Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63618
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av mikroRNA från fästingspottkörtlar och renade extracellulära vesiklar. Detta är ett universellt förfarande som kombinerar vanliga reagenser och förnödenheter. Metoden tillåter också användning av ett litet antal fästingar, vilket resulterar i mikroRNA av hög kvalitet som lätt kan sekvenseras.

Abstract

Fästingar är viktiga ektoparasiter som kan vektorisera flera patogener. Spottkörtlarna hos fästingar är viktiga för utfodring eftersom deras saliv innehåller många effektorer med farmaceutiska egenskaper som kan minska värdens immunsvar och förbättra patogenöverföringen. En grupp av sådana effektorer är mikroRNA (miRNA). miRNA är korta icke-kodande sekvenser som reglerar värdgenuttryck vid tick-host-gränssnittet och inom fästets organ. Dessa små RNA transporteras i fästingsaliv via extracellulära vesiklar (EV), som tjänar inter- och intracellulär kommunikation. Vesiklar som innehåller miRNA har identifierats i saliv av fästingar. Men lite är känt om miRNA: s roller och profiler i fästingspyttblåsor och körtlar. Dessutom kräver studien av vesiklar och miRNA i fästingsaliv tråkiga procedurer för att samla fästingsaliv. Detta protokoll syftar till att utveckla och validera en metod för att isolera miRNA från renade extracellulära vesiklar som produceras av ex vivo-organkulturer . De material och metoder som behövs för att extrahera miRNA från extracellulära vesiklar och tick spottkörtlar beskrivs här.

Introduction

Fästingar är ektoparasiter som vektoriserar många patogener till vilda djur, boskap, människor och deras husdjur 1,2. Fästingmatning resulterar i betydande ekonomisk förlust genom att orsaka skador på hud, minska vikt och mjölkproduktion på grund av svår anemi och överföring av potentiellt dödliga sjukdomsframkallande patogener 1,3,4,5. Nuvarande kontrollmetoder för hantering av fästingpopulationer är inriktade på användningen av akaricider. Ändå har den kontinuerliga uppkomsten av akaricidresistens hos fästingar som parasiterar boskap 5,6, den ökade förekomsten av fästingbett7 och patogenöverföring inom bostadsområden 8,9 lett till ett behov av unika fästingkontrollalternativ.

Fästingens spottkörtlar är viktiga organ som säkerställer en fästings biologiska framgång. De bildas av olika acinustyper (I, II, III och IV) med olika fysiologiska funktioner. Spottkörtlarna är ansvariga för osmoregulation, både av och på värden, genom att återföra vattenöverskott och järninnehåll till värden via salivation 2,10. Typ I acini är också involverade i upptaget av vatten från atmosfären genom utsöndring av hygroskopisk saliv10,11. Saliveffektorproteiner, såsom cement och cystatiner, produceras i sekretoriska celler i typ II och III acini 10,12. Typ I acini påverkar inte fästingmatning, vilket indikerar att blodmjölsintaget inte utlöser morfologiska och fysiologiska förändringar i dessa acini typ13,14. Å andra sidan aktiveras Acini typ II och III under utfodring och presenterar mycket liten aktivitet före fastsättning. Således är utfodring nödvändig för att utlösa utvidgningen av sekretoriska celler inom typ II acini och produktionen av bioaktiva föreningar. Typ III acini reduceras i storlek under utfodring på grund av utsöndringen i sekretoriska granuler12.

Spottkörtlarna är också platsen för patogeninfektion i fästingen och överföringsvägen. Under utfodring utsöndrar fästingar flera föreningar med farmaceutiska effekter som behövs för framgångsrik slutförande av blodmjölet 10,15,16. Dessa föreningar har antiinflammatoriska, immunsuppressiva och vasodilaterande egenskaper 10,15,17. Nya studier har visat att extracellulära vesiklar (EV) som härrör från fästingspottkörtlar har flera av dessa föreningar, vilket inducerar antiinflammatoriska och immunmodulerande effekter 18,19,20. "Extracellulära vesiklar" är ett paraplybegrepp som används för att beskriva vesiklar klassificerade som exosomer och mikrovesiklar baserat på deras storlek och biogenes. Sammantaget är elbilar lipidblbs med dubbelskiktsmembran som är ~ 40 nm-1 μm i storlek21; i allmänhet beskrivs exosomer som 40-150 nm stora, medan mikrovesiklar är mellan 150 nm-1 μm i storlek 21,22,23. Storleken är dock inte en indikation på elbilens biogenesväg22.

Biogenesen av exosomer börjar med sekventiell invagination av plasmamembranet. Denna invagination leder till bildandet av multivesikulära kroppar och resulterar slutligen i deformation av det vesikulära membranet genom verkan av ESCRT-komplex eller sfingomyelinaser (sMases)24,25. Exosomerna kan antingen lyseras i lysosomerna för att upprätthålla cellulär homeostas eller avslutas via vesikulär fusion till plasmamembranet för att leverera cellulära beståndsdelar till mottagarcellerna21,24. Å andra sidan bildas mikrovesiklar genom verkan av flopasses och flipasses, vilket förändrar konformationen av lipider i plasmamembranet26. Elbilar är viktiga för cell-till-cell-kommunikation och fungerar som ett transportsystem för intracellulär last, såsom lipider, proteiner, nukleinsyror och mikroRNA (miRNA)21,27,28. När de väl har transporterats levererar dessa vesiklar sin last till cytoplasman hos mottagarcellerna och genererar fenotypiska förändringar i mottagarcellen22,29. På grund av vikten av extracellulära vesiklar vid fästingmatning och manipulation av värdens immun- och sårläkningssvar18,20, presenterar lasten inom extracellulära vesiklar potentiella mål för utveckling av anti-tick-terapier och en unik mekanism för att störa fästingmatning. Detta inkluderar miRNA inom fästingspottkörtlar och spottkörtel-härledda extracellulära vesiklar.

miRNA är korta icke-kodande sekvenser, ~ 18-22 nukleotid (nt) i längd, som kan post-transkriptionellt reglera, bryta ner eller tysta mRNA-sekvenser30,31. Under transkription klyvs pri-miRNA av Dicer (RNA-polymeras III) för att bilda en distinkt hårnålsliknande struktur och blir ett pre-miRNA. Pre-miRNA skärs återigen av Drosha (RNA-polymeras III) för att bilda en mogen miRNA-duplex. Den mogna sekvensen integreras i det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC) som kompletterar mRNA-sekvensen, vilket orsakar translationsförtryck eller mRNA-nedbrytning 28,30,32. Under värdmatning kan miRNA i fästingsaliv modulera värdgenuttryck för att undertrycka immunsvar och förbättra patogenöverföringen 33,34,35,36,37. Även om det finns omfattande studier om elbilar och miRNA, är deras roller under utfodring vid fästing-värdgränssnittet fortfarande dåligt förstådda. Att optimera protokoll som enkelt kan resultera i isolering och rening av högkvalitativa miRNA är avgörande för att främja vår kunskap om dessa ämnen.

Flera alternativ kan användas för att isolera elbilar, såsom ultracentrifugering, exosomutfällning, polymerutfällning, immunoaffinitetskromatografi och storleksbaserade uteslutningstekniker38. Dessa tekniker kan emellertid inte skilja mellan exosomer eller mikrovesiklar. Således, som tidigare nämnts, används EV som ett paraplybegrepp när man isolerar elbilar från olika prover. Vesiklarna isolerade i experimenten som beskrivs här representerar en blandning av vesiklar härledda från olika biogenesvägar. Ytterligare rening av en specifik population av extracellulära vesiklar kan uppnås genom immunoprecipitation med användning av pärlor belagda med antikroppar mot markörer (dvs exosomala markörer, tumörmarkörer) som är unika för vesikelpopulationen av intresse39,40. miRNA kan också extraheras via olika kommersiellt tillgängliga isoleringssatser 7,41,42.

Målet med detta projekt var att utveckla ett protokoll som kombinerar vanligt förekommande metoder för att isolera elbilar och extrahera miRNA från både elbilar och spottkörtlar. Eftersom utsöndringen av bioaktiva föreningar aktiveras genom att mata12, bör fästingar tillåtas att mata för att identifiera miRNA som kan vara viktiga för att manipulera värdens immun- och sårläkningssvar. Det nuvarande protokollet kräver ett litet antal fästingar (20 fästingar) för att isolera elbilar och deras respektive miRNA, jämfört med andra tidigare beskrivna studier som krävde 2000 fästingar43. Vidare undviker det kontaminering av salivutsöndringar med pilokarpin44, vilket kan påverka experiment som studerar effekten av elbilar och deras miRNA på värdceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt djuranvändningsprotokoll (AUP # 2020-0026) godkänt av institutionens djurvårds- och användningskommitté (AICUC) vid Texas A &M University. Fästingarterna, Ixodes scapularis och Rhipicephalus (Boophilus) microplus, och Nya Zeelands vita hankaniner, 42-72 dagar gamla, användes för den aktuella studien. I. scapularis mottogs från Center for Disease Control (CDC) och Oklahoma State University, certifierad som patogenfri. R. microplus föddes upp vid Cattle Fever Tick Research Laboratory i Edinburg, Tx. Kaninerna erhölls från kommersiella källor (se materialtabell). Detta protokoll kan universellt isolera extracellulära vesiklar och miRNA från olika fästingarter, livsstadier och vävnader.

1. Uppfödning av hondjur I. scapularis och kapselpreparat

  1. Förbered en etylen-vinylacetatskumkapsel enligt procedurerna för hårda fästingar-utfodringskaniner45. Placera en kapsel på varje axelblad på kaninen för totalt två kapslar per angrepp.
    OBS: Kortfattat består dessa kapslar av två rutor av etylen-vinylacetatskum med ett inre tomt utrymme. En kvadrat limmas på djurets baksida (i detta fall kaniner) med ett vävnadslim (se materialtabell). Fint nät limmas på den andra rutan för att undvika att fästingar flyr. De två rutorna stängs med självhäftande kroktejp.
  2. Låt kapslarna stelna i 24 timmar innan du fäster kapseln på kaninerna. Förvara skumkapslarna i rumstemperatur.
    OBS: Kapslarna kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur.
  3. Fäst kapseln på rakade kaniner och låt stå i 24 timmar före fästingangrepp.

2. Beredning av vesikelfria medier

  1. För att förbereda vesikelfritt medium13, kombinera 0,5 ml fetalt bovint serum, 0,5 ml tryptosfosfatbuljong, 0,1 ml 10% lipoprotein-kolesterolkoncentrat, 0,5 ml 5% natriumbikarbonat (NaHCO3), 0,25 ml 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra (HEPES) och 8,125 ml L15C300-medium (se materialtabell). Justera volymen på mediet efter behov. Placera mediet i en 26,3 ml polykarbonatcentrifugflaska.
  2. Balansera flaskorna med en viktskillnad på maximalt 0,01 g för att säkerställa att ultracentrifugen fungerar korrekt.
  3. Ultracentrifugera mediet i 18 timmar vid 100 000 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten via pipett och se noga till att inte störa någon pellet som bildas.
  4. Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör och ultracentrifugera en andra gång i 18 timmar vid 100 000 x g vid 4 °C, med rätt balans.
  5. Isolera den återstående supernatanten och passera genom ett 0,22 μm sprutfilter för att avlägsna föroreningar. Pipettera supernatanten i ett 50 ml centrifugrör.
  6. Förvara supernatanten i en frys på -20 °C tills det behövs eller upp till 3 år.

3. Kanin angrepp

  1. Skär av toppen av en 10 ml spruta och ladda vuxna I. scapularis honor med en vanlig pensel.
  2. Täck sprutöppningen med steril gasbindning (figur 1).
  3. Placera kaninen på en bordsskiva eller en arbetsyta horisontellt; Linda kaninen tätt med en handduk och täck båda ögonen och lämna den beredda kapseln (steg 1.1) utsatt för att infektera kaninen med fästingar.
  4. Öppna kapseln och sätt in fästingar genom att trycka på spruthandtaget. Sätt in fästingarna nära kaninhuden. Stäng snabbt kapslar för att förhindra att fästingarna flyr.
  5. Enligt den experimentella designen, låt de kvinnliga fästingarna mata så länge som behövs. Låt inte manliga Ixodes scapularis ligga kvar i kapseln i mer än 24 timmar för att undvika uttorkning.
    OBS: Antalet fästingar som ska angripas i djuren är upp till utredarens bedömning. Detta protokoll använde ~ 100 fästingar per angrepp för att redogöra för dödlighet och tillräckligt med material för replikat. De preliminära experimenten fastställde att minst 20 fästingar/replikat behövdes för att erhålla tillräckligt med material för sekvensering av miRNA.

4. Avlägsnande av de matade kvinnorna

  1. Placera de angripna kaninerna under 2% isofluran i syre med hjälp av en gasdiffusor. Ställ in syrehastigheten mellan 700-1000 l/min.
    OBS: Andra anestetika kan användas för att undvika nöd eller smärta.
  2. Ta bort de matade kvinnorna genom att gripa fästingarna med deras capitulum, med fina pincett, så nära huden som möjligt. Se till att mundelarna är helt borttagna för att undvika bakteriell infektion.
  3. Placera fästingarna i ett 15 ml centrifugrör.
  4. Rengör bettplatsen med 70% etanol och tillsätt en liten mängd trippelantibiotikum (fingertoppsvärde, se materialtabell) för att förhindra infektion på fästingbettplatsen.
  5. Bär fästingarna till laboratoriet för dissektioner (steg 5). Utför dessa dissektioner inom 24-48 timmar efter att fästingarna tagits bort för att undvika nedbrytning av spottkörtlarna15,43.

5. Spottkörteldissektion och extracellulär vesikelsekretion

  1. Tillsätt 500 μL vesikelfritt medium (steg 2) med 5 μL 100x penicillin, 5 μL 100x streptomycin, 5 μL 10 mg/ml rifampicin och 5 μL 100x amfotericin till varje brunn (se materialtabell). Tillsätt 1x PBS med rifampicin till alla brunnar som inte innehåller vesikelfritt medium för att förhindra bakterietillväxt.
  2. Placera fästingarna på en klar mikroskopisk glasskiva med dubbelsidig matttejp under ett dissekerande mikroskop. För att förhindra uttorkning av organ, tillsätt 10 μL 1x PBS till varje fästing före dissektion.
  3. Använd 4 mm vannas sax (se Materialtabell) och gör ett litet snitt på ~1 mm på sidan av varje hona. Ta helt bort fästets dorsala sida (figur 2) och ta bort båda spottkörtlarna.
  4. Sätt 20-40 fästingspottkörtlar i 500 μL vesikelfritt medium tillsatt till en enda brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta (figur 3).
  5. Inkubera spottkörtelproverna vid 32 °C i 24 timmar för att möjliggöra utsöndring av elbilarna.

6. Isolering av extracellulära vesiklar

  1. Efter 24 timmars inkubation pipetterar du allt medium som innehåller spottkörtlarna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Centrifugera provet vid 300 x g vid 4 °C i 10 minuter för att isolera spottkörtlarna. Två faser kommer att separeras i detta steg: (1) supernatanten som innehåller elbilarna och (2) spottkörtlarna (pellets).
  3. För att fortsätta isoleringen av elbilarna, pipettera supernatanten i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Återsuspendera pelleten som innehåller spottkörtlarna (steg 6.2) i 500 μL RNAlater (se materialtabell) och förvara vid -80 °C tills den används eller på obestämd tid.
    OBS: Dessa spottkörtlar kommer att användas för miRNA-isolering i steg 8.
  4. Centrifugera supernatanten vid 2000 x g vid 4 °C i 10 minuter för att avlägsna cellrester. Pipettera supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Kassera pelleten.
  5. Centrifugera supernatanten vid 10 000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna apoptotiska kroppar och större elbilar. Kasta pelleten och pipettera supernatanten i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  6. Fäst en 10 ml spruta på ett 1 μm nylonsprutfilter. Placera sprutan och filtret ovanför ett ultracentrifugrör (figur 4A). Tillsätt sedan provet (figur 4B) och fyll sprutan med 10 ml 1x PBS (figur 4C) och balansera röret därefter (figur 4D).
  7. Placera rören i en 70Ti-rotor (se materialtabell) och snurra vid 100 000 x g i 18 timmar vid 4 °C.
  8. Efter 18 timmars ultracentrifugering, observera en pellet i rörets nedre ände (figur 5). Pelleten är de koncentrerade extracellulära vesiklarna.
  9. Ta bort 90%-100% av supernatanten utan att återsuspera EV-pelleten. Resuspend pelleten med 1x PBS. Om inte alla supernatanten kunde tas bort, använd den återstående supernatanten för att återsuspendera pelleten.
  10. Pipettera 500 μL av EV-pelleten/supernatanten till ett 300 K centrifugalfilter (se materialtabell).
    OBS: Detta tar bort alla icke-vesikelassocierade proteiner, miRNA och andra molekyler, medan vesiklarna inte kommer att passera genom filtret.
  11. Centrifugera vid 8 000 x g i 10 min vid omgivningstemperatur. Upprepa steg 6.10 tills alla EV-pellets/supernatant har passerat genom filtret.
  12. Tillsätt 400 μL steriliserad 1x PBS till kolonnen och blanda noggrant via pipett för att ta bort elbilar som är fästa vid membranet. Placera provet i ett 1,5 ml DNase-/RNase-fritt rör. Proverna kan förvaras vid -80 °C på obestämd tid eller tills de används. Undvik överdriven upptining av provet för att förhindra nedbrytning av provet.
    OBS: Placera rören på is när de tas ut ur ultracentrifugen för att förhindra EV-nedbrytning. Det slutliga provet kommer att vara EV-pelleten i 400 μL 1x PBS. 25 μL av detta prov kommer att användas för nanopartikelspårningsanalys (NTA, steg 7) och 375 μL för miRNA-isolering (steg 8).

7. Nanopartikel spårningsanalys (NTA)

  1. Ta 25 μl av det slutliga provet (steg 6.12) och tillsätt 375 μl 1x PBS.
  2. Ladda det utspädda provet i en 1 ml nållös spruta och skruva fast den optiska linsen på NTA.
  3. Justera inställningarna i enlighet därmed och spela in videor baserat på inställningsinställningar.
    OBS: I den aktuella studien gjordes tre avläsningar på 60 s vardera. Varje NTA-avläsning representerar en teknisk replikat. Olika prover från fästingmatning under samma tid representerar enskilda biologiska replikat. Kameran ställdes in på nivå 7 och detekteringströskeln ställdes in på nivå 5.
  4. Uppskatta de slutliga EV-siffrorna med följande formel:
    ((startkoncentration av elbilar (utspädningsfaktor)) * (total volym kvar i provröret)/1000) = totalt antal elbilar i provet
    OBS: Volymen måste divideras med 1000 eftersom NTA läser proverna som koncentration / ml.

8. miRNA-extraktion från spottkörtlar och extracellulära vesiklar

  1. Tillsätt 100 μl av lysreagenset (se materialtabell) till det återstående provet från steg 6.12 och homogenisera med steriliserade mortelstötar (figur 6).
  2. Tillsätt de återstående 600 μl av lysreagenset och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
  3. Tillsätt 140 μL kloroform, skaka kraftigt i 15 s och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
  4. Snurra vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
  5. Pipettera den tydliga toppfasen, undvik interfas, till ett nytt 1,5 ml rör. Detta kommer att resultera i ~ 525 μL av förväntad provvolym. Tillsätt sedan en 1: 1 volym 100% etanol av molekylkvalitet.
  6. Tillsätt 700 μL av provet i en RNA-isoleringsspinnkolonn (se materialtabell).
  7. Snurra vid 8 000 x g i 30 s vid omgivningstemperatur, kassera genomströmningen.
  8. Tvätta provet med 700 μl RTE-buffert (se materialtabell), snurra vid 8 000 x g i 30 s, kassera genomströmningen.
  9. Tvätta provet med 500 μl RPE-buffert (se materialtabell), snurra vid 8 000 x g i 30 s, kassera genomströmningen.
  10. Tillsätt 500 μL etanol av 80% molekylär kvalitet och snurra vid 8 000 x g i 2 min, kassera genomströmningen.
  11. Snurra kolonnen med maximal hastighet i 5 minuter för att torka membranet. Kassera uppsamlingsröret och placera kolonnen på ett nytt 1,5 ml mikrofugerör.
  12. Tillsätt 14 μL RNase-/DNase-fritt vatten till membranet och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
  13. Centrifugera vid 21 000 x g i 1 min vid rumstemperatur.
  14. Tillsätt 1 μl RNas-hämmare (se materialtabell) till de eluerade miRNA och blanda väl via pipett.
    OBS: Innan miRNA-extraktion från spottkörtlar, ta bort eventuell RNAlater genom att tillsätta 1 ml 1x PBS (1: 1 volym) och snurra ner spottkörtlarna med maximal hastighet i 15 minuter vid 4 ° C. Detta måste upprepas tre gånger eller tills spottkörtlarna har sjunkit tillräckligt för att ta bort supernatanten. Vid denna tidpunkt representerar provet en blandning av små RNA på ~ 20-150 bp i storlek (kompletterande figur 1).

9. Mätning av miRNA-koncentration

  1. Mät koncentrationen av litet RNA via ett kommersiellt tillgängligt RNA-analyskit41 (se materialtabell).
  2. Blanda i varje rör 199 μl utspädningsbuffert (komponent A och B som anges i satsen per prov), 1 μl fluorescerande färgämne som är specifikt för detektion av miRNA (mätvåglängd 260 nm) (per prov) och 2 μl litet RNA (steg 8) för varje prov, enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Innan du läser provrören, läs förspädd miRNA-standard 1 och standard 2 (finns i satsen) för att skapa en standardkurva före provmätning.
    OBS: Standarderna används som ett jämförelseverktyg för att bestämma den uppmätta miRNA-koncentrationen i proverna.
  4. Placera varje standard och provrör i den särskilda fluorometern (se materialtabell) för att mäta koncentrationen som ng/μL.

10. Bestämning av miRNA-kvaliteten

  1. Bestäm kvaliteten på miRNA och andra små RNA via gelelektrofores med hjälp av en bioanalysator46, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
  2. Innan provavläsningen normaliseras proverna så att de har samma koncentration.
  3. Läs proverna genom ett litet RNA-chip 41,46, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
    OBS: För att bestämma miRNA-kvaliteten är de gelliknande bilderna (banden) och elektroferogrammen (toppar) indikatorer på provkvaliteten. Ju mörkare bandet i gelén är, desto bättre är miRNA-kvaliteten. Ju lättare bandet är (eller om inget band finns), desto sämre kvalitet eller bevisar provnedbrytning46,47.

11. mikroRNA-anrikning

  1. Berika miRNA med hjälp av ett litet RNA-sekvenseringssats, enligt tillverkarens instruktioner från det lilla RNA-provberedningssatsen (se materialtabell).
  2. Ligate varje prov med en 3 'adenylerad adapter och ta bort överskottsadaptern via pärlrensning. Lägg sedan till en 5 'adapter och ta bort överskottsadaptern med en pärlrensning48.
    OBS: Både adaptrar och pärlor för rengöring tillhandahölls i det lilla RNA-sekvenseringssatsen från avsnitt 11.1 (se materialtabell).
  3. För att syntetisera den första strängen, förbered en huvudblandning av proverna som är ligerade med båda adaptrarna, RT-bufferten och M-MuLV Reverse transcriptase som tillhandahålls i satsen (se materialtabell). Inkubera sedan blandningen i 30 min vid 42 °C och 10 min vid 90 °C. Följ upp med en provrensning enligt instruktionerna.
  4. Förstärk den första strängen med rt-primern framåt och omvänd universalprimer som medföljer i satsen (se materialtabell) via en konventionell polymeraskedjereaktion (PCR) i 2 minuter vid 95 °C, sedan i 12-25 cykler i 20 s vid 95 °C, 30 s vid 60 °C och 15 s vid 72 °C. Slutligen 2 min vid 72 °C.
    PCR-produktstorleken förväntas vara ~ 150 bp (figur 7).
  5. Mät pcr-produktens kvalitet via bandstation enligt tillverkarens anvisningar (se materialtabell).
  6. Sekvensera proverna med hjälp av nästa generations sekvenseringssystem (75 cykler) enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
    OBS: För miRNA-anrikning måste provkvantitet och kvalitet kontrolleras (steg 9-10) innan biblioteket förbereds.

12. Bioinformatisk analys

  1. Identifiera de bevarade och unika miRNA med hjälp av ett integrerat applikationsverktyg för miRNA-identifiering.
    OBS: I den aktuella studien utfördes miRNA-identifiering via miRDeep249,50. miRDeep2 är en gratis onlinekatalog över alla identifierade bevarade och nya miRNA som finns i olika arter 49,50 (se materialtabell).
  2. Justera läsningarna till motsvarande genom med hjälp av mapparen som är integrerad med programvaran.
  3. Ange följande parametrar i mappmodulen.
    1. Trimma adaptersekvenserna som lagts till från steg 11.2 och ta bort sekvenser som är mindre än 18 nukleotider långa. Ta bort de redundanta lässekvenserna.
    2. Konvertera filerna med parametern parse till FASTA-format, endast om filen inte är i FASTA-format49.
    3. Justera de filtrerade och trimmade sekvenserna mot motsvarande genom. Om det inte finns något genom för arten av intresse, anpassa dig till den närmaste homologa arten.
    4. Visa utdatafilerna som "reads.fa" och "reads_vs_genome.arf". "Read.fa" innehåller endast de icke-redundanta läsningarna, och "reads_vs_genome.arf" kommer att innehålla de mappade läsningarna som är anpassade till genomet.
  4. Använd båda utdatafilerna från steg 12.2 och utför miRNA-uttrycksprofilering med hjälp av kvantifieraren integrerad med programvaran.
    1. Ladda ner de intressanta arterna miRNA-prekursorsekvenser och de mogna miRNA-sekvenserna från miRBase 51,52,53,54,55,56. Om det inte finns några prekursorer eller mogna sekvenser för arten av intresse, ladda ner "hairpin.fa.gz" och "mature.fa.gz" som innehåller alla prekursorer och mogna sekvenser för alla organismer som finns tillgängliga på miRBase.
    2. Packa upp filerna "hairpin.fa.gz" och "mature.fa.gz".
    3. Mata in filerna "reads.fa" och "read_vs_genome.arf" från avsnitt 12.3.4 och de okomprimerade filerna från 12.4.2.
    4. Läs utdatafilerna som "outputname.csv", "outputname.html" och "outputname.pdf". Utdatafilens namn kan ställas in enligt utredaren.
      Filen "outputname.csv" innehåller uttrycksprofilerna. Specifikt kommer uttrycksprofilen att ha miRNA-ID, summan av läsningar för alla prover som mappats till miRNA, antalet läsningar mappade till ett specifikt miRNA för varje prov och det föregångs-ID som motsvarar de mogna miRNA: erna. "Outputname.html" från steg 12.4.4 kommer att innehålla länkarna till University of Santa Cruz Genome Browser (USCS), National Center for Biotechnology Information (NCBI) och miRBase. USCS och NCBI kommer att innehålla frågesekvenserna för de aktuella prekursorerna mot den icke-redundanta nukleotiddatabasen, och miRBase kommer att ha information om den aktuella miRNA-prekursorn. "Outputname.pdf" kommer att ha RNA-sekundärstrukturen för miRNA som uttrycks och inriktningen av prekursorsekvensen.
  5. Om du vill identifiera unika och bevarade miRNA använder du miRDeep2.
    1. Använd utdatafilerna från steg 12.3.4 och steg 12.4.2 som indatafiler.
      Utdatafilerna som läses som "outputname.html" innehåller förutsägelserna för de unika och bevarade miRNA i exemplet.
    2. Använd poäng >1 för miRNA-profilering och poäng >4 för vidare experimentell analys, såsom miRNA-hämning och härmning av endogena miRNA 34,36,57.
    3. Välj och identifiera de unika miRNA från miRbase baserat på följande: miRDeep2-poäng (steg 12.5.3), uppskattning av sann sannolikhet (>90%), signifikant randfold p-värde (<0.05)49,50,56.
      OBS: Bioinformatisk analys gjordes via miRDeep2 i Cyverse Discovery Environment58,59, en gratis onlineplattform för bioinformatisk analys. De bevarade och unika miRNA som identifierades genom miRDeep2 jämfördes med alla arter från miRbase. Framtida miRDeep2-identifiering kan jämföras med motsvarande genom för de arter som är av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det nuvarande protokollet ger en detaljerad metod för att extrahera miRNA från spottkörtlar och elbilar. Enligt resultaten är detta protokoll effektivt för isolering av miRNA från vuxna av två olika fästingarter, I. scapularis och R. microplus, och kan potentiellt också användas i andra fästingarter. Elbilens koncentration (partiklar/ml) mättes via NTA. För R. microplus innehöll varje kön och livsstadium tre biologiska replikat uppmätta i tre tekniska replikat. Proverna separerades efter kön och livsstadium (figur 8) för att visa variationen inom varje prov. Därefter kombinerades proverna för att visa variationen och de statistiska skillnaderna med hjälp av en tvåvägs ANOVA och Tukeys flera jämförelsetester20 (p-värde = < 0,05) (figur 9). Varje prov bestod av ~ 40 spottkörtlar dissekerade från 20 honor, män och nymfer. Efter isolering och kvantifiering av elbilarna användes proverna för liten RNA-rening.

Koncentrationen av det lilla RNA i varje prov mättes via Qubit (tabell 1), och kvaliteten mättes via en bioanalysator med standardgelelektrofores46,47. Halterna är i nanogram (tabell 1) i en volym på 14 μl för båda fästingarterna. Den genomsnittliga summan av små RNA-koncentrationer från I. scapularis organ varierade från 45,92-6,356 ng. RNA-koncentrationen av I. scapularis vesiklar varierade från 72,24-2 128 ng. För R. microplus varierade organkoncentrationen från 259-2 142 ng och blåsorna varierade från 59,22-1 848 ng. Proverna normaliserades till samma koncentration och deras kvalitet mättes sedan via en bioanalysator (figur 10). En referensstege användes i gelén som en markör för kvalitetsbedömning. Bandets integritet, intensitet och toppar var representanter för potentiell nedbrytning eller total koncentration i varje prov. Band motsvarande 5 s och 5,8 s ribosomala RNA fanns endast i spottkörtelorganproverna (figur 10, körfält A-D) och saknades i vesikeln från spottkörtelproverna (figur 10, körfält E,F), vilket visar skillnaderna i små RNA-profiler mellan organ och extracellulära vesiklar. Provnedbrytning härleddes av frånvaron av band i gelén; detta innebar att det fanns betydande provnedbrytning. Det rekommenderas att alla prover med betydande nedbrytning kasseras.

För att demonstrera närvaron av miRNA-prover i preparaten framställdes små RNA cDNA-bibliotek från RNA-prover som har lagrats i 3-4 månader efter liten RNA-isolering. Märkligt nog hittades högre provnedbrytning i dessa prover. Körfälten A-D och G visade tecken på nedbrytning; tvärtom visade E, F och H-K minimal nedbrytning och tillräcklig koncentration för miRNA cDNA-biblioteksförberedelser (kompletterande figur 1). Endast ett prov försämrades när proverna användes omedelbart efter rening (figur 10), vilket tyder på att miRNA-prover var mer benägna att brytas ned när de renades från elbilar. Således valdes proverna E, F, H och I för anrikningsanalys. Asteriskerna visar bandstorlekarna på ~150 bp, vilket var de förväntade storlekarna efter förberedelse av cDNA-biblioteket (figur 7). De nedre svaga banden indikerar primerdimmern.

Under EV-isolering kan centrifugeringshastigheten och tiden påverka den slutliga EV-koncentrationen. Vid pipettering av EV-pelleten i 300 k-kolumnerna, som nämnts tidigare i steg 6.10, är en låg volym och hastighet avgörande för att förhindra att elbilar passerar genom membranet. Tidigare studier visade att 700 μl vid 12 000 x g i 20 minuter med användning av en annan centrifugalkoncentrator var tillräckligt för att korrekt separera elbilar från de lösliga proteinerna20; låga EV-koncentrationer visades dock i NTA med ett annat filter. Därför är det viktigt att optimera filtren och andra tillgängliga material. När man först använde 300 k-kolumnerna testades olika hastighetsintervall för att bestämma vilken som gav den högsta EV-koncentrationen. Antalet vesiklar som förlorades under centrifugering mättes med NTA-analys; Man drog slutsatsen att lägre hastigheter resulterade i högre vesikelkoncentration i genomströmningen (visas inte). Man drog slutsatsen att 500 μl vid 6 000-8 000 x g var tillfredsställande för att isolera elbilarna. När detta väl var bestämt användes detta protokoll för att isolera vesiklar från I. scapularis och R. microplus. Koncentrationen av vesiklarna isolerade från varje fästingart mättes via NTA (figur 8). EV-koncentrationerna varierade mellan 7,07 x 107 och 7,94 x 109 partiklar/ml. EV-kvantiteten korrelerade med miRNA-koncentrationerna, där den större mängden EV resulterade i en högre koncentration av miRNA extraherat.

Figure 1
Figur 1: 1 ml nållösa sprutor laddade med kvinnlig vuxen I. scapularis och täckta med steriliserad gasväv.

Figure 2
Figur 2: Ryggsidan av en uppslukad hona avlägsnades med 4 mm vannas sax. Honan var nedsänkt i 1x PBS för att förhindra uttorkning av organ. De gula pilarna pekar på de exponerade spottkörtlarna. Figuren togs med 50x förstoring med en högupplöst objektivlins. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: En cellodlingsplatta efter en 24 timmars inkubation vid 32 °C. Den första raden av brunnar innehåller vesikelfria medier och dissekerade spottkörtlar. Resten av brunnarna innehåller 1x PBS med Rifampicin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: En provberedningsprocess för en ultracentrifugcykel. (A) En 10 ml nållös spruta toppad med ett 1 μm sprutfilter. (B) Supernatanten efter tre centrifugeringsomgångar pipetteras in i sprutan. (C) Resten av sprutan fylls till 10 ml med 1x steriliserad PBS. (D) Sprutan är täckt och supernatanten med 1x PBS filtreras in i ultracentrifugröret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Efter 18 timmars ultracentrifugering bildas en pellet av extracellulära vesiklar längst ner på ultracentrifugröret.

Figure 6
Figur 6: En steriliserad stöt används för att homogenisera spottkörtelorgan och de extracellulära vesiklarna.

Figure 7
Figur 7: En gelelektrofores mätt via bandstation som visar de miRNA-förberedda biblioteken efter en anrikningsanalys. Proverna från kvinnliga R. microplus spottkörtelorgan och elbilar baserades på minimal nedbrytning och tillräcklig miRNA-koncentration för cDNA-bibliotekssyntes. Stegen (L) visar referenspunkterna i nukleotider och de övre och nedre markörerna. Asteriskerna anger banden av storlek produkt ~ 150 bp, vilket betyder de små RNA cDNA-biblioteken. De nedre banden visar primer dimer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: En representativ siffra för variationen mellan de biologiska replikaten (A) honor, (B) hanar och (C) nymfer. X-axeln visar EV-storleken (nm) och y-axeln visar EV-koncentrationen (partiklar/ml). Ett tvåvägs ANOVA och Tukeys jämförelsetest visade statistiska skillnader (P-värde = < 0,05). Felstaplarna representerar standardfelet för att ta hänsyn till variationen. Varje prov innehöll 20 fästingar med tre biologiska replikat. Proverna registrerades i 60 s, tre gånger vardera. Kameran ställdes in på nivå 7 och detekteringströskeln ställdes in på nivå 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: En representativ siffra för variationen för alla kombinerade biologiska replikat för nymfer (röd), honor (blå) och hanar (svart). X-axeln visar EV-storleken (nm) och y-axeln visar EV-koncentrationen (partiklar/ml). Ett tvåvägs ANOVA och Tukeys jämförelsetest visade statistiska skillnader (P-värde = < 0,05). Felstaplarna representerar standardfelet för att ta hänsyn till variationen. Varje prov innehöll 20 fästingar med tre biologiska replikat. Asteriskerna symboliserar en signifikant skillnad på p < 0,05. Varje inspelning gjordes i 60 s, tre gånger vardera. Kameran ställdes in på nivå 7 och detekteringströskeln ställdes in på nivå 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: En representativ gel via bioanalysatorn. Gelelektroforesen utfördes med hjälp av en basstege som referens. En mogen miRNA-sekvens är ~ 18-22 nt lång, där svaga band visas i det angivna storleksintervallet. Andra små RNA, såsom små nukleära RNA, överföringsbudar-RNA och reglerande RNA, finns också i proverna. Storleken på de små RNA varierade från ~ 20-150 nt. Proverna varierar från fästingarter, vävnader och kön. För bana G visar ett exempel på provnedbrytning inga band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: En gelelektrofores mättes via bioanalysatorn och visade de extraherade miRNA: s kvalitet från R. microplus kvinnliga spottkörtelorgan och elbilar. Stegen (L) visar referensstorlekarna i nukleotider, där mogna miRNA mäter ~ 18-22 nt i längd. Banorna A-D och G visar nedbrytning, och körfälten E, F och H-K visar minimal nedbrytning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Art Genus Orgel/ Vesikel EV-koncentration miRNA-koncentration (ng)
R. mikroplus Kvinnlig Orgel Ej tillämpligt 259
R. mikroplus Kvinnlig Orgel Ej tillämpligt 2,142
R. mikroplus Kvinnlig Vesikler 1,64 E+08 59.22
R. mikroplus Kvinnlig Vesikler 1.64 E+09 1,848
I. scapularis Kvinnlig Orgel Ej tillämpligt 45.92
I. scapularis Kvinnlig Orgel Ej tillämpligt 6,356
I. scapularis Kvinnlig Vesikler 1.73E+08 65.66
I. scapularis Kvinnlig Vesikler 3.14 E+09 2,128

Tabell 1: Ett exempel på miRNA-koncentrationerna för både spottkörtlar och extracellulära vesiklar. Kolumnen med miRNA-koncentrationer representerar de lägsta till högsta koncentrationerna för varje fästingart.

mikroRNA I. scapularis I. ricinus R. mikroplus H. longicornis Referenser
miR-8 A P P P 33, 36, 37, 43
miR-71 P P P A 33, 36, 37, 43
miR-279 P A A P 33, 36, 37, 43
låt-7 A P P P 33, 36, 37, 43

Tabell 2: De konserverade miRNA i olika fästingarter. (P) indikerar att miRNA vanligtvis uttrycktes eller var närvarande, och (A) betyder att miRNA inte vanligtvis uttrycktes eller detekterades.

Typ av prov Antal poäng >1* Antal poäng >4γ Antal bevarade Antal romaner
Manlig 17 0 48,885 23
Kvinnlig 25 0 48,885 21
Nymfer 38 0 48,885 38

Tabell 3. De bevarade och unika miRNA upptäcktes i elbilarna för R. microplus-kvinnor , män och nymfer. *miRNA-poäng som används för profilering. γmiRNA-poäng som används för funktionella experiment.

Tilläggstabell 1: En tabell som visar nästa generations sekvenseringsresultatför R. microplus manliga elbilar som utsöndras från spottkörtlar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 2: En tabell som visar nästa generations sekvenseringsresultatför R. microplus kvinnliga elbilar som utsöndras från spottkörtlar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 3: En tabell som visar nästa generations sekvenseringsresultatför R. microplus nymf-elbilar som utsöndras från spottkörtlar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nuvarande protokollet ger en detaljerad metod för att extrahera miRNA från spottkörtlar och elbilar. Det finns dock viktiga överväganden, som alla beskrivs i anteckningarna för varje avsnitt i detta protokoll. Kapseln och nätnätet måste säkras under fästingmatning för att förhindra att fästingar släpper ut. Kapselberedningen och placeringen beskrivs i Koga et al.40. Flera replikat av fästingdissektionerna måste göras om ett olämpligt prov kasseras. Dessutom kan flera utmaningar vara närvarande när man använder EV-isoleringstekniker från fästingvävnad 18,20,43. Till exempel bör vävnader hållas fuktiga under dissektion för att undvika uttorkning. Detta görs genom att lägga till PBS under hela dissektionen. Både PBS och media som används för dissektion och odling av organen bör bibehållas med antibiotika för att undvika bakteriell kontaminering från fästingmikrobiomet. Dessa bör inkludera antibiotika som riktar sig mot gramnegativa och grampositiva bakterier eftersom båda finns i fästingvävnader60. På samma sätt måste man vara försiktig under dissektion för att minska kontaminering med vävnader från andra organ. Således måste dissektioner göras långsamt, och när användaren får erfarenhet kan fler fästingar dissekeras. Slutligen, eftersom elbilar utsöndras från alla celler, inklusive patogeninfekterade celler, måste fästingstudier som utför EV-isolering använda EV-fria medier och buffertar för att undvika cross-EV-kontaminering25,61.

Ändå möjliggör detta protokoll en minskning av antalet fästingar som behövs för att producera fästingspavgasivbilar. Tidigare protokoll krävde salivation av ett betydligt större antal fästingar. Till exempel behövde miRNA som utsöndrades i saliv-ELbilar i Haemaphysalis longicornis salivation av 2,000 vuxna fästingar43. Detta kan vara extremt dyrt för laboratorier som saknar kapacitet att föda upp fästingar. På samma sätt frystes Amblyomma maculatumvävnader som användes för EV-isolering delvis före isolering och behandlades med 75 U / ml kollagenas typ 3, vilket kan påverka äktheten hos EV-utsöndringen19. Vidare krävde dessa studier 80-100 par spottkörtlar18.

Jämförelsevis kan detta protokoll tillämpas på flera fästingarter och kräver ett lågt antal fästingar för att isolera elbilar och extrahera kvalitetskonserverade och nya miRNA (tabell 2) 33,36,37,43. MiRNA-koncentrationerna varierade kraftigt men var tillräckliga för nästa generations sekvensering (tabell 3 och tilläggstabellerna 1-3). Detta protokoll kan justeras för att rymma en större provstorlek om större miRNA-koncentrationer behövs. Material som används i detta protokoll är också utbytbara beroende på materialtillgänglighet. Provvolymer och centrifugeringshastighet måste dock justeras enligt tillverkarens instruktioner för de kit och kolumner som används.

En nackdel med denna metod är att miRNA och elbilar lätt kan försämras under extraktions- och isoleringsstegen. Därför måste protokollet genomföras snabbt och effektivt. När det anges måste proverna hållas på is och miRNA-extraktionen måste utföras i en steriliserad miljö. Dessutom kan en RNase-behandling göras på de isolerade elbilarna för att eliminera stora RNA som är fästa vid EV-membranet. Detta kan förhindra att stora RNA förorenar provet under miRNA-extraktioner. Slutligen är tillsats av en RNAse-hämmare till miRNA-provet efter isolering från elbilar eller organ en viktig förebyggande åtgärd för nedbrytning. Detta protokoll kan ändras och tillämpas parallellt med experimentets mål som genomförs.

Framtida tillämpningar för detta protokoll kan inkludera studier av patogen-vektorinteraktioner för att förstå hur patogener påverkar miRNA och annan genomisk last inom fästing-saliv-elbilar. På samma sätt kan detta protokoll definiera specifika proteiner och cellulära processer som är involverade i förpackningen av miRNA i fästing-elbilar, och den specifika effekten dessa elbilar och miRNA har på sårläkning och immunsvar. På grund av den ökande fästingresistensen mot akaricider finns det ett desperat behov av unika kontrollmetoder. Elbilar har potential för en alternativ kontrollmetod jämfört med akaricider. Elbilar kan användas som nanotransportörer i terapeutiska tillämpningar 18,23,61. Hos människor har elbilar som transporterar miRNA använts för att undertrycka tumörtillväxt under cancerimmunterapi62,63. På samma sätt kan elbilar i fästingar bära genetiskt modifierade miRNA som har visat sig påverka vitala fästingbiologiska funktioner och patogenöverföring 36,57,64. Den framtida riktningen är att använda detta protokoll för att bestämma miRNA-profilerna för flera fästingarter för att identifiera miRNA av intresse för funktionella studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi är mycket tacksamma för hjälpen från Cattle Fever tick Laboratory i Edinburg, Texas. Vi vill tacka Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado och Homer Vasquez. Vi vill också uppmärksamma hjälpen från Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario och Stephanie Guzman Valencia under hela projektet. Vi vill tacka Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group för deras hjälp och råd under skrivandet av detta manuskript. Följande reagenser tillhandahölls av Centers for Disease Control and Prevention för distribution av BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Kvinnliga I. scapularis-fästingar mottogs också från Tick Rearing Facility vid Oklahoma State University. Detta projekt finansierades av Texas A&M University T3: triader för transformationsbidrag och samarbetsavtalet #58-3094-1-003 av USDA-ARS till AOC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
  2. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
  3. de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
  4. Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , Elsevier. 603-672 (2019).
  5. Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
  7. Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
  8. Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
  9. Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
  10. Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67 (2004).
  11. Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984 (2017).
  12. Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
  13. Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
  14. Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
  15. Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281 (2017).
  16. Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410 (2018).
  17. Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
  18. Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554 (2020).
  19. Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764 (2018).
  20. Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  21. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  22. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  23. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  24. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213 (2018).
  25. Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944 (2021).
  26. Chávez, A. S. O., O'Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212 (2019).
  27. Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
  28. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  29. Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
  30. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  31. Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
  32. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  33. Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
  34. Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
  35. Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
  36. Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
  37. Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
  38. Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
  39. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. Proteomic Profiling. , Springer. 179-209 (2015).
  40. Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
  41. Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  42. Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
  43. Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718 (2020).
  44. Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
  45. Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
  46. Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658 (2006).
  47. Tissot, C. Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Agilent Technologies. , Palo Alto, Calif, USA. Available from: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-7870EN.pdf (2008).
  48. Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964 (2021).
  49. Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12 (2011).
  50. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
  51. Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl_1 109-111 (2004).
  52. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl_1 140-144 (2006).
  53. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl_1 154-158 (2007).
  54. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 152-157 (2011).
  56. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
  57. Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
  58. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34 (2011).
  59. Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342 (2016).
  60. Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130 (2022).
  61. Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917 (2020).
  62. Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
  63. Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
  64. Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289 (2021).

Tags

Biologi utgåva 182 extracellulära vesiklar mikroRNA tick-host-gränssnitt fästingar
Isolering av mikroRNA från Tick <em>Ex Vivo</em> spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, … More

Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter