる。唾液腺を含むペレットを500 μLのRNAlater( 材料表を参照)に再懸濁し(ステップ6.2)、使用するまで、または無期限に-80°Cで保存する。
注:これらの唾液腺は、ステップ8のmiRNA単離に使用されます。 - 上清を4°Cで2000 x g で10分間遠心分離し、細胞破片を除去した。上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブにピペットで入れます。ペレットを捨てる。
- 上清を 10,000 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離して、アポトーシス体とより大きな EV を除去します。ペレットを投げ、上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブにピペットで入れます。
- 10 mL シリンジを 1 μm ナイロンシリンジフィルターに取り付けます。シリンジとフィルターを超遠心チューブの上に置きます(図4A)。次に、サンプルを加え(図4B)、シリンジに10mLの1x PBSを充填し(図4C)、それに応じてチューブのバランスを取ります(図4D)。
- チューブを70Tiローター( 材料表を参照)に入れ、100,000 x g で4°Cで18時間回転させます。
- 18時間の超遠心分離後、チューブの下端にあるペレットを観察します(図5)。ペレットは濃縮された細胞外小胞である。
- EVペレットを再懸濁することなく上清の90%〜100%を除去する。ペレットを1x PBSで再懸濁する。すべての上清を除去できない場合は、残りの上清を使用してペレットを再懸濁します。
- EVペレット/上清500 μLを300 K遠心フィルターにピペットで入れます( 材料表を参照)。
注:これにより、小胞に関連しないタンパク質、miRNA、およびその他の分子が除去されますが、小胞はフィルターを通過しません。 - 周囲温度で 8,000 x g で 10 分間遠心分離します。すべてのEVペレット/上清がフィルターを通過するまで、手順6.10を繰り返します。
- 滅菌した 1x PBS を 400 μL カラムに加え、ピペット で 十分に混合して、メンブレンに付着した EV を除去します。サンプルを1.5mLのDNase-/RNaseフリーチューブに入れます。サンプルは、-80°Cで無期限に、または使用するまで保存することができます。サンプルの劣化を防ぐために、過度のサンプルの解凍は避けてください。
注:EVの劣化を防ぐために、超遠心分離機から取り出したときは、チューブを氷の上に置きます。最終サンプルは、400 μL の 1x PBS の EV ペレットになります。このサンプルの25 μLはナノ粒子追跡分析(NTA、ステップ7)に使用され、375 μLはmiRNA単離(ステップ8)に使用されます。
ナノ粒子追跡分析(NTA)
- 最終サンプルを25 μL取り(ステップ6.12)、1x PBSを375 μL加えます。
- 希釈したサンプルを1mLの無針シリンジにセットし、NTAの光学レンズにしっかりとねじ込みます。
- それに応じて設定を調整し、設定設定に基づいてビデオをキャプチャします。
注:本研究では、それぞれ60秒の3つの測定値が取られた。すべての NTA 読み取りは、技術的なレプリケートを表します。同じ時間の長さのダニ摂食からの異なるサンプルは、個々の生物学的複製を表す。カメラはレベル 7 に設定され、検出しきい値はレベル 5 に設定されました。 - 最終的なEV数値を次の式で推定します。
((開始EV濃度(希釈率)*(サンプルチューブに残った総量)/1000)=サンプル中のEVの合計
注: NTA はサンプルを濃度/mL として読み取るため、容量は 1000 で割る必要があります。
8. 唾液腺および細胞外小胞からのmiRNA抽出
- ステップ6.12の残りのサンプルに溶解試薬( 材料表を参照)を100μL加え、滅菌乳棒でホモジナイズします(図6)。
- 残りの600 μLの溶解試薬を加え、室温で5分間インキュベートする。
- 140 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振とうし、室温で3分間インキュベートする。
- 12,000 x g で 4 °C で 15 分間スピンします。
- 相間を避けて透明な上相を新しい1.5 mLチューブにピペットで入れます。これにより、予想されるサンプル量が約525μLになります。次に、100%分子グレードのエタノールの1:1容量を加える。
- 700 μL のサンプルを RNA 単離スピンカラムに追加します( 材料表を参照)。
- 周囲温度で30秒間8,000 x g でスピンし、フロースルーを捨てます。
- サンプルを 700 μL の RTE バッファー ( 材料表を参照) で洗浄し、8,000 x g で 30 秒間スピンし、フロースルーを捨てます。
- サンプルを 500 μL の RPE バッファー ( 材料表を参照) で洗浄し、8,000 x g で 30 秒間スピンし、フロースルーを捨てます。
- 500 μL の 80% 分子グレードのエタノールを加え、8,000 x g で 2 分間スピンし、フロースルーを捨てます。
- カラムを最大速度で 5 分間回転させて膜を乾燥させます。収集チューブを廃棄し、カラムを新しい 1.5 mL マイクロフュージチューブの上に置きます。
- 14 μLのRNase-/DNaseフリー水を膜に加え、室温で5分間インキュベートする。
- 室温で1分間、21,000 x g で遠心分離する。
- 溶出したmiRNAにRNase阻害剤( 材料表参照)を1μL加え、ピペット で よく混合します。
注:唾液腺からmiRNAを抽出する前に、1mlの1x PBS(1:1容量)を加えてRNAlaterを除去し、4°Cで15分間、最大速度で唾液腺をスピンダウンします。 これは、3回、または唾液腺が上清を除去するのに十分に沈むまで繰り返す必要があります。この時点で、サンプルは、サイズが約20〜150 bpの小さなRNAの混合物を表しています(補足図1)。
9. miRNA濃度の測定
- 市販のRNAアッセイキット41を介して低分子RNAの濃度を測定する(材料表参照)。
- 各チューブに、メーカーの指示に従って、199 μLの希釈バッファー(キットに付属の成分AおよびBをサンプルあたり)、miRNAの検出に特異的な蛍光色素1 μL(測定波長260 nm)(サンプルあたり)、および各サンプルに2 μLの低分子RNA(ステップ8)を混合します。
- サンプルチューブを読み取る前に、予め希釈されたmiRNA標準1および標準2(キットに付属)を読み取り、サンプル測定前に標準曲線を作成します。
注:標準物質は、サンプル中の測定されたmiRNA濃度を決定するための比較ツールとして使用されます。 - 各標準品とサンプルチューブを専用の蛍光光度計( 材料表参照)に入れ、濃度をng/μLとして測定します。
10. miRNA の品質の決定
- miRNAおよび他の小さなRNAの品質は、バイオアナライザ46を用いて、製造業者の指示に従ってゲル電気泳動を介して決定する(材料表を参照)。
- サンプルの読み取りの前に、サンプルを同じ濃度になるように正規化します。
- 製造元の指示に従って、小さなRNAチップ41,46を通してサンプルを読み取ります(材料表を参照)。
注:miRNAの品質を決定するために、ゲル状の画像(バンド)および電気泳動図(ピーク)はサンプル品質の指標です。ゲル中のバンドが濃いほど、miRNAの品質は向上します。バンドが軽いほど(またはバンドが存在しない場合)、品質が悪くなるか、サンプルの劣化が証明されます46,47。
11. マイクロRNAエンリッチメント
- small RNA シーケンシングキットを使用して miRNA を濃縮し、小 RNA サンプル調製キットの製造元の指示に従います ( 材料表を参照)。
- 各サンプルを3フィートのアデニル化アダプターでリゲートし、ビーズクリーンアップ を介して 余分なアダプターを取り外します。次に、5'アダプタを追加し、ビーズクリーンアップ48によって余分なアダプタを取り外す。
メモ: クリーンアップ用のアダプターとビーズは、セクション 11.1 の small RNA シーケンシングキットで提供されました ( 材料表を参照)。 - 第1の鎖を合成するには、キットに付属のアダプター、RTバッファー、およびM-MuLV逆転写酵素の両方と連結したサンプルのマスターミックスを調製します( 材料表を参照)。次に、混合物を42°Cで30分間、90°Cで10分間インキュベートする。 指示に記載されているサンプルクリーンアップでフォローアップします。
- キットに付属のRTフォワードプライマーおよびリバースユニバーサルプライマー( 材料表参照)を用いて、従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を介して 95°Cで2分間、次いで95°Cで20秒間、60°Cで30秒間、および72°Cで15秒間、12-25サイクルにわたって第1鎖を増幅する。 最後に、72°Cで2分間。
注: PCR 産物のサイズは ~150 bp と予想されます(図 7)。 - メーカーの指示に従ってテープステーション で PCR製品の品質を測定します( 材料表を参照)。
- 次世代シーケンシングシステム(75サイクル)を使用してサンプルをシーケンシングし、製造元の指示に従います( 材料表を参照)。
注: miRNA を濃縮するには、ライブラリー調製前にサンプルの量と質を確認する必要があります(ステップ 9 ~ 10)。
12. バイオインフォマティクス解析
- miRNA同定のための統合されたアプリケーションツールを使用して、保存されたユニークなmiRNAを同定します。
注:本研究では、miRNAの同定をmiRDeep249,50を介して行った。miRDeep2は、様々な種49,50に見られるすべての同定された保存および新規miRNAの無料オンラインカタログです(材料表を参照)。 - ソフトウェアに統合されたマッパーを使用して、読み取り値を対応するゲノムに合わせます。
- マッパーモジュールに次のパラメータを入力します。
- ステップ 11.2 から追加されたアダプター配列をトリミングし、長さが 18 ヌクレオチド未満の配列を削除します。冗長な読み取りシーケンスを削除します。
- 解析から FASTA 形式パラメーターを使用してファイルを変換するのは、ファイルが FASTA 形式49 でない場合のみです。
- フィルタリングおよびトリミングした配列を対応するゲノムにアライメントします。目的の種のゲノムがない場合は、最も近い相同種にアライメントします。
- 出力ファイルを "reads.fa" と "reads_vs_genome.arf" として表示します。"read.fa" には冗長でない読み取りのみが含まれ、「reads_vs_genome.arf」にはゲノムにアライメントされたマップされた読み取りが含まれます。
- ステップ12.2からの両方の出力ファイルを使用して、ソフトウェアと統合された量化子を使用してmiRNA発現プロファイリングを実行します。
- 目的の種のmiRNA前駆体配列および成熟miRNA配列をmiRBase 51、52、53、54、55、56からダウンロードする。目的の種の前駆体配列または成熟配列がない場合は、miRBaseで利用可能なすべての生物のすべての前駆体および成熟配列を含む「hairpin.fa.gz」および「mature.fa.gzをダウンロードしてください。
- "hairpin.fa.gz" ファイルと "mature.fa.gz" ファイルを解凍します。
- セクション 12.3.4 の "reads.fa" ファイルと "read_vs_genome.arf" ファイル、および 12.4.2 の非圧縮ファイルを入力します。
- 出力ファイルを "outputname.csv"、"outputname.html"、"outputname.pdf として読み込みます。出力ファイル名は、調査員に応じて設定できます。
メモ: "outputname.csv" ファイルには式プロファイルが含まれます。具体的には、発現プロファイルは、miRNA ID、miRNA にマッピングされたすべてのサンプルの読み取りの合計、各サンプルの特定の miRNA にマッピングされた読み取り数、および成熟 miRNA に対応する前駆体 ID を持つことになります。ステップ 12.4.4 の「出力名.html」には、サンタクルーズ大学ゲノムブラウザー (USCS)、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI)、および miRBase へのリンクが含まれます。USCSおよびNCBIは、非冗長ヌクレオチドデータベースに対する現在の前駆体のクエリ配列を含み、miRBaseは現在のmiRNA前駆体の情報を有する。「出力名」は.pdf発現されるmiRNAのRNA二次構造と前駆体配列のアラインメントを有する。
- 一意で保存された miRNA を同定するには、miRDeep2 を使用します。
- ステップ 12.3.4 およびステップ 12.4.2 の出力ファイルを入力ファイルとして使用します。
注: "outputname.html" と読み取られる出力ファイルには、サンプル中の一意で保存された miRNA の予測が含まれます。 - miRNAプロファイリングにはスコア>1を使用し、miRNA阻害や内因性miRNAの模倣などのさらなる実験分析にはスコア>4を使用します34、36、57。
- miRDeep2スコア(ステップ12.5.3)、真確率の推定(>90%)、有意なランドフォールドp値(<0.05)49,50,56に基づいて、miRbaseから一意のmiRNAを選択して同定します。
注:バイオインフォマティクス分析は、バイオインフォマティクス分析のための無料のオンラインプラットフォームであるCyverse Discovery Environment 58,59のmiRDeep2を介して行われました。miRDeep2 を通じて同定された保存されたユニークな miRNA を、miRbase のすべての種と比較した。将来のmiRDeep2同定は、目的の種の対応するゲノムと比較することができる。
- ステップ 12.3.4 およびステップ 12.4.2 の出力ファイルを入力ファイルとして使用します。
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Representative Results
本プロトコルは、唾液腺およびEVからmiRNAを抽出するための詳細な方法論を提供する。結果によると、このプロトコルは、 I. scapularis および R. microplusの2つの異なるダニ種の成体からのmiRNAの単離に有効であり、潜在的に他のダニ種でも使用することができる。EVの濃度(粒子/mL)はNTA 経由で 測定した。 R. microplusの場合、各性別およびライフステージには、3つの技術的反復で測定された3つの生物学的反復が含まれていた。サンプルを性別およびライフステージ(図8)で分離し、各サンプル内の変動を示した。次に、サンプルを組み合わせ、二元配置分散分析とTukeyの多重比較検定20 (p値=<0.05)を用いて変動および統計的差異を表示した(図9)。各サンプルは、20人の女性、男性、およびニンフから解剖された〜40個の唾液腺から構成されていた。EVの単離および定量の後、サンプルを低分子RNA精製に使用した。
各サンプル中の低分子RNAの濃度をQubit(表1)を介して測定し、品質を標準ゲル電気泳動46、47を用いたバイオアナライザーを介して測定した。濃度は、両方のダニ種について14μL容量のナノグラム(表1)である。I. scapularis器官からの小RNA濃度の平均合計は、45.92〜6,356ngの範囲であった。I. scapularis vesiclesのRNA濃度は72.24-2,128 ngの範囲であった。R. microplusの場合、器官濃度は259〜2,142ngの範囲であり、小胞は59.22〜1,848ngの範囲であった。サンプルを同じ濃度に正規化し、バイオアナライザーを介してその品質を測定しました(図10)。基準はしごは、品質評価のためのマーカーとしてゲル中に使用した。バンドの完全性、強度、およびピークは、各サンプルにおける潜在的な分解または総濃度の代表であった。5秒および5.8秒のリボソームRNAに対応するバンドは、唾液腺器官サンプルにのみ存在し(図10、レーンA〜D)、唾液腺サンプルからの小胞には存在せず(図10、レーンE、F)、器官と細胞外小胞との間の小さなRNAプロファイルの違いを実証した。サンプル分解は、ゲル中にバンドがないことによって推測された;これは、サンプルの著しい劣化があったことを意味していました。著しい劣化を有するサンプルは廃棄することをお勧めします。
調製物内のmiRNAサンプルの存在を実証するために、低分子RNA単離後3〜4ヶ月間保存されたRNA試料から低分子RNAcDNAライブラリーを調製した。奇妙なことに、これらのサンプルではより高いサンプル劣化が見つかりました。レーンA-DとGは劣化の兆候を示しました。それどころか、E、F、およびH-Kは、miRNA cDNAライブラリー調製のための最小限の分解および十分な濃度を示した(補足図1)。精製直後にサンプルを使用した場合、分解されたサンプルは1つだけであり(図10)、miRNAサンプルはEVから精製されると分解されやすいことが示唆されます。これにより、サンプルE、F、H、および濃縮分析のために選択した。アスタリスクは〜150 bpのバンドサイズを示し、これはcDNAライブラリー調製後に予想されるサイズであった(図7)。下部のかすかなバンドはプライマー二量体を示す。
EVアイソレーション中、遠心分離の速度と時間は最終的なEV濃度に影響を与える可能性があります。ステップ 6.10 で前述したように、EV ペレットを 300 k カラムにピペッティングする場合、EV が膜を通過するのを防ぐためには、低い体積と速度が不可欠です。以前の研究では、別の遠心濃縮器を使用して12,000 x g で700 μLを20分間使用すれば、EVを可溶性タンパク質から適切に分離するのに十分であることが示されました20;しかし、低いEV濃度は、別のフィルタを使用してNTAに表示された。したがって、フィルターやその他の利用可能な材料を最適化することが不可欠です。最初に300kカラムを使用したとき、異なる速度間隔を試験して、どれが最も高いEV濃度を与えるかを決定しました。遠心分離中に失われる小胞の数は、NTA分析によって測定された。より低い速度は、フロースルー(図示せず)におけるより高い小胞濃度をもたらすと結論付けられた。6,000-8,000 x g で500 μLがEVの分離に満足できると結論付けられました。これが決定されると、このプロトコルを使用して、 I. scapularis および R. microplus から小胞を単離した。各ダニ種から単離された小胞の濃度をNTA を介して 測定した(図8)。EV濃度は7.07 x107 ~7.94 x109 粒子/mLの間で変化しました。EV量はmiRNA濃度と相関し、EV量が多いほど、抽出されるmiRNA濃度が高くなった。
図 1: 成人女性 I. 肩甲骨 を装填し、滅菌ガーゼで覆われた 1 mL の無針注射器。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:充血した女性の背側を4mmのバンナハサミで除去した。 雌は、臓器乾燥を防ぐために1x PBSに浸された。黄色の矢印は露出した唾液腺を指しています。この図は、高解像度の対物レンズで50倍の倍率で撮影されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:32°Cで24時間インキュベートした後の細胞培養プレート。 ウェルの最初の列には、小胞を含まない培地と解剖された唾液腺が含まれています。残りの井戸には、リファンピシンを含む1x PBSが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:超遠心サイクルのサンプル調製プロセス。(A)10 mLの無針シリンジに1 μmのシリンジフィルターをトッピングしたもの。(B)3回の遠心分離後の上清をシリンジにピペットで留める。(C)シリンジの残りの部分を、1x滅菌PBSで10mLまで充填する。(D)シリンジを覆い、1x PBSで上清を濾過して超遠心チューブに入れる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:超遠心18時間後、超遠心管の底部に細胞外小胞のペレットが形成されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 滅菌された乳棒を使用して、唾液腺器官と細胞外小胞を均質化します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:濃縮分析後にmiRNAを調製ライブラリを表示したテープステーション で 測定したゲル電気泳動。 雌 のR.マイクロプラス 唾液腺器官およびEVからのサンプルは、最小限の分解およびcDNAライブラリー合成のための十分なmiRNA濃度に基づいていた。はしご(L)は、ヌクレオチドおよび上下マーカーにおける基準点を示す。アスタリスクは、サイズ積〜150 bpのバンドを示し、これは小さなRNA cDNAライブラリーを示す。下バンドはプライマー二量体を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:(A)雌、(B)雄、および(C)ニンフの生物学的複製間の変動の代表的な図。 X軸はEVサイズ(nm)を示し、y軸はEV濃度(粒子/mL)を示す。二元配置分散分析とTukeyの比較検定では、統計的差異が表示されました(P値 = < 0.05)。エラーバーは、変動を説明するための標準誤差を表します。各サンプルには、3つの生物学的複製を有する20ダニが含まれていた。サンプルを60秒間、それぞれ3回記録した。カメラはレベル7に設定され、検出しきい値はレベル5に設定されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ニンフ(赤)、雌(青)、および雄(黒)のすべての複合生物学的複製の変動の代表的な図。 X 軸は EV サイズ (nm) を示し、y 軸は EV 濃度 (粒子/mL) を示します。二元配置分散分析とTukeyの比較検定では、統計的差異が表示されました(P値 = < 0.05)。エラーバーは、変動を説明するための標準誤差を表します。各サンプルには、3つの生物学的複製を有する20ダニが含まれていた。アスタリスクは 、p <0.05の有意差を象徴しています。各録音は60秒間、それぞれ3回行われました。カメラはレベル7に設定され、検出しきい値はレベル5に設定されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:バイオアナライザー を介した 代表的なゲル。 ゲル電気泳動は、ベースラダーを基準として用いて行った。成熟したmiRNA配列は〜18〜22ntの長さであり、ここで、微弱なバンドが指定されたサイズ範囲で示される。小さな核RNA、トランスファーメッセンジャーRNA、調節RNAなどの他の小さなRNAもサンプル中に存在する。小さなRNAのサイズは〜20〜150 ntの範囲であった。サンプルは、ダニの種、組織、性別によって異なります。レーンGの場合、サンプル劣化の例はバンドを示していません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:バイオアナライザー を介して ゲル電気泳動を測定し、 R.マイクロプラス 雌唾液腺器官およびEVから抽出されたmiRNAの品質を表示した。はしご(L)はヌクレオチド単位の基準サイズを示しており、成熟miRNAの長さは約18〜22 ntです。レーン A-D と G は劣化を示し、レーン E、F、および H-K は最小限の劣化を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 種 | ジェンダー | 臓器/小胞 | EV集中 | miRNA濃度(ng) |
| R. マイクロプラス | 女性 | 器官 | 該当なし | 259 |
| R. マイクロプラス | 女性 | 器官 | 該当なし | 2,142 |
| R. マイクロプラス | 女性 | 小胞 | 1.64 E+08 | 59.22 |
| R. マイクロプラス | 女性 | 小胞 | 1.64 E+09 | 1,848 |
| I. 肩甲骨 | 女性 | 器官 | 該当なし | 45.92 |
| I. 肩甲骨 | 女性 | 器官 | 該当なし | 6,356 |
| I. 肩甲骨 | 女性 | 小胞 | 1.73E+08 | 65.66 |
| I. 肩甲骨 | 女性 | 小胞 | 3.14 E+09 | 2,128 |
表1:唾液腺および細胞外小胞の両方に対するmiRNA濃度の例。miRNA濃度のカラムは、各ダニ種について最低から最高濃度を表す。
| マイクロRNA | I. 肩甲骨 | I. リシヌス | R. マイクロプラス | H. ロンギコルニス | 参照 |
| miR-8 | ある | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
| miR-71 | P | P | P | ある | 33, 36, 37, 43 |
| miR-279 | P | ある | ある | P | 33, 36, 37, 43 |
| レット-7 | ある | P | P | P | 33, 36, 37, 43 |
表2:異なるダニ種における保存されたmiRNAs。(P)は、miRNAが一般的に発現または存在したことを意味し、(A)は、miRNAが一般的に発現または検出されなかったことを示す。
| サンプルタイプ | スコア数 >1* | スコア数 >4γ | 保存数 | 小説の数 |
| 男性 | 17 | 0 | 48,885 | 23 |
| 女性 | 25 | 0 | 48,885 | 21 |
| ニンフ | 38 | 0 | 48,885 | 38 |
表 3.保存されたユニークなmiRNAは、 R. microplus の女性、男性、ニンフのEVで検出されました。*プロファイリングに使用されるmiRNAスコア。機能実験に用 いたmiRNAスコアγ。
補足表1:唾液腺から分泌されるR.マイクロプラス雄EVsの次世代シーケンシング結果を示す表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:唾液腺から分泌されるR.マイクロプラス女性EVの次世代シーケンシング結果を示す表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表3:唾液腺から分泌されるR.マイクロプラスニンフEVsについての次世代シーケンシング結果を示す表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在のプロトコルは、唾液腺およびEVからmiRNAを抽出するための詳細な方法論を提供する。ただし、重要な考慮事項があり、そのすべてがこのプロトコルの各セクションのメモに詳述されています。カプセルとメッシュネットは、ダニの餌やり中に固定して、ダニの逃げないようにする必要があります。カプセルの調製および配置は、Kogaら40に記載されている。不適切なサンプルが廃棄された場合、ダニ解剖のいくつかの反復を行う必要があります。さらに、ダニ組織からのEV単離技術を利用する場合、いくつかの課題が存在する可能性がある18、20、43。例えば、乾燥を避けるために、解剖中は組織を湿らせておくべきである。これは、解剖を通してPBSを添加することによって行われる。臓器の解剖および培養に使用されるPBSおよび培地の両方は、ダニのマイクロバイオームからの細菌汚染を避けるために抗生物質で維持されるべきである。これらには、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を標的とする抗生物質が含まれるべきであるが、両者はダニ組織60内で見出すことができる。同様に、解剖中は、他の器官からの組織による汚染を減らすために注意を払わなければならない。したがって、解剖はゆっくりと行う必要があり、ユーザーが経験を積むにつれて、より多くのダニを解剖することができます。最後に、EVは病原体感染細胞を含むすべての細胞から分泌されるため、EV単離を実施するダニ研究は、EV間の汚染を避けるためにEVフリーの培地とバッファーを使用する必要があります25,61。
それにもかかわらず、このプロトコルは、ダニ唾液EVを製造するために必要なダニの数を減らすことを可能にする。以前のプロトコルでは、かなり多くのダニの唾液分泌が必要でした。例えば、 ロンギコルニス血液の 唾液EV内で分泌されるmiRNAは、2,000匹の成体ダニの唾液分泌を必要とした43。これは、ダニを後付けする能力を欠いている研究室にとって非常に高価になる可能性があります。同様に、EV単離に使用した Amblyomma maculatum 組織は、単離前に部分的に凍結し、75U/mLのコラゲナーゼ3型で処理したが、これはEV分泌の真正性に影響を与える可能性がある19。さらに、これらの研究は、80〜100対の唾液腺18を必要とした。
比較的、このプロトコルは複数のダニ種に適用することができ、EVを単離し、品質保存された新規miRNAを抽出するためにより少ない数のダニを必要とする(表2)33、36、37、43。miRNA濃度は大きく変化しましたが、次世代シーケンシングには十分でした(表3および補足表1~3)。このプロトコルは、より大きなmiRNA濃度が必要な場合、より大きなサンプルサイズに対応するように調整することができます。また、このプロトコルで使用される材料は、材料の入手可能性に応じて代替可能です。ただし、サンプル量と遠心分離速度は、使用するキットとカラムに関する製造元の指示に従って調整する必要があります。
この方法の欠点は、miRNAおよびEVが抽出および単離のステップを通して容易に分解され得ることである。したがって、プロトコルは迅速かつ効率的に達成されなければなりません。記載されている場合、サンプルは氷上に保管する必要があり、miRNA抽出は滅菌された環境で実施する必要があります。さらに、単離されたEVに対してRNase処理を行い、EV膜に結合した大きなRNAを除去することができる。これにより、miRNA抽出中に大きなRNAがサンプルを汚染するのを防ぐことができます。最後に、EVまたは臓器からの単離後にmiRNAサンプルにRNAse阻害剤を添加することは、分解の重要な予防措置である。このプロトコルは、実施中の実験の目的と並行して変更および適用することができます。
このプロトコルの将来の用途には、病原体がダニ唾液EV内のmiRNAおよび他のゲノム貨物にどのように影響するかを理解するための病原体 - ベクター相互作用の研究が含まれる可能性がある。同様に、このプロトコルは、ダニEVへのmiRNAのパッケージングに関与する特定のタンパク質および細胞プロセス、ならびにこれらのEVおよびmiRNAが創傷治癒および免疫応答に及ぼす特定の効果を定義することができる。殺ダニ剤に対するダニ耐性の増加のために、ユニークな制御方法の絶望的な必要性がある。EVは殺ダニ剤に比べて代替的な制御方法の可能性を秘めている。EVは、治療用途におけるナノトランスポーターとして使用することができる18,23,61。ヒトでは、miRNAを輸送するEVが、がん免疫療法中の腫瘍増殖を抑制するために用いられてきた62,63。同様に、ダニにおいて、EVは、重要なダニの生物学的機能および病原体伝達に影響を及ぼすことが示されている遺伝子改変miRNAを保有することができる36、57、64。将来の方向性は、このプロトコルを使用して複数のダニ種のmiRNAプロファイルを決定し、機能研究の対象となるmiRNAを同定することです。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
テキサス州エジンバーグの牛コレラダニ研究所からの支援に深く感謝しています。マイケル・モーゼス、ジェイソン・ティドウェル、ジェームズ・ヘルムス、セザリオ・アガド、ホーマー・バスケスに感謝します。また、サラ・シャープトン、エリザベス・ローストロ、エイミー・フィリップ、ケルシー・ジョンソン、ケリー・コッカン、アンドリュー・ヒルハウス、シャルルツ・アロチョ・ロザリオ、ステファニー・グスマン・バレンシアのプロジェクト全体の支援に感謝します。テキサスA&M Aggie Women in Entomology(AWE)ライティンググループには、この原稿の執筆中に助けとアドバイスをいただき、感謝します。以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIHによる配布のために疾病管理予防センターによって提供された: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510.雌 のI. scapularisダニも オクラホマ州立大学のティック飼育施設から受け取られた。このプロジェクトは、テキサスA&M大学T3:トランスフォーメーション助成金のためのトライアドと、USDA-ARSからAOCへの協力協定#58-3094-1-003によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm syringe filter | GenClone | 25-240 | |
| 1 µm nylon syringe filter | Tisch Scientific | 283129028 | |
| 1 inch black adhesive | Amazon | B00FQ937NM | Capsule |
| 10 mL needeless syringe | Exelint | 26265 | |
| 3' and 5' Adapters | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| 4 mm vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1.1523 | |
| 70Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Amphotericin | Corning | 30-003-CF | |
| Beads | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bioanalyzer kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | ||
| Chloroform | Macron | UN1888 | |
| Cyverse Discovery Enviornment | https://cyverse.org/discovery-environment | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Double-sideded carpet tape | amazon | 286373 | |
| Falcon Tubes, 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | FBS-02-0050 | |
| fine forceps | Excelta | 5-S-SE | |
| Foamies, 2 mm | Amazon | B004M5QGBQ | Capsule |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceuticals manfactured | 193.33165.3 | |
| Ixodes scaplaris | CDC, Oklahoma State University | ||
| L15C300 medium | In-lab | ||
| lipoprotein-cholesterol concentrate | MPI | 02191476-CF | |
| Microscope slide | VWR | 10118-596 | |
| miRDeep2 | https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2 | ||
| M-MuLV Reverse Transcriptase | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| molecular grade ethanol | Fischer Bioreagents | UN1170 | |
| multi-well 24 well tissue culture treated plate | Corning | 353047 | |
| Nanopaticle Tracking Analyzer machine | Malvern Panalytical | ||
| Nanosep with 300K Omega filter | Pall Corporation | OD3003C33 | |
| NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 | PerkinElmer | ||
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina | 20024906 | |
| Optima XPN 90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Penicillin | Thermofischer Scientific | ICN19453780 | |
| Pippettes | Ependorff | ||
| polycarbonate centrifuge bottle | Beckman Coulter | 355618 | |
| Qiagen miRNeasy kit | Qiagen | 217084 | |
| QIAzol lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Qubit | Thermofisher | Q32880 | |
| Qubit kit | Thermofisher | Q10212 | |
| Rabbits | Charles River | ||
| Reverse Universal Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit |
| Rhipicephalus microplus | Cattle Fever Tick Research Labratoty | ||
| Rifampicin | Fischer Bioreagents | 215544 | |
| RNAlater | Invitrogen | 833280 | |
| RNAse free tubes | VWR | 87003294 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Fischer | 11111729 | |
| RNAse/DNAse free water | Qiagen | 217084 | |
| RNeasy Minelute spin column | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| RT Buffer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RT Forward Primer | Illumina | 20024906 | NEXTFLEX Small RNA-seq kit |
| RTE Buffer | Qiagen | 217084 | Qiagen miRNeasy kit |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Sorvall ST16 | Thermo Fischer | 75004380 | |
| Sterilized Gauze sponges | Covidien | 2187 | |
| Sterilized PBS | Sigma | RNBK0694 | |
| streptomycin | thermofischer Scientific | 15240062 | |
| TapeStation | Aligent | G2991BA | |
| Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive | Amazon | 7.42836E+11 | Capsule |
| Tissue Adhesive | 3M VetBond | ||
| Triple Antibiotics | dechra | 17033-122-75 | |
| Tryptose phosphate broth | BD | BD 260300 |
References
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