Summary
Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.
Abstract
Fosforylering is een noodzakelijke posttranslationele modificatie die de eiwitfunctie reguleert en de celsignaleringsresultaten stuurt. De huidige methoden om eiwitfosforylering te meten, kunnen de heterogeniteit in fosforylering tussen individuele eiwitten niet behouden. De single-molecule pull-down (SiMPull) assay werd ontwikkeld om de samenstelling van macromoleculaire complexen te onderzoeken via immunoprecipitatie van eiwitten op een glazen coverslip gevolgd door single-molecule imaging. De huidige techniek is een aanpassing van SiMPull die robuuste kwantificering biedt van de fosforyleringstoestand van membraanreceptoren over de volledige lengte op het niveau van één molecuul. Door duizenden individuele receptoren op deze manier in beeld te brengen, kunnen eiwitfosforyleringspatronen worden gekwantificeerd. Het huidige protocol beschrijft de geoptimaliseerde SiMPull-procedure, van monstervoorbereiding tot beeldvorming. Optimalisatie van glaspreparatie- en antilichaamfixatieprotocollen verbetert de gegevenskwaliteit verder. Het huidige protocol biedt code voor de single-molecule data-analyse die de fractie van receptoren berekent die in een monster worden gefosforyleerd. Hoewel dit werk zich richt op fosforylering van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR), kan het protocol worden gegeneraliseerd naar andere membraanreceptoren en cytosolische signaalmoleculen.
Introduction
Membraan-geassocieerde signalering wordt afgestemd door een combinatie van ligand-geïnduceerde membraanreceptoractivering en rekrutering van downstream accessoire-eiwitten die het signaal verspreiden. Fosforylering van belangrijke tyrosines in receptorcytoplasmatische staarten is van cruciaal belang voor het initiëren van de vorming van signaleringscomplexen, of signaalosomen 1,2. Daarom is een belangrijke vraag in de biologie hoe fosforyleringspatronen worden gecreëerd en onderhouden om signaalpartners te werven en cellulaire uitkomsten te dicteren. Dit omvat het begrijpen van de heterogeniteit van receptorfosforylering, zowel in overvloed als in de specifieke fosfotyrosinepatronen die een middel kunnen bieden om signaaluitgangen te manipuleren door de samenstelling van het signaalosoom 3,4,5,6,7 te dicteren. Er zijn echter beperkingen in de huidige methoden om eiwitfosforylering te ondervragen. Western blot-analyse is uitstekend voor het beschrijven van trends van eiwitfosforylering, maar is semikwantitatief8 en geeft geen informatie over de heterogeniteit van het systeem omdat duizenden tot miljoenen receptoren samen worden gemiddeld. Hoewel western blots het mogelijk maken om een monster te onderzoeken met behulp van fosfo-specifieke antilichamen tegen specifieke tyrosines, kunnen ze geen informatie geven over multisite fosforyleringspatronen binnen hetzelfde eiwit. Kwantitatieve fosfoproteomica rapporteren over de abundantie van fosfoyrosine, maar er zijn beperkingen aan het detecteren van multisietfosforylering, omdat de residuen van belang zich moeten bevinden in hetzelfde peptide (meestal 7-35 aminozuren) dat wordt gegenereerd door enzymatische vertering 9,10,11.
Om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen, is de single-molecule pull-down (SiMPull) assay aangepast om de fosforyleringstoestanden van intacte receptoren op het niveau van één molecuul te kwantificeren. SiMPull werd voor het eerst gedemonstreerd als een krachtig hulpmiddel voor het ondervragen van macromoleculaire complexen door Jain et al.12,13. In SiMPull werden macromoleculaire complexen immunoprecipitated (IP) op antilichaam-gefunctionaliseerde glazen coverslips en vervolgens geanalyseerd door middel van single-molecule microscopie voor eiwit subunitnummer en co-IP met complexe componenten12. Een modificatie door Kim et al.14, genaamd SiMBlot, was de eerste die een variatie van SiMPull gebruikte om fosforylering van gedenatureerde eiwitten te analyseren. Het SiMBlot-protocol is gebaseerd op het vastleggen van gebiotinyleerde celoppervlakeiwitten met behulp van NeutrAvidin-gecoate coverslips, die vervolgens worden onderzocht op fosforylering met fosfo-specifieke antilichaametikettering14. Ondanks deze vooruitgang waren verbeteringen nodig om de kwantificering van posttranslationele modificatie robuuster en toepasbaarder te maken voor een breder scala aan eiwitten.
Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde SiMPull-benadering die werd gebruikt om fosforyleringspatronen van intacte epidermale groeifactorreceptor (EGFR) te kwantificeren als reactie op een reeks ligandcondities en oncogene mutaties15. Hoewel dit werk zich richt op EGFR, kan deze aanpak worden toegepast op elke membraanreceptor en cytosolische eiwitten van belang (POI), waarvoor kwaliteitsantistoffen beschikbaar zijn. Het protocol bevat stappen om de autofluorescentie van monsters te verminderen, een ontwerp van een monsterarray dat een minimaal monstervolume vereist met gelijktijdige voorbereiding van maximaal 20 monsters, en optimalisatie van antilichaametikettering en fixatieomstandigheden. Data-analyse-algoritmen zijn ontwikkeld voor detectie en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten met één molecuul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coverslip voorbereiding
OPMERKING: Voor deze stap moet men persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) dragen, waaronder een dubbele laag nitrilhandschoenen, een veiligheidsbril of gezichtsscherm en een laboratoriumjas.
- Voer piranha-etsen uit om organisch puin van het glas te verwijderen.
LET OP: Piranha-oplossing is een sterk oxidatiemiddel dat corrosief en zeer reactief is bij contact met organische materialen. Reactie met organisch puin is exotherm en potentieel explosief. De procedure moet dus worden uitgevoerd in een chemische zuurkast met de vleugel verlaagd. Pyrex glaswerk is nodig om de piranha-oplossing te verwerken.- Bereid de werkruimte voor in een chemische zuurkast. Schik coverslips zonder overlap in de bodem van een 4 L glazen bekerglas, het "reactie" bekerglas, en plaats het reactiebeker op een kookplaat met zachte hitte. Laat het glaswerk 10 min opwarmen. Plaats een "afval" glazen bekerglas van 1 L met 500 ml ddH2O proximaal in het reactiebeker.
- Voeg 49 ml 12 N zwavelzuur (H2SO4) langzaam toe aan het reactiebekerglas met een glazen serologische pipet. Spoel de pipet in het afvalbeker voordat u het weggooit.
- Voeg druppelsgewijs 21 ml 30% waterstofperoxide (H2O2) met een glazen serologische pipet toe aan het reactiebeker. Verdeel de H2O2 druppeltjes langzaam gelijkmatig over de bodem van de reactiekolf om lokaal blussen van de piranha-etsreactie te voorkomen. Spoel de pipet in het afvalbeker voordat u het weggooit.
LET OP: Voeg altijd H2O2 toe aan de H2SO4 en nooit andersom. - Piranha ets de coverslips gedurende 30 min. Roer de inhoud van het reactiebekerstuk voorzichtig om de 5 minuten.
- Doof de piranha-oplossing door de inhoud van het afvalbeker in het reactiebeker te gieten. Breng de vloeistof langzaam over de wand van het reactiebeker om spatten te minimaliseren. Verwijder het reactiebekertje van de kookplaat.
- Wanneer de reactie is geblust en afgekoeld, giet u de piranha-oplossing terug in het afvalbekerglas voor neutralisatie zonder de geëtste coverslips van het reactiebeker te verwijderen.
- Neutraliseer de piranha-oplossing met de geleidelijke toevoeging van een zwakke basis. Gebruik bijvoorbeeld een overmatige massa 20 g natriumbicarbonaat (NaHCO3)/100 ml piranha-oplossing.
LET OP: Bewaar piranha-oplossingen niet in verzegelde afvalcontainers. De oplossing moet altijd worden geneutraliseerd voordat deze wordt verwijderd. De neutralisatiereactie produceert krachtige bellen en kan explosief zijn als het niet wordt gecontroleerd door de geleidelijke toevoeging van de zwakke basis. - Roer de geneutraliseerde oplossing met een glazen roerstaaf en laat deze 2 uur reageren. Verhoog de pH tot >4 en gooi de oplossing weg.
- Breng tussen de toevoegingen van zwakke basis aan de piranha-oplossing de geëtste coverslips van het reactiebekerstuk over in een Buchner-trechter met een glazen roerstaaf en spoel gedurende 5 minuten in lopende ddH2O.
OPMERKING: Ga onmiddellijk door naar de volgende stap of bewaar de piranha geëtste coverslips maximaal 2 weken in ddH2O in een verzegelde glazen pot of petrischaal (wikkel met afdichtingsfolie, zie Materiaaltabel).
- Bad-sonicateer de coverslips in organische oplosmiddelen volgens de onderstaande stappen.
- Doe de coverslips in een glazen Coplin-pot (zie Materiaaltafel) en dek af met methanol (CH3OH). Sluit het deksel af op de pot met afdichtingsfolie en badgeluid gedurende 10 minuten. Giet de methanol voorzichtig uit de Coplin-pot in een glazen opslagfles.
- Vul de Coplin-pot met aceton (C3H6O), sluit het deksel af en bad-soniceer gedurende 10 minuten. Giet de aceton voorzichtig uit de Coplin pot in een glazen bewaarfles.
LET OP: Methanol is brandbaar en acuut giftig. Gebruik in een chemische zuurkast. Aceton is brandbaar en irriterend. Behandel het daarom en bewaar het in glas en gebruik het in een chemische zuurkast. Verwijder als gevaarlijk afval volgens lokale voorschriften en richtlijnen.
OPMERKING: Methanol en aceton kunnen elk tot vijf keer worden hergebruikt.
- Activeer het coverslipoppervlak voor silaanfunctionalisatie.
- Bad-sonicate met 1 M kaliumhydroxide (KOH) gedurende 20 min. Giet de KOH voorzichtig uit de Coplin Jar in een conische buis van 50 ml voor hergebruik.
LET OP: KOH is corrosief en irriterend. Gebruik in een chemische zuurkast en niet bewaren in glas. Bewaar het in polypropyleen buizen. Verwijder als gevaarlijk afval volgens lokale voorschriften en richtlijnen.
OPMERKING: KOH kan tot vijf keer worden hergebruikt. - Spoel tweemaal af met ddH2O. Giet ddH2O af van de coverslips en verwarm vervolgens elke coverslip door door de vlam van een Bunsen-brander te zwaaien om al het oppervlaktevocht af te voeren. Doe de coverslips in een droge Coplin pot.
- Bad-sonicate met 1 M kaliumhydroxide (KOH) gedurende 20 min. Giet de KOH voorzichtig uit de Coplin Jar in een conische buis van 50 ml voor hergebruik.
- Voer coverslip aminosilanisatie uit.
- Bereid de aminosilaanoplossing door 69,4 ml methanol te mengen met 3,6 ml azijnzuur (CH3COOH) in een erlenmeyer. Voeg 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaan (aminosilaan) toe en meng goed (zie Materiaaltabel).
LET OP: Azijnzuur is ontvlambaar en corrosief. Handvat met glazen pipetten en bewaren in glas. Werk met azijnzuur in een chemische zuurkast. Aminosilaan is een acuut toxisch inhalatiegevaar, een sensibilisator en een irriterend middel. Het is schadelijk voor het waterleven. Gebruik in een chemische zuurkast. Gooi de chemicaliën weg als gevaarlijk afval volgens de lokale regelgeving en richtlijnen.
OPMERKING: Aminosilaan is lichtgevoelig en hydrolyseert snel in water. Alle stappen met dit reagens moeten worden uitgevoerd onder minimale lichtomstandigheden om de activiteit te behouden. Reinig de fles met stikstofgas en breng afdichtingsfolie aan voordat u deze in een donkere exsiccator bewaart. Vervang elke 6-9 maanden. - Voeg onmiddellijk de aminosilaanoplossing toe aan de Coplin-pot. Dek af en breng de afdichtingsfolie aan en blijf beschermen tegen licht.
- Incubeer de coverslips in de aminosilaanoplossing gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (RT). Bad-soniceren gedurende 1 min en dan incuberen voor nog eens 10 min. Giet de aminosilaanoplossing voorzichtig in een afvalcontainer die is aangewezen voor CH3OH met sporenaminosilaan en CH3COOH.
- Spoel de coverslips af met methanol en giet de oplossing in een afvalcontainer die bestemd is voor methanol.
- Spoel de coverslips drie keer gedurende 2 minuten elk met ddH2O. Giet de coverslips af, dep overtollig vocht weg en droog volledig aan de lucht gedurende 10 minuten.
- Bereid de aminosilaanoplossing door 69,4 ml methanol te mengen met 3,6 ml azijnzuur (CH3COOH) in een erlenmeyer. Voeg 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilaan (aminosilaan) toe en meng goed (zie Materiaaltabel).
- Voer de arrayvoorbereiding /biotine-PEG-functionalisatie van de coverslips uit.
- Bereid 1 M NaHCO3 (pH 8,5) werkmateriaal voor door 84,5 mg NaHCO3 op te lossen in 1 ml ddH2O. Verdun voor de eindconcentratie van 10 mM NaHCO3 1 M NaHCO3 tot ddH2O (1:100).
- Teken een rasterarray op de droge aminosinaire coverslips met een hydrofobe barrièrepen (zie Materiaaltabel) en wacht tot de inkt is opgedroogd. Schrijf een id op de coverslip om de juiste oriëntatie te markeren. Plaats de coverslips in een bevochtigde kamer.
OPMERKING: De array moet bestaan uit 16-20 vierkanten, ongeveer 4 mm x 4 mm groot. - Om de biotine-PEG succinimidyl valerate (biotine-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG) oplossing te maken, verwijdert u eerst mPEG en biotine-PEG (zie Materiaaltabel) uit de vriezer en balanceert u met RT. Voeg 153 mg mPEG en 3,9 mg biotine-PEG (~1:39 biotine-PEG:mPEG) toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis en resuspensie in 609 μL van 10 mM NaHCO3 door voorzichtig pipetteren. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 minuut bij RT om bellen te verwijderen.
OPMERKING: De hydrolysehalfwaardetijd van succinimidylvalraat in pH 8,5 buffer is ~ 30 min. Nadat u de buffer aan mPEG hebt toegevoegd, gaat u zo snel mogelijk verder met de volgende stappen. Deze stap is van cruciaal belang. - Breng de biotine-PEG/mPEG-oplossing aan om elk vierkant in de coverslip-arrays volledig te bedekken, meestal 10-15 μL per vierkant. Laat geen vloeistof over de gedefinieerde ruimte lopen. Bewaar de coverslips in een vochtigheidskamer in het donker gedurende 3-4 uur bij RT.
- Was de coverslips met overvloedige hoeveelheden water door ze achtereenvolgens in 3x 250 ml glazen bekers gevuld met ddH2O te dopen gedurende 10 s elk.
- Verdrijf al het vocht uit de dekzeilen met stikstofgas. Bewaar de coverslips rug-aan-rug in een met stikstof gevulde conische buis van 50 ml omwikkeld met afdichtingsfolie bij -20 °C.
OPMERKING: Ga onmiddellijk verder met stap 2 of bewaar coverslips bij -20 °C tot 1 week voor gebruik.
2. Bereiding van SiMPull lysaat
LET OP: De vereiste PBM's voor de resterende stappen van het protocol zijn nitrilhandschoenen, veiligheidsbrillen en laboratoriumjassen.
OPMERKING: De lysaten werden bereid uit de adherente CHO-cellen die EGFR-GFP tot expressie brachten. De cellen werden 's nachts12,13 in een 60 mm weefselkweek (TC60) schaal geplaatst. CHO-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% L-glutamine, 1% Penicilline-Streptomycine en 500 ng / ml geneticïne (zie materiaaltabel). Andere adherente cellijnen of suspensiecellen kunnen ook worden gebruikt.
- Plaats de cellen volgens de onderstaande stappen.
- Was de kweekschaal (met daarin de cellen) met 1 ml 1x PBS. Voeg 1 ml 1x Trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken. Breng met behulp van een pipet de losgemaakte cellen van de schotel over naar een centrifugebuis van 1,5 ml.
- Neem 10 μL trypan blue en meng met 10 μL celsuspensie in een aparte centrifugebuis. Tel cellen met 10 μL van het celmengsel in een automatische celteller, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Bord 8 x 105 cellen 's nachts in een TC60 petrischaaltje. Bord één gerecht per voorwaarde.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werden de cellen onbehandeld of behandeld met Pervanadaat en EGF zoals beschreven in stap 2.4.1.
- Bereid de volgende oplossingen voor het cellysaatpreparaat.
- Bereid ijskoud 1x PBS (pH 7,4).
- Bereid lysisbuffer voor, een oplossing van 1% niet-ionisch, niet-degenererend detergens (zie Materiaaltabel) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) en 150 mM NaCl aangevuld met Protease/Fosfataseremmer (PPI) (1:100 uit voorraad). Plaats de buis op een nutator en laat de buffer 15 min mengen. Bewaar de bereide oplossing op ijs.
- Bereid de Tyrode-buffer voor op een eindconcentratie van 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM glucose en 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA) (zie Materiaaltabel). Verwarm de oplossing tot 37 °C.
- Bereid de positieve controle voor fosforylering voor - 1 mM pervanadaatbehandeling.
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Pervandate is de geperoxideerde vorm van vanadaat- een remmer van eiwit tyrosine fosfatasen16. Het voorkomen van eiwitdefosforylering door het remmen van fosfatase-activiteit resulteert in een sterk gefosforyleerd monster.- Bereid een voorraad van 200 mM geactiveerd natriumortafonaat (Na3VO4).
- Voeg voor het bereiden van 100 ml oplossing 3,89 g Na3VO4 (zie materiaaltabel) toe aan 90 ml ddH2O en los op tijdens het roeren. Stel de pH in op 10 door HCl of NaOH druppelsgewijs toe te voegen. Als u HCl toevoegt, wordt de oplossing geel.
- Breng het volume op 100 ml met ddH2O. Kook de oplossing door deze in de magnetron te verwarmen. Na het koken zal de oplossing kleurloos zijn.
- Koel de oplossing af op RT en stel de pH opnieuw in op 10. Herhaal het koken, koelen en pH-aanpassing nog twee tot vier keer, totdat de pH stabiliseert op 10. Aliquot en bewaren bij -20 °C.
- Bereid een bouillon van 30 mM pervanadaat (PV) door 20,4 μL 3% H2O2 te mengen met 100 μL van 200 mM Na3VO4 en 546,8 μL ddH2O (equimolaire concentraties van H2O2 en geactiveerd Na3VO4). Incubeer in het donker bij RT gedurende 15 min.
- Bereid 1 mM PV in de buffer van Tyrode. Voeg voor een oplossing van 10 ml 0,33 ml 30 mM PV-voorraad toe aan 9,67 ml van de buffer van 37 °C Tyrode. Behandel cellen onmiddellijk.
- Was de cellen eenmaal met 3 ml buffer van Tyrode. Voeg 3 ml 1 mM PV toe aan de buffer van de Tyrode aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Bereid een voorraad van 200 mM geactiveerd natriumortafonaat (Na3VO4).
- Voer de ligandstimulatie uit.
- Stimuleer cellen met het ligand van belang met behulp van de juiste concentratie, tijd en temperatuur. Voor maximale EGFR-stimulatie incubeer je met 1 ml 50 nM epidermale groeifactor (EGF, zie materiaaltabel) + 1 mM PV in de buffer van Tyrode gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voer cellyse uit.
- Na de gewenste celbehandeling zet je de schaal op ijs en was je deze met ijskoude 1x PBS. Verwijder het volledige volume van PBS volledig met behulp van een pipet.
- Voeg 180 μL lysisbuffer (stap 2.2.2) toe aan de plaat. Gebruik een celschraper om buffer rond de plaat te trekken om de cellen volledig te bedekken. Oefen stevige, consistente druk uit met de celschraper over het gehele gekweekte oppervlak om de cellen volledig te lyseren.
OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer moet tot een minimum worden beperkt om een hoge eiwitconcentratie te garanderen. - Pipetteer de gelyseerde cellen en breng ze over in een buis van 1,5 ml. Houd de buis 30 min op ijs. Vortex de lysaten om de 5 min.
OPMERKING: Als de POI uit meerdere subeenheden bestaat of gevoelig is voor dissociatie, vortex de lysaten dan niet. - Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over op een nieuwe buis van 1,5 ml met behulp van een pipet. Dit bevat het totale eiwit lysaat.
- Reserveer 10 μL van het lysaat en verdun het tot 90 μL van de lysisbuffer voor bicinchoninische colorimetrische assay (BCA) analyse17. Bewaar het resterende totale eiwitlysaat bij -80 °C.
- Bepaal de totale eiwitconcentratie van lysaat met behulp van BCA-analyse (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Totale eiwitlysaten kunnen op de experimentdag worden bereid en vers worden gebruikt of gedurende maximaal 12 weken als aliquots voor eenmalig gebruik bij -80 °C worden bewaard. Niet invriezen/ontdooien.
3. Functionalisatie van de array met het gebiotinyleerde antilichaam
- Bereid de volgende oplossingen voor.
- T50 Buffer, een oplossing van 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 50 mM NaCl. De oplossing is 1 maand stabiel bij RT.
- T50-BSA door T50-buffer aan te vullen met 0,1 mg/ml BSA. Bewaar de bereide oplossing op ijs.
- 10 mg/ml natriumboorhydride (NaBH4) in 1x PBS. Bereid dit direct voor gebruik voor.
- 0,2 mg/ml NeutrAvidin (zie materiaaltabel) in T50-buffer.
LET OP: NaBH4 is een reductiemiddel en is brandbaar. Spoel de container na gebruik altijd met stikstofgas en bewaar deze in een exsiccator.
- Functionaliseer de array met het gebiotinyleerde antilichaam.
- Verwijder de PEG-biotine gefunctionaliseerde arrays uit de vriezer en breng de conische buis in evenwicht naar RT voordat u deze opent. Plaats de coverslip met de array omhoog gericht op een met afdichtingsfolie beklede 100 mm weefselkweekschaal (TC100).
OPMERKING: Minimaliseer overheadverlichting. Alle oplossingen moeten "parelen" op de vierkanten die worden gedefinieerd door de hydrofobe array. Voeg een geschikt volume oplossing toe om elk vierkant (meestal 10-15 μL) volledig te bedekken en laat de vloeistof de gedefinieerde ruimte niet overstromen. Om vloeistoffen snel te verwijderen, gebruikt u een interne vacuümleiding die aan een vacuümfles is bevestigd om afval op te vangen. Laat NaBH4 1 uur ontgassen voordat u het weggooit door de buis open te laten in de chemische zuurkast. NaBH4-behandeling is noodzakelijk om autofluorescentie op de achtergrond te verminderen, waardoor vals-positieve detecties van één molecuul worden verminderd. - Behandel elk vierkant van de array met 10 mg/ml NaBH4 in 1x PBS gedurende 4 minuten op RT. Was driemaal met PBS.
- Incubeer elk vierkant gedurende 5 minuten met 0,2 mg / ml NeutrAvidin in T50. Was drie keer met T50-BSA.
OPMERKING: NeutrAvidin bindt aan PEG-biotine en biedt een bindingsplaats voor gebiotinyleerde antilichamen 12,13,15. - Incubeer elk vierkant gedurende 10 minuten met 2 μg/ml gebiotinyleerd POI-specifiek antilichaam in T50-BSA; drie keer wassen met T50-BSA.
OPMERKING: Het huidige protocol maakt gebruik van gebiotinyleerd anti-EGFR IgG (zie Tabel van Materialen) om EGFR-GFP vast te leggen.
- Verwijder de PEG-biotine gefunctionaliseerde arrays uit de vriezer en breng de conische buis in evenwicht naar RT voordat u deze opent. Plaats de coverslip met de array omhoog gericht op een met afdichtingsfolie beklede 100 mm weefselkweekschaal (TC100).
4. SiMPull van POI van hele cellysaten
OPMERKING: Plaats de TC100-schaal met gefunctionaliseerde SiMPull-arrays op ijs voor de rest van het SiMPull-preparaat. Deze stap is het naar beneden halen van een POI uit totaal eiwitlysaat. Het lysaat mag na het ontdooien niet opnieuw worden gebruikt.
- Bereid de volgende oplossingen voor.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA)/0,1% glutaaraldehyde (GA) in 1x PBS.
LET OP: PFA en GA zijn toxische chemische fixatieven en potentiële carcinogenen. Draag PBM's. Gooi de chemicaliën weg als gevaarlijk afval volgens de lokale regelgeving en richtlijnen. - Bereid 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA)/0,1% glutaaraldehyde (GA) in 1x PBS.
- Ontdooi en meng het lysaat door voorzichtig op en neer te pipetteren. Blijf op ijs.
- Verdun 1 μL van het lysaat tot 100 μL ijskoude T50-BSA/PPI.
OPMERKING: Bepaal indien nodig de juiste verdunningsfactor van het totale eiwitlysaat door een reeks verdunningen op de array toe te passen. De optimale dichtheid van SiMPull receptoren per array gebied is 0,04-0,08/μm2. Lysaatverdunningen kunnen worden beoordeeld in stap 6 (Data-analyse). - Incubeer het lysaat op de array gedurende 10 minuten; daarna vier keer wassen met ijskoude T50-BSA/PPI.
- Verdun AF647-geconjugeerd antifosfotyrosine-antilichaam (zie materiaaltabel) in ijskoude T50-BSA/PPI en incubeer gedurende 1 uur op de array.
OPMERKING: In dit protocol wordt een pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG gebruikt om de gefosforyleerde populatie van EGFR-GFP te identificeren. Het gebruik van direct gelabelde antilichamen neemt de behoefte aan secundaire antilichamen weg, waardoor de etiketteringsopties toenemen en de consistentie van de resultaten wordt verbeterd. Fluorescerend gelabelde antilichamen kunnen worden verkregen uit commerciële bronnen. Als ze niet in de handel verkrijgbaar zijn, kunnen antilichamen op maat worden gelabeld met behulp van standaard bioconjugatietechnieken en zijn er commerciële bioconjugatiekits beschikbaar. Elke batch fluorescerend gelabelde antilichamen moet worden getest op optimale etiketteringsomstandigheden door SiMPull uit te voeren om een dosiscurve te meten en het verzadigingspunt te vinden. - Was zes keer met ijskoude T50-BSA gedurende een totaal van 6-8 min.
- Twee keer wassen met ijskoude 1x PBS.
- Incubeer de array met 4% PFA/0,1% GA-oplossing gedurende 10 minuten om dissociatie van antilichamen te voorkomen.
- Was tweemaal gedurende 5 minuten elk met 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS om de fixatiemiddelen te inactiveren.
OPMERKING: Voor experimenten met meer dan één antilichaam (bijvoorbeeld het detecteren van meerdere fosfotyrosineplaatsen), herhaalt u stap 4.5-4.9. Zie stap 6.2.9 voor informatie over het bepalen van sterische hinder tussen twee antilichamen.
5. Beeldacquisitie
OPMERKING: Beeldacquisitie met één molecuul wordt uitgevoerd met behulp van een 150x TIRF-objectief en een beeldsplitser die elk spectraal kanaal in een specifiek kwadrant van de emCCD-camera vastlegt (zie Materiaaltabel). Kalibratiebeelden worden voor het eerst verkregen om kanaalregistratie en cameraversterkingskalibratie mogelijk te maken met een nanoverhard kanaaluitlijningsraster (nanogrid) dat 20 x 20 arrays van 200 ± 50 nm-gaten bevat op een intragatafstand van 3 ± 1 μm (totale grootte ~ 60 μm × 60 μm).
- Voer kanaalregistratie uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Nauwkeurige kanaalregistratie is nodig om de colocalisatie van emitters goed te berekenen. Deze stap is van cruciaal belang.- Reinig het oliedoel en deponeer een druppel olie op het doel. Plaats het nanogrid op het podium voor beeldvorming. Gebruik doorgelaten wit licht om scherp te stellen op het rasterpatroon.
OPMERKING: Beelden met het nanogrid worden verkregen met behulp van doorgelaten licht, dat door het nanogrid gaat en in alle spectrale kanalen wordt gedetecteerd. Als alternatief kan men multifluorescente kralen gebruiken die fluorescentie uitzenden die in elk kanaal wordt gedetecteerd. Beeldacquisitie moet worden geoptimaliseerd volgens elke microscoopopstelling. - Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen van het raster. Zorg ervoor dat pixels niet verzadigd zijn. Sla de afbeeldingsreeks op als 'Fiduciaal'.
- Defocus van het nanogrid om een luchtig patroon te creëren18. Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen voor versterkingskalibraties. Sla de afbeelding op als "Gain".
- Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen voor camera-offset door te voorkomen dat al het licht naar de camera gaat. Sla de afbeelding op als "Achtergrond".
- Reinig het oliedoel en deponeer een druppel olie op het doel. Plaats het nanogrid op het podium voor beeldvorming. Gebruik doorgelaten wit licht om scherp te stellen op het rasterpatroon.
- Verkrijg SiMPull-afbeeldingen.
OPMERKING: Voordat u de coverslip-array in beeld brengt, wisselt u de Tris-oplossing in voor T50-BSA en brengt u de array in evenwicht met RT.- Reinig de oliedoelstelling en deponeer extra olie op het doel. Bevestig de coverslip array op de microscooptrap.
- Optimaliseer het excitatievermogen, de TIRF-hoek en de camera-integratietijd van elke fluorofoor. Het doel is om de hoogste signaal-naar-ruis te bereiken en tegelijkertijd de fotobleaching van het monster te minimaliseren. Noteer het laservermogen voor consistentie in toekomstige metingen.
OPMERKING: De huidige studie gebruikte 300 ms blootstellingstijd voor het verrode kanaal en 1 s voor het groene kanaal. De 642 nm laser werd gebruikt bij ongeveer 500 μW laservermogen, terwijl de 488 nm laser werd gebruikt bij 860 μW, gemeten vóór de buislens. - Verkrijg afbeeldingen voor elk voorbeeld. Stel eerst het verrode kanaal voor, gevolgd door elke fluorofoor met een lagere golflengte om fotobleaching te verminderen. Vanwege het lage volume dat voor elk monster wordt gebruikt, controleert u het bufferniveau elke 30-45 minuten en vult u het indien nodig aan.
6. Data-analyse
- Download de democodes.
OPMERKING: De meegeleverde democode en voorbeeldgegevenssets demonstreren de volledige workflow voor gegevensanalyse (aanvullende coderingsbestanden 1-4). De systeemvereisten die worden vermeld in SiMPullMain.m zijn te vinden in Aanvullend coderingsbestand 1.-
Pak uit en sla op in een persoonlijke map Documenten/MATLAB (MacOS/Linux) of Documenten\MATLAB (Windows).
OPMERKING: Dit genereert vier nieuwe mappen: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs. - Open het bestand "ReadMe_Setup.txt" in de map SiMPull_class.
- Installeer MATLAB en MATLAB Toolboxes: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox en Statistics and Machine Learning toolbox.
- Installeer DipImage19 volgens de downloadinstructies.
- Installeer "smite" single-molecule analysepakket zoals beschreven in ReadMe_setup.txt.
OPMERKING: "smite" is beschikbaar op de GitHub-repository (zie Materiaaltabel). - Open SiMPullMain.m, gevonden in SiMPull_class map, door het bestand naar het MATLAB-venster te slepen.
- Wijzig de map in ...\MATLAB\Sample Data\ door op het pictogram Bladeren naar map te klikken en de map te selecteren.
-
Pak uit en sla op in een persoonlijke map Documenten/MATLAB (MacOS/Linux) of Documenten\MATLAB (Windows).
- Overzicht van stappen in de gegevensverwerking
- Voer SiMPullMain.m uit - volg de instructies voor elke sectie. Voer elke sectie afzonderlijk uit door de cursor in die sectie te plaatsen en op het pictogram Sectie uitvoeren te klikken.
OPMERKING: De algemene stappen voor gegevensanalyse worden in deze sectie beschreven. Gedetailleerde instructies zijn te vinden in de bijbehorende SiMPullMain.m-code. - Voer het gedeelte 'Initialisatie' uit om het pad in te stellen om spectrale kanalen en beeldgrootte te definiëren.
- Voer het gedeelte 'Cameraversterking en -offset zoeken' uit om cameraversterking om te zetten naar fotonen met behulp van de gegevenssets Gain en Background.
- Voer het gedeelte 'Kanaalregistratie' uit om de lokaal gewogen gemiddelde transformatie te berekenen die wordt gebruikt voor de registratie van afbeeldingen.
- Formatteer en beheer de gegevens. Voer de sectie 'Voeg opeenvolgende kanalen toe aan een quad-afbeelding' uit. Voer "Verwijder slechte frames" uit.
- Voer de sectie "Fit Single Molecules and Find Overlapping Molecules" uit.
OPMERKING: Deze sectie voert meerdere functies uit om afzonderlijke moleculen in elk kanaal te lokaliseren en colocalisatiegebeurtenissen tussen spectrale kanalen te bepalen. - Om het minimale aantal fotonen per echte GFP-fit te bepalen, voert u de "Optimize Minimum Photon Threshold" uit. Dit is een iteratief proces.
- Stel eerst smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] en voer de sectie uit. Selecteer "Lege gegevens" -bestanden wanneer daarom wordt gevraagd. Herhaal dit met de bestanden "CHO-EGFR-GFP".
- Selecteer een geschikte minimumdrempelwaarde door de twee histogrammen te vergelijken. Stel smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] en voer de sectie opnieuw uit.
- Voer de sectie 'Percentage GFP-past positief voor FR-signaal berekenen' uit om achtergrondlokalisaties te corrigeren en eindwaarden te berekenen.
- Voer optie 1 (stap 6.2.10) of optie 2 (stap 6.2.11) uit volgens de experimentele behoefte.
- Optie 1: Corrigeer voor het aantal receptoren dat beschikbaar is op het plasmamembraan voor ligandbinding, zoals beschreven in referentie15.
- Ten eerste, label oppervlaktereceptoren met verzadigingsniveaus van fluorescerende NHS Ester-kleurstof (NHS-AF647, zie Tabel van materialen). Voer vervolgens een SiMPull-experiment uit om het percentage GFP-lokalisatie te bepalen dat colocaliseert met AF647.
OPMERKING: Dit geeft een schatting van de fractie receptoren die beschikbaar zijn voor NHS-etikettering en de verhouding van receptoren op het oppervlak (SR). - Pas de SR-correctie toe in de uiteindelijke berekening: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, waarbij NGFP het gecorrigeerde aantal GFP-lokalisaties is, NBG het achtergrondlokalisatienummer en NLOC het totale aantal lokalisaties.
OPMERKING: In het huidige voorbeeld wordt deze correctie niet toegepast omdat Pervanadaat membraandoorlatend16 is en daarom is de werking van fosfataseremming niet beperkt tot oppervlaktereceptoren.
- Ten eerste, label oppervlaktereceptoren met verzadigingsniveaus van fluorescerende NHS Ester-kleurstof (NHS-AF647, zie Tabel van materialen). Voer vervolgens een SiMPull-experiment uit om het percentage GFP-lokalisatie te bepalen dat colocaliseert met AF647.
- Optie 2: Houd voor multisietfosforyleringsmetingen rekening met de mogelijkheid van sterische hinder wanneer twee antilichamen worden gebruikt.
OPMERKING: Sterische belemmering kan een vermindering van het waargenomen percentage gefosforyleerde receptoren voor antilichaam 1 veroorzaken in aanwezigheid van antilichaam 2 (P12), vergeleken met alleen antilichaam 1 (P1).- Gebruik SiMPull om P1 en P12 te bepalen en de correctiefactor voor sterische hinder te berekenen, volgens eerder gepubliceerde referentie15.
- Voer SiMPullMain.m uit - volg de instructies voor elke sectie. Voer elke sectie afzonderlijk uit door de cursor in die sectie te plaatsen en op het pictogram Sectie uitvoeren te klikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een cartoon met het SiMPull-proces is weergegeven in figuur 1A. Coverslips worden gefunctionaliseerd met Behulp van NeutrAvidin als een anker voor gebiotinyleerde anti-EGFR-antilichamen om EGFR-GFP te vangen uit totale eiwitlysaten. Na het wegspoelen van ongebonden eiwit worden de gefosforyleerde receptoren gelabeld met een antifosfotyrosine (anti-PY) antilichaam15. Figuur 1B toont een afbeelding van de hydrofobe array, waarbij meerdere monsters kunnen worden voorbereid en afgebeeld op dezelfde coverslip. Een voordeel van deze monsterhouder is dat minimale monstervolumes van ~10 μL nodig zijn. De coverslip kan in beeld worden gebracht door deze direct op het microscooppodium te plaatsen. Het is echter nuttig om de coverslip te stabiliseren door een coverslip-houder te gebruiken. De coversliphouder in figuur 1B is gemaakt met behulp van een 3D-printer en de blauwdruk wordt geleverd in Aanvullend coderingsbestand 5. De autofluorescentie van de hydrofobe inkt is een nuttige gids voor het vinden van het brandpuntsvlak van het monster (figuur 1C). Een voorbeeld van een raw-afbeelding met meerdere kanalen wordt weergegeven in figuur 1D. Een overlay van de ruwe groene en verrode kanalen is weergegeven in figuur 1E.
Figuur 2 schetst de analyseworkflow en biedt representatieve gegevens. Data-acquisitie begint eerst met het verwerven van fiducials voor kanaalregistratie, die wordt gebruikt om de individuele spectrale kanaalgegevens te bedekken (figuur 2A). Bright-field beelden worden gemaakt met behulp van een nanogrid patroon dat wit licht passeert en wordt gedetecteerd in elk spectraal kanaal van de beeldsplitter (niet weergegeven). Het groene kanaal fungeert als het referentiekanaal en het verrode kanaal is het verschoven kanaal. De lokaal gewogen gemiddelde transformatie wordt berekend met behulp van de fitgeotrans20-functie in MATLAB en wordt gebruikt om verrode coördinaten in het coördinatenframe van het groene kanaal te verschuiven. Deze transformatie maakt gebruik van een tweede-orde polynoom model op elk controlepunt. Meerkanaalsgegevens van de SiMPull-array worden vervolgens verkregen. Deze workflow bestond uit een semi-geautomatiseerde acquisitie, waarbij een start-ROI werd geselecteerd voor het specifieke steekproefvierkant, en drie regio's rond dit gebied werden in beeld gebracht, zodat elke dataset de volledige quad-view afbeelding van drie onafhankelijke ROI's bevat (figuur 1D). In elk spectraal kanaal worden de kandidaat-locaties van de emitter gevonden door een verschil van Gaussisch filter op afbeeldingen toe te passen en lokale maxima te identificeren. Subregio's (vakken, figuur 2B) worden getekend rond lokale maxima en het aantal emitterfotonen wordt geschat door aan te nemen dat elke subregio slechts één emitter bevat. Subregio's met emitterkandidaten met fotonentellingen boven een minimumwaarde worden behouden voor aanpassing. Een Gaussische puntspreidingsfunctie (PSF) past bij elke emitterkandidaat binnen kleine subregio's die ruwweg rond elke emitter zijn gecentreerd. De resulterende lokalisaties worden gedrempeld op basis van hun aantal fotonen, achtergrond, Cramér-Rao ondergrens van de fitcoördinaten, PSF-variantie (d.w.z. PSF-breedte) en een p-waarde die de goedheid van de pasvorm van het PSF-model beschrijft. Voor elk spectraal kanaal wordt een Gaussisch beeld gemaakt, met een uniforme intensiteit Gaussische klodders op de coördinaten voor elke goede pasvorm (figuur 2C). Colocalisatie wordt gevisualiseerd door de Gaussische beelden van elk spectraal kanaal te overlappen met behulp van de transformatie berekend uit het fiduciale monster (figuur 2D). Het is belangrijk om de receptor fluorescerend te labelen voor identificatie, omdat er nog steeds een niet-specifieke binding is van de antifosfosforrosine-antilichamen aan het oppervlak wanneer cellysaat aanwezig is. Het EGFR-GFP (groene kanaal) wordt gebruikt om een masker van de receptorlocaties te genereren en alleen het AF647-anti-PY-signaal (verrood kanaal) binnen dat masker wordt geteld (figuur 2D). Paren binnen 1 pixel (106,7 nm pixelgrootte) worden beschouwd als gecolokaliseerd en opgeslagen in een lijst met de referentiekanaalcoördinaten. Het percentage AF647 gecolokaliseerd met GFP wordt berekend om de fractie van gefosforyleerde receptoren te bepalen (figuur 2E).
Er zijn verschillende kritieke stappen om een goede gegevenskwaliteit te garanderen. Een van die inspanningen is het incuberen van de coverslip-array met NaBH4 zoals beschreven in het protocol om autofluorescentie in het groene kanaal te doven. Deze autofluorescentie verwijst naar het niet-specifieke signaal als gevolg van mogelijke onzuiverheden op het glas, dat enkelvoudige of geconjugeerde π bindingen bevat21. Dergelijke onzuiverheden zijn mogelijk afkomstig van de aminosilaan- en PEG-reagentia die worden gebruikt in het functionalisatieproces of stof uit de lucht en hebben de neiging om te fluoresceren in het groene spectrale kanaal. Ondanks inspanningen om glas onder stikstof te houden, kunnen deze moleculen ook worden gegenereerd door oxidatie die optreedt in opslag. NaBH4 is ook gebruikt om fluorescentie van onzuiverheden op dia's en microarrays te verminderen, waaronder die met silaancoating16. Figuur 3A toont de vermindering van het aantal achtergronddetecties dat optreedt wanneer het piranha geëtste glas wordt behandeld met NaBH4. Hoewel NaBH4 de achtergrondfluorescentie drastisch vermindert, worden sommige emitters nog steeds gedetecteerd in het groene kanaal. Men kan dit corrigeren door achtergrondafbeeldingen te verkrijgen van lysaatvrije monsters (figuur 3D) en het gemiddelde aantal achtergrondlokalisaties af te trekken van de GFP-bevattende monsters. Fluorescentie van onzuiverheden werd niet gedetecteerd in het verrode kanaal. Als de receptordichtheid te hoog is, kunnen meerdere GFP-emitters worden gevonden binnen een enkele diffractie-beperkte plek (gegevens niet getoond). Met behulp van step-photobleaching om het aantal GFP's per spot te identificeren, ontdekten we dat een receptordichtheid tussen 0,04-0,08 eiwitten / μm2 voldoende afstand tussen enkele emitters bood om het potentieel van het vinden van meerdere emitters per spot12 te verwijderen. De receptordichtheid kan worden geoptimaliseerd door de hoeveelheid IP-antilichaam gebonden aan het glasoppervlak of de hoeveelheid toegevoegd lysaat te variëren. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het antilichaam dat gericht is op de POI op verzadigingsniveaus wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om een antilichaamconcentratiecurve op gefosforyleerde monsters te verkrijgen om de juiste etiketteringsomstandigheden te bepalen (figuur 3B). Daarnaast moet de fosfo-specificiteit van een antilichaam worden gevalideerd met rustmonsters en/of behandeling met eiwitspecifieke kinaseremmers (figuur 3B). Antilichamen zullen dissociëren van de receptor tijdens het beeldtijdvenster. Het behandelen van het monster met een combinatie van PFA en GA voorkwam signaalverlies (figuur 3C).
Ten slotte is het belangrijk om de parameters voor het passen van één molecuul te optimaliseren. De eerste stap voor het vinden van een doos die potentiële emitterkandidaten identificeert (figuur 2B) moet genereus zijn om veel kandidaten in staat te stellen de Gaussische fitting te ondergaan. De minimale fotondrempel voor het vinden van dozen kan dus relatief laag zijn om alle echte stralers en sommige achtergrondvlekken vast te leggen. Het is ook belangrijk om de doosgrootte en overlapvergoeding niet te klein in te stellen. Het houden van de doosgrootte binnen 5-7 pixels en het toestaan van overlap met twee pixels is ideaal voor emitters met de aanbevolen dichtheid. Na het vinden van de doos moet de minimale fotonendrempel in de passtap worden geoptimaliseerd. De parameter minimale fotonen draagt bij aan het bepalen welke Gaussiaanse gemonteerde stralers als een echte fit doorgaan. Om de juiste minimale fotondrempel voor echte GFP-pasvormen te bepalen, bevat de code een histogramplotgrafiekfunctie om de fotonen / lokalisatie in zowel achtergrond- (geen cellysaat) als GFP-bevattende (plus cellysaat) monsters (figuur 3D) te onderzoeken. Deze stap is belangrijk omdat, hoewel NaBH4 de hoeveelheid fluorescentie van onzuiverheden vermindert, het niet alle achtergrondlokalisaties verwijdert. Figuur 3D toont de noodzaak aan om een minimale fotonendrempel in te stellen om het aantal detecties van onzuiverheden te verminderen. Om deze drempel te bepalen, wordt een histogram van achtergrondtransmissie-intensiteiten berekend op basis van het afbeelden van een monster dat niet wordt blootgesteld aan cellysaat (figuur 3D, linksboven). De meerderheid van de achtergronduitstoters bleek waarden te hebben van minder dan 475 fotonen. Ter vergelijking: de steekproef met echte GFP-emitters vertoonde een aanzienlijk deel van de verdeling boven 475 (figuur 3D, rechtsboven). De drempel wordt door inspectie gekozen om zoveel mogelijk achtergrondtellingen te verwijderen en tegelijkertijd de hoeveelheid signaalverlies van het lysaatmonster te minimaliseren (figuur 3D, onderste rij). De resterende achtergrondtellingsdichtheid bij deze drempel wordt in de kwantitatieve analyse meegenomen.
Figuur 1: Overzicht van de monstervoorbereiding. (A) Cartoon met de SiMPull-benadering. Coverslips worden gefunctionaliseerd met een antilichaam dat de POI herkent om die POI van hele cellysaten te vangen. Het glas wordt eerst gecoat met PEG en biotine-PEG. NeutrAvidin wordt dan gebonden aan de biotine-PEG en fungeert als een anker voor het gebiotinyleerde anti-POI-antilichaam. Gefosforyleerde eiwitten worden vervolgens gedetecteerd met een fluorescerend gelabeld anti-PY-antilichaam. (B) Foto van de coversliphouder (rood) met coverslip array op zijn plaats en gemonteerd op de microscooptrap. De multisample arrays worden gegenereerd met behulp van hydrofobe inkt om tot 20 individuele monstervierkanten op een enkele glazen coverslip te creëren. De coverslip is 60 mm x 24 mm. (C) Voorbeeldbeelden van de hydrofobe inktautofluorescentie (magenta) en fluorescerende kralen (groen). De autofluorescentie van de hydrofobe inkt is een handige gids om het brandpuntsvlak op het oppervlak van de coverslip te vinden. (D) Voorbeeld van een onbewerkte gegevensafbeelding met spectrale kanalen die op de camerachip worden gescheiden door de Quad-view beeldsplitter. De Quad-view filterset bevat de volgende emissiefilters: blauw (445/45 nm), groen (525/45 nm), rood (600/37 nm), verrood (685/40 nm). (E) Ruwe overlay van groene en verrode kanalen. Het witte vak geeft het gebied aan dat verder is onderzocht in figuur 2B-D. Schaalbalk (C-E) = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Workflow voor gegevensanalyse. (A) Kanaalregistratie wordt eerst uitgevoerd op afbeeldingen die zijn verkregen van het nanogrid. Na het bijsnijden van de twee spectrale kanalen van belang (hier, groen en verrood), worden de fiduciale beelden voor elk kanaal over elkaar gelegd (links). Vergroting van het vak in de linker afbeelding (Inzet) laat zien dat de afbeeldingen nog niet echt geregistreerd zijn. De emitters in elk kanaal passen in een Gaussisch model en zijn gelokaliseerd (Registratie). Lokalisatie van emitters wordt weergegeven als cirkels voor het verrode kanaal en kruisen voor het groene kanaal. De laatste stap is het toepassen van een lokaal gewogen gemiddelde transformatie om de ver-rode kanaallokalisatiecoördinaten te verschuiven naar het groene kanaalreferentiekader (uitgelijnd). De berekende lokaal gewogen gemiddelde transformatie wordt vervolgens gebruikt om de volgende SiMPull-gegevens te registreren. (B) Representatieve beelden van het groene/EGFR-GFP-kanaal en het verrode/AF647-anti-PY-kanaal. Enkele stralers boven het aantal achtergrondfotonen worden geïdentificeerd en gemarkeerd met dozen. (C) Het emissieprofiel in elk geselecteerd vak is geschikt voor een Gaussisch model en de emitters die passen in het model van een enkele fluorofoor PSF worden bewaard. (D) Een masker wordt gemaakt van de GFP-emitters om de locatie van EGFR-GFP (groen) te identificeren. Colocalisatie van EGFR-GFP en AF647-anti-PY identificeert gefosforyleerde receptoren (wit). (E) De fractie van gefosforyleerde receptoren wordt berekend uit de gecolokaliseerde EGFR-GFP en AF647-anti-PY fits. Het staafdiagram vergelijkt PV + EGF-behandeling met rustende cellen, gemiddeld voor meerdere metingen. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten die zijn berekend vanuit een binomiale verdeling. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kritische stappen om de gegevenskwaliteit te waarborgen. (A) Van links naar rechts zijn de eerste drie panelen representatieve beelden van de autofluorescentie op glas onder de respectieve omstandigheden: na piranha-etsen, met PEG, en PEG plus NaBH4-behandeling (aangegeven met +). Bovendien blijft de oppervlaktefunctionalisatie behouden na nabh4-behandeling , zoals aangetoond door minimale niet-specifieke PY99-AF647-binding met behoud van robuuste binding van EGFR-GFP van het lysaat. B) Voor elke partij antilichamen die wordt gebruikt, moet een verzadigingscurve worden verkregen om een optimale etikettering van antilichamen te garanderen. Deze figuur toont de concentratiecurve voor het labelen van EGFR met het plaatsspecifieke fosfototyrosine-antilichaam, anti-EGFR-pY1173. Minimale fosforylering wordt gedetecteerd in onbehandelde cellen (rustende, grijze diamant). Als controle op niet-specifieke binding werden cellen ook behandeld met de EGFR-kinaseremmer Lapatinib, voordat 100 nM EGF (magentadriehoek) werd toegevoegd, wat de verwachte preventie van EGFR-fosforylering aantoont. Foutbalken vertegenwoordigen een standaardfout die uitgaat van een binomiale verdeling. (C) Fixatie van het monster met een combinatie van PFA en GA voorkomt dissociatie van antilichamen in de loop van de tijd. Foutbalken vertegenwoordigen een standaardfout die uitgaat van een binomiale verdeling. (D) Valse positieven worden uitgesloten door de juiste drempel voor Gaussische aanpassing te selecteren. Door het histogram van fitintensiteiten op een lage drempel (Threshold = 0; boven) tussen achtergrond (geen lysaat) en echte gegevens (plus cellysaat) te vergelijken, kan de juiste waarde worden geselecteerd (Threshold = 475; onder) om pasvormen te verwijderen van autofluorescente plekken in het groene kanaal. De verticale magentalijn geeft een drempel van 475 fotonen aan. Histogrammen worden berekend op basis van hetzelfde aantal ROI's voor elk monstertype (n = 3). Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend coderingsbestand 1: zip-bestand met scripts en hulpprogramma's voor het uitvoeren van SiMPull-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplementary Coding File 2: zip-bestand met het smite single-molecule analysepakket. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 3: zip-bestand met de voorbeeldgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 4: zip-bestand met representatieve voorbeeldgegevensanalyse-uitvoer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 5: Coverslip houder blauwdruk voor 3D printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd om kwantitatieve metingen van receptorfosforylering op het niveau van één eiwit mogelijk te maken. Verschillende eenvoudige maar belangrijke wijzigingen in het SiMPull-protocol werden ontwikkeld die de betrouwbaarheid van de meting voor fosfo-tyrosinedetectie verbeterden, waaronder vermindering van autofluorescentie met NaBH4-behandeling en postfixatie van het monster om antilichaamdissociatie te voorkomen. Het gebruik van het groene kanaalmasker om receptorlocaties te identificeren voor de berekening van colocalisatie met het anti-PY-antilichaam verbetert ook de meetnauwkeurigheid door potentiële artefacten te verwijderen uit de niet-specifieke binding van het antilichaam aan het cellysaat. De tweekleurenbeeldvorming werd gebruikt om de fractie van gefosforyleerde receptoren te detecteren. In dit scenario werd de receptor genetisch gelabeld met GFP en werd het antilichaam direct gelabeld met een verrode kleurstof. De SiMPull-benadering is van toepassing op andere eiwitdoelen waarvoor specifieke antilichamen beschikbaar zijn, waaronder intracellulaire eiwitten. Omdat denatureringsvoorwaarden niet nodig zijn, kunnen bovendien multisubunitreceptoren/-complexen worden opgevangen. Denaturatie kan echter worden opgenomen als de PTM's van belang zich in gestructureerde regio's van het eiwit bevinden14. Uiteindelijk kan SiMPull gemakkelijk worden uitgebreid met gelijktijdige etikettering van verschillende fosfo-tyrosines op individuele receptoren om multisietfosforyleringspatronen te kwantificeren15. Het op een dergelijke manier ondervragen van intacte receptoren over de volledige lengte kan niet worden bereikt met andere standaardmethoden, waaronder western blotting en fosfo-massaspectrometrie.
Samen met de voordelen van SiMPull, moeten enkele beperkingen worden overwogen. Zoals bij elke op antilichamen gebaseerde techniek, zijn de affiniteit en specificiteit van de gebruikte antilichamen van cruciaal belang voor het succes van de meting. Daarom is het belangrijk om de etikettering van antilichamen te optimaliseren en idealiter secundaire antilichamen te vermijden door direct gelabelde primaire antilichamen te gebruiken. Bovendien zullen de oppervlaktegebonden antilichamen eiwitten neerslaan die gelokaliseerd zijn in het plasmamembraan en in cytosolische compartimenten. Dit kan fosforylering onderschatten, omdat cytosol-gelokaliseerde eiwitten niet toegankelijk zijn voor het exogene toegevoegde ligand. Er moeten extra stappen worden ondernomen om de receptoroppervlakniveaus te corrigeren (stap 6.2.10). De antifosfotyrosine-antilichamen vertoonden enige niet-specifieke binding zodra lysaat aanwezig was. Om dit artefact te voorkomen, werd de EGFR genetisch getagd met GFP om de locatie van receptoren te identificeren, waardoor we het anti-PY-signaal van de receptor konden uitsluiten. Als endogene eiwitten moeten worden ondervraagd, kan counterstaining met een totaal eiwitantilichaam het maskerbeeld opleveren, met passende correctie voor elke niet-specifieke binding. Ten slotte, terwijl SiMPull informatie biedt over heterogeniteit op eiwitniveau, is het lysaat dat in dit protocol wordt gegenereerd afkomstig van duizenden cellen en gaat de variabiliteit van cel tot cel verloren. Er is echter vooruitgang geboekt in de richting van eencellige SiMPull met behulp van een stroomkamer bestaande uit een coverslip en een microscoopzijde met een opening van 10 μm; bacteriën werden spaarzaam op de coverslip geplaatst, terwijl de dia werd gefunctionaliseerd met antilichamen om de gewenste eiwitten te vangen. Bij lysis van de bacteriën werden de eiwitten van elke cel gevangen in een beperkt gebied op de met antilichamen gecoate dia22. Soortgelijke eencellige SiMPull-analyse van zoogdiercellen en eiwitfosforylering kan in de toekomst mogelijk zijn.
Het SiMPull-protocol bevat verschillende kritieke stappen die nodig zijn om gegevens van hoge kwaliteit te garanderen. Het protocol bevat bijvoorbeeld een uitgebreide voorbereiding van het coverslipglas. Piranha-etsdeksels reinigen het glas grondig en verhogen hydroxylgroepen en hydrofielheid, die nodig zijn om het oppervlak van de coverslip te optimaliseren. Na verschillende wasbeurten met organische oplosmiddelen biedt KOH-behandeling extra hydroxylgroepen voor aminosilanisatie13,23, die het glas bedekt met aminegroepen voor PEG- en biotine-PEG-binding. Onjuiste reiniging of functionalisatie bij een van deze stappen zal interfereren met het naar beneden trekken van eiwitten. Controle van de molaire verhouding van PEG:biotine-PEG, samen met de lysaatconcentratie, zijn belangrijke factoren bij het verkrijgen van de juiste eiwit-IP-dichtheid op het SiMPull-substraat. Zoals bij elke biologische test, is er variabiliteit tussen cellysaatpreparaten en kunnen kleine verschillen tussen fosforyleringspercentages worden gezien tussen monsterreplicaties. Daarom is het belangrijk om de fosforyleringsniveaus van verschillende tyrosinelocaties binnen hetzelfde monster te meten. De voorbeeldkamer die in dit protocol wordt beschreven, biedt een systeem om veel gegevenspunten in één beeldverwerkingssessie te verzamelen en maakt het mogelijk om het gemiddelde te nemen over meerdere SiMPull-experimenten.
Aan de kant van de beeldacquisitie is het belangrijk om het fiduciële monster te verkrijgen om een nauwkeurige kanaaloverlay te garanderen; anders zal colocalisatie niet nauwkeurig zijn. Het is ook belangrijk om het laservermogen en de camera-instellingen te optimaliseren om signaal-naar-ruis te maximaliseren en tegelijkertijd fotobleaching te minimaliseren. Ten slotte, terwijl de monsterarray een kleine hoeveelheid monster en reagentia vereist, zijn de lage volumes gevoelig voor verdamping tijdens de beeldvormingssessie. Het is belangrijk om de monsterarray (~ 30-45 min) periodiek te controleren en indien nodig een buffer toe te voegen om te voorkomen dat monsters drogen.
Het huidige protocol demonstreerde het gebruik van SiMPull om fosforyleringstoestanden van membraanreceptoren te kwantificeren. Hoewel gericht op EGFR, kan de aanpak worden toegepast op andere celoppervlakreceptoren en intracellulaire eiwitten en eiwitcomplexen, zolang er geschikte antilichamen beschikbaar zijn. Een ander potentieel gebruik voor SiMPull is het ondervragen van de inhoud en fosforyleringsstatus van fasegescheiden condensaten. Daarnaast kan SiMPull worden gebruikt om andere PTM's te meten, zoals ubiquitinatie. Daarom biedt SiMPull een uniek hulpmiddel voor celbiologen om PTM's te ondervragen op intacte eiwitten en PTM-patronen te correleren met cellulaire uitkomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 en R01CA248166 to DSL. EMB werd ondersteund door het ASERT-IRACDA-programma (NIH K12GM088021) en JAR door het UNM MARC-programma (NIH 2T34GM008751-20). We erkennen dankbaar het gebruik van de gedeelde bron van fluorescentiemicroscopie van het University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, ondersteund door NIH P30CA118100. We willen Drs. Ankur Jain en Taekijip Ha erkennen, wiens oorspronkelijke ontwikkeling van SiMPull dit werk inspireerde.
ES-C presenteer adres: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al.
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T.
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
