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Biochemistry

प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की मात्रा का ठहराव के लिए एक अनुकूलित एकल अणु पुल-डाउन परख

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक बेहतर एकल-अणु पुल-डाउन (सिमपुल) परख का उपयोग करके प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को मापने के लिए नमूना तैयारी और डेटा विश्लेषण का वर्णन करता है।

Abstract

फॉस्फोराइलेशन एक आवश्यक पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है जो प्रोटीन फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है और सेल सिग्नलिंग परिणामों को निर्देशित करता है। प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को मापने के वर्तमान तरीके व्यक्तिगत प्रोटीन में फॉस्फोराइलेशन में विषमता को संरक्षित नहीं कर सकते हैं। सिंगल-मॉलिक्यूल पुल-डाउन (सिमपुल) परख को ग्लास कवरस्लिप पर प्रोटीन के इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना की जांच करने के लिए विकसित किया गया था, जिसके बाद सिंगल-अणु इमेजिंग की गई थी। वर्तमान तकनीक सिमपुल का एक अनुकूलन है जो एकल-अणु स्तर पर पूर्ण लंबाई झिल्ली रिसेप्टर्स के फॉस्फोराइलेशन राज्य का मजबूत परिमाणीकरण प्रदान करता है। इस तरह से हजारों व्यक्तिगत रिसेप्टर्स इमेजिंग प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन पैटर्न को मापने की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नमूना तैयारी से इमेजिंग तक अनुकूलित एसआईएमपुल प्रक्रिया का विवरण देता है। ग्लास तैयारी और एंटीबॉडी निर्धारण प्रोटोकॉल का अनुकूलन डेटा की गुणवत्ता को और बढ़ाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एकल-अणु डेटा विश्लेषण के लिए कोड प्रदान करता है जो एक नमूने के भीतर फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स के अंश की गणना करता है। जबकि यह काम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) के फॉस्फोराइलेशन पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल को अन्य झिल्ली रिसेप्टर्स और साइटोसोलिक सिग्नलिंग अणुओं के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Introduction

झिल्ली से जुड़े सिग्नलिंग को लिगैंड-प्रेरित झिल्ली रिसेप्टर सक्रियण और डाउनस्ट्रीम गौण प्रोटीन की भर्ती के संयोजन से ट्यून किया जाता है जो सिग्नल का प्रचार करते हैं। रिसेप्टर साइटोप्लाज्मिक पूंछ में प्रमुख टायरोसिन का फॉस्फोराइलेशन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स, या सिग्नलोसोम 1,2 के गठन को शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण सवाल यह है कि सिग्नलिंग भागीदारों की भर्ती और सेलुलर परिणामों को निर्देशित करने के लिए फॉस्फोराइलेशन पैटर्न कैसे बनाए और बनाए रखा जाता है। इसमें रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन की विषमता को समझना शामिल है, दोनों बहुतायत में और विशिष्ट फॉस्फोटायरोसिन पैटर्न में जो सिग्नलोसोम 3,4,5,6,7 की संरचना को निर्धारित करके सिग्नलिंग आउटपुट में हेरफेर करने का एक साधन प्रदान कर सकता है। हालांकि, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन से पूछताछ करने के लिए वर्तमान तरीकों में सीमाएं हैं। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के रुझानों का वर्णन करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन अर्ध-मात्रात्मक8 है और सिस्टम की विषमता पर जानकारी प्रदान नहीं करता है क्योंकि हजारों से लाखों रिसेप्टर्स एक साथ औसत हैं। जबकि पश्चिमी धब्बे विशिष्ट टायरोसिन के लिए फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एक नमूने की जांच करने की अनुमति देते हैं, वे एक ही प्रोटीन के भीतर मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन पैटर्न पर जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं। फॉस्फोटायरोसिन बहुतायत पर मात्रात्मक फॉस्फोप्रोटिओमिक्स रिपोर्ट करते हैं, लेकिन मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन का पता लगाने की सीमाएं हैं, क्योंकि ब्याज के अवशेषों को उसी पेप्टाइड (आमतौर पर 7-35 अमीनो एसिड) के भीतर स्थित होना चाहिए जो एंजाइमी पाचन 9,10,11 द्वारा उत्पन्न होता है।

ऊपर उल्लिखित सीमाओं को दूर करने के लिए, एकल-अणु पुल-डाउन (सिमपुल) परख को एकल-अणु स्तर पर बरकरार रिसेप्टर्स के फॉस्फोराइलेशन राज्यों को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है। एसआईएमपुल को पहली बार जैन एट अल 12,13 द्वारा मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स से पूछताछ के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में प्रदर्शित किया गया था। सिमपुल में, मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स को एंटीबॉडी-फंक्शनलाइज्ड ग्लास कवरलिप्स पर इम्यूनोप्रेसिपिटेटेड (आईपी) किया गया था और फिर प्रोटीन सबयूनिट नंबर के लिए एकल-अणु माइक्रोस्कोपी और जटिल घटकों12 के साथ सह-आईपी के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। किम एट अल .14 द्वारा एक संशोधन, जिसे सिमब्लॉट कहा जाता है, विकृत प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण करने के लिए सिमपुल की भिन्नता का उपयोग करने वाला पहला व्यक्ति था। सिमब्लॉट प्रोटोकॉल न्यूट्राएविडिन-लेपित कवरलिप्स का उपयोग करके बायोटिनिलेटेड सेल सतह प्रोटीन को कैप्चर करने पर निर्भर करता है, जिसे तब फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी लेबलिंग14 के साथ फॉस्फोराइलेशन के लिए जांच की जाती है। इन अग्रिमों के बावजूद, पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन की मात्रा का ठहराव अधिक मजबूत बनाने और प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू करने के लिए सुधार की आवश्यकता थी।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक अनुकूलित सिमपुल दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसका उपयोग लिगैंड स्थितियों और ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन15 की एक श्रृंखला के जवाब में बरकरार एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) के फॉस्फोराइलेशन पैटर्न को मापने के लिए किया गया था। हालांकि यह काम ईजीएफआर पर केंद्रित है, इस दृष्टिकोण को किसी भी झिल्ली रिसेप्टर और ब्याज के साइटोसोलिक प्रोटीन (पीओआई) पर लागू किया जा सकता है, जिसके लिए गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। प्रोटोकॉल नमूना ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए कदम शामिल हैं, एक नमूना सरणी डिजाइन जिसके लिए 20 नमूनों की एक साथ तैयारी के साथ न्यूनतम नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, और एंटीबॉडी लेबलिंग और निर्धारण स्थितियों का अनुकूलन होता है। फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के एकल-अणु का पता लगाने और मात्रा का ठहराव करने के लिए डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं।

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Protocol

1. कवरस्लिप तैयारी

नोट: इस कदम के लिए, किसी को व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनने की आवश्यकता होती है, जिसमें नाइट्राइल दस्ताने, सुरक्षा चश्मा या फेस शील्ड की एक डबल परत और एक प्रयोगशाला कोट शामिल होता है।

  1. कांच से कार्बनिक मलबे को हटाने के लिए पिरान्हा नक़्क़ाशी करें।
    सावधानी: पिरान्हा समाधान एक मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट है जो कार्बनिक पदार्थों के संपर्क में आने पर संक्षारक और अत्यधिक प्रतिक्रियाशील होता है। कार्बनिक मलबे के साथ प्रतिक्रिया एक्सोथर्मिक और संभावित विस्फोटक है। इस प्रकार, प्रक्रिया को सैश कम करने के साथ एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए। पिरान्हा समाधान को संभालने के लिए पाइरेक्स ग्लासवेयर की आवश्यकता होती है।
    1. एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर कार्यक्षेत्र तैयार करें। 4 एल ग्लास बीकर, "प्रतिक्रिया" बीकर के तल में ओवरलैप के बिना कवरलिप्स व्यवस्थित करें, और प्रतिक्रिया बीकर को कोमल गर्मी के साथ हॉटप्लेट पर रखें। कांच के बने पदार्थ को 10 मिनट के लिए गर्म होने दें। प्रतिक्रिया बीकर के लिए डीडीएच2ओ समीपस्थ के 500 मिलीलीटर के साथ एक "अपशिष्ट" 1 एल ग्लास बीकर रखें।
    2. एक ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ प्रतिक्रिया बीकर में धीरे-धीरे12एन सल्फ्यूरिक एसिड (एच 2 एसओ 4) के49 एमएल जोड़ें। निपटान से पहले अपशिष्ट बीकर में पिपेट कुल्ला।
    3. प्रतिक्रिया बीकर के लिए एक गिलास सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड(एच2 हे 2) ड्रॉपवाइज के21 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरेपिरान्हा नक़्क़ाशी प्रतिक्रिया के स्थानीयकृत शमन को रोकने के लिए प्रतिक्रिया फ्लास्क के तल पर समान रूप से एच2 ओ 2 बूंदों को वितरित करें। निपटान से पहले अपशिष्ट बीकर में पिपेट कुल्ला।
      सावधानी: हमेशा एच2ओ2 को एच2एसओ4 में जोड़ें, और कभी भी इसके विपरीत नहीं।
    4. पिरान्हा कवरलिप्स को 30 मिनट के लिए खोदें। धीरे-धीरे प्रतिक्रिया बीकर की सामग्री को हर 5 मिनट में उत्तेजित करें।
    5. प्रतिक्रिया बीकर में अपशिष्ट बीकर की सामग्री डालकर पिरान्हा समाधान को बुझाएं। छिड़काव को कम करने के लिए प्रतिक्रिया बीकर की दीवार के नीचे धीरे-धीरे तरल स्थानांतरित करें। हॉटप्लेट से प्रतिक्रिया बीकर निकालें।
    6. जब प्रतिक्रिया बुझ जाती है और ठंडा हो जाती है, तो प्रतिक्रिया बीकर से नक़्क़ाशीदार कवरलिप्स को हटाए बिना बेअसर करने के लिए अपशिष्ट बीकर में पिरान्हा समाधान वापस डालें।
    7. एक कमजोर आधार के क्रमिक जोड़ के साथ पिरान्हा समाधान को बेअसर करें। उदाहरण के लिए, अत्यधिक द्रव्यमान 20 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3) / 100 एमएल पिरान्हा समाधान का उपयोग करें।
      सावधानी: सील अपशिष्ट कंटेनरों में पिरान्हा समाधान स्टोर न करें। निपटान से पहले समाधान को हमेशा बेअसर किया जाना चाहिए। न्यूट्रलाइजेशन प्रतिक्रिया जोरदार बुलबुले पैदा करती है और कमजोर आधार के क्रमिक जोड़ द्वारा नियंत्रित नहीं होने पर विस्फोटक हो सकती है।
    8. एक ग्लास हलचल रॉड के साथ बेअसर समाधान हिलाओ और इसे 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया दें। पीएच को >4 तक बढ़ाएं और समाधान का निपटान करें।
    9. पिरान्हा समाधान के लिए कमजोर आधार के परिवर्धन के बीच, एक ग्लास हलचल रॉड के साथ एक बुचनर कीप में प्रतिक्रिया बीकर से नक़्क़ाशीदार कवरलिप्स को स्थानांतरित करें और डीडीएच2ओ चलाने में 5 मिनट के लिए कुल्ला करें।
      नोट: अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें या एक सील बंद ग्लास जार या पेट्री डिश में डीडीएच 2 ओ में2सप्ताह तक पिरान्हा नक़्क़ाशीदार कवरलिप्स स्टोर करें (सीलिंग फिल्म के साथ लपेटें, सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कार्बनिक सॉल्वैंट्स में कवरलिप्स को स्नान-सोनिकेट करें।
    1. एक गिलास कोप्लिन जार में कवरलिप्स रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और मेथनॉल (सीएच3ओएच) के साथ कवर करें। 10 मिनट के लिए सीलिंग फिल्म और स्नान-सोनिकेट के साथ जार के ढक्कन को सील करें। ध्यान से मेथनॉल को कोप्लिन जार से कांच की भंडारण बोतल में डालें।
    2. एसीटोन (सी3एच6ओ) के साथ कोप्लिन जार भरें, ढक्कन को सील करें, और 10 मिनट के लिए स्नान-सोनिकेट करें। ध्यान से कोप्लिन जार से एसीटोन को कांच की भंडारण बोतल में डालें।
      सावधानी: मेथनॉल ज्वलनशील और तीव्रता से विषाक्त है। एक रासायनिक धूआं हुड में प्रयोग करें। एसीटोन ज्वलनशील और एक अड़चन है। इसलिए, इसे कांच में संभालें और स्टोर करें, और इसे रासायनिक धूआं हुड में उपयोग करें। स्थानीय नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार खतरनाक कचरे के रूप में निपटान करें।
      नोट: मेथनॉल और एसीटोन प्रत्येक पांच बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  3. सिलेन कार्यात्मकता के लिए कवरस्लिप सतह को सक्रिय करें।
    1. 20 मिनट के लिए 1 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (केओएच) के साथ स्नान-सोनिकेट। पुन: उपयोग के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोप्लिन जार से केओएच को सावधानीपूर्वक डालें।
      सावधानी: केओएच संक्षारक और एक अड़चन है। एक रासायनिक धूआं हुड में उपयोग करें और कांच में स्टोर न करें। इसे पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्टोर करें। स्थानीय नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार खतरनाक कचरे के रूप में निपटान करें।
      नोट: केओएच को पांच बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    2. कवरलिप्स से डीडीएच2ओ ड्रेन डीडीएच2ओ के साथ दो बार कुल्ला, और फिर सभी सतह की नमी को चलाने के लिए बनसेन बर्नर की लौ के माध्यम से लहराते हुए प्रत्येक कवरस्लिप को गर्म करें। एक सूखे कोप्लिन जार में कवरलिप्स रखें।
  4. कवरस्लिप एमिनोसिलनाइजेशन करें।
    1. एक शंक्वाकार फ्लास्क में 3.6 मिलीलीटर एसिटिक एसिड(सीएच 3सीओओएच) के साथ 69.4 एमएल मेथनॉल मिलाकर एमिनोसिलेन समाधान तैयार करें। एन-(2-एमिनोएथिल) -3-एमिनोप्रोपिलट्रिमेथॉक्सिसिलेन (एमिनोसिलेन) के 720 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      सावधानी: एसिटिक एसिड ज्वलनशील और संक्षारक है। ग्लास पिपेट के साथ संभालें और ग्लास में स्टोर करें। एक रासायनिक धूआं हुड में एसिटिक एसिड के साथ काम करें। एमिनोसिलेन एक तीव्र विषाक्त साँस लेना खतरा, एक संवेदक और एक अड़चन है। यह जलीय जीवन के लिए हानिकारक है। एक रासायनिक धूआं हुड में प्रयोग करें। स्थानीय नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार रसायनों को खतरनाक अपशिष्ट के रूप में निपटाएं।
      नोट: एमिनोसिलेन प्रकाश संवेदनशील है और पानी में तेजी से हाइड्रोलाइज करता है। गतिविधि को बनाए रखने के लिए इस अभिकर्मक के साथ सभी चरणों को न्यूनतम प्रकाश स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए। नाइट्रोजन गैस के साथ बोतल को शुद्ध करें और एक अंधेरे डिसिकेटर में भंडारण से पहले सीलिंग फिल्म लागू करें। हर 6-9 महीने में बदलें।
    2. तुरंत कोप्लिन जार में अमीनोसिलेन समाधान जोड़ें। कवर करें और सीलिंग फिल्म लागू करें, प्रकाश से बचाने के लिए जारी रखें।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए अमीनोसिलेन समाधान में कवरलिप्स सेते हैं। 1 मिनट के लिए स्नान-सोनिकेट करें और फिर एक और 10 मिनट के लिए सेते हैं। ध्यान से ट्रेस एमिनोसिलेन और सीएच 3सीओओएचके साथ सीएच3ओएच के लिए नामित अपशिष्ट कंटेनर में एमिनोसिलेन समाधान डालें।
    4. मेथनॉल के साथ कवरलिप्स कुल्ला और मेथनॉल के लिए नामित अपशिष्ट कंटेनर में समाधान डालो।
    5. डीडीएच2ओ के साथ प्रत्येक 2 मिनट के लिए कवरलिप्स को तीन बार कुल्लाएं कवरलिप्स निकालें, अतिरिक्त नमी को दूर करें, और 10 मिनट के लिए पूरी तरह से हवा सूखजाएं।
  5. कवरलिप्स की सरणी तैयारी/बायोटिन-पीईजी कार्यात्मकता करें।
    1. 84.5 मिलीग्राम एनएएचसीओ3 को डीडीएच2ओ के 1 एमएल में भंग करके 1 एम एनएएचसीओ3 (पीएच 8.5) वर्किंग स्टॉक तैयार करें। 10 एमएम एनएएचसीओ3 की अंतिम एकाग्रता के लिए, 1 एम एनएएचसीओ3 को डीडीएच2ओ (1: 100) में पतला करें।
    2. हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ शुष्क एमिनोसिलेनाइज्ड कवरलिप्स पर एक ग्रिड सरणी खींचें और स्याही के सूखने की प्रतीक्षा करें। उचित अभिविन्यास को चिह्नित करने के लिए कवरस्लिप पर एक पहचानकर्ता लिखें। कवरलिप्स को एक आर्द्र कक्ष में रखें।
      नोट: सरणी में 16-20 वर्ग, आकार में लगभग 4 मिमी x 4 मिमी शामिल होना चाहिए।
    3. बायोटिन-पीईजी सक्सिनिमिडाइल वैलेरेट (बायोटिन-पीईजी)/एमपीईजी सक्सिनिमिडाइल वैलेरेट (एमपीईजी) समाधान बनाने के लिए, पहले, फ्रीजर से एमपीईजी और बायोटिन-पीईजी ( सामग्री की तालिका देखें) को हटा दें और आरटी में संतुलित करें। बुलबुले को हटाने के लिए आरटी पर 1 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
      नोट: पीएच 8.5 बफर में सक्सिनिमिडिल वैलेरेट का हाइड्रोलिसिस आधा जीवन ~ 30 मिनट है। एमपीईजी में बफर जोड़ने के बाद, जितनी जल्दी हो सके निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ें। यह कदम महत्वपूर्ण है।
    4. कवरस्लिप सरणियों में प्रत्येक वर्ग को पूरी तरह से कवर करने के लिए बायोटिन-पीईजी / एमपीईजी समाधान लागू करें, आमतौर पर 10-15 μL प्रति वर्ग। तरल को परिभाषित स्थान को ओवरफ्लो करने की अनुमति न दें। आरटी पर 3-4 घंटे के लिए अंधेरे में एक आर्द्रता कक्ष में कवरलिप्स स्टोर करें।
    5. कवरलिप्स को पानी की प्रचुर मात्रा में धोएं, क्रमिक रूप से उन्हें 10 एस के लिए डीडीएच 2 ओ से भरे 3x250एमएल ग्लास बीकर में डुबोकर धोएं।
    6. नाइट्रोजन गैस के साथ कवरलिप्स से सभी नमी को ड्राइव करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर सीलिंग फिल्म के साथ लिपटे नाइट्रोजन से भरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कवरलिप्स बैक-टू-बैक स्टोर करें।
      नोट: चरण 2 के लिए तुरंत आगे बढ़ें या उपयोग से पहले 1 सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस पर कवरलिप्स स्टोर करें।

2. सिमपुल लाइसेट की तैयारी

सावधानी: प्रोटोकॉल के शेष चरणों के लिए आवश्यक पीपीई नाइट्राइल दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और प्रयोगशाला कोट हैं।

नोट: लाइसेट्स ईजीएफआर-जीएफपी व्यक्त करने वाले अनुयायी सीएचओ कोशिकाओं से तैयार किए गए थे। कोशिकाओं को रात भर12,13 में 60 मिमी टिशू कल्चर (टीसी 60) डिश में चढ़ाया गया था। सीएचओ कोशिकाओं को डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 500 एनजी / एमएल आनुवंशिकी के साथ पूरक किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)। अन्य अनुयायी सेल लाइनों या निलंबन कोशिकाओं का भी उपयोग किया जा सकता है।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कोशिकाओं को प्लेट करें।
    1. 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ संस्कृति पकवान (कोशिकाओं युक्त) धो लें। 1x ट्रिप्सिन के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। एक विंदुक का उपयोग कर, एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए डिश से अलग कोशिकाओं हस्तांतरण।
    2. ट्रिपैन नीले रंग के 10 μL ले लो और एक अलग अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन के 10 μL के साथ मिश्रण। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक स्वचालित सेल काउंटर में सेल मिश्रण के 10 μL का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. प्लेट 8 x 105 कोशिकाओं एक टीसी 60 पेट्री डिश में रात भर. शर्त प्रति एक पकवान प्लेट करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, कोशिकाओं को या तो अनुपचारित किया गया था या चरण 2.4.1 में वर्णित पेर्वानाडेट और ईजीएफ के साथ इलाज किया गया था।
  2. सेल लाइसेट तैयारी के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. बर्फ ठंडा 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) तैयार करें।
    2. फॉस्फेट अवरोधक (पीपीआई) (स्टॉक से 1: 100) के साथ पूरक 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.2) और 150 एमएम एनएसीएल में 1% गैर-आयनिक, गैर-पतित डिटर्जेंट ( सामग्री की तालिका देखें) का समाधान तैयार करें। एक नटेटर पर ट्यूब रखें और बफर को 15 मिनट के लिए मिश्रण करने की अनुमति दें। तैयार घोल को बर्फ पर रखें।
    3. 135 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम केसीएल, 0.4 एमएम एमजीसीएल 2, 1 एमएम सीएसीएल2, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच7.2), 20 एमएम ग्लूकोज और 0.1% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) की अंतिम एकाग्रता के लिए टायरोड के बफर को तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. फॉस्फोराइलेशन के लिए सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें - 1 एमएम परवानेडेट उपचार।
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है। पेरवंडेट वैनाडेट का पेरोक्सीडाइज्ड रूप है- प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेटेस16 का एक अवरोधक। फॉस्फेट गतिविधि को बाधित करके प्रोटीन डिफॉस्फोराइलेशन को रोकने से अत्यधिक फॉस्फोराइलेटेड नमूना होता है।
    1. सक्रिय सोडियम ऑर्थोवानाडेट (ना3वीओ4) का 200 एमएम स्टॉक तैयार करें।
      1. 100 एमएल समाधान तैयार करने के लिए, डीडीएच2ओ के 90 एमएल में ना 3 वीओ4 (सामग्री की तालिका देखें) के3.89ग्राम जोड़ें और सरगर्मी करते समय भंग करें। एचसीएल या एनएओएच ड्रॉपवाइज जोड़कर पीएच को 10 में समायोजित करें। एचसीएल जोड़ने से समाधान पीला हो जाएगा।
      2. डीडीएच2ओ के साथ वॉल्यूम को 100 एमएल तक लाएं माइक्रोवेव में गर्म करके घोल को उबालें। उबलने के बाद, समाधान रंगहीन हो जाएगा।
      3. आरटी के समाधान को ठंडा करें और पीएच को 10 पर समायोजित करें। उबलते, शीतलन और पीएच समायोजन को दो से चार बार दोहराएं, जब तक कि पीएच 10 पर स्थिर न हो जाए। विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 200 एमएम एनए 3 वीओ 4 के 100 μL और डीडीएच2ओ के 546.8 μL (एच2 हे 2 हे 2 की समतुल्य सांद्रता और सक्रिय ना 3 वीओ4) के साथ3% एच 2 ओ 2 के20.4 μL को मिलाकर30एमएम परवानेडेट (पीवी) का स्टॉक तैयारकरें। 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते हैं।
    3. टायरोड के बफर में 1 एमएम पीवी तैयार करें। 10 एमएल समाधान के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस टायरोड के बफर के 9.67 एमएल में 30 एमएम पीवी स्टॉक के 0.33 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं का तुरंत इलाज करें।
    4. टायरोड के बफर के 3 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं के लिए टायरोड के बफर में 1 एमएम पीवी के 3 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. लिगैंड उत्तेजना करें।
    1. उचित एकाग्रता, समय और तापमान का उपयोग करके ब्याज के लिगैंड के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें। अधिकतम ईजीएफआर उत्तेजना के लिए, 50 एनएम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ, सामग्री की तालिका देखें) के 1 एमएल + 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए टायरोड के बफर में पीवी के 1 एमएम के साथ सेते हैं।
  5. सेल लिसिस करें।
    1. वांछित सेल उपचार के बाद, पकवान को बर्फ पर रखें और बर्फ-ठंडा 1 एक्स पीबीएस के साथ धो लें। पूरी तरह से एक विंदुक का उपयोग पीबीएस की पूरी मात्रा को हटा दें।
    2. प्लेट में लाइसिस बफर (चरण 2.2.2) के 180 μL जोड़ें। कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए प्लेट के चारों ओर बफर खींचने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें। कोशिकाओं को पूरी तरह से लाइज करने के लिए पूरी सुसंस्कृत सतह पर सेल खुरचनी के साथ फर्म, सुसंगत दबाव लागू करें।
      नोट: एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए लाइसिस बफर की मात्रा को कम से कम रखा जाना चाहिए।
    3. विंदुक लाइज्ड कोशिकाओं और उन्हें एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित। ट्यूब को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। भंवर हर 5 मिनट में लाइसेट्स।
      नोट: यदि पीओआई में कई सबयूनिट होते हैं या पृथक्करण के प्रति संवेदनशील होते हैं, तो लाइसेट्स को भंवर न करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 एक्स जी पर लाइसेड कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। एक पिपेट का उपयोग कर एक नया 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। इसमें कुल प्रोटीन लाइसेट होता है।
    5. लाइसेट के 10 μL आरक्षित करें और इसे बिसिनकोनिनिक वर्णमिति परख (बीसीए) विश्लेषण17 के लिए लाइसिस बफर के 90 μL में पतला करें। शेष कुल प्रोटीन लाइसेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. बीसीए विश्लेषण का उपयोग करके कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: कुल प्रोटीन लाइसेट्स प्रयोग के दिन तैयार किया जा सकता है और 12 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल-उपयोग विभाज्य के रूप में ताजा या संग्रहीत किया जा सकता है। फ्रीज /पिघलना मत करो।

3. बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के साथ सरणी का कार्यात्मककरण

  1. निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. टी 50 बफर, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) और 50 एमएम एनएसीएल का समाधान। समाधान आरटी पर 1 महीने के लिए स्थिर है।
    2. बीएसए के 0.1 मिलीग्राम / एमएल के साथ टी 50 बफर को पूरक करके टी 50-बीएसए। तैयार घोल को बर्फ पर रखें।
    3. 1एक्स पीबीएस में सोडियम बोरोहाइड्राइड (एनएबीएच4) के 10 मिलीग्राम / इसे उपयोग करने से तुरंत पहले तैयार कर लें।
    4. टी 50 बफर में न्यूट्राएविडिन के 0.2 मिलीग्राम / एमएल ( सामग्री की तालिका देखें)।
      सावधानी: एनएबीएच4 एक कम करने वाला एजेंट है और ज्वलनशील है। हमेशा उपयोग के बाद कंटेनर को नाइट्रोजन गैस से शुद्ध करें और इसे डेसिकेटर में स्टोर करें।
  2. बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के साथ सरणी को कार्यात्मक करें।
    1. फ्रीजर से खूंटी-बायोटिन कार्यात्मक सरणियों को हटा दें और खोलने से पहले शंक्वाकार ट्यूब को आरटी में संतुलित करें। 100 मिमी टिशू कल्चर (टीसी 100) डिश को रेखांकित सीलिंग फिल्म पर उन्मुख सरणी के साथ कवरस्लिप रखें।
      नोट: ओवरहेड प्रकाश व्यवस्था को कम करें। हाइड्रोफोबिक सरणी द्वारा परिभाषित वर्गों पर सभी समाधानों को "मनका" होना चाहिए। प्रत्येक वर्ग (आमतौर पर 10-15 μL) को पूरी तरह से कवर करने के लिए समाधान की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें और तरल को परिभाषित स्थान को ओवरफ्लो करने की अनुमति न दें। तरल पदार्थों को तेजी से हटाने के लिए, कचरे को पकड़ने के लिए वैक्यूम फ्लास्क से जुड़ी इन-हाउस वैक्यूम लाइन का उपयोग करें। रासायनिक धूआं हुड में ट्यूब को खुला छोड़कर निपटान से पहले एनएबीएच4 को 1 घंटे के लिए डीगैस करने की अनुमति दें। एनएबीएच4 उपचार पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए आवश्यक है, जिससे झूठी सकारात्मक एकल अणु का पता लगाने में कमी आती है।
    2. आरटी पर 4 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस में एनएबीएच4 के 10 मिलीग्राम / एमएल के साथ सरणी के प्रत्येक वर्ग का इलाज करें।
    3. टी 50 में न्यूट्राएविडिन के 0.2 मिलीग्राम / एमएल के साथ 5 मिनट के लिए प्रत्येक वर्ग सेते हैं। टी 50-बीएसए के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: न्यूट्राएविडिन खूंटी-बायोटिन को बांधता है और बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी 12,13,15 के लिए एक बाध्यकारी साइट प्रदान करता है।
    4. टी 50-बीएसए में बायोटिनिलेटेड पीओआई-विशिष्ट एंटीबॉडी के 2 μg / एमएल के साथ 10 मिनट के लिए प्रत्येक वर्ग सेते हैं; टी 50-बीएसए के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल ईजीएफआर-जीएफपी पर कब्जा करने के लिए बायोटिनिलेटेड एंटी-ईजीएफआर आईजीजी ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करता है।

4. पूरे सेल लाइसेट्स से पीओआई का सिमपुल

नोट: सिमपुल तैयारी के शेष के लिए बर्फ पर कार्यात्मक सिमपुल सरणियों के टीसी 100 पकवान रखें। यह चरण कुल प्रोटीन लाइसेट से पीओआई का पुल-डाउन है। विगलन के बाद लाइसेट का पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।

  1. निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)/0.1% ग्लूटाराल्डिहाइड (जीए) तैयार करें।
      सावधानी: पीएफए और जीए विषाक्त रासायनिक फिक्सेटिव और संभावित कार्सिनोजेन्स हैं। पीपीई पहनें। स्थानीय नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार रसायनों को खतरनाक अपशिष्ट के रूप में निपटाएं।
    2. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4 तैयार करें।
  2. पिघलना और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके लाइसेट को मिलाएं। बर्फ पर रखो।
  3. लाइसेट के 1 μL को 100 μL बर्फ-ठंडा T50-BSA / पीपीआई में पतला करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो सरणी में कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला लागू करके कुल प्रोटीन लाइसेट के उपयुक्त कमजोर पड़ने वाले कारक का निर्धारण करें। प्रति सरणी क्षेत्र सिमपुल रिसेप्टर्स का इष्टतम घनत्व 0.04-0.08 / लाइसेट कमजोर पड़ने का मूल्यांकन चरण 6 (डेटा विश्लेषण) में किया जा सकता है।
  4. 10 मिनट के लिए सरणी पर लाइसेट सेते हैं; फिर बर्फ-ठंडे टी 50-बीएसए / पीपीआई के साथ चार बार धोएं।
  5. पीपीआई में एएफ 647-संयुग्मित एंटी-फॉस्फोटायरोसिन एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें और 1 घंटे के लिए सरणी पर सेते हैं।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, ईजीएफआर-जीएफपी की फॉस्फोराइलेटेड आबादी की पहचान करने के लिए एक पैन एंटी-पीटीयर (पीवाई 99) -एएफ 647 आईजीजी का उपयोग किया जाता है। सीधे लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता को दूर करता है, लेबलिंग विकल्पों को बढ़ाता है और परिणामों की स्थिरता में सुधार करता है। फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले एंटीबॉडी वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए जा सकते हैं। यदि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, तो एंटीबॉडी को मानक बायोकंजुगेशन तकनीकों का उपयोग करके कस्टम लेबल किया जा सकता है, और वाणिज्यिक बायोकंजुगेशन किट उपलब्ध हैं। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटीबॉडी के प्रत्येक बैच को खुराक वक्र को मापने और संतृप्ति बिंदु खोजने के लिए एसआईएमपुल प्रदर्शन करके इष्टतम लेबलिंग स्थितियों के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता होती है।
  6. कुल 6-8 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे टी 50-बीएसए के साथ छह बार धोएं।
  7. बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
  8. एंटीबॉडी पृथक्करण को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए 4% पीएफए / 0.1% जीए समाधान के साथ सरणी सेते हैं।
  9. फिक्सेटिव को निष्क्रिय करने के लिए 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4 / पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धोएं।
    नोट: एक से अधिक एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, (उदाहरण के लिए, कई फॉस्फोटायरोसिन साइटों का पता लगाने), चरण 4.5-4.9 दोहराएं। दो एंटीबॉडी के बीच स्टेरिक बाधा का निर्धारण करने के बारे में जानकारी के लिए चरण 6.2.9 देखें।

5. छवि अधिग्रहण

नोट: एकल अणु छवि अधिग्रहण एक 150x TIRF उद्देश्य और एक छवि फाड़नेवाला है कि ECCD कैमरा के एक विशिष्ट चतुर्थांश में प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल पर कब्जा कर लेता है का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)। अंशांकन छवियों को पहले एक नैनोपैटर्न चैनल संरेखण ग्रिड (नैनोग्रिड) के साथ चैनल पंजीकरण और कैमरा लाभ अंशांकन की अनुमति देने के लिए अधिग्रहित किया जाता है जिसमें 3 ± 1 μm (कुल आकार ~ 60 μm × 60 μm) की इंट्राहोल दूरी पर 200 ± 50 एनएम छेद के 20 x 20 सरणियाँ होती हैं।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए चैनल पंजीकरण करें।
    नोट: उत्सर्जकों के कोलोकलाइजेशन की ठीक से गणना करने के लिए सटीक चैनल पंजीकरण की आवश्यकता होती है। यह कदम महत्वपूर्ण है।
    1. तेल उद्देश्य को साफ करें और उद्देश्य पर तेल की एक बूंद जमा करें। इमेजिंग के लिए मंच पर नैनोग्रिड रखें। प्रेषित सफेद प्रकाश का उपयोग करके, ग्रिड पैटर्न पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: नैनोग्रिड के साथ छवियों को प्रेषित प्रकाश का उपयोग करके अधिग्रहित किया जाता है, जो नैनोग्रिड से गुजरता है और सभी वर्णक्रमीय चैनलों में पाया जाता है। वैकल्पिक रूप से, कोई मल्टीफ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग कर सकता है जो प्रत्येक चैनल में पाए गए प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं। छवि अधिग्रहण को प्रत्येक माइक्रोस्कोप सेटअप के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
    2. ग्रिड की 20 छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि पिक्सेल संतृप्त नहीं हैं। छवि श्रृंखला को "फिड्यूशियल" के रूप में सहेजें।
    3. एक हवादार पैटर्न बनाने के लिए नैनोग्रिड को डिफोकसकरें 18. लाभ अंशांकन के लिए 20 छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करें। छवि को "लाभ" के रूप में सहेजें।
    4. कैमरे पर जाने से सभी प्रकाश को अवरुद्ध करके कैमरा ऑफसेट के लिए 20 छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करें। छवि को "पृष्ठभूमि" के रूप में सहेजें।
  2. सिमपुल छवियों का अधिग्रहण करें।
    नोट: कवरस्लिप सरणी इमेजिंग से पहले, टी 50-बीएसए के लिए ट्रिस समाधान का आदान-प्रदान करें और सरणी को आरटी में संतुलित करें।
    1. तेल उद्देश्य को साफ करें और उद्देश्य पर अतिरिक्त तेल जमा करें। माइक्रोस्कोप चरण पर कवरस्लिप सरणी को सुरक्षित करें।
    2. प्रत्येक फ्लोरोफोर की उत्तेजना शक्ति, टीआईआरएफ कोण और कैमरा एकीकरण समय का अनुकूलन करें। लक्ष्य नमूने के फोटोब्लीचिंग को कम करते हुए उच्चतम सिग्नल-टू-शोर प्राप्त करना है। भविष्य के माप में स्थिरता के लिए लेजर शक्ति रिकॉर्ड करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन ने दूर-लाल चैनल के लिए 300 एमएस एक्सपोजर समय और हरे चैनल के लिए 1 एस का उपयोग किया। 642 एनएम लेजर का उपयोग लगभग 500 μW लेजर पावर पर किया गया था, जबकि 488 एनएम लेजर का उपयोग 860 μW पर किया गया था, जिसे ट्यूब लेंस से पहले मापा गया था।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए छवियों का अधिग्रहण करें। फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए प्रत्येक निचले तरंग दैर्ध्य फ्लोरोफोर के बाद पहले दूर-लाल चैनल की छवि बनाएं। प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग की जाने वाली कम मात्रा के कारण, हर 30-45 मिनट में बफर स्तर की जांच करें और आवश्यकतानुसार फिर से भरें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. डेमो कोड डाउनलोड करें।
    नोट: प्रदान किए गए डेमो कोड और उदाहरण डेटा सेट पूर्ण डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो (पूरक कोडिंग फ़ाइलें 1-4) प्रदर्शित करते हैं। सिमपुलमेन.एम में सूचीबद्ध सिस्टम आवश्यकताएं पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में पाई जाती हैं।
    1. अनज़िप करें और एक व्यक्तिगत दस्तावेज़ / मैटलैब (मैकओएस / लिनक्स) या दस्तावेज़ \ MATLAB (विंडोज) निर्देशिका में सहेजें ।
      नोट: यह चार नए फ़ोल्डर उत्पन्न करता है: SiMPull_class, स्माइट, नमूना डेटा, नमूना विश्लेषण आउटपुट।
    2. SiMPull_class फ़ोल्डर में मिली "ReadMe_Setup.txt" फ़ाइल खोलें।
    3. मैटलैब और मैटलैब टूलबॉक्स स्थापित करें: वक्र फिटिंग टूलबॉक्स, समानांतर कंप्यूटिंग टूलबॉक्स, और सांख्यिकी और मशीन लर्निंग टूलबॉक्स।
    4. डाउनलोड निर्देशों के अनुसार डिपइमेज19 इंस्टॉल करें।
    5. ReadMe_setup.txt में वर्णित "स्माइट" एकल-अणु विश्लेषण पैकेज स्थापित करें।
      नोट: "स्माइट" गिटहब भंडार पर उपलब्ध है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. फ़ाइल को मैटलैब विंडो में खींचकर, SiMPull_class फ़ोल्डर में पाए जाने वाले SiMPullMa.m खोलें।
    7. फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें आइकन पर क्लिक करके और फ़ोल्डर का चयन करके निर्देशिका को ...\MATLAB\नमूना डेटा में परिवर्तित करें.
  2. डेटा प्रोसेसिंग चरणों का अवलोकन
    1. प्रत्येक अनुभाग के लिए निर्देशों का पालन करते हुए सिमपुल मेन.एम चलाएं। कर्सर को उस अनुभाग में रखकर और अनुभाग चलाएँ चिह्न पर क्लिक करके प्रत्येक अनुभाग को व्यक्तिगत रूप से निष्पादित करें।
      नोट:: डेटा विश्लेषण के लिए सामान्य चरण इस खंड में वर्णित हैं। विस्तृत निर्देश साथ में सिमपुलमेन.एम कोड में पाए जाते हैं।
    2. वर्णक्रमीय चैनल और छवि आकार को परिभाषित करने के लिए पथ सेट करने के लिए "प्रारंभ" अनुभाग चलाएँ।
    3. लाभ और पृष्ठभूमि डेटासेट का उपयोग करके कैमरा लाभ को फोटॉन में परिवर्तित करने के लिए "कैमरा लाभ और ऑफसेट ढूंढें" अनुभाग चलाएं।
    4. छवि पंजीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले स्थानीय भारित माध्य ट्रांसफ़ॉर्म की गणना करने के लिए "चैनल पंजीकरण" अनुभाग चलाएँ।
    5. डेटा को स्वरूपित और क्यूरेट करें. "एक क्वाड छवि में अनुक्रमिक चैनल में शामिल हों" अनुभाग चलाएँ। "खराब फ्रेम्स निकालें" चलाएं।
    6. "फ़िट एकल अणु और अतिव्यापी अणु ढूँढें" अनुभाग चलाएँ।
      नोट: यह अनुभाग प्रत्येक चैनल में एकल अणुओं को स्थानीयकृत करने और वर्णक्रमीय चैनलों के बीच कोलोकलाइजेशन घटनाओं को निर्धारित करने के लिए कई कार्यों को निष्पादित करता है।
    7. सच्चे जीएफपी फिट प्रति न्यूनतम फोटॉन गिनती निर्धारित करने के लिए, "न्यूनतम फोटॉन थ्रेशोल्ड ऑप्टिमाइज़ करें" चलाएं। यह एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया है।
      1. सबसे पहले, एसएमएफ सेट करें। Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] और अनुभाग चलाएं। संकेत मिलने पर "रिक्त डेटा" फ़ाइलों का चयन करें। "चो-ईजीएफआर-जीएफपी" फ़ाइलों के साथ दोहराएं।
      2. दो हिस्टोग्राम की तुलना करके एक उपयुक्त न्यूनतम थ्रेशोल्ड मान का चयन करें। एसएमएफ सेट करें। Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] और अनुभाग को फिर से चलाएं।
    8. पृष्ठभूमि स्थानीयकरण को सही करने और अंतिम मानों की गणना करने के लिए "जीएफपी का प्रतिशत एफआर सिग्नल के लिए सकारात्मक फिट बैठता है" खंड चलाएं।
    9. प्रायोगिक आवश्यकता के अनुसार विकल्प 1 (चरण 6.2.10) या विकल्प 2 (चरण 6.2.11) निष्पादित करें।
    10. विकल्प 1: लिगैंड बाइंडिंग के लिए प्लाज्मा झिल्ली पर उपलब्ध रिसेप्टर्स की संख्या के लिए सही है, जैसा कि संदर्भ15 में वर्णित है।
      1. सबसे पहले, फ्लोरोसेंट एनएचएस एस्टर डाई (एनएचएस-एएफ 647, सामग्री की तालिका देखें) के संतृप्त स्तर के साथ लेबल सतह रिसेप्टर्स। फिर जीएफपी स्थानीयकरण के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक सिमपुल प्रयोग करें जो एएफ 647 के साथ कोलोकलाइज़ करता है।
        नोट: यह एनएचएस लेबलिंग के लिए उपलब्ध रिसेप्टर्स के अंश और सतह (एसआर) पर रिसेप्टर्स के अनुपात का अनुमान प्रदान करता है।
      2. अंतिम गणना में एसआर सुधार लागू करें: एनजीएफपी = (एनएलओसी - एनबीजी) * एसआर, जहां एनजीएफपी जीएफपी स्थानीयकरण की सही संख्या है, एनबीजी पृष्ठभूमि स्थानीयकरण संख्या है, और एनएलओसी कुल स्थानीयकरण है।
        नोट: वर्तमान उदाहरण में, यह सुधार लागू नहीं किया जाता है क्योंकि पेरवानाडेट झिल्ली पारगम्य16 है और इसलिए, फॉस्फेट निषेध की कार्रवाई सतह रिसेप्टर्स तक सीमित नहीं है।
    11. विकल्प 2: मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन माप के लिए, दो एंटीबॉडी का उपयोग किए जाने पर स्टेरिक बाधा की संभावना पर विचार करें।
      नोट: स्टेरिक बाधा एंटीबॉडी 1 के लिए फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स के मनाया प्रतिशत में कमी का कारण बन सकती है जब एंटीबॉडी 2 (पी 12) की उपस्थिति में, अकेले एंटीबॉडी 1 (पी 1) की तुलना में।
      1. पी 1 और पी 12 निर्धारित करने और पहले प्रकाशित संदर्भ15 के बाद स्टेरिक बाधा के लिए सुधार कारक की गणना करने के लिए सिमपुल का उपयोग करें।

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Representative Results

सिमपुल प्रक्रिया को दर्शाने वाला एक कार्टून चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। कुल प्रोटीन लाइसेट्स से ईजीएफआर-जीएफपी को पकड़ने के लिए बायोटिनिलेटेड एंटी-ईजीएफआर एंटीबॉडी के लिए एक लंगर के रूप में न्यूट्राएविडिन का उपयोग करके कवरलिप्स को कार्यात्मक किया जाता है। अनबाउंड प्रोटीन को धोने के बाद, फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स को एंटी-फॉस्फोटायरोसिन (एंटी-पीवाई) एंटीबॉडी15 के साथ लेबल किया जाता है। चित्रा 1 बी हाइड्रोफोबिक सरणी की एक छवि दिखाता है, जहां कई नमूने तैयार किए जा सकते हैं और एक ही कवरस्लिप पर इमेज किए जा सकते हैं। इस नमूना धारक का एक लाभ यह है कि ~ 10 μL के न्यूनतम नमूना संस्करणों की आवश्यकता होती है। कवरस्लिप को सीधे माइक्रोस्कोप चरण पर रखकर इमेज किया जा सकता है। हालांकि, कवरस्लिप होल्डर का उपयोग करके कवरस्लिप को स्थिर करना सहायक होता है। चित्रा 1 बी में दिखाए गए कवरस्लिप धारक को 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके बनाया गया था, और ब्लूप्रिंट पूरक कोडिंग फ़ाइल 5 में प्रदान किया गया है। हाइड्रोफोबिक स्याही का ऑटोफ्लोरेसेंस नमूने (चित्रा 1 सी) के फोकल विमान को खोजने के लिए एक उपयोगी मार्गदर्शिका है। मल्टीचैनल कच्ची छवि का एक उदाहरण चित्रा 1 डी में दिखाया गया है। कच्चे हरे और दूर-लाल चैनलों का एक ओवरले चित्रा 1 ई में दिखाया गया है।

चित्रा 2 विश्लेषण वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है और प्रतिनिधि डेटा प्रदान करता है। डेटा अधिग्रहण पहले चैनल पंजीकरण के लिए फिड्यूशियल प्राप्त करने के साथ शुरू होता है, जिसका उपयोग व्यक्तिगत वर्णक्रमीय चैनल डेटा (चित्रा 2 ए) को ओवरले करने के लिए किया जाता है। ब्राइट-फील्ड छवियों को एक नैनोग्रिड पैटर्न का उपयोग करके लिया जाता है जो सफेद प्रकाश से गुजरता है और छवि फाड़नेवाला (नहीं दिखाया गया) के प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल में पाया जाता है। हरा चैनल संदर्भ चैनल के रूप में कार्य करता है, और दूर-लाल चैनल स्थानांतरित चैनल है। स्थानीय भारित माध्य रूपांतरण की गणना मैटलैब में फिटजियोट्रांस20 फ़ंक्शन का उपयोग करके की जाती है और इसका उपयोग हरे रंग के चैनल के समन्वय फ्रेम में दूर-लाल निर्देशांक को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। यह रूपांतरण प्रत्येक नियंत्रण बिंदु पर दूसरे क्रम के बहुपद मॉडल का उपयोग करता है। सिमपुल सरणी के मल्टीचैनल डेटा को तब अधिग्रहित किया जाता है। इस वर्कफ़्लो में एक अर्ध-स्वचालित अधिग्रहण शामिल था, जहां विशिष्ट नमूना वर्ग के लिए एक प्रारंभिक आरओआई का चयन किया गया था, और इस क्षेत्र के आसपास के तीन क्षेत्रों को इमेज किया गया था, जैसे कि प्रत्येक डेटासेट में तीन स्वतंत्र आरओआई (चित्रा 1 डी) से पूर्ण क्वाड-व्यू छवि होती है। प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल में, उत्सर्जक उम्मीदवार स्थानों को छवियों में गाऊसी फ़िल्टर के अंतर को लागू करके और स्थानीय मैक्सिमा की पहचान करके पाया जाता है। उपक्षेत्रों (बक्से, चित्रा 2 बी) स्थानीय मैक्सिमा के चारों ओर खींचे जाते हैं, और उत्सर्जक फोटॉन गिनती का अनुमान यह मानकर लगाया जाता है कि प्रत्येक उपक्षेत्र में केवल एक उत्सर्जक होता है। न्यूनतम मूल्य से ऊपर फोटॉन गिनती वाले उत्सर्जक उम्मीदवारों को रखने वाले उप-क्षेत्रों को फिटिंग के लिए बनाए रखा जाता है। एक गाऊसी बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) प्रत्येक उत्सर्जक उम्मीदवार को प्रत्येक उत्सर्जक के चारों ओर केंद्रित छोटे उपक्षेत्रों के भीतर फिट बैठता है। परिणामी स्थानीयकरण उनके फोटॉन गिनती, पृष्ठभूमि, फिट निर्देशांक के क्रैमर-राव निचले बाउंड, पीएसएफ विचरण (यानी, पीएसएफ चौड़ाई), और पीएसएफ मॉडल के फिट की भलाई का वर्णन करने वाले पी-वैल्यू के आधार पर थ्रेसहोल्ड किए जाते हैं। प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल के लिए एक गाऊसी छवि बनाई गई है, जिसमें प्रत्येक अच्छे फिट (चित्रा 2 सी) के लिए निर्देशांक पर समान तीव्रता गाऊसी ब्लॉब्स रखे गए हैं। फिड्यूशियल नमूने (चित्रा 2 डी) से गणना किए गए रूपांतरण का उपयोग करके प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल से गाऊसी छवियों को ओवरले करके कोलोकलाइजेशन की कल्पना की जाती है। पहचान के लिए रिसेप्टर को फ्लोरोसेंटली लेबल करना महत्वपूर्ण है क्योंकि सेल लाइसेट मौजूद होने पर सतह पर एंटी-फॉस्फोटायरोसिन एंटीबॉडी का अभी भी गैर-विशिष्ट बंधन है। ईजीएफआर-जीएफपी (ग्रीन चैनल) का उपयोग रिसेप्टर स्थानों का मुखौटा उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, और उस मुखौटा के भीतर केवल एएफ 647-एंटी-पीवाई सिग्नल (दूर-लाल चैनल) गिना जाता है (चित्रा 2 डी)। 1 पिक्सेल (106.7 एनएम पिक्सेल आकार) के भीतर जोड़े को कोलोकलाइज़्ड माना जाता है और संदर्भ चैनल निर्देशांक वाली सूची में सहेजा जाता है। जीएफपी के साथ सहस्थानीयकृत एएफ 647 का प्रतिशत फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स (चित्रा 2 ई) के अंश को निर्धारित करने के लिए गणना की जाती है।

अच्छी डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। ऐसा ही एक प्रयास एनएबीएच4 के साथ कवरस्लिप सरणी को इनक्यूबेट करना है जैसा कि हरे रंग के चैनल में ऑटोफ्लोरेसेंस बुझाने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है। यह ऑटोफ्लोरेसेंस ग्लास पर संभावित अशुद्धियों के कारण गैर-विशिष्ट संकेत को संदर्भित करता है, जिसमें एकल या संयुग्मित π बॉन्डहोते हैं 21. ऐसी अशुद्धियां संभावित रूप से कार्यात्मक प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले अमीनोसिलेन और पीईजी अभिकर्मकों या हवा से धूल से होती हैं, और हरे वर्णक्रमीय चैनल में फ्लोरोसिस होती हैं। नाइट्रोजन के तहत संग्रहीत ग्लास रखने के प्रयासों के बावजूद, इन अणुओं को भंडारण में होने वाले ऑक्सीकरण के माध्यम से भी उत्पन्न किया जा सकता है। एनएबीएच4 का उपयोग स्लाइड और माइक्रोएरे पर अशुद्धियों से प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए भी किया गया है, जिसमें सिलेन कोटिंग16 भी शामिल है। चित्रा 3 ए पृष्ठभूमि का पता लगाने की संख्या में कमी को दर्शाता है जो तब होता है जब पिरान्हा नक़्क़ाशीदार ग्लास को एनएबीएच4 के साथ इलाज किया जाता है। जबकि एनएबीएच4 नाटकीय रूप से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करता है, कुछ उत्सर्जक अभी भी हरे रंग के चैनल में पाए जाते हैं। कोई लाइसेट-मुक्त नमूनों (चित्रा 3 डी) से पृष्ठभूमि छवियों को प्राप्त करके और जीएफपी युक्त नमूनों से पृष्ठभूमि स्थानीयकरण की औसत संख्या को घटाकर इसे सही कर सकता है। सुदूर-लाल चैनल में अशुद्धियों से प्रतिदीप्ति का पता नहीं चला था। यदि रिसेप्टर घनत्व बहुत अधिक है, तो कई जीएफपी उत्सर्जक एक विवर्तन-सीमित स्थान (डेटा नहीं दिखाया गया है) के भीतर पाए जा सकते हैं। प्रति स्पॉट जीएफपी की संख्या की पहचान करने के लिए स्टेप-फोटोब्लीचिंग का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि 0.04-0.08 प्रोटीन / μm2 के बीच एक रिसेप्टर घनत्व ने प्रति स्पॉट12 में कई उत्सर्जकों को खोजने की क्षमता को हटाने के लिए एकल उत्सर्जकों के बीच पर्याप्त रिक्ति प्रदान की। रिसेप्टर घनत्व को कांच की सतह से बंधे आईपी एंटीबॉडी की मात्रा या जोड़े गए लाइसेट की मात्रा को अलग करके अनुकूलित किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पीओआई को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग संतृप्त स्तरों पर किया जाता है। उपयुक्त लेबलिंग स्थितियों (चित्रा 3 बी) को निर्धारित करने के लिए फॉस्फोराइलेटेड नमूनों पर एंटीबॉडी एकाग्रता वक्र प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, एंटीबॉडी की फॉस्फो-विशिष्टता को प्रोटीन-विशिष्ट किनेज अवरोधकों (चित्रा 3 बी) के साथ आराम करने वाले नमूनों और / या उपचार के साथ मान्य करने की आवश्यकता है। इमेजिंग समय खिड़की के दौरान एंटीबॉडी रिसेप्टर से अलग हो जाएंगे। पीएफए और जीए के संयोजन के साथ नमूना का इलाज संकेत हानि (चित्रा 3 सी) को रोका।

अंत में, एकल-अणु फिटिंग मापदंडों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। पहला "बॉक्स खोज" कदम जो संभावित उत्सर्जक उम्मीदवारों (चित्रा 2 बी) की पहचान करता है, कई उम्मीदवारों को गाऊसी फिटिंग से गुजरने की अनुमति देने के लिए उदार होना चाहिए। इस प्रकार, बॉक्स खोजने के लिए न्यूनतम फोटॉन थ्रेसहोल्ड सभी वास्तविक उत्सर्जकों और कुछ पृष्ठभूमि स्पॉट को पकड़ने के लिए अपेक्षाकृत कम हो सकता है। बॉक्स आकार सेट नहीं करना और भत्ता को बहुत छोटा ओवरलैप करना भी महत्वपूर्ण है। बॉक्स आकार को 5-7 पिक्सेल के भीतर रखना और दो-पिक्सेल ओवरलैप की अनुमति देना अनुशंसित घनत्व पर उत्सर्जकों के लिए आदर्श है। बॉक्स खोजने के बाद, फिटिंग चरण में न्यूनतम फोटॉन थ्रेसहोल्ड को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। न्यूनतम फोटॉन पैरामीटर यह निर्धारित करने में योगदान देता है कि कौन से गाऊसी फिट उत्सर्जक एक सच्चे फिट के रूप में गुजरते हैं। सच्चे जीएफपी फिट बैठता है के लिए उचित न्यूनतम फोटॉन थ्रेसहोल्ड निर्धारित करने के लिए, कोड पृष्ठभूमि (कोई सेल लाइसेट) और जीएफपी युक्त (प्लस सेल लाइसेट) नमूने (चित्रा 3 डी) दोनों में फोटॉन/स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक हिस्टोग्राम प्लॉटिंग फ़ंक्शन शामिल है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि, जबकि एनएबीएच4 अशुद्धियों से प्रतिदीप्ति की मात्रा को कम करता है, यह सभी पृष्ठभूमि स्थानीयकरणों को नहीं हटाता है। चित्रा 3 डी अशुद्धियों से पता लगाने की संख्या को कम करने के लिए न्यूनतम फोटॉन थ्रेसहोल्ड सेट करने की आवश्यकता को दर्शाता है। इस दहलीज का निर्धारण करने के लिए, पृष्ठभूमि उत्सर्जक तीव्रता का एक हिस्टोग्राम इमेजिंग एक नमूना है कि सेल लाइसेट (चित्रा 3 डी, ऊपर बाईं ओर) के संपर्क में नहीं है से गणना की है। अधिकांश पृष्ठभूमि उत्सर्जकों में 475 फोटॉन से कम मूल्य पाए गए। इसकी तुलना में, सच्चे जीएफपी उत्सर्जक युक्त नमूने ने 475 (चित्रा 3 डी, शीर्ष दाएं) से ऊपर वितरण का एक महत्वपूर्ण अंश दिखाया। थ्रेसहोल्ड लाइसेट नमूना (चित्रा 3 डी, नीचे पंक्ति) से सिग्नल हानि की मात्रा को कम करते हुए संभव के रूप में कई पृष्ठभूमि मायने रखता है को हटाने के लिए निरीक्षण द्वारा चुना जाता है। इस दहलीज पर शेष पृष्ठभूमि गिनती घनत्व मात्रात्मक विश्लेषण में के लिए जिम्मेदार है।

Figure 1
चित्रा 1: नमूना तैयारी का अवलोकन. (ए) सिमपुल दृष्टिकोण को दर्शाते हुए कार्टून। कवरलिप्स को एक एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जाता है जो पूरे सेल लाइसेट्स से उस पीओआई को पकड़ने के लिए पीओआई को पहचानता है। ग्लास को पहले खूंटी और बायोटिन-पीईजी के साथ लेपित किया जाता है। न्यूट्राएविडिन तब बायोटिन-पीईजी से बंधा होता है और बायोटिनिलेटेड एंटी-पीओआई एंटीबॉडी के लिए एक लंगर के रूप में कार्य करता है। फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटी-पीवाई एंटीबॉडी के साथ पता लगाया जाता है। (बी) कवरस्लिप धारक (लाल) की तस्वीर जगह में कवरस्लिप सरणी के साथ और माइक्रोस्कोप चरण पर घुड़सवार। मल्टीसैंपल सरणियों को हाइड्रोफोबिक स्याही का उपयोग करके एक ग्लास कवरस्लिप पर 20 व्यक्तिगत नमूना वर्ग बनाने के लिए उत्पन्न किया जाता है। कवरस्लिप 60 मिमी x 24 मिमी है (सी) हाइड्रोफोबिक स्याही ऑटोफ्लोरेसेंस (मैजेंटा) और फ्लोरोसेंट मोती (हरा) की उदाहरण छवियां। हाइड्रोफोबिक स्याही का ऑटोफ्लोरेसेंस कवरस्लिप सतह पर फोकल विमान को खोजने के लिए एक उपयोगी मार्गदर्शिका है। (डी) क्वाड-व्यू इमेज स्प्लिटर द्वारा कैमरा चिप पर अलग किए गए वर्णक्रमीय चैनलों के साथ एक कच्चे डेटा छवि का उदाहरण। क्वाड-व्यू फ़िल्टर सेट में निम्नलिखित उत्सर्जन फ़िल्टर शामिल हैं: नीला (445/45 एनएम), हरा (525/45 एनएम), लाल (600/37 एनएम), दूर-लाल (685/40 एनएम)। (ई) हरे और दूर-लाल चैनलों का कच्चा ओवरले। सफेद बॉक्स चित्रा 2 बी-डी में आगे की जांच किए गए क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार (C-E) = 2 μm। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो( ए) चैनल पंजीकरण पहले नैनोग्रिड से प्राप्त छवियों पर किया जाता है। ब्याज के दो वर्णक्रमीय चैनलों (यहां, हरे और दूर-लाल) को क्रॉप करने के बाद, प्रत्येक चैनल के लिए फिड्यूशियल छवियों को मढ़ा जाता है (बाएं)। बाईं छवि (इनसेट) में बॉक्स की वृद्धि से पता चलता है कि छवियां अभी तक वास्तव में पंजीकृत नहीं हैं। प्रत्येक चैनल में उत्सर्जक एक गाऊसी मॉडल फिट होते हैं और स्थानीयकृत (पंजीकरण) होते हैं। उत्सर्जकों के स्थानीयकरण को दूर-लाल चैनल के लिए हलकों और हरे चैनल के लिए क्रॉस के रूप में दिखाया गया है। अंतिम चरण हरे रंग के चैनल संदर्भ फ्रेम (संरेखित) में दूर-लाल चैनल स्थानीयकरण निर्देशांक को स्थानांतरित करने के लिए एक स्थानीय भारित माध्य रूपांतरण लागू करना है। गणना की गई स्थानीय भारित माध्य रूपांतरण का उपयोग बाद के सिमपुल डेटा को पंजीकृत करने के लिए किया जाता है। (बी) हरे / ईजीएफआर-जीएफपी चैनल और दूर-लाल / एएफ 647-एंटी-पीवाई चैनल की प्रतिनिधि छवियां। पृष्ठभूमि फोटॉन गिनती के ऊपर एकल उत्सर्जकों की पहचान की जाती है और बक्से के साथ चिह्नित किया जाता है। (सी) प्रत्येक चयनित बॉक्स के भीतर उत्सर्जन प्रोफ़ाइल एक गाऊसी मॉडल के लिए फिट है, और उत्सर्जक जो एक एकल फ्लोरोफोर पीएसएफ के मॉडल को फिट करते हैं, उन्हें रखा जाता है। (डी) ईजीएफआर-जीएफपी (हरा) के स्थान की पहचान करने के लिए जीएफपी उत्सर्जकों से एक मास्क बनाया जाता है। ईजीएफआर-जीएफपी और एएफ 647-एंटी-पीवाई का कोलोकलाइजेशन फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स (सफेद) की पहचान करता है। (ई) फॉस्फोराइलेटेड रिसेप्टर्स के अंश की गणना कोलोकलाइज्ड ईजीएफआर-जीएफपी और एएफ 647-एंटी-पीवाई फिट से की जाती है। बार ग्राफ पीवी + ईजीएफ उपचार की तुलना आराम करने वाली कोशिकाओं से करता है, जो कई मापों के लिए औसत है। त्रुटि पट्टियाँ द्विपद वितरण मानकर गणना की गई मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। स्केल बार = 2 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम ( ए ) बाएं से दाएं, पहले तीन पैनल संबंधित स्थितियों के तहत ग्लास पर ऑटोफ्लोरेसेंस की प्रतिनिधि छवियां हैं: पिरान्हा नक़्क़ाशी के बाद, खूंटी के साथ, और खूंटी प्लस एनएबीएच4 उपचार (+ के साथ इंगित)। इसके अतिरिक्त, एनएबीएच4 उपचार के बाद सतह कार्यात्मकता को बनाए रखा जाता है जैसा कि लाइसेट से ईजीएफआर-जीएफपी के मजबूत बंधन को बनाए रखते हुए न्यूनतम गैर-विशिष्ट पीवाई 99-एएफ 647 बाध्यकारी द्वारा प्रदर्शित किया गया है। (बी) इष्टतम एंटीबॉडी लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के प्रत्येक बैच के लिए एक संतृप्ति वक्र का अधिग्रहण किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा साइट-विशिष्ट फॉस्फोटायरोसिन एंटीबॉडी, एंटी-ईजीएफआर-पीवाई 1173 के साथ ईजीएफआर को लेबल करने के लिए एकाग्रता वक्र दिखाता है। अनुपचारित कोशिकाओं (आराम, ग्रे हीरे) में न्यूनतम फॉस्फोराइलेशन का पता लगाया जाता है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए एक नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को ईजीएफ (मैजेंटा त्रिकोण) के 100 एनएम जोड़ने से पहले ईजीएफआर किनेज अवरोधक, लैपाटिनिब के साथ भी इलाज किया गया था, जो ईजीएफआर फॉस्फोराइलेशन की अपेक्षित रोकथाम को दर्शाता है। त्रुटि पट्टियाँ द्विपद वितरण मानते हुए मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) पीएफए और जीए के संयोजन के साथ नमूने का निर्धारण समय के साथ एंटीबॉडी पृथक्करण को रोकता है। त्रुटि पट्टियाँ द्विपद वितरण मानते हुए मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। (डी) गाऊसी फिटिंग के लिए उपयुक्त सीमा का चयन करके झूठी सकारात्मक को बाहर रखा गया है। पृष्ठभूमि (कोई लाइसेट नहीं) और वास्तविक डेटा (प्लस सेल लाइसेट) के बीच कम थ्रेसहोल्ड (थ्रेसहोल्ड = 0; शीर्ष) पर फिट तीव्रता के हिस्टोग्राम की तुलना करना हरे चैनल में ऑटोफ्लोरोसेंट स्पॉट से फिट को हटाने के लिए उपयुक्त मूल्य (थ्रेसहोल्ड = 475; नीचे) के चयन की अनुमति देता है। ऊर्ध्वाधर मैजेंटा लाइन 475 फोटॉन थ्रेसहोल्ड को इंगित करती है। हिस्टोग्राम की गणना प्रत्येक नमूना प्रकार (एन = 3) के लिए आरओआई की समान संख्या से की जाती है। स्केल बार = 2 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल 1: ज़िप फ़ाइल जिसमें SiMPull विश्लेषण चलाने के लिए स्क्रिप्ट और उपयोगिताओं शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: ज़िप फ़ाइल जिसमें स्माइट एकल-अणु विश्लेषण पैकेज होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: नमूना डेटा युक्त ज़िप फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: प्रतिनिधि नमूना डेटा विश्लेषण आउटपुट युक्त ज़िप फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल 5: 3-डी प्रिंटिंग के लिए कवरस्लिप धारक ब्लूप्रिंट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एकल प्रोटीन स्तर पर रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन के मात्रात्मक माप को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया था। सिमपुल प्रोटोकॉल में कई सरल लेकिन महत्वपूर्ण संशोधन विकसित किए गए थे जो फॉस्फो-टायरोसिन का पता लगाने के लिए माप की विश्वसनीयता में सुधार करते थे, जिसमें एनएबीएच4 उपचार के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस में कमी और एंटीबॉडी पृथक्करण को रोकने के लिए नमूने के पोस्टफिक्सिंग शामिल थे। एंटी-पीवाई एंटीबॉडी के साथ कोलोकलाइजेशन की गणना के लिए रिसेप्टर स्थानों की पहचान करने के लिए ग्रीन चैनल मास्क का उपयोग करना सेल लाइसेट के लिए एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन से संभावित कलाकृतियों को हटाकर माप सटीकता में सुधार करता है। दो-रंग इमेजिंग का उपयोग रिसेप्टर्स फॉस्फोराइलेटेड के अंश का पता लगाने के लिए किया गया था। इस परिदृश्य में, रिसेप्टर को आनुवंशिक रूप से जीएफपी के साथ टैग किया गया था, और एंटीबॉडी को सीधे एक दूर-लाल डाई के साथ लेबल किया गया था। सिमपुल दृष्टिकोण अन्य प्रोटीन लक्ष्यों पर लागू होता है जिसके लिए इंट्रासेल्युलर प्रोटीन सहित विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। इसके अलावा, क्योंकि विकृतीकरण स्थितियों की आवश्यकता नहीं है, मल्टीसबयूनिट रिसेप्टर्स / हालांकि, विकृतीकरण को शामिल किया जा सकता है यदि ब्याज के पीटीएम प्रोटीन14 के संरचित क्षेत्रों में स्थित हैं। आखिरकार, मल्टीसाइट फॉस्फोराइलेशन पैटर्न15 को मापने के लिए व्यक्तिगत रिसेप्टर्स पर अलग-अलग फॉस्फो-टायरोसिन के एक साथ लेबलिंग को शामिल करने के लिए सिमपुल को आसानी से विस्तारित किया जा सकता है। इस तरह से पूर्ण लंबाई, बरकरार रिसेप्टर्स की पूछताछ पश्चिमी सोख्ता और फॉस्फो-मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित अन्य मानक तरीकों से प्राप्त नहीं की जा सकती है।

सिमपुल के फायदों के साथ, कुछ सीमाओं पर विचार करने की आवश्यकता है। किसी भी एंटीबॉडी-आधारित तकनीक के साथ, उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की आत्मीयता और विशिष्टता माप की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, एंटीबॉडी लेबलिंग स्थितियों को अनुकूलित करना और आदर्श रूप से सीधे लेबल वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके माध्यमिक एंटीबॉडी से बचना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सतह-बाध्य एंटीबॉडी प्लाज्मा झिल्ली और साइटोसोलिक डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत प्रोटीन को अवक्षेपित करेंगे। यह फॉस्फोराइलेशन को कम करके आंक सकता है क्योंकि साइटोसोल-स्थानीयकृत प्रोटीन बहिर्जात रूप से जोड़े गए लिगैंड के लिए सुलभ नहीं हैं। रिसेप्टर सतह के स्तर (चरण 6.2.10) को सही करने के लिए अतिरिक्त कदम उठाए जाने चाहिए। एंटी-फॉस्फोटायरोसिन एंटीबॉडी ने लाइसेट मौजूद होने के बाद कुछ गैर-विशिष्ट बंधन का प्रदर्शन किया। इस विरूपण साक्ष्य से बचने के लिए, ईजीएफआर को रिसेप्टर्स के स्थान की पहचान करने के लिए जीएफपी के साथ आनुवंशिक रूप से टैग किया गया था, जिसने हमें रिसेप्टर से एंटी-पीवाई सिग्नल को बाहर करने की अनुमति दी थी। यदि अंतर्जात प्रोटीन से पूछताछ की जानी है, तो कुल प्रोटीन एंटीबॉडी के साथ काउंटरस्टेनिंग किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए उचित सुधार के साथ मास्क छवि प्रदान कर सकता है। अंत में, जबकि सिमपुल प्रोटीन स्तर पर विषमता पर जानकारी प्रदान करता है, इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न लाइसेट हजारों कोशिकाओं से होता है, और सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता खो जाती है। हालांकि, सिंगल-सेल सिमपुल की ओर प्रगति एक प्रवाह कक्ष का उपयोग करके की गई है जिसमें एक कवरस्लिप और 10 μm अंतराल के साथ एक माइक्रोस्कोप पक्ष शामिल है; बैक्टीरिया को कवरस्लिप पर विरल रूप से चढ़ाया गया था, जबकि स्लाइड को वांछित प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया गया था। बैक्टीरिया के लसीका पर, प्रत्येक कोशिका से प्रोटीन एंटीबॉडी-लेपित स्लाइड22 पर एक सीमित क्षेत्र में कब्जा कर लिया गया था। भविष्य में स्तनधारी कोशिकाओं और प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन का समान एकल-कोशिका सिमपुल विश्लेषण संभव हो सकता है।

एसआईएमपुल प्रोटोकॉल में उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल में कवरस्लिप ग्लास की एक विस्तृत तैयारी शामिल है। पिरान्हा नक़्क़ाशी कवरलिप्स कांच को अच्छी तरह से साफ करता है और हाइड्रॉक्सिल समूहों और हाइड्रोफिलिसिटी को बढ़ाता है, जो कवरस्लिप सतह को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हैं। कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ कई धोने के बाद, केओएच उपचार अमीनोसिलनाइजेशन13,23 के लिए अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल समूह प्रदान करता है, जो खूंटी और बायोटिन-पीईजी बाध्यकारी के लिए अमाइन समूहों के साथ ग्लास को कोट करता है। इनमें से किसी भी चरण में अनुचित सफाई या कार्यात्मकता प्रोटीन पुल-डाउन में हस्तक्षेप करेगी। खूंटी के दाढ़ अनुपात का नियंत्रण: बायोटिन-पीईजी, लाइसेट एकाग्रता के साथ, सिमपुल सब्सट्रेट पर उपयुक्त प्रोटीन आईपी घनत्व प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कारक हैं। किसी भी जैविक परख के साथ, सेल लाइसेट तैयारी के बीच परिवर्तनशीलता है, और फॉस्फोराइलेशन प्रतिशत के बीच छोटे अंतर नमूना प्रतिकृतियों के बीच देखे जा सकते हैं। इसलिए, एक ही नमूने के भीतर विभिन्न टायरोसिन साइटों के फॉस्फोराइलेशन स्तर को मापना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित नमूना कक्ष एक इमेजिंग सत्र में कई डेटा बिंदुओं को इकट्ठा करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है और कई SiMPull प्रयोगों पर औसत के लिए अनुमति देता है।

छवि अधिग्रहण पक्ष पर, एक सटीक चैनल ओवरले सुनिश्चित करने के लिए फिड्यूशियल नमूना प्राप्त करना महत्वपूर्ण है; अन्यथा, कोलोकलाइजेशन सटीक नहीं होगा। सिग्नल-टू-शोर को अधिकतम करने के लिए लेजर पावर और कैमरा सेटिंग्स को अनुकूलित करना भी महत्वपूर्ण है, जबकि एक ही समय में फोटोब्लीचिंग को कम करना भी महत्वपूर्ण है। अंत में, जबकि नमूना सरणी को थोड़ी मात्रा में नमूना और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, कम मात्रा इमेजिंग सत्र के दौरान वाष्पीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होती है। समय-समय पर नमूना सरणी (~ 30-45 मिनट) की जांच करना और नमूनों को सुखाने से रोकने के लिए आवश्यकतानुसार बफर जोड़ना महत्वपूर्ण है।

वर्तमान प्रोटोकॉल ने झिल्ली रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन राज्यों को मापने के लिए सिमपुल के उपयोग का प्रदर्शन किया। ईजीएफआर पर ध्यान केंद्रित करते समय, दृष्टिकोण को अन्य सेल सतह रिसेप्टर्स और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों पर लागू किया जा सकता है, जब तक कि उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध न हों। सिमपुल के लिए एक और संभावित उपयोग चरण-पृथक कंडेनसेट की सामग्री और फॉस्फोराइलेशन स्थिति से पूछताछ करना है। इसके अलावा, सिमपुल का उपयोग अन्य पीटीएम को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि सर्वव्यापीता। इसलिए, सिमपुल कोशिका जीवविज्ञानियों के लिए बरकरार प्रोटीन पर पीटीएम से पूछताछ करने और सेलुलर परिणाम के साथ पीटीएम पैटर्न को सहसंबंधित करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 35 जीएम 126934, आर 01 एआई 153617 और डीएसएल के लिए आर 01 सीए 248166 द्वारा समर्थित किया गया था। ईएमबी को एएसआरटी-आईआरएसीडीए कार्यक्रम (एनआईएच के 12 जीएम088021) और यूएनएम मार्क कार्यक्रम (एनआईएच 2 टी 34 जीएम 008751-20) द्वारा जेएआर के माध्यम से समर्थित किया गया था। हम कृतज्ञतापूर्वक न्यू मैक्सिको व्यापक कैंसर केंद्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन विश्वविद्यालय का उपयोग करते हुए स्वीकार करते हैं, जो एनआईएच पी 30 सीए 118100 द्वारा समर्थित है। हम डॉ अंकुर जैन और ताइकिजिप हा को स्वीकार करना चाहते हैं, जिनके एसआईएमपुल के मूल विकास ने इस काम को प्रेरित किया।
ईएस-सी वर्तमान पता: इम्यूनोडायनामिक्स ग्रुप, एकीकृत कैंसर इम्यूनोलॉजी की प्रयोगशाला, कैंसर अनुसंधान केंद्र, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

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References

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जैव रसायन अंक 184
प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की मात्रा का ठहराव के लिए एक अनुकूलित एकल अणु पुल-डाउन परख
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Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

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