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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Abstract

La fosforilación es una modificación posttraduccional necesaria que regula la función de la proteína y dirige los resultados de la señalización celular. Los métodos actuales para medir la fosforilación de proteínas no pueden preservar la heterogeneidad en la fosforilación a través de proteínas individuales. El ensayo pull-down de una sola molécula (SiMPull) se desarrolló para investigar la composición de complejos macromoleculares a través de la inmunoprecipitación de proteínas en una cubierta de vidrio seguida de imágenes de una sola molécula. La técnica actual es una adaptación de SiMPull que proporciona una cuantificación robusta del estado de fosforilación de los receptores de membrana de longitud completa a nivel de molécula única. La obtención de imágenes de miles de receptores individuales de esta manera permite cuantificar los patrones de fosforilación de proteínas. El presente protocolo detalla el procedimiento Optimizado de SiMPull, desde la preparación de la muestra hasta la obtención de imágenes. La optimización de la preparación de vidrio y los protocolos de fijación de anticuerpos mejora aún más la calidad de los datos. El protocolo actual proporciona código para el análisis de datos de una sola molécula que calcula la fracción de receptores fosforilados dentro de una muestra. Si bien este trabajo se centra en la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el protocolo puede generalizarse a otros receptores de membrana y moléculas de señalización citosólica.

Introduction

La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas 1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosforilación del receptor, tanto en abundancia como en los patrones específicos de fosfotirosina que pueden proporcionar un medio para manipular las salidas de señalización al dictar la composición del signalosoma 3,4,5,6,7. Sin embargo, existen limitaciones en los métodos actuales para interrogar la fosforilación de proteínas. El análisis de Western blot es excelente para describir las tendencias de la fosforilación de proteínas, pero essemicuantitativo 8 y no proporciona información sobre la heterogeneidad del sistema porque se promedian entre miles y millones de receptores. Si bien los western blots permiten sondear una muestra utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra tirosinas específicas, no pueden proporcionar información sobre los patrones de fosforilación multisitio dentro de la misma proteína. La fosfoproteómica cuantitativa informa sobre la abundancia de fosfotirosina, pero existen limitaciones para detectar la fosforilación multisitio, ya que los residuos de interés deben ubicarse dentro del mismo péptido (típicamente 7-35 aminoácidos) que se genera por la digestión enzimática 9,10,11.

Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de extracción de una sola molécula (SiMPull) se ha adaptado para cuantificar los estados de fosforilación de los receptores intactos a nivel de molécula única. SiMPull fue demostrado por primera vez como una poderosa herramienta para interrogar complejos macromoleculares por Jain et al.12,13. En SiMPull, los complejos macromoleculares fueron inmunoprecipitados (IP) en cubiertas de vidrio funcionalizadas por anticuerpos y luego analizados a través de microscopía de molécula única para el número de subunidades de proteínas y co-IP con componentes complejos12. Una modificación de Kim et al.14, denominada SiMBlot, fue la primera en utilizar una variación de SiMPull para analizar la fosforilación de proteínas desnaturalizadas. El protocolo SiMBlot se basa en la captura de proteínas biotiniladas de la superficie celular utilizando cápsulas recubiertas de NeutrAvidin, que luego se sondean para la fosforilación con el etiquetado de anticuerpos fosfoespecíficos14. A pesar de estos avances, se necesitaron mejoras para hacer que la cuantificación de la modificación posttraduccional fuera más robusta y aplicable a una gama más amplia de proteínas.

El presente protocolo describe un enfoque optimizado de SiMPull que se utilizó para cuantificar los patrones de fosforilación del receptor intacto del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en respuesta a una variedad de condiciones de ligando y mutaciones oncogénicas15. Si bien este trabajo se centra en EGFR, este enfoque se puede aplicar a cualquier receptor de membrana y proteínas citosólicas de interés (POI), para las cuales se dispone de anticuerpos de calidad. El protocolo incluye pasos para reducir la autofluorescencia de la muestra, un diseño de matriz de muestras que requiere un volumen mínimo de muestras con la preparación simultánea de hasta 20 muestras, y la optimización del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación. Se han desarrollado algoritmos de análisis de datos para la detección de moléculas individuales y la cuantificación de proteínas fosforiladas.

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Protocol

1. Preparación de coverslip

NOTA: Para este paso, uno necesita usar equipo de protección personal (EPP), que incluye una doble capa de guantes de nitrilo, gafas de seguridad o protector facial, y una bata de laboratorio.

  1. Realice el grabado de pirañas para eliminar los desechos orgánicos del vidrio.
    PRECAUCIÓN: La solución de piraña es un agente oxidante fuerte que es corrosivo y altamente reactivo cuando está en contacto con materiales orgánicos. La reacción con los desechos orgánicos es exotérmica y potencialmente explosiva. Por lo tanto, el procedimiento debe realizarse en una campana de humos químicos con la hoja bajada. Se requiere cristalería Pyrex para manejar la solución de piraña.
    1. Prepare el espacio de trabajo dentro de una campana de humos químicos. Coloque los cubrebocas sin superposición en la parte inferior de un vaso de precipitados de vidrio de 4 L, el vaso de precipitados de "reacción", y coloque el vaso de precipitados de reacción en una placa caliente con calor suave. Deje que la cristalería se caliente durante 10 min. Coloque un vaso de precipitados de vidrio "residuo" de 1 L con 500 mL de ddH2O proximal al vaso de precipitados de reacción.
    2. Añadir 49 ml de ácido sulfúrico 12 N (H2SO4) lentamente al vaso de precipitados de reacción con una pipeta serológica de vidrio. Enjuague la pipeta en el vaso de precipitados de desecho antes de desecharla.
    3. Añadir 21 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (H2O2) gota a gota con una pipeta serológica de vidrio al vaso de reacción. Distribuya lentamente las gotas de H2O2 uniformemente a través de la parte inferior del matraz de reacción para evitar el enfriamiento localizado de la reacción de grabado de pirañas. Enjuague la pipeta en el vaso de precipitados de desecho antes de desecharla.
      PRECAUCIÓN: Agregue siempre H2O2 en el H2SO4, y nunca al revés.
    4. Piranha graba las cubiertas durante 30 min. Agita suavemente el contenido del vaso de precipitados de reacción cada 5 min.
    5. Apague la solución de piraña vertiendo el contenido del vaso de precipitados de desecho en el vaso de precipitados de reacción. Transfiera el líquido lentamente por la pared del vaso de precipitados de reacción para minimizar las salpicaduras. Retire el vaso de precipitados de reacción de la placa caliente.
    6. Cuando la reacción se apague y se enfríe, vierta la solución de piraña de nuevo en el vaso de precipitados de desecho para su neutralización sin eliminar las cubiertas grabadas del vaso de precipitados de reacción.
    7. Neutralice la solución de piraña con la adición gradual de una base débil. Por ejemplo, use una masa excesiva de 20 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) / 100 ml de solución de piraña.
      PRECAUCIÓN: No almacene soluciones de piraña en contenedores de residuos sellados. La solución siempre debe neutralizarse antes de su eliminación. La reacción de neutralización produce burbujas vigorosas y puede ser explosiva si no se controla mediante la adición gradual de la base débil.
    8. Revuelva la solución neutralizada con una varilla de agitación de vidrio y deje que reaccione durante 2 h. Eleve el pH a >4 y deseche la solución.
    9. Entre las adiciones de base débil a la solución de piraña, transfiera las cubiertas grabadas del vaso de precipitados de reacción a un embudo Buchner con una varilla de agitación de vidrio y enjuague durante 5 minutos en funcionamiento ddH2O.
      NOTA: Continúe inmediatamente al siguiente paso o guarde los cubrehojas grabados con piraña durante un máximo de 2 semanas en ddH2O en un frasco de vidrio sellado o placa de Petri (envuelva con película de sellado, consulte la Tabla de materiales).
  2. Bastone los recubiertos en disolventes orgánicos siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque las fundas en un frasco de vidrio Coplin (ver Tabla de Materiales) y cúbralas con metanol (CH3OH). Selle la tapa al frasco con película de sellado y sonicado de baño durante 10 minutos. Vierta cuidadosamente el metanol del frasco de Coplin en una botella de almacenamiento de vidrio.
    2. Llene el frasco de Coplin con acetona (C3H6O), selle la tapa y suene el baño durante 10 minutos. Vierta cuidadosamente la acetona del frasco de Coplin en una botella de almacenamiento de vidrio.
      PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y agudamente tóxico. Úselo en una campana de humos químicos. La acetona es inflamable e irritante. Por lo tanto, manipularlo y almacenarlo en vidrio, y usarlo en una campana de humos químicos. Deseche como residuo peligroso de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: El metanol y la acetona se pueden reutilizar hasta cinco veces cada uno.
  3. Active la superficie de la cubierta para la funcionalización del silano.
    1. Baño-sonicato con 1 M de hidróxido de potasio (KOH) durante 20 min. Vierta cuidadosamente el KOH fuera del frasco Coplin en un tubo cónico de 50 ml para su reutilización.
      PRECAUCIÓN: KOH es corrosivo e irritante. Úselo en una campana de humos químicos y no lo guarde en vidrio. Guárdelo en tubos de polipropileno. Deseche como residuo peligroso de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: KOH se puede reutilizar hasta cinco veces.
    2. Enjuague dos veces con ddH2O. Drene ddH2O de las fundas y luego caliente cada funda agitando la llama de un quemador Bunsen para eliminar toda la humedad de la superficie. Coloque las fundas en un frasco seco de Coplin.
  4. Realizar aminosilanización de coverslip.
    1. Preparar la solución de aminosilano mezclando 69,4 mL de metanol con 3,6 mL de ácido acético (CH3COOH) en un matraz cónico. Añadir 720 μL de N-(2-aminoetilo)-3-aminopropiltrimetoxisilano (aminosilano) y mezclar bien (ver Tabla de Materiales).
      PRECAUCIÓN: El ácido acético es inflamable y corrosivo. Manipular con pipetas de vidrio y almacenar en vidrio. Trabajar con ácido acético en una campana de humos químicos. El aminosilano es un peligro de inhalación agudamente tóxico, un sensibilizante y un irritante. Es perjudicial para la vida acuática. Úselo en una campana de humos químicos. Deseche los productos químicos como residuos peligrosos de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
      NOTA: El aminosilano es fotosensible e hidroliza rápidamente en el agua. Todos los pasos con este reactivo deben realizarse en condiciones de luz mínimas para retener la actividad. Purgue la botella con gas nitrógeno y aplique una película de sellado antes de almacenarla en un desecador oscuro. Reemplace cada 6-9 meses.
    2. Agregue inmediatamente la solución de aminosilano al frasco de Coplin. Cubra y aplique la película de sellado, continuando protegiendo de la luz.
    3. Incubar los recubiertos en la solución de aminosilano durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente (RT). Baño-sonicado durante 1 min y luego incubar durante otros 10 min. Vierta cuidadosamente la solución de aminosilano en un contenedor de residuos designado para CH3OH con trazas de aminosilano y CH3COOH.
    4. Enjuague las cubiertas con metanol y vierta la solución en un contenedor de residuos designado para metanol.
    5. Enjuague los cubrehojas tres veces durante 2 minutos cada uno con ddH2O. Escurra las fundas, elimine el exceso de humedad y seque al aire por completo durante 10 minutos.
  5. Realizar la preparación de la matriz/funcionalización biotina-PEG de las cubiertas.
    1. Preparar 1 M de NaHCO3 (pH 8,5) de material de trabajo disolviendo 84,5 mg de NaHCO3 en 1 mL de ddH2O. Para la concentración final de 10 mM NaHCO3, diluya 1 M NaHCO3 en ddH2O (1:100).
    2. Dibuje una matriz de cuadrícula en los recubiertos aminosilanizados secos con una pluma de barrera hidrofóbica (consulte la Tabla de materiales) y espere a que la tinta se seque. Escriba un identificador en el cubrehojas para marcar la orientación adecuada. Coloque las fundas en una cámara humidificada.
      NOTA: La matriz debe consistir en 16-20 cuadrados, de aproximadamente 4 mm x 4 mm de tamaño.
    3. Para hacer la solución de valerato de biotina-PEG succinimidil (biotina-PEG)/mPEG succinimidilato (mPEG), primero, retire mPEG y biotina-PEG (ver Tabla de Materiales) del congelador y equilibre a RT. Agregue 153 mg de mPEG y 3.9 mg de biotina-PEG (~1:39 biotina-PEG:mPEG) a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, y resuspenda en 609 μL de 10 mM NaHCO3 mediante pipeteo suave. Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a RT para eliminar burbujas.
      NOTA: La vida media de hidrólisis del valerato de succinimidil en el tampón de pH 8.5 es de ~ 30 min. Después de agregar el búfer a mPEG, continúe con los siguientes pasos lo más rápido posible. Este paso es crítico.
    4. Aplique la solución de biotina-PEG/mPEG para cubrir completamente cada cuadrado en las matrices de coverslip, típicamente 10-15 μL por cuadrado. No permita que el líquido desborde el espacio definido. Guarde los cubrehojas en una cámara de humedad en la oscuridad durante 3-4 h en RT.
    5. Lave los cubrehojas con grandes cantidades de agua sumergiéndolos secuencialmente en 3 vasos de precipitados de vidrio de 250 ml llenos de ddH2O durante 10 s cada uno.
    6. Expulse toda la humedad de las cubiertas con gas nitrógeno. Guarde las cubiertas consecutivas en un tubo cónico de 50 ml lleno de nitrógeno envuelto con película de sellado a -20 °C.
      NOTA: Proceda inmediatamente al paso 2 o guarde los cubrehojas a -20 °C durante un máximo de 1 semana antes de su uso.

2. Preparación de Lisado de SiMPull

PRECAUCIÓN: El EPP requerido para los pasos restantes del protocolo son guantes de nitrilo, gafas de seguridad y batas de laboratorio.

NOTA: Los lisados se prepararon a partir de las células CHO adherentes que expresan EGFR-GFP. Las células fueron chapadas en un plato de cultivo de tejidos de 60 mm (TC60) durante la noche12,13. Las células CHO se cultivaron en DMEM suplementadas con 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 500 ng/ml de genética (ver Tabla de Materiales). También se pueden utilizar otras líneas celulares adherentes o células de suspensión.

  1. Coloque las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Lave la placa de cultivo (que contiene las células) con 1 ml de 1x PBS. Añadir 1 ml de 1x tripsina e incubar durante 5 min a 37 °C para separar las células. Usando una pipeta, transfiera las células separadas del plato a un tubo centrífugo de 1.5 ml.
    2. Tome 10 μL de azul de tripano y mezcle con 10 μL de suspensión celular en un tubo de centrífuga separado. Cuente las celdas utilizando 10 μL de la mezcla de células en un contador de celdas automático, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    3. Placa 8 x 105 celdas durante la noche en una placa de Petri TC60. Plato de un plato por condición.
      NOTA: Para el presente estudio, las células no fueron tratadas o tratadas con pervanadato y EGF como se describe en el paso 2.4.1.
  2. Prepare las siguientes soluciones para la preparación del lisado celular.
    1. Preparar 1x PBS helado (pH 7.4).
    2. Preparar tampón de lisis, una solución de detergente no iónico no degenerante al 1% (ver Tabla de Materiales) en 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) y 150 mM NaCl suplementado con Inhibidor de Proteasa/Fosfatasa (IBP) (1:100 de stock). Coloque el tubo en un nutator y deje que el tampón se mezcle durante 15 minutos. Mantenga la solución preparada sobre hielo.
    3. Prepare el tampón del Tyrode para una concentración final de 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM de glucosa y 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) (ver Tabla de Materiales). Calentar la solución a 37 °C.
  3. Prepare el control positivo para la fosforilación - 1 mM de tratamiento con pervanadato.
    NOTA: Este paso es opcional. El pervandato es la forma peroxidada de vanadato, un inhibidor de la proteína tirosina fosfatasas16. La prevención de la desfosforilación de proteínas mediante la inhibición de la actividad de la fosfatasa da como resultado una muestra altamente fosforilada.
    1. Preparar un stock de 200 mM de ortovanadato de sodio activado (Na3VO4).
      1. Para preparar una solución de 100 ml, agregue 3,89 g de Na3VO4 (consulte la Tabla de materiales) a 90 ml de ddH2O y disuelva mientras se agita. Ajuste el pH a 10 agregando HCl o NaOH gota a gota. Agregar HCl volverá la solución amarilla.
      2. Lleve el volumen a 100 ml con ddH2O. Hervir la solución calentándola en el microondas. Después de hervir, la solución será incolora.
      3. Enfríe la solución a RT y reajuste el pH a 10. Repita el ajuste de ebullición, enfriamiento y pH de dos a cuatro veces más, hasta que el pH se estabilice en 10. Alícuota y conservar a -20 °C.
    2. Preparar un stock de pervanadato (PV) de 30 mM mezclando 20,4 μL de H2O2 al 3 % con 100 μL de 200 mM Na3VO4 y 546,8 μL de ddH2O (concentraciones equimolares de H2O2 y Naactivado 3VO4). Incubar en la oscuridad en RT durante 15 min.
    3. Prepare 1 mM PV en el búfer de Tyrode. Para una solución de 10 ml, agregue 0,33 ml de material fotovoltaico de 30 ml a 9,67 ml del búfer de Tyrode de 37 °C. Trate las células inmediatamente.
    4. Lave las células una vez con 3 ml del tampón de Tyrode. Añadir 3 mL de 1 mM PV en el tampón de Tyrode a las células e incubar durante 15 min a 37 °C.
  4. Realizar la estimulación del ligando.
    1. Estimular las células con el ligando de interés utilizando la concentración, el tiempo y la temperatura adecuados. Para la estimulación máxima del EGFR, incubar con 1 ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de 50 nM, ver Tabla de materiales) + 1 mM de PV en el tampón de Tyrode durante 5 min a 37 °C.
  5. Realizar lisis celular.
    1. Después del tratamiento celular deseado, coloque el plato sobre hielo y lávelo con 1x PBS helado. Retire completamente el volumen completo de PBS usando una pipeta.
    2. Añadir 180 μL de tampón de lisis (paso 2.2.2) a la placa. Use un raspador de celdas para tirar del búfer alrededor de la placa para cubrir las celdas por completo. Aplique una presión firme y constante con el raspador celular a través de toda la superficie cultivada para lisar las células por completo.
      NOTA: El volumen del tampón de lisis debe mantenerse al mínimo para garantizar una alta concentración de proteínas.
    3. Pipetear las células lisadas y transferirlas a un tubo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 30 min. Vórtice los lisados cada 5 min.
      NOTA: Si el POI consta de múltiples subunidades o es sensible a la disociación, no vórtice los lisados.
    4. Centrifugar las células lisadas a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml con una pipeta. Este contiene el lisado total de proteínas.
    5. Reservar 10 μL del lisado y diluirlo en 90 μL del tampón de lisis para el análisis colorimétrico bicinchonínico (BCA)17. Conservar el lisado total de proteínas restante a -80 °C.
    6. Determinar la concentración total de proteínas lisadas mediante análisis de BCA (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Los lisados de proteínas totales se pueden preparar el día del experimento y usarse frescos o almacenados como alícuotas de un solo uso a -80 ° C durante un máximo de 12 semanas. No congele/descongele.

3. Funcionalización de la matriz con el anticuerpo biotinilado

  1. Prepare las siguientes soluciones.
    1. T50 Buffer, una solución de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 50 mM NaCl. La solución es estable durante 1 mes en RT.
    2. T50-BSA complementando el tampón T50 con 0,1 mg/ml de BSA. Mantenga la solución preparada sobre hielo.
    3. 10 mg/ml de borohidruro de sodio (NaBH4) en 1x PBS. Prepárelo inmediatamente antes de usarlo.
    4. 0,2 mg/ml de NeutrAvidin (ver Tabla de Materiales) en tampón T50.
      PRECAUCIÓN: NaBH4 es un agente reductor y es inflamable. Siempre purgue el recipiente con gas nitrógeno después de su uso y guárdelo en un desecador.
  2. Funcionalizar la matriz con el anticuerpo biotinilado.
    1. Retire las matrices funcionalizadas de PEG-biotina del congelador y equilibre el tubo cónico a RT antes de abrirlo. Coloque el cubrehojas con la matriz orientada hacia arriba en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm (TC100) forrado con película de sellado.
      NOTA: Minimice la iluminación cenital. Todas las soluciones deben "amontonarse" en los cuadrados definidos por la matriz hidrofóbica. Agregue un volumen apropiado de solución para cubrir completamente cada cuadrado (típicamente 10-15 μL) y no permita que el líquido desborde el espacio definido. Para eliminar rápidamente los líquidos, utilice una línea de vacío interna conectada a un matraz de vacío para capturar los residuos. Deje que NaBH4 se desgasifique durante 1 h antes de desecharlo dejando el tubo abierto en la campana de humos químicos. El tratamiento con NaBH4 es necesario para reducir la autofluorescencia de fondo, reduciendo así las detecciones falsas positivas de una sola molécula.
    2. Trate cada cuadrado de la matriz con 10 mg/ml de NaBH4 en 1x PBS durante 4 min en RT. Lavar tres veces con PBS.
    3. Incubar cada cuadrado durante 5 min con 0,2 mg/ml de NeutrAvidin en T50. Lavar tres veces con T50-BSA.
      NOTA: NeutrAvidin se une a PEG-biotina y proporciona un sitio de unión para anticuerpos biotinilados 12,13,15.
    4. Incubar cada cuadrado durante 10 min con 2 μg/ml de anticuerpo biotinilado específico de POI en T50-BSA; lavar tres veces con T50-BSA.
      NOTA: El presente protocolo utiliza IgG anti-EGFR biotinilada (ver Tabla de Materiales) para capturar EGFR-GFP.

4. SiMPull de POI de lisados de células enteras

NOTA: Coloque el plato TC100 de matrices siMPull funcionalizadas sobre hielo durante el resto de la preparación de SiMPull. Este paso es la extracción de un POI a partir del lisado total de proteínas. El lisado no debe reutilizarse después de la descongelación.

  1. Prepare las siguientes soluciones.
    1. Prepare 4% de paraformaldehído (PFA)/0.1% de glutaraldehído (GA) en 1x PBS.
      PRECAUCIÓN: PFA y GA son fijadores químicos tóxicos y carcinógenos potenciales. Use EPP. Deseche los productos químicos como residuos peligrosos de acuerdo con las regulaciones y pautas locales.
    2. Preparar 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. Descongele y mezcle el lisado canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Manténgase en hielo.
  3. Diluir 1 μL del lisado en 100 μL de T50-BSA/PPI helado.
    NOTA: Si es necesario, determine el factor de dilución apropiado del lisado total de proteínas aplicando un rango de diluciones a la matriz. La densidad óptima de los receptores SiMPull por área de matriz es de 0.04-0.08/μm2. Las diluciones de lisado se pueden evaluar en el paso 6 (Análisis de datos).
  4. Incubar el lisado en la matriz durante 10 minutos; luego lavar cuatro veces con T50-BSA/PPI helado.
  5. Diluir el anticuerpo antifosfototirosina conjugado con AF647 (ver Tabla de materiales) en T50-BSA/PPI helado e incubar en la matriz durante 1 h.
    NOTA: En el presente protocolo, se utiliza una igG pan anti-pTyr (PY99)-AF647 para identificar la población fosforilada de EGFR-GFP. El uso de anticuerpos marcados directamente elimina la necesidad de anticuerpos secundarios, aumentando las opciones de etiquetado y mejorando la consistencia de los resultados. Los anticuerpos marcados fluorescentemente se pueden obtener de fuentes comerciales. Si no están disponibles comercialmente, los anticuerpos se pueden etiquetar de forma personalizada utilizando técnicas de bioconjugación estándar, y los kits de bioconjugación comerciales están disponibles. Cada lote de anticuerpos marcados fluorescentemente debe probarse para determinar las condiciones óptimas de etiquetado mediante la realización de SiMPull para medir una curva de dosis y encontrar el punto de saturación.
  6. Lavar seis veces con T50-BSA helado durante un total de 6-8 min.
  7. Lavar dos veces con 1x PBS helado.
  8. Incubar la matriz con una solución de PFA al 4%/0,1% de GA durante 10 min para evitar la disociación de anticuerpos.
  9. Lavar dos veces durante 5 min cada una con 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS para inactivar los fijadores.
    NOTA: Para experimentos que utilicen más de un anticuerpo (por ejemplo, detectar múltiples sitios de fosfotirosina), repita los pasos 4.5-4.9. Consulte el paso 6.2.9 para obtener información sobre la determinación del obstáculo estérico entre dos anticuerpos.

5. Adquisición de imágenes

NOTA: La adquisición de imágenes de una sola molécula se realiza utilizando un objetivo TIRF de 150x y un divisor de imágenes que captura cada canal espectral en un cuadrante específico de la cámara emCCD (consulte la Tabla de materiales). Las imágenes de calibración se adquieren por primera vez para permitir el registro de canales y la calibración de ganancia de la cámara con una rejilla de alineación de canales con nanopatrón (nanorred) que contiene 20 x 20 matrices de agujeros de 200 ± 50 nm a una distancia intraacusia de 3 ± 1 μm (tamaño total ~ 60 μm × 60 μm).

  1. Realice el registro del canal siguiendo los pasos a continuación.
    NOTA: Se necesita un registro preciso del canal para calcular correctamente la colocalización de los emisores. Este paso es crítico.
    1. Limpie el objetivo de aceite y deposite una gota de aceite en el objetivo. Coloque la nanorred en el escenario para obtener imágenes. Usando la luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula.
      NOTA: Las imágenes con la nanorred se adquieren utilizando luz transmitida, que pasa a través de la nanorred y se detecta en todos los canales espectrales. Alternativamente, se pueden usar cuentas multifluorescentes que emiten fluorescencia detectada en cada canal. La adquisición de imágenes deberá optimizarse de acuerdo con la configuración de cada microscopio.
    2. Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula. Asegúrese de que los píxeles no estén saturados. Guarde la serie de imágenes como "Fiducial".
    3. Desenfoque la nanorred para crear un patrón Airy18. Adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia. Guarde la imagen como "Ganancia".
    4. Adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz para que no vaya a la cámara. Guarde la imagen como "Fondo".
  2. Adquirir imágenes SiMPull.
    NOTA: Antes de crear imágenes de la matriz de coverslip, cambie la solución Tris por T50-BSA y equilibre la matriz a RT.
    1. Limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure la matriz de laca en el escenario del microscopio.
    2. Optimice la potencia de excitación de cada fluoróforo, el ángulo TIRF y el tiempo de integración de la cámara. El objetivo es lograr la mayor cantidad de señal a ruido al tiempo que se minimiza el fotoblanqueo de la muestra. Registre la potencia del láser para obtener consistencia en futuras mediciones.
      NOTA: El presente estudio utilizó un tiempo de exposición de 300 ms para el canal rojo lejano y 1 s para el canal verde. El láser de 642 nm se utilizó a una potencia láser de aproximadamente 500 μW, mientras que el láser de 488 nm se utilizó a 860 μW, medido antes de la lente del tubo.
    3. Adquirir imágenes para cada muestra. Imagine primero el canal rojo lejano, seguido de cada fluoróforo de longitud de onda inferior para reducir el fotoblanqueo. Debido al bajo volumen utilizado para cada muestra, verifique el nivel del búfer cada 30-45 minutos y reponga según sea necesario.

6. Análisis de datos

  1. Descargue los códigos de demostración.
    NOTA: El código de demostración proporcionado y los conjuntos de datos de ejemplo muestran el flujo de trabajo completo de análisis de datos (Archivos de codificación suplementarios 1-4). Los requisitos del sistema enumerados en SiMPullMain.m se encuentran en el archivo de codificación suplementaria 1.
    1. Descomprima y guarde en un directorio personal Documents/MATLAB (MacOS/Linux) o Documents\MATLAB (Windows).
      NOTA: Esto genera cuatro carpetas nuevas: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Abra el archivo "ReadMe_Setup.txt" que se encuentra en la carpeta SiMPull_class.
    3. Instale MATLAB y MATLAB Toolboxes: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox y Statistics and Machine Learning toolbox.
    4. Instale DipImage19 de acuerdo con las instrucciones de descarga.
    5. Instale el paquete de análisis de molécula única "smite" como se describe en ReadMe_setup.txt.
      NOTA: "smite" está disponible en el repositorio de GitHub (consulte la Tabla de materiales).
    6. Abra SiMPullMain.m, que se encuentra en SiMPull_class carpeta, arrastrando el archivo a la ventana de MATLAB.
    7. Cambie el directorio a ...\MATLAB\Sample Data\ haciendo clic en el icono Buscar carpeta y seleccionando la carpeta.
  2. Descripción general de los pasos del procesamiento de datos
    1. Ejecute SiMPullMain.m - siguiendo las instrucciones para cada sección. Ejecute cada sección individualmente colocando el cursor en esa sección y haciendo clic en el icono Ejecutar sección.
      NOTA: Los pasos generales para el análisis de datos se describen en esta sección. Las instrucciones detalladas se encuentran en el código SiMPullMain.m que lo acompaña.
    2. Ejecute la sección "Inicialización" para establecer la ruta para definir los canales espectrales y el tamaño de la imagen.
    3. Ejecute la sección "Buscar ganancia y desplazamiento de cámara" para convertir la ganancia de la cámara en fotones utilizando los conjuntos de datos de ganancia y fondo.
    4. Ejecute la sección "Registro de canal" para calcular la transformación media ponderada local utilizada para el registro de imágenes.
    5. Formatee y cure los datos. Ejecute la sección "Unir canales secuenciales en una imagen cuádruple". Ejecute "Eliminar marcos defectuosos".
    6. Ejecute la sección "Ajustar moléculas individuales y encontrar moléculas superpuestas".
      NOTA: Esta sección ejecuta múltiples funciones para localizar moléculas individuales en cada canal y determinar eventos de colocalización entre canales espectrales.
    7. Para determinar el recuento mínimo de fotones por ajuste verdadero de GFP, ejecute el "Optimizar umbral mínimo de fotones". Este es un proceso iterativo.
      1. Primero, establezca smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] y ejecute la sección. Seleccione los archivos "Datos en blanco" cuando se le solicite. Repita con los archivos "CHO-EGFR-GFP".
      2. Seleccione un valor umbral mínimo apropiado comparando los dos histogramas. Establecer smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] y vuelva a ejecutar la sección.
    8. Ejecute la sección "Calcular porcentaje de GFP se ajusta a positivo para la señal FR" para corregir las localizaciones en segundo plano y calcular los valores finales.
    9. Realice la opción 1 (paso 6.2.10) o la opción 2 (paso 6.2.11) según la necesidad experimental.
    10. Opción 1: Corregir el número de receptores disponibles en la membrana plasmática para la unión al ligando, como se describe en la Referencia15.
      1. Primero, etiquete los receptores de superficie con niveles saturantes de colorante fluorescente NHS Ester (NHS-AF647, consulte la Tabla de materiales). A continuación, realice un experimento SiMPull para determinar el porcentaje de localización de GFP que se colocaliza con AF647.
        NOTA: Esto proporciona una estimación de la fracción de receptores disponibles para el etiquetado NHS y la proporción de receptores en la superficie (SR).
      2. Aplique la corrección SR en el cálculo final: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, donde NGFP es el número corregido de localizaciones GFP, NBG es el número de localización de fondo y NLOC es localizaciones totales.
        NOTA: En el presente ejemplo, esta corrección no se aplica porque el pervanadato es permeable a la membrana16 y, por lo tanto, la acción de la inhibición de la fosfatasa no se limita a los receptores de superficie.
    11. Opción 2: Para mediciones de fosforilación multisitio, considere el potencial de obstáculo estérico cuando se usan dos anticuerpos.
      NOTA: El obstáculo estérico puede causar una reducción en el porcentaje observado de receptores fosforilados para el anticuerpo 1 cuando está en presencia del anticuerpo 2 (P12), en comparación con el anticuerpo 1 solo (P1).
      1. Utilice SiMPull para determinar P1 y P12 y calcular el factor de corrección para el obstáculo estérico, siguiendo la Referencia15 publicada anteriormente.

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Representative Results

Una caricatura que representa el proceso SiMPull se muestra en la Figura 1A. Los trips se funcionalizan utilizando NeutrAvidin como ancla para anticuerpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisados de proteínas totales. Después de lavar la proteína no unida, los receptores fosforilados se etiquetan con un anticuerpo antifosfototirosina (anti-PY)15. La Figura 1B muestra una imagen de la matriz hidrofóbica, donde se pueden preparar e visualizar múltiples muestras en el mismo cobertor. Una ventaja de este soporte de muestra es que se requieren volúmenes mínimos de muestra de ~ 10 μL. El coverslip se puede obtener una imagen colocándolo directamente en el escenario del microscopio. Sin embargo, es útil estabilizar el cubrehojas mediante el uso de un soporte para cubrehojas. El soporte de la cubierta que se muestra en la Figura 1B se creó utilizando una impresora 3D, y el plano se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 5. La autofluorescencia de la tinta hidrofóbica es una guía útil para encontrar el plano focal de la muestra (Figura 1C). Un ejemplo de una imagen raw multicanal se muestra en la Figura 1D. En la Figura 1E se muestra una superposición de los canales verde crudo y rojo lejano.

La figura 2 describe el flujo de trabajo de análisis y proporciona datos representativos. La adquisición de datos comienza primero con la adquisición de fiduciales para el registro de canales, que se utiliza para superponer los datos de canales espectrales individuales (Figura 2A). Las imágenes de campo brillante se toman utilizando un patrón de nanorred que pasa la luz blanca y se detecta en cada canal espectral del divisor de imágenes (no se muestra). El canal verde actúa como el canal de referencia, y el canal rojo lejano es el canal desplazado. La transformada media ponderada local se calcula utilizando la función fitgeotrans20 de MATLAB y se utiliza para desplazar las coordenadas rojas lejanas al marco de coordenadas del canal verde. Esta transformada utiliza un modelo polinómico de segundo orden en cada punto de control. A continuación, se adquieren datos multicanal de la matriz SiMPull. Este flujo de trabajo consistió en una adquisición semiautomatizada, donde se seleccionó un ROI inicial para el cuadrado de muestra específico, y se tomaron imágenes de tres regiones alrededor de esta área, de modo que cada conjunto de datos contiene la imagen completa de vista cuádruple de tres ROI independientes (Figura 1D). En cada canal espectral, las ubicaciones candidatas al emisor se encuentran aplicando una diferencia de filtro gaussiano a las imágenes e identificando máximos locales. Las subregiones (recuadros, Figura 2B) se dibujan alrededor de máximos locales, y los recuentos de fotones emisores se estiman asumiendo que cada subregión contiene solo un emisor. Las subregiones que tienen candidatos a emisores con recuentos de fotones superiores a un valor mínimo se conservan para el ajuste. Una función de dispersión de puntos gaussiana (PSF) se ajusta a cada candidato emisor dentro de pequeñas subregiones aproximadamente centradas alrededor de cada emisor. Las localizaciones resultantes se umbralizan en función de su recuento de fotones, fondo, límite inferior de Cramér-Rao de las coordenadas de ajuste, varianza de PSF (es decir, ancho de PSF) y un valor p que describe la bondad de ajuste del modelo de PSF. Se crea una imagen gaussiana para cada canal espectral, con manchas gaussianas de intensidad uniforme colocadas en las coordenadas para cada buen ajuste (Figura 2C). La colocalización se visualiza superponiendo las imágenes gaussianas de cada canal espectral utilizando la transformada calculada a partir de la muestra fiducial (Figura 2D). Es importante etiquetar fluorescentemente el receptor para su identificación, ya que todavía hay una unión inespecífica de los anticuerpos antifosfototirosina a la superficie cuando el lisado celular está presente. El EGFR-GFP (canal verde) se utiliza para generar una máscara de las ubicaciones del receptor, y solo se cuenta la señal AF647-anti-PY (canal rojo lejano) dentro de esa máscara (Figura 2D). Los pares dentro de 1 píxel (tamaño de píxel de 106,7 nm) se consideran colocalizados y guardados en una lista que contiene las coordenadas del canal de referencia. El porcentaje de AF647 colocalizado con GFP se calcula para determinar la fracción de receptores fosforilados (Figura 2E).

Hay varios pasos críticos para garantizar una buena calidad de los datos. Uno de esos esfuerzos es incubar la matriz de coverslip con NaBH4 como se describe en el protocolo para apagar la autofluorescencia en el canal verde. Esta autofluorescencia se refiere a la señal no específica debida a posibles impurezas en el vidrio, que contiene enlaces π simples o conjugados21. Tales impurezas provienen potencialmente de los reactivos de aminosilano y PEG utilizados en el proceso de funcionalización o polvo del aire, y tienden a fluorescencia en el canal espectral verde. A pesar de los esfuerzos para mantener el vidrio almacenado bajo nitrógeno, estas moléculas también pueden generarse a través de la oxidación que ocurre en el almacenamiento. NaBH4 también se ha utilizado para reducir la fluorescencia de las impurezas en portaobjetos y microarrays, incluidos aquellos con recubrimiento de silano16. La Figura 3A muestra la reducción en el número de detecciones de fondo que ocurren cuando el vidrio grabado de piraña se trata con NaBH4. Si bien NaBH4 reduce drásticamente la fluorescencia de fondo, algunos emisores aún se detectan en el canal verde. Se puede corregir esto adquiriendo imágenes de fondo de muestras sin lisado (Figura 3D) y restando el número promedio de localizaciones de fondo de las muestras que contienen GFP. No se detectó fluorescencia de impurezas en el canal rojo lejano. Si la densidad del receptor es demasiado alta, se pueden encontrar múltiples emisores de GFP dentro de un solo punto limitado por difracción (datos no mostrados). Usando el fotoblanqueo escalonado para identificar el número de GFP por punto, encontramos que una densidad de receptores entre 0.04-0.08 proteínas / μm2 proporcionó suficiente espacio entre emisores individuales para eliminar el potencial de encontrar múltiples emisores por punto12. La densidad del receptor se puede optimizar variando la cantidad de anticuerpo IP unido a la superficie del vidrio o la cantidad de lisado añadido. Es fundamental asegurarse de que el anticuerpo dirigido al POI se utiliza a niveles saturados. Se recomienda adquirir una curva de concentración de anticuerpos en muestras fosforiladas para determinar las condiciones de etiquetado apropiadas (Figura 3B). Además, la fosfoespecificidad de un anticuerpo debe validarse con muestras en reposo y/o tratamiento con inhibidores de la quinasa específicos de proteínas (Figura 3B). Los anticuerpos se disociarán del receptor durante la ventana de tiempo de la imagen. El tratamiento de la muestra con una combinación de PFA y GA evitó la pérdida de señal (Figura 3C).

Finalmente, es importante optimizar los parámetros de ajuste de una sola molécula. El primer paso de "búsqueda de caja" que identifica posibles candidatos emisores (Figura 2B) debe ser generoso para permitir que muchos candidatos se sometan al Ajuste Gaussiano. Por lo tanto, el umbral mínimo de fotones para la búsqueda de cajas puede ser relativamente bajo para capturar todos los emisores reales y algunos puntos de fondo. También es importante no establecer el tamaño de la caja y la asignación de superposición demasiado pequeña. Mantener el tamaño de la caja dentro de 5-7 píxeles y permitir la superposición de dos píxeles es ideal para emisores a la densidad recomendada. Después de encontrar la caja, el umbral mínimo de fotones en el paso de ajuste debe optimizarse. El parámetro de fotones mínimos contribuye a determinar qué emisores gaussianos ajustados pasan como un ajuste verdadero. Para determinar el umbral mínimo de fotones adecuado para los ajustes verdaderos de GFP, el código incluye una función de trazado de histograma para examinar los fotones / localización en muestras de fondo (sin lisado celular) y que contienen GFP (más lisado de células) (Figura 3D). Este paso es importante porque, si bien NaBH4 reduce la cantidad de fluorescencia de las impurezas, no elimina todas las localizaciones de fondo. La figura 3D demuestra la necesidad de establecer un umbral mínimo de fotones para reducir el número de detecciones de impurezas. Para determinar este umbral, se calcula un histograma de las intensidades del emisor de fondo a partir de imágenes de una muestra que no está expuesta al lisado celular (Figura 3D, arriba a la izquierda). Se encontró que la mayoría de los emisores de fondo tenían valores inferiores a 475 fotones. En comparación, la muestra que contenía verdaderos emisores de GFP mostró una fracción significativa de la distribución por encima de 475 (Figura 3D, arriba a la derecha). El umbral se elige mediante inspección para eliminar tantos recuentos de fondo como sea posible al tiempo que se minimiza la cantidad de pérdida de señal de la muestra de lisado (Figura 3D, fila inferior). La densidad de recuento de fondo restante en este umbral se tiene en cuenta en el análisis cuantitativo.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de la preparación de la muestra. (A) Dibujos animados que representan el enfoque siMPull. Los tripslips se funcionalizan con un anticuerpo que reconoce el POI para capturar ese POI de lisados de células enteras. El vidrio se recubre primero con PEG y biotina-PEG. NeutrAvidin se une entonces a la biotina-PEG y actúa como un ancla para el anticuerpo anti-POI biotinilado. Las proteínas fosforiladas se detectan con un anticuerpo anti-PY marcado fluorescentemente. (B) Fotografía del soporte de la cubierta (rojo) con la matriz de la cubierta en su lugar y montada en el escenario del microscopio. Las matrices multimuestra se generan utilizando tinta hidrofóbica para crear hasta 20 cuadrados de muestra individuales en una sola cubierta de vidrio. El cobertor es de 60 mm x 24 mm. (C) Imágenes de ejemplo de la autofluorescencia de tinta hidrofóbica (magenta) y perlas fluorescentes (verde). La autofluorescencia de la tinta hidrofóbica es una guía útil para encontrar el plano focal en la superficie del labio de cubierta. (D) Ejemplo de una imagen de datos en bruto con canales espectrales separados en el chip de la cámara por el divisor de imagen Quad-view. El conjunto de filtros Quad-view incluye los siguientes filtros de emisión: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), rojo (600/37 nm), rojo lejano (685/40 nm). (E) Superposición cruda de canales verdes y rojo lejano. El cuadro blanco indica la región examinada más a fondo en la Figura 2B-D. Barra de escala (C-E) = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo de análisis de datos. (A) El registro del canal se realiza primero en imágenes adquiridas de la nanorred. Después de recortar los dos canales espectrales de interés (aquí, verde y rojo lejano), las imágenes fiduciales para cada canal se superponen (izquierda). La ampliación del cuadro en la imagen de la izquierda (recuadro) muestra que las imágenes aún no están realmente registradas. Los emisores en cada canal se ajustan a un modelo gaussiano y están localizados (Registro). La localización de emisores se muestra como círculos para el canal rojo lejano y cruces para el canal verde. El paso final es aplicar una transformada media ponderada local para desplazar las coordenadas de localización del canal rojo lejano al marco de referencia del canal verde (Alineado). A continuación, se utiliza la transformada media ponderada local calculada para registrar los datos siMPull posteriores. (B) Imágenes representativas del canal verde/EGFR-GFP y del canal rojo lejano/AF647-anti-PY. Los emisores individuales por encima del recuento de fotones de fondo se identifican y marcan con cajas. (C) El perfil de emisión dentro de cada caja seleccionada se ajusta a un modelo gaussiano, y se mantienen los emisores que se ajustan al modelo de un solo fluoróforo PSF. (D) Se crea una máscara a partir de los emisores de GFP para identificar la ubicación de EGFR-GFP (verde). La colocalización de EGFR-GFP y AF647-anti-PY identifica receptores fosforilados (blancos). (E) La fracción de receptores fosforilados se calcula a partir de los ajustes colocalizados EGFR-GFP y AF647-anti-PY. El gráfico de barras compara el tratamiento PV + EGF con las células en reposo, promediado para múltiples mediciones. Las barras de error representan el error estándar calculado asumiendo una distribución binomial. Barra de escala = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Pasos críticos para garantizar la calidad de los datos. (A) De izquierda a derecha, los tres primeros paneles son imágenes representativas de la autofluorescencia en vidrio en las condiciones respectivas: después del grabado de pirañas, con PEG, y PEG más tratamiento naBH4 (indicado con +). Además, la funcionalización de la superficie se mantiene después del tratamiento con NaBH4 , como lo demuestra la unión mínima inespecífica a PY99-AF647, mientras que conserva la unión robusta de EGFR-GFP del lisado. (B) Se debe adquirir una curva de saturación para cada lote de anticuerpos utilizados para garantizar un etiquetado óptimo de anticuerpos. Esta figura muestra la curva de concentración para el etiquetado de EGFR con el anticuerpo de fosfotirosina específico del sitio, anti-EGFR-pY1173. Se detecta una fosforilación mínima en células no tratadas (en reposo, diamante gris). Como control de la unión inespecífica, las células también se trataron con el inhibidor de la quinasa EGFR, Lapatinib, antes de agregar 100 nM de EGF (triángulo magenta), lo que muestra la prevención esperada de la fosforilación de EGFR. Las barras de error representan el error estándar asumiendo una distribución binomial. (C) La fijación de la muestra con una combinación de PFA y GA evita la disociación de anticuerpos con el tiempo. Las barras de error representan el error estándar asumiendo una distribución binomial. (D) Los falsos positivos se excluyen seleccionando el umbral apropiado para el ajuste gaussiano. La comparación del histograma de intensidades de ajuste en un umbral bajo (Umbral = 0; arriba) entre el fondo (sin lisado) y los datos reales (más lisado celular) permite la selección del valor apropiado (Umbral = 475; inferior) para eliminar los ajustes de los puntos autofluorescentes en el canal verde. La línea magenta vertical indica un umbral de 475 fotones. Los histogramas se calculan a partir del mismo número de ROI para cada tipo de muestra (n = 3). Barra de escala = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación suplementario 1: archivo zip que contiene scripts y utilidades para ejecutar el análisis SiMPull. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: archivo zip que contiene el paquete de análisis de una sola molécula de smite . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 3: archivo zip que contiene los datos de muestra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 4: archivo zip que contiene resultados representativos de análisis de datos de muestra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 5: Plano del soporte de la cubierta para impresión 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El protocolo descrito aquí se optimizó para permitir mediciones cuantitativas de la fosforilación del receptor a nivel de proteína única. Se desarrollaron varias modificaciones sencillas pero importantes al protocolo SiMPull que mejoraron la confiabilidad de la medición para la detección de fosfo-tirosina, incluida la reducción de la autofluorescencia con el tratamiento con NaBH4 y la colocación posterior de la muestra para prevenir la disociación de anticuerpos. El uso de la máscara de canal verde para identificar las ubicaciones de los receptores para el cálculo de la colocalización con el anticuerpo anti-PY también mejora la precisión de la medición al eliminar los artefactos potenciales de la unión no específica del anticuerpo al lisado celular. La imagen de dos colores se utilizó para detectar la fracción de receptores fosforilados. En este escenario, el receptor fue marcado genéticamente con GFP, y el anticuerpo fue etiquetado directamente con un tinte rojo lejano. El enfoque SiMPull se aplica a otros objetivos proteicos para los que se dispone de anticuerpos específicos, incluidas las proteínas intracelulares. Además, debido a que no se requieren condiciones de desnaturalización, también se pueden capturar receptores / complejos multisubunidades. Sin embargo, la desnaturalización puede incorporarse si los PTM de interés se encuentran en regiones estructuradas de la proteína14. En última instancia, SiMPull se puede expandir fácilmente para incluir el etiquetado simultáneo de fosfo-tirosinas distintas en receptores individuales para cuantificar los patrones de fosforilación multisitio15. El interrogatorio de receptores intactos de longitud completa de tal manera no puede lograrse mediante otros métodos estándar, incluidos el western blotting y la espectrometría de masas fosfométricas.

Junto con las ventajas de SiMPull, se deben considerar algunas limitaciones. Al igual que con cualquier técnica basada en anticuerpos, la afinidad y la especificidad de los anticuerpos utilizados son fundamentales para el éxito de la medición. Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones de etiquetado de anticuerpos e idealmente evitar los anticuerpos secundarios mediante el uso de anticuerpos primarios marcados directamente. Además, los anticuerpos unidos a la superficie precipitarán proteínas localizadas en la membrana plasmática y dentro de los compartimentos citosólicos. Esto puede subestimar la fosforilación ya que las proteínas localizadas con citosol no son accesibles al ligando agregado exógenamente. Se deben tomar medidas adicionales para corregir los niveles de superficie del receptor (paso 6.2.10). Los anticuerpos antifosfototirosina exhibieron cierta unión inespecífica una vez que el lisado estuvo presente. Para evitar este artefacto, el EGFR fue etiquetado genéticamente con GFP para identificar la ubicación de los receptores, lo que nos permitió excluir la señal anti-PY del receptor. Si las proteínas endógenas van a ser interrogadas, entonces la contratinción con un anticuerpo de proteína total puede proporcionar la imagen de la máscara, con la corrección adecuada para cualquier unión no específica. Finalmente, mientras que SiMPull proporciona información sobre la heterogeneidad a nivel de proteína, el lisado generado en este protocolo es de miles de células, y se pierde la variabilidad de célula a célula. Sin embargo, los avances hacia el SiMPull unicelular se han realizado utilizando una cámara de flujo que consiste en un cubrehojas y un lado de microscopio con un espacio de 10 μm; las bacterias estaban escasamente chapadas en el cobertor mientras que el portaobjetos se funcionalizaba con anticuerpos para capturar las proteínas deseadas. Tras la lisis de la bacteria, las proteínas de cada célula fueron capturadas en un área confinada en la diapositiva 22 recubierta deanticuerpos. Un análisis similar de SiMPull unicelular de células de mamíferos y fosforilación de proteínas puede ser posible en el futuro.

El protocolo SiMPull contiene varios pasos críticos necesarios para garantizar datos de alta calidad. Por ejemplo, el protocolo incluye una preparación elaborada del vidrio de la cubierta. Piranha etching coverslips limpia a fondo el vidrio y aumenta los grupos hidroxilo y la hidrofilicidad, que son necesarios para optimizar la superficie de coverslip. Después de varios lavados con disolventes orgánicos, el tratamiento KOH proporciona grupos hidroxilo adicionales para la aminosilanización13,23, que recubre el vidrio con grupos amina para la unión PEG y biotina-PEG. La limpieza o funcionalización inadecuada en cualquiera de estos pasos interferirá con la extracción de proteínas. El control de la relación molar de PEG:biotina-PEG, junto con la concentración de lisado, son factores clave para obtener una densidad IP proteica adecuada en el sustrato de SiMPull. Al igual que con cualquier ensayo biológico, existe variabilidad entre las preparaciones de lisado celular, y se pueden observar pequeñas diferencias entre los porcentajes de fosforilación entre las réplicas de la muestra. Por lo tanto, es importante medir los niveles de fosforilación de diferentes sitios de tirosina dentro de la misma muestra. La cámara de muestra descrita en este protocolo proporciona un sistema para recopilar muchos puntos de datos en una sesión de imágenes y permite promediar múltiples experimentos siMPull.

En el lado de la adquisición de imágenes, es importante obtener la muestra fiducial para garantizar una superposición de canal precisa; de lo contrario, la colocalización no será precisa. También es importante optimizar la potencia del láser y la configuración de la cámara para maximizar la señal a ruido y, al mismo tiempo, minimizar el fotoblanqueo. Por último, mientras que la matriz de muestras requiere una pequeña cantidad de muestras y reactivos, los bajos volúmenes son susceptibles a la evaporación durante la sesión de imágenes. Es importante verificar periódicamente la matriz de muestras (~ 30-45 min) y agregar tampón según sea necesario para evitar que las muestras se sequen.

El presente protocolo demostró el uso de SiMPull para cuantificar los estados de fosforilación del receptor de membrana. Si bien se centra en EGFR, el enfoque se puede aplicar a otros receptores de la superficie celular y proteínas intracelulares y complejos de proteínas, siempre que se disponga de anticuerpos apropiados. Otro uso potencial de SiMPull es interrogar el contenido y el estado de fosforilación de los condensados separados por fases. Además, SiMPull se puede utilizar para medir otros PTM, como la ubiquitinación. Por lo tanto, SiMPull proporciona una herramienta única para que los biólogos celulares interroguen ptms en proteínas intactas y correlacionen patrones de PTM con el resultado celular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R35GM126934, R01AI153617 y R01CA248166 a DSL. EMB fue apoyado a través del programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) y JAR por el programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos el uso del recurso compartido de microscopía de fluorescencia del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Nuevo México, respaldado por NIH P30CA118100. Queremos reconocer a los Dres. Ankur Jain y Taekijip Ha, cuyo desarrollo original de SiMPull inspiró este trabajo.
ES-C presente dirección: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

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References

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Bioquímica Número 184
Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas
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Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

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