Summary
Detta protokoll beskriver provberedning och dataanalys för att kvantifiera proteinfosforylering med hjälp av en förbättrad enmolekylär pull-down (SiMPull) -analys.
Abstract
Fosforylering är en nödvändig posttranslationell modifiering som reglerar proteinfunktionen och styr cellsignaleringsresultat. Nuvarande metoder för att mäta proteinfosforylering kan inte bevara heterogeniteten i fosforylering över enskilda proteiner. Den enmolekylära pull-down (SiMPull) -analysen utvecklades för att undersöka sammansättningen av makromolekylära komplex via immunoprecipitation av proteiner på ett glasöverdrag följt av enmolekylär avbildning. Den nuvarande tekniken är en anpassning av SiMPull som ger robust kvantifiering av fosforyleringstillståndet för membranreceptorer i full längd på enmolekylnivå. Avbildning av tusentals enskilda receptorer på detta sätt möjliggör kvantifiering av proteinfosforyleringsmönster. Det nuvarande protokollet beskriver den optimerade SiMPull-proceduren, från provberedning till avbildning. Optimering av glasberedning och antikroppsfixeringsprotokoll förbättrar datakvaliteten ytterligare. Det nuvarande protokollet tillhandahåller kod för enmolekylär dataanalys som beräknar fraktionen av receptorer fosforylerade i ett prov. Medan detta arbete fokuserar på fosforylering av den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR), kan protokollet generaliseras till andra membranreceptorer och cytosoliska signalmolekyler.
Introduction
Membranassocierad signalering ställs in genom en kombination av ligandinducerad membranreceptoraktivering och rekrytering av nedströms tillbehörsproteiner som sprider signalen. Fosforylering av viktiga tyrosiner i receptorcytoplasmatiska svansar är avgörande för att initiera bildandet av signalkomplex eller signalosomer 1,2. Därför är en viktig fråga inom biologin hur fosforyleringsmönster skapas och upprätthålls för att rekrytera signalpartners och diktera cellulära resultat. Detta inkluderar att förstå heterogeniteten hos receptorfosforylering, både i överflöd och i de specifika fosfotyrosinmönstren som kan ge ett sätt att manipulera signalutgångar genom att diktera signalosomenssammansättning 3,4,5,6,7. Det finns dock begränsningar i nuvarande metoder för att förhöra proteinfosforylering. Western blot-analys är utmärkt för att beskriva trender för proteinfosforylering men är semikvantitativ8 och ger inte information om systemets heterogenitet eftersom tusentals till miljoner receptorer är i genomsnitt tillsammans. Medan western blots tillåter sondering av ett prov med fosfospecifika antikroppar mot specifika tyrosiner, kan de inte ge information om fosforyleringsmönster på flera platser inom samma protein. Kvantitativ fosfoproteomik rapporterar om fosfotyrosin överflöd, men det finns begränsningar för att detektera multisite fosforylering, eftersom resterna av intresse måste placeras inom samma peptid (vanligtvis 7-35 aminosyror) som genereras av enzymatisk matsmältning 9,10,11.
För att övervinna de begränsningar som nämns ovan har den enmolekylära pull-down (SiMPull) -analysen anpassats för att kvantifiera fosforyleringstillstånden för intakta receptorer på enmolekylnivå. SiMPull demonstrerades först som ett kraftfullt verktyg för att förhöra makromolekylära komplex av Jain et al.12,13. I SiMPull immunoprecipiterades makromolekylära komplex (IP) på antikroppsfunktionaliserade glasöverdrag och analyserades sedan genom enmolekylär mikroskopi för proteinunderenhetsnummer och co-IP med komplexa komponenter12. En modifiering av Kim et al.14, kallad SiMBlot, var den första som använde en variant av SiMPull för att analysera fosforylering av denaturerade proteiner. SiMBlot-protokollet förlitar sig på att fånga biotinylerade cellyteproteiner med neutrAvidin-belagda täckglas, som sedan undersöks för fosforylering med fosfospecifik antikroppsmärkning14. Trots dessa framsteg behövdes förbättringar för att göra kvantifieringen av posttranslationell modifiering mer robust och tillämplig på ett bredare spektrum av proteiner.
Det nuvarande protokollet beskriver en optimerad SiMPull-metod som användes för att kvantifiera fosforyleringsmönster för intakt epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) som svar på en rad ligandförhållanden och onkogena mutationer15. Även om detta arbete fokuserar på EGFR, kan detta tillvägagångssätt tillämpas på alla membranreceptorer och cytosoliska proteiner av intresse (POI), för vilka kvalitetsantikroppar finns tillgängliga. Protokollet innehåller steg för att minska provets autofluorescens, en provmatrisdesign som kräver minimal provvolym med samtidig beredning av upp till 20 prover och optimering av antikroppsmärkning och fixeringsförhållanden. Dataanalysalgoritmer har utvecklats för enmolekylsdetektion och kvantifiering av fosforylerade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av täckglas
OBS: För detta steg måste man bära personlig skyddsutrustning (PPE), som inkluderar ett dubbelt lager nitrilhandskar, skyddsglasögon eller ansiktsskydd och en labbrock.
- Utför piranha-etsning för att ta bort organiskt skräp från glaset.
VARNING: Piranha-lösningen är ett starkt oxidationsmedel som är frätande och mycket reaktivt vid kontakt med organiska material. Reaktion med organiskt skräp är exotermt och potentiellt explosivt. Således måste proceduren utföras i en kemisk rökhuv med skärmen sänkt. Pyrex glasvaror krävs för att hantera piranha-lösningen.- Förbered arbetsytan inuti en kemisk dragskåp. Ordna täckglas utan överlappning i botten av en 4 L glasbägare, "reaktionsbägaren" och placera reaktionsbägaren på en kokplatta med mild värme. Låt glasen värmas i 10 min. Placera en "avfall" 1 L glasbägare med 500 ml ddH2O proximal till reaktionsbägaren.
- Tillsätt 49 ml svavelsyra (H2S04) långsamt till reaktionsbägaren med en serologisk pipett av glas. Skölj pipetten i avfallsbägaren innan den kasseras.
- Tillsätt 21 ml 30% väteperoxid (H2O2) droppvis med en serologisk pipett av glas till reaktionsbägaren. Fördela långsamt H2O2-dropparna jämnt över reaktionskolvens botten för att förhindra lokal släckning av piranha-etsningsreaktionen. Skölj pipetten i avfallsbägaren innan den kasseras.
VARNING: Lägg alltid till H2O2 i H2SO4 och aldrig vice versa. - Piranha etsar täckglasen i 30 min. Agitera försiktigt innehållet i reaktionsbägaren var 5:e minut.
- Släck piranha-lösningen genom att hälla innehållet i avfallsbägaren i reaktionsbägaren. Överför vätskan långsamt ner på reaktionsbägarens vägg för att minimera stänk. Ta bort reaktionsbägaren från kokplattan.
- När reaktionen släcks och kyls, häll piranha-lösningen tillbaka i avfallsbägaren för neutralisering utan att ta bort de etsade täckglasen från reaktionsbägaren.
- Neutralisera piranha-lösningen med gradvis tillsats av en svag bas. Använd till exempel en överdriven massa 20 g natriumbikarbonat (NaHCO3)/100 ml piranha-lösning.
VARNING: Förvara inte piranha-lösningar i slutna avfallsbehållare. Lösningen måste alltid neutraliseras före bortskaffande. Neutraliseringsreaktionen ger kraftiga bubblor och kan vara explosiv om den inte styrs av den gradvisa tillsatsen av den svaga basen. - Rör om den neutraliserade lösningen med en glasrörstång och låt den reagera i 2 timmar. Höj pH till >4 och kassera lösningen.
- Mellan tillsatserna av svag bas till piranha-lösningen, överför de etsade täckglasen från reaktionsbägaren till en Buchner-tratt med en glasrörstång och skölj i 5 minuter i löpande ddH2O.
OBS: Fortsätt omedelbart till nästa steg eller förvara de piranha-etsade täckglasen i upp till 2 veckor i ddH2O i en förseglad glasburk eller petriskål (linda med tätningsfilm, se materialtabell).
- Bath-sonicate täckglass i organiska lösningsmedel enligt stegen nedan.
- Placera täckglasen i en Coplin-glasburk (se materialtabell) och täck med metanol (CH3OH). Försegla locket på burken med tätningsfilm och bad-ultraljud i 10 min. Häll försiktigt metanolen ur Coplin-burken i en glasförvaringsflaska.
- Fyll Coplin-burken med aceton (C3H6O), försegla locket och bad-sonikat i 10 minuter. Häll försiktigt acetonen ur Coplin-burken i en glasförvaringsflaska.
VARNING: Metanol är brandfarligt och akut giftigt. Använd i en kemisk dragskåp. Aceton är brandfarligt och irriterande. Hantera därför med och förvara den i glas och använd den i en kemisk dragskåp. Släng som farligt avfall enligt lokala föreskrifter och riktlinjer.
OBS: Metanol och aceton kan återanvändas upp till fem gånger vardera.
- Aktivera täckglasytan för silanfunktionalisering.
- Bath-sonicate med 1 M kaliumhydroxid (KOH) i 20 min. Häll försiktigt KOH ur Coplin-burken i ett 50 ml koniskt rör för återanvändning.
VARNING: KOH är frätande och irriterande. Använd i en kemisk dragskåp och förvara inte i glas. Förvara den i polypropenrör. Släng som farligt avfall enligt lokala föreskrifter och riktlinjer.
OBS: KOH kan återanvändas upp till fem gånger. - Skölj två gånger med ddH2O. Töm ddH2O från täckglasen och värm sedan varje täckglas genom att vinka genom lågan på en Bunsenbrännare för att driva bort all ytfuktighet. Lägg täckglasen i en torr Coplin-burk.
- Bath-sonicate med 1 M kaliumhydroxid (KOH) i 20 min. Häll försiktigt KOH ur Coplin-burken i ett 50 ml koniskt rör för återanvändning.
- Utför coverslip aminosilanisering.
- Bered aminosilanlösningen genom att blanda 69,4 ml metanol med 3,6 ml ättiksyra (CH3COOH) i en E-kolv. Tillsätt 720 μL N-(2-aminoetyl)-3-aminopropyltrimetoxisilan (aminosilan) och blanda väl (se materialtabell).
VARNING: Ättiksyra är brandfarligt och frätande. Hantera med glaspipetter och förvara i glas. Arbeta med ättiksyra i en kemisk dragskåpa. Aminosilan är en akut toxisk inandningsrisk, en sensibiliserande och irriterande. Det är skadligt för vattenlevande liv. Använd i en kemisk dragskåp. Kassera kemikalierna som farligt avfall enligt lokala föreskrifter och riktlinjer.
OBS: Aminosilan är ljuskänsligt och hydrolyseras snabbt i vatten. Alla steg med detta reagens måste utföras under minimala ljusförhållanden för att behålla aktiviteten. Rensa flaskan med kvävgas och applicera tätningsfilm före förvaring i en mörk exsickator. Byt ut var 6-9 månader. - Tillsätt omedelbart aminosilanlösningen till Coplin-burken. Täck och applicera tätningsfilmen och fortsätt att skydda mot ljus.
- Inkubera täckglasen i aminosilanlösningen i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur (RT). Bath-sonicate i 1 min och sedan inkubera i ytterligare 10 min. Häll försiktigt aminosilanlösningen i en avfallsbehållare avsedd förCH3OHmed spåraminosilan ochCH3COOH.
- Skölj täckglasen med metanol och häll lösningen i en avfallsbehållare avsedd för metanol.
- Skölj täckglasen tre gånger i 2 min vardera med ddH2O. Töm täckglasen, badda bort överflödig fukt och lufttorka helt i 10 min.
- Bered aminosilanlösningen genom att blanda 69,4 ml metanol med 3,6 ml ättiksyra (CH3COOH) i en E-kolv. Tillsätt 720 μL N-(2-aminoetyl)-3-aminopropyltrimetoxisilan (aminosilan) och blanda väl (se materialtabell).
- Utför arrayberedningen/biotin-PEG-funktionaliseringen av täckglasen.
- Bered 1 M NaHCO3 (pH 8,5) arbetslager genom att lösa upp 84,5 mg NaHCO3 till 1 ml ddH2O. För slutlig koncentration av 10 mM NaHCO3, späd 1 M NaHCO3 till ddH2O (1:100).
- Rita en rutnätsuppsättning på de torra aminosilaniserade täckglasen med en hydrofob barriärpenna (se materialtabell) och vänta tills bläcket torkar. Skriv en identifierare på omslagsbladet för att markera rätt orientering. Placera täckglasen i en fuktad kammare.
OBS: Matrisen ska bestå av 16-20 rutor, cirka 4 mm x 4 mm i storlek. - För att göra biotin-PEG-succinimidylvalerat (biotin-PEG) / mPEG-succinimidylvalerat (mPEG) -lösningen, ta först bort mPEG och biotin-PEG (se materialtabell) från frysen och balansera till RT. Tillsätt 153 mg mPEG och 3,9 mg biotin-PEG (~ 1:39 biotin-PEG: mPEG) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och resuspend i 609 μL 10 mM NaHCO3 genom mild pipettering. Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min vid RT för att avlägsna bubblor.
OBS: Hydrolyshalveringstiden för succinimidylvalerat i pH 8,5-buffert är ~ 30 min. När du har lagt till bufferten i mPEG fortsätter du med följande steg så snabbt som möjligt. Det här steget är avgörande. - Applicera biotin-PEG/mPEG-lösningen för att helt täcka varje kvadrat i täckglasmatriserna, vanligtvis 10-15 μL per kvadrat. Låt inte vätska rinna över det definierade utrymmet. Förvara täckglasen i en fuktkammare i mörker i 3-4 timmar vid RT.
- Tvätta täckglasen med rikliga mängder vatten genom att i följd doppa dem i 3x 250 ml glasbägare fyllda med ddH2O i 10 s vardera.
- Driv bort all fukt från täckglasen med kvävgas. Förvara täckglasen rygg mot rygg i ett kvävefyllt 50 ml koniskt rör insvept med tätningsfilm vid -20 °C.
OBS: Fortsätt omedelbart till steg 2 eller förvara överdragsglas vid -20 °C i upp till 1 vecka före användning.
2. Beredning av SiMPull-lysat
VARNING: Den nödvändiga ppe-skyddsutrustningen för de återstående stegen i protokollet är nitrilhandskar, skyddsglasögon och labbrockar.
OBS: Lysaterna framställdes från de vidhäftande CHO-cellerna som uttrycker EGFR-GFP. Cellerna pläterades i en 60 mm vävnadsodlingsskål (TC60) över natten12,13. CHO-celler odlades i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin och 500 ng / ml genetiskt inn (se materialtabell). Andra vidhäftande cellinjer eller suspensionsceller kan också användas.
- Platta cellerna enligt stegen nedan.
- Tvätta odlingsskålen (innehållande cellerna) med 1 ml 1x PBS. Tillsätt 1 ml 1x trypsin och inkubera i 5 minuter vid 37 °C för att ta bort cellerna. Använd en pipett och överför de fristående cellerna från skålen till ett 1,5 ml centrifugrör.
- Ta 10 μL trypanblått och blanda med 10 μL cellsuspension i ett separat centrifugrör. Räkna celler med 10 μl av cellblandningen i en automatisk cellräknare, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
- Platta 8 x 105 celler över natten i en TC60 petriskål. Tallrik en maträtt per tillstånd.
ANMÄRKNING: För den aktuella studien behandlades cellerna antingen eller behandlades med Pervanadat och EGF enligt beskrivningen i steg 2.4.1.
- Förbered följande lösningar för celllysatberedningen.
- Förbered iskall 1x PBS (pH 7,4).
- Förbered lysbuffert, en lösning av 1% icke-joniskt, icke-degenererande tvättmedel (se materialtabell) i 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) och 150 mM NaCl kompletterat med proteas/fosfatashämmare (PPI) (1:100 från lager). Placera röret på en mutter och låt bufferten blandas i 15 minuter. Håll den beredda lösningen på is.
- Förbered Tyrodens buffert för en slutlig koncentration av 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM glukos och 0,1% Bovint serumalbumin (BSA) (se materialtabell). Värm lösningen till 37 °C.
- Förbered den positiva kontrollen för fosforylering - 1 mM pervanadatbehandling.
OBS: Detta steg är valfritt. Pervandat är den peroxiderade formen av vanadat-en hämmare av proteintyrosinfosfataser16. Att förhindra proteindefosforylering genom att hämma fosfatasaktivitet resulterar i ett mycket fosforylerat prov.- Förbered ett 200 mM lager av aktiverat natriumortvavadat (Na3VO4).
- För att bereda 100 ml lösning, tillsätt 3,89 g Na3VO4 (se materialtabell) till 90 ml ddH2O och lös upp under omrörning. Justera pH till 10 genom att tillsätta HCl eller NaOH droppvis. Om du lägger till HCl blir lösningen gul.
- Bringa volymen till 100 ml med ddH2O. Koka lösningen genom att värma den i mikrovågsugnen. Efter kokning blir lösningen färglös.
- Kyl lösningen till RT och justera pH till 10. Upprepa kokningen, kylningen och pH-justeringen två till fyra gånger tills pH stabiliseras vid 10. Alikvotera och förvara vid -20 °C.
- Bered ett lager på 30 mM pervanadat (PV) genom att blanda 20,4 μL 3%H2O2med 100 μL 200 mM Na3VO4 och 546,8 μL ddH2O (ekvimolära koncentrationer avH2O2och aktiveratNa3VO4). Inkubera i mörkret vid RT i 15 min.
- Förbered 1 mM PV i Tyrodes buffert. För 10 ml lösning, tillsätt 0,33 ml 30 mM PV-lager till 9,67 ml 37 °C Tyrodes buffert. Behandla celler omedelbart.
- Tvätta cellerna en gång med 3 ml tyrodes buffert. Tillsätt 3 ml 1 mM PV i Tyrodes buffert till cellerna och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
- Förbered ett 200 mM lager av aktiverat natriumortvavadat (Na3VO4).
- Utför ligandstimuleringen.
- Stimulera celler med liganden av intresse med lämplig koncentration, tid och temperatur. För maximal EGFR-stimulering, inkubera med 1 ml 50 nM Epidermal tillväxtfaktor (EGF, se materialtabell) + 1 mM PV i Tyrodes buffert i 5 minuter vid 37 °C.
- Utför celllys.
- Efter önskad cellbehandling, placera skålen på is och tvätta med iskall 1x PBS. Ta bort hela volymen PBS helt med en pipett.
- Tillsätt 180 μl lysbuffert (steg 2.2.2) till plattan. Använd en cellskrapa för att dra buffert runt plattan för att täcka cellerna helt. Applicera fast, konsekvent tryck med cellskrapan över hela den odlade ytan för att lysera cellerna helt.
OBS: Volymen av lysbuffert måste hållas på ett minimum för att säkerställa en hög proteinkoncentration. - Pipettera de lyserade cellerna och överför dem till ett 1,5 ml rör. Håll tuben på is i 30 min. Virvla lysatorna var 5:e minut.
OBS: Om POI består av flera underenheter eller är känslig för dissociation, virvla inte lysaterna. - Centrifugera de lyserade cellerna vid 16 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör med en pipett. Detta innehåller det totala proteinet lysat.
- Reservera 10 μL av lysaten och späd den till 90 μl av lysbufferten för bicinchoninisk kolorimetrisk analys (BCA) analys17. Förvara den återstående totala proteinlysaten vid -80 °C.
- Bestäm den totala proteinkoncentrationen av lysat med hjälp av BCA-analys (se materialtabell).
OBS: Totalt proteinlysater kan beredas på experimentdagen och användas färska eller lagras som alikvoter för engångsbruk vid -80 °C i upp till 12 veckor. Frys/tina inte.
3. Funktionalisering av matrisen med den biotinylerade antikroppen
- Förbered följande lösningar.
- T50 Buffer, en lösning av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 50 mM NaCl. Lösningen är stabil i 1 månad på RT.
- T50-BSA genom att komplettera T50-bufferten med 0,1 mg/ml BSA. Håll den beredda lösningen på is.
- 10 mg/ml natriumborhydrid (NaBH4) i 1x PBS. Förbered detta omedelbart före användning.
- 0,2 mg/ml NeutrAvidin (se materialtabell) i T50-buffert.
VARNING: NaBH4 är ett reduktionsmedel och är brandfarligt. Rensa alltid behållaren med kvävgas efter användning och förvara den i en exsickator.
- Funktionalisera matrisen med den biotinylerade antikroppen.
- Ta bort PEG-biotinfunktionaliserade matriser från frysen och balansera det koniska röret till RT innan det öppnas. Placera täckglaset med matrisen orienterad uppåt på en tätningsfilm fodrad 100 mm vävnadsodlingsskål (TC100).
OBS: Minimera takbelysningen. Alla lösningar ska "pärla upp" på de rutor som definieras av den hydrofoba matrisen. Tillsätt en lämplig volym lösning för att helt täcka varje kvadrat (vanligtvis 10-15 μL) och låt inte vätska rinna över det definierade utrymmet. För att snabbt avlägsna vätskor, använd en intern vakuumledning fäst vid en vakuumkolv för att fånga upp avfall. Låt NaBH4 avgasas i 1 timme före bortskaffande genom att lämna röret öppet i den kemiska dragskåpet. NaBH4-behandling är nödvändig för att minska bakgrundsautofluorescensen och därigenom minska falskt positiva enmolekyldetektioner. - Behandla varje kvadrat av matrisen med 10 mg/ml NaBH4 i 1x PBS i 4 min vid RT.
- Inkubera varje kvadrat i 5 minuter med 0,2 mg/ml NeutrAvidin i T50. Tvätta tre gånger med T50-BSA.
OBS: NeutrAvidin binder till PEG-biotin och ger ett bindningsställe för biotinylerade antikroppar 12,13,15. - Inkubera varje kvadrat i 10 minuter med 2 μg/ml biotinylerad POI-specifik antikropp i T50-BSA; tvätta tre gånger med T50-BSA.
OBS: Detta protokoll använder biotinylerad anti-EGFR IgG (se materialtabell) för att fånga EGFR-GFP.
- Ta bort PEG-biotinfunktionaliserade matriser från frysen och balansera det koniska röret till RT innan det öppnas. Placera täckglaset med matrisen orienterad uppåt på en tätningsfilm fodrad 100 mm vävnadsodlingsskål (TC100).
4. SiMPull av POI från helcellslysater
OBS: Placera TC100-skålen med funktionaliserade SiMPull-matriser på is under resten av SiMPull-beredningen. Detta steg är neddragningen av en POI från totalt proteinlysat. Lysaten får inte återanvändas efter upptining.
- Förbered följande lösningar.
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA)/0,1% glutaraldehyd (GA) i 1x PBS.
VARNING: PFA och GA är giftiga kemiska fixeringsmedel och potentiella cancerframkallande ämnen. Använd personlig skyddsutrustning. Kassera kemikalierna som farligt avfall enligt lokala föreskrifter och riktlinjer. - Förbered 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA)/0,1% glutaraldehyd (GA) i 1x PBS.
- Tina och blanda lysaten genom att försiktigt pipettera upp och ner. Håll på isen.
- Späd 1 μl av lysaten till 100 μl iskall T50-BSA/PPI.
OBS: Bestäm vid behov lämplig utspädningsfaktor för det totala proteinet lysat genom att applicera ett utspädningsintervall på matrisen. Den optimala densiteten hos SiMPull-receptorer per arrayområde är 0,04-0,08 / μm2. Lysatutspädningar kan bedömas i steg 6 (Dataanalys). - Inkubera lysaten på matrisen i 10 minuter; tvätta sedan fyra gånger med iskall T50-BSA/PPI.
- Späd AF647-konjugerad antifosfotyrosinantikropp (se materialtabell) i iskall T50-BSA/PPI och inkubera på matrisen i 1 timme.
OBS: I detta protokoll används en pan anti-pTyr (PY99) -AF647 IgG för att identifiera den fosforylerade populationen av EGFR-GFP. Användningen av direkt märkta antikroppar tar bort behovet av sekundära antikroppar, ökar märkningsalternativen och förbättrar resultatens konsistens. Fluorescerande märkta antikroppar kan erhållas från kommersiella källor. Om de inte är kommersiellt tillgängliga kan antikroppar specialmärkas med hjälp av standardbiokonjugeringstekniker, och kommersiella biokonjugationssatser finns tillgängliga. Varje sats fluorescerande märkta antikroppar måste testas för optimala märkningsförhållanden genom att utföra SiMPull för att mäta en doskurva och hitta mättnadspunkten. - Tvätta sex gånger med iskall T50-BSA i totalt 6-8 min.
- Tvätta två gånger med iskall 1x PBS.
- Inkubera matrisen med 4% PFA/0,1% GA-lösning i 10 minuter för att förhindra dissociation av antikroppar.
- Tvätta två gånger i 5 min vardera med 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS för att inaktivera fixeringsmedlen.
OBS: För experiment med mer än en antikropp (t.ex. detektera flera fosfotyrosinställen), upprepa steg 4.5-4.9. Se steg 6.2.9 för information om bestämning av steriskt hinder mellan två antikroppar.
5. Bildförvärv
OBS: Enmolekylär bildinsamling utförs med hjälp av ett 150x TIRF-mål och en bilddelare som fångar varje spektralkanal i en specifik kvadrant av emCCD-kameran (se materialtabell). Kalibreringsbilder förvärvas först för att möjliggöra kanalregistrering och kameraförstärkningskalibrering med ett nanomönsterat kanalinriktningsnät (nanogrid) som innehåller 20 x 20 arrays med 200 ± 50 nm hål på ett intrahålsavstånd på 3 ± 1 μm (total storlek ~ 60 μm × 60 μm).
- Utför kanalregistrering enligt stegen nedan.
OBS: Noggrann kanalregistrering krävs för att korrekt beräkna samlokaliseringen av sändare. Det här steget är avgörande.- Rengör oljemålet och lägg en droppe olja på målet. Placera nanogridet på scenen för avbildning. Använd överfört vitt ljus, fokusera på rutmönstret.
OBS: Bilder med nanogridet förvärvas med hjälp av överfört ljus, som passerar genom nanogridet och detekteras i alla spektralkanaler. Alternativt kan man använda multifluorescerande pärlor som avger fluorescens detekterad i varje kanal. Bildförvärv måste optimeras enligt varje mikroskopinställning. - Skaffa en serie med 20 bilder av rutnätet. Se till att pixlarna inte är mättade. Spara bildserien som "Fiducial".
- Fokusera nanogridet för att skapa ett luftigt mönster18. Skaffa en serie med 20 bilder för förstärkningskalibreringar. Spara bilden som "Gain".
- Skaffa en serie med 20 bilder för kamerakompensation genom att blockera allt ljus från att gå till kameran. Spara bilden som "Bakgrund".
- Rengör oljemålet och lägg en droppe olja på målet. Placera nanogridet på scenen för avbildning. Använd överfört vitt ljus, fokusera på rutmönstret.
- Skaffa SiMPull-bilder.
OBS: Innan du avbildar coverlip-matrisen, byt ut Tris-lösningen mot T50-BSA och balansera matrisen till RT.- Rengör oljemålet och sätt in ytterligare olja på målet. Säkra täckglasuppsättningen på mikroskopsteget.
- Optimera varje fluorofors excitationskraft, TIRF-vinkel och kameraintegrationstid. Målet är att uppnå den högsta signal-till-bruset samtidigt som fotoblekningen av provet minimeras. Registrera lasereffekten för konsistens i framtida mätningar.
OBS: Den aktuella studien använde 300 ms exponeringstid för den fjärrröda kanalen och 1 s för den gröna kanalen. 642 nm lasern användes vid cirka 500 μW lasereffekt, medan 488 nm lasern användes vid 860 μW, mätt före rörlinsen. - Hämta bilder för varje prov. Avbilda den långröda kanalen först, följt av varje fluorofor med lägre våglängd för att minska fotoblekningen. På grund av den låga volymen som används för varje prov, kontrollera buffertnivån var 30-45: e minut och fyll på efter behov.
6. Analys av data
- Ladda ner demokoderna.
Obs: Den medföljande demokoden och exempeldatauppsättningarna visar det fullständiga arbetsflödet för dataanalys (kompletterande kodningsfiler 1-4). Systemkraven som anges i SiMPullMain.m finns i Kompletterande kodningsfil 1.-
Packa upp och spara i en personlig dokument/MATLAB-katalog (MacOS/Linux) eller dokument\MATLAB (Windows).
Obs: Detta genererar fyra nya mappar: SiMPull_class, smite, sample data, sample analysis outputs. - Öppna filen "ReadMe_Setup.txt" som finns i mappen SiMPull_class.
- Installera MATLAB- och MATLAB-verktygslådor: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox och Statistics and Machine Learning toolbox.
- Installera DipImage19 enligt nedladdningsanvisningarna.
- Installera "smite" enmolekylanalyspaket enligt beskrivningen i ReadMe_setup.txt.
"smite" är tillgängligt på GitHub-lagringsplatsen (se materialtabell). - Öppna SiMPullMain.m, som finns i SiMPull_class mapp, genom att dra filen till MATLAB-fönstret.
- Ändra katalogen till ...\MATLAB\Sample Data\ genom att klicka på ikonen Bläddra efter mapp och välja mappen.
-
Packa upp och spara i en personlig dokument/MATLAB-katalog (MacOS/Linux) eller dokument\MATLAB (Windows).
- Översikt över databehandlingssteg
- Kör SiMPullMain.m - följ instruktionerna för varje avsnitt. Kör varje avsnitt individuellt genom att placera markören i det avsnittet och klicka på ikonen Kör avsnitt.
De allmänna stegen för dataanalys beskrivs i det här avsnittet. Detaljerade instruktioner finns i den medföljande SiMPullMain.m-koden. - Kör avsnittet "Initialisering" för att ställa in sökvägen för att definiera spektralkanaler och bildstorlek.
- Kör avsnittet "Hitta kameraförstärkning och förskjutning" för att konvertera kameraförstärkning till fotoner med hjälp av gain- och bakgrundsdatauppsättningarna.
- Kör avsnittet "Kanalregistrering" för att beräkna den lokala viktade medeltransformen som används för bildregistrering.
- Formatera och kurera data. Kör avsnittet "Gå med i sekventiella kanaler i en fyrbild". Kör "Ta bort dåliga ramar".
- Kör avsnittet "Passa enstaka molekyler och hitta överlappande molekyler".
OBS: Detta avsnitt utför flera funktioner för att lokalisera enskilda molekyler i varje kanal och bestämma samlokaliseringshändelser mellan spektrala kanaler. - För att bestämma det minsta fotonantalet per äkta GFP-passform, kör "Optimera minsta fotontröskel". Detta är en iterativ process.
- Ställ först in smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] och kör avsnittet. Välj "Tomma data" -filer när du blir ombedd. Upprepa med filerna "CHO-EGFR-GFP".
- Välj ett lämpligt minimitröskelvärde genom att jämföra de två histogrammen. Ställ in smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] och kör avsnittet igen.
- Kör avsnittet "Beräkna procentandel av GFP passar positivt för FR-signal" för att korrigera bakgrundslokaliseringar och beräkna slutliga värden.
- Utför alternativ 1 (steg 6.2.10) eller alternativ 2 (steg 6.2.11) enligt experimentellt behov.
- Alternativ 1: Korrigera för antalet receptorer som finns tillgängliga vid plasmamembranet för ligandbindning, enligt beskrivningen i referens15.
- Märk först ytreceptorer med mättande nivåer av fluorescerande NHS Ester-färgämne (NHS-AF647, se materialtabell). Utför sedan ett SiMPull-experiment för att bestämma procentandelen GFP-lokalisering som samlokaliseras med AF647.
OBS: Detta ger en uppskattning av fraktionen av receptorer som är tillgängliga för NHS-märkning och förhållandet mellan receptorer på ytan (SR). - Tillämpa SR-korrigeringen i den slutliga beräkningen: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, där NGFP är det korrigerade antalet GFP-lokaliseringar, NBG är bakgrundslokaliseringsnumret och NLOC är totala lokaliseringar.
OBS: I det här exemplet tillämpas inte denna korrigering eftersom Pervanadate är membrangenomsläpplig16 och därför är verkan av fosfatashämning inte begränsad till ytreceptorer.
- Märk först ytreceptorer med mättande nivåer av fluorescerande NHS Ester-färgämne (NHS-AF647, se materialtabell). Utför sedan ett SiMPull-experiment för att bestämma procentandelen GFP-lokalisering som samlokaliseras med AF647.
- Alternativ 2: För fosforyleringsmätningar på flera platser, överväga potentialen för steriskt hinder när två antikroppar används.
OBS: Steriskt hinder kan orsaka en minskning av den observerade andelen fosforylerade receptorer för antikropp 1 i närvaro av antikropp 2 (P12), jämfört med antikropp 1 ensam (P1).- Använd SiMPull för att bestämma P1 och P12 och beräkna korrektionsfaktorn för steriskt hinder, efter tidigare publicerad referens15.
- Kör SiMPullMain.m - följ instruktionerna för varje avsnitt. Kör varje avsnitt individuellt genom att placera markören i det avsnittet och klicka på ikonen Kör avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tecknad film som visar SiMPull-processen visas i figur 1A. Coverslips funktionaliseras med NeutrAvidin som ankare för biotinylerade anti-EGFR-antikroppar för att fånga EGFR-GFP från totala proteinlysater. Efter tvättning av obundet protein märks de fosforylerade receptorerna med en antifosfotyrosin (anti-PY) antikropp15. Figur 1B visar en bild av den hydrofoba matrisen, där flera prover kan framställas och avbildas på samma täckglas. En fördel med denna provhållare är att minimala provvolymer på ~ 10 μL krävs. Täckglaset kan avbildas genom att placera det direkt på mikroskopstadiet. Det är dock bra att stabilisera täckglaset med hjälp av en täckglashållare. Omslagshållaren som visas i figur 1B skapades med hjälp av en 3D-skrivare, och ritningen finns i kompletterande kodningsfil 5. Autofluorescensen hos det hydrofoba bläcket är en användbar guide för att hitta provets fokalplan (figur 1C). Ett exempel på en flerkanalig råbild visas i figur 1D. Ett överlägg av de rågröna och fjärrröda kanalerna visas i figur 1E.
Bild 2 beskriver analysarbetsflödet och ger representativa data. Datainsamling börjar först med att förvärva fiducials för kanalregistrering, som används för att lägga över de enskilda spektralkanaldata (figur 2A). Ljusfältsbilder tas med ett nanogridmönster som passerar vitt ljus och detekteras i varje spektralkanal i bilddelaren (visas inte). Den gröna kanalen fungerar som referenskanal och den fjärrröda kanalen är den skiftade kanalen. Den lokala viktade medeltransformen beräknas med funktionen fitgeotrans20 i MATLAB och används för att flytta fjärrröda koordinater till koordinatramen för den gröna kanalen. Den här transformen använder en andra ordningens polynommodell vid varje kontrollpunkt. Flerkanalsdata för SiMPull-matrisen förvärvas sedan. Det här arbetsflödet bestod av en halvautomatisk insamling, där en startande ROI valdes för den specifika exempelkvadraten och tre regioner runt det här området avbildades, så att varje datauppsättning innehåller den fullständiga fyrvybilden från tre oberoende AVKASTNING:er (bild 1D). I varje spektralkanal hittas emitterkandidatplatserna genom att tillämpa en skillnad i Gaussiskt filter på bilder och identifiera lokala maxima. Delregioner (rutor, figur 2B) ritas runt lokala maxima, och antalet emitterfoton uppskattas genom att anta att varje delregion endast innehåller en emitter. Delregioner som innehar emitterkandidater med fotonantal över ett minimivärde behålls för montering. En Gaussisk punktspridningsfunktion (PSF) passar varje emitterkandidat inom små delregioner som är ungefär centrerade kring varje emitter. De resulterande lokaliseringarna är tröskelbaserade baserat på deras fotonantal, bakgrund, Cramér-Rao nedre gräns för passformskoordinaterna, PSF-varians (dvs. PSF-bredd) och ett p-värde som beskriver god passformen hos PSF-modellen. En Gaussisk bild skapas för varje spektralkanal, med enhetlig intensitet Gaussiska blobbar placerade vid koordinaterna för varje bra passform (figur 2C). Samlokalisering visualiseras genom att lägga över de gaussiska bilderna från varje spektralkanal med hjälp av transformen beräknad från fiducialprovet (figur 2D). Det är viktigt att fluorescerande märka receptorn för identifiering eftersom det fortfarande finns icke-specifik bindning av anti-fosfotyrosinantikropparna till ytan när celllysat är närvarande. EGFR-GFP (grön kanal) används för att generera en mask av receptorplatserna, och endast AF647-anti-PY-signalen (fjärrröd kanal) inom den masken räknas (figur 2D). Par inom 1 pixelstorlek (106,7 nm pixelstorlek) anses vara samlokaliserade och sparas i en lista som innehåller referenskanalkoordinaterna. Procentandelen AF647 samlokaliserad med GFP beräknas för att bestämma fraktionen av fosforylerade receptorer (Figur 2E).
Det finns flera viktiga steg för att säkerställa god datakvalitet. En sådan ansträngning är att inkubera täckglasuppsättningen med NaBH4 som beskrivs i protokollet för att släcka autofluorescens i den gröna kanalen. Denna autofluorescens avser den icke-specifika signalen på grund av möjliga föroreningar på glaset, innehållande enstaka eller konjugerade π bindningar21. Sådana föroreningar är potentiellt från aminosilan- och PEG-reagenserna som används i funktionaliseringsprocessen eller damm från luften och tenderar att fluorescera i den gröna spektralkanalen. Trots ansträngningar för att hålla glas lagrat under kväve kan dessa molekyler också genereras genom oxidation som sker vid lagring. NaBH4 har också använts för att minska fluorescensen från föroreningar på objektglas och mikroarrayer, inklusive de med silanbeläggning16. Figur 3A visar minskningen av antalet bakgrundsdetekteringar som uppstår när det piranha-etsade glaset behandlas med NaBH4. Medan NaBH4 minskar bakgrundsfluorescens dramatiskt, detekteras vissa sändare fortfarande i den gröna kanalen. Man kan korrigera detta genom att skaffa bakgrundsbilder från lysatfria prover (figur 3D) och subtrahera det genomsnittliga antalet bakgrundslokaliseringar från de GFP-innehållande proverna. Fluorescens från föroreningar detekterades inte i den långröda kanalen. Om receptordensiteten är för hög kan flera GFP-sändare hittas inom en enda diffraktionsbegränsad plats (data visas inte). Med hjälp av stegfotoblekning för att identifiera antalet GFP per plats fann vi att en receptordensitet mellan 0,04-0,08 proteiner / μm2 gav tillräckligt avstånd mellan enskilda emittrar för att ta bort potentialen att hitta flera emittrar per plats12. Receptordensiteten kan optimeras genom att variera mängden IP-antikropp bunden till glasytan eller mängden tillsatt lysat. Det är viktigt att se till att antikroppen som riktar sig mot POI används vid mättande nivåer. Det rekommenderas att förvärva en antikroppskoncentrationskurva på fosforylerade prover för att bestämma lämpliga märkningsförhållanden (figur 3B). Dessutom måste fosfospecificiteten hos en antikropp valideras med viloprover och/eller behandling med proteinspecifika kinashämmare (figur 3B). Antikroppar kommer att dissociera från receptorn under bildtidsfönstret. Behandling av provet med en kombination av PFA och GA förhindrade signalförlust (figur 3C).
Slutligen är det viktigt att optimera parametrarna för enmolekylspassning. Det första "box finding"-steget som identifierar potentiella emitterkandidater (figur 2B) måste vara generöst för att många kandidater ska kunna genomgå Gaussian Fitting. Således kan den minsta fotontröskeln för att hitta lådor vara relativt låg för att fånga alla verkliga sändare och vissa bakgrundsfläckar. Det är också viktigt att inte ställa in lådstorleken och överlappa ersättningen för liten. Att hålla lådstorleken inom 5-7 pixlar och tillåta överlappning med två pixlar är idealisk för sändare med den rekommenderade densiteten. Efter att lådan har hittats måste den minsta fotontröskeln i monteringssteget optimeras. Minsta fotonparameter bidrar till att bestämma vilka Gaussiska monterade emittrar som passerar som en riktig passform. För att bestämma rätt minsta fotontröskel för äkta GFP-passningar innehåller koden en histogramplottningsfunktion för att undersöka fotonerna / lokaliseringen i både bakgrund (ingen celllysat) och GFP-innehållande (plus celllysat) prover (figur 3D). Detta steg är viktigt eftersom NaBH4 minskar mängden fluorescens från föroreningar, men det tar inte bort alla bakgrundslokaliseringar. Figur 3D visar behovet av att ställa in en lägsta fotontröskel för att minska antalet detektioner från föroreningar. För att bestämma denna tröskel beräknas ett histogram över bakgrundsemitterintensiteter från avbildning av ett prov som inte utsätts för celllysat (figur 3D, uppe till vänster). Majoriteten av bakgrundsemitterarna visade sig ha värden mindre än 475 fotoner. Som jämförelse visade provet som innehöll sanna GFP-emittrar en betydande del av fördelningen över 475 (figur 3D, uppe till höger). Tröskeln väljs genom inspektion för att ta bort så många bakgrundsräkningar som möjligt samtidigt som mängden signalförlust från lysatprovet minimeras (figur 3D, nedre raden). Den återstående bakgrundstätheten vid denna tröskel redovisas i den kvantitativa analysen.
Figur 1: Översikt över provberedning. Täckglas funktionaliseras med en antikropp som känner igen POI för att fånga den POI från helcellslysater. Glaset beläggs först med PEG och biotin-PEG. NeutrAvidin binds sedan till biotin-PEG och fungerar som ett ankare för den biotinylerade anti-POI-antikroppen. Fosforylerade proteiner detekteras sedan med en fluorescerande märkt anti-PY-antikropp. (B) Fotografi av omslagshållaren (röd) med täckglas på plats och monterad på mikroskopsteget. De multisample arrays genereras med hydrofobt bläck för att skapa upp till 20 individuella provrutor på ett enda glasöverdrag. Täckglaset är 60 mm x 24 mm. (C) Exempelbilder på hydrofobt bläck autofluorescens (magenta) och fluorescerande pärlor (grön). Autofluorescensen hos det hydrofoba bläcket är en användbar guide för att hitta fokalplanet vid täckglasytan. (D) Exempel på en rådatabild med spektrala kanaler separerade på kamerachipet av Quad-view-bilddelaren. Filteruppsättningen med fyra vyer innehåller följande emissionsfilter: blå (445/45 nm), grön (525/45 nm), röd (600/37 nm), fjärrröd (685/40 nm). (E) Rå överlagring av gröna och långröda kanaler. Den vita rutan anger den region som undersöks ytterligare i figur 2B-D. Skalstreck (C-E) = 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Arbetsflöde för dataanalys(A) Kanalregistrering utförs först på bilder som förvärvats från nanogridet. Efter beskärning av de två spektralkanalerna av intresse (här, gröna och långröda) läggs fiducialbilderna för varje kanal över (vänster). Förstoring av rutan i den vänstra bilden (Infälld) visar att bilderna ännu inte är riktigt registrerade. Emittrarna i varje kanal passar en Gaussisk modell och är lokaliserade (Registrering). Lokalisering av sändare visas som cirklar för den röda kanalen och korsar för den gröna kanalen. Det sista steget är att tillämpa en lokal viktad medeltransform för att flytta de fjärrröda kanallokaliseringskoordinaterna till den gröna kanalreferensramen (justerad). Den beräknade lokala viktade medeltransformen används sedan för att registrera efterföljande SiMPull-data. (B) Representativa bilder av den gröna/EGFR-GFP-kanalen och den fjärrröda/AF647-anti-PY-kanalen. Enstaka sändare ovanför bakgrundsfotonantalet identifieras och markeras med rutor. C) Utsläppsprofilen i varje vald låda anpassas till en Gaussisk modell, och de sändare som passar modellen för en enda fluorofashämmare behålls. (D) En mask skapas från GFP-emittrarna för att identifiera platsen för EGFR-GFP (grön). Samlokalisering av EGFR-GFP och AF647-anti-PY identifierar fosforylerade receptorer (vita). (E) Fraktionen av fosforylerade receptorer beräknas från de samlokaliserade EGFR-GFP- och AF647-anti-PY-passningarna. Stapeldiagrammet jämför PV + EGF-behandling med vilande celler, i genomsnitt för flera mätningar. Felstaplar representerar standardfel beräknat med antagande av en binomialfördelning. Skalstreck = 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kritiska steg för att säkerställa datakvalitet. (A) Från vänster till höger är de tre första panelerna representativa bilder av autofluorescensen på glas under respektive förhållanden: efter piranha-etsning, med PEG och PEG plus NaBH4-behandling (indikerad med +). Dessutom bibehålls ytfunktionalisering efter NaBH4-behandling , vilket demonstreras av minimal icke-specifik PY99-AF647-bindning samtidigt som robust bindning av EGFR-GFP från lysaten bibehålls. (B) En mättnadskurva måste förvärvas för varje sats antikroppar som används för att säkerställa optimal antikroppsmärkning. Denna figur visar koncentrationskurvan för märkning av EGFR med den platsspecifika fosfotyrosinantikroppen, anti-EGFR-pY1173. Minimal fosforylering detekteras i obehandlade celler (Vila, grå diamant). Som en kontroll för icke-specifik bindning behandlades cellerna också med EGFR-kinashämmaren, Lapatinib, innan de tillsatte 100 nM EGF (magenta triangel), vilket visar det förväntade förebyggandet av EGFR-fosforylering. Felstaplar representerar standardfel som antar en binomialfördelning. (C) Fixering av provet med en kombination av PFA och GA förhindrar dissociation av antikroppar över tid. Felstaplar representerar standardfel som antar en binomialfördelning. (D) Falska positiva resultat utesluts genom att välja lämplig tröskel för gaussisk anpassning. Jämförelse av histogrammet för passformsintensiteter vid en låg tröskel (Tröskel = 0; överst) mellan bakgrund (ingen lysat) och verkliga data (plus celllysat) möjliggör val av lämpligt värde (Tröskel = 475; botten) för att ta bort passningar från autofluorescerande fläckar i den gröna kanalen. Den vertikala magentalinjen indikerar en tröskel på 475 fotoner. Histogram beräknas utifrån samma antal avkastningar för varje provtyp (n = 3). Skalstreck = 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande kodningsfil 1: zip-fil som innehåller skript och verktyg för att köra SiMPull-analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: zip-fil som innehåller smite-analyspaketet med en molekyl. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: zip-fil som innehåller exempeldata. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 4: zip-fil som innehåller representativa provdataanalysutgångar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 5: Täckglashållare för 3D-utskrift. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här optimerades för att möjliggöra kvantitativa mätningar av receptorfosforylering vid den enda proteinnivån. Flera enkla men viktiga modifieringar av SiMPull-protokollet utvecklades som förbättrade tillförlitligheten i mätningen för fosfo-tyrosindetektering, inklusive minskning av autofluorescens med NaBH4-behandling och efterfixering av provet för att förhindra antikroppsdissociation. Att använda den gröna kanalmasken för att identifiera receptorplatser för beräkning av samlokalisering med anti-PY-antikroppen förbättrar också mätnoggrannheten genom att ta bort potentiella artefakter från den icke-specifika bindningen av antikroppen till celllysaten. Tvåfärgsavbildningen användes för att detektera fraktionen av receptorer fosforylerade. I detta scenario var receptorn genetiskt märkt med GFP, och antikroppen märktes direkt med ett långt rött färgämne. SiMPull-metoden gäller för andra proteinmål för vilka specifika antikroppar finns tillgängliga, inklusive intracellulära proteiner. Dessutom, eftersom denatureringsförhållanden inte krävs, kan multisubenhetsreceptorer / komplex också fångas. Denaturering kan emellertid införlivas om PTM: erna av intresse är belägna i strukturerade regioner av proteinet14. I slutändan kan SiMPull lätt utökas till att omfatta samtidig märkning av distinkta fosfo-tyrosiner på enskilda receptorer för att kvantifiera fosforyleringsmönster på flera platser15. Förhör av fullängds, intakta receptorer på ett sådant sätt kan inte uppnås med andra standardmetoder, inklusive western blotting och fosfo-masspektrometri.
Tillsammans med fördelarna med SiMPull måste vissa begränsningar beaktas. Som med alla antikroppsbaserade tekniker är affiniteten och specificiteten hos antikroppar som används avgörande för mätningens framgång. Därför är det viktigt att optimera antikroppsmärkningsförhållanden och helst undvika sekundära antikroppar genom att använda direktmärkta primära antikroppar. Dessutom kommer de ytbundna antikropparna att fälla ut proteiner lokaliserade till plasmamembranet och inom cytosoliska fack. Detta kan underskatta fosforylering eftersom cytosol-lokaliserade proteiner inte är tillgängliga för den exogent tillsatta liganden. Ytterligare åtgärder måste vidtas för att korrigera receptorns ytnivåer (steg 6.2.10). Antifosfotyrosinantikropparna uppvisade viss icke-specifik bindning när lysat var närvarande. För att undvika denna artefakt var EGFR genetiskt märkt med GFP för att identifiera receptorernas placering, vilket gjorde det möjligt för oss att utesluta anti-PY-signalen från receptorn. Om endogena proteiner ska förhöras kan motfärgning med en total proteinantikropp ge maskbilden, med lämplig korrigering för eventuell icke-specifik bindning. Slutligen, medan SiMPull ger information om heterogenitet på proteinnivå, är lysaten som genereras i detta protokoll från tusentals celler och cell-till-cell-variabiliteten går förlorad. Framsteg mot encellig SiMPull har emellertid gjorts med hjälp av en flödeskammare bestående av en täckglas och en mikroskopsida med ett gap på 10 μm; bakterier pläterades glest på täckglaset medan bilden funktionaliserades med antikropp för att fånga de önskade proteinerna. Vid lys av bakterierna fångades proteinerna från varje cell i ett begränsat område på den antikroppsbelagda bilden22. Liknande encellig SiMPull-analys av däggdjursceller och proteinfosforylering kan vara möjlig i framtiden.
SiMPull-protokollet innehåller flera kritiska steg som krävs för att säkerställa data av hög kvalitet. Till exempel innehåller protokollet en detaljerad beredning av täckglaset. Piranha etsning täckerlips rengör glaset noggrant och ökar hydroxylgrupper och hydrofilicitet, vilket behövs för att optimera täckglasytan. Efter flera tvättar med organiska lösningsmedel ger KOH-behandling ytterligare hydroxylgrupper för aminosilanisering13,23, som täcker glaset med amingrupper för PEG- och biotin-PEG-bindning. Felaktig rengöring eller funktionalisering vid något av dessa steg kommer att störa protein pull-down. Kontroll av molförhållandet PEG: biotin-PEG, tillsammans med lysatkoncentration, är nyckelfaktorer för att erhålla lämplig protein-IP-densitet på SiMPull-substratet. Som med alla biologiska analyser finns det variation mellan celllysatpreparat, och små skillnader mellan fosforyleringsprocent kan ses mellan provreplikat. Därför är det viktigt att mäta fosforyleringsnivåerna för olika tyrosinställen inom samma prov. Provkammaren som beskrivs i detta protokoll tillhandahåller ett system för att samla in många datapunkter i en avbildningssession och möjliggör medelvärde över flera SiMPull-experiment.
På bildförvärvssidan är det viktigt att erhålla fiducialprovet för att säkerställa ett korrekt kanalöverlägg; annars kommer samlokalisering inte att vara korrekt. Det är också viktigt att optimera lasereffekt och kamerainställningar för att maximera signal-till-brus samtidigt som fotoblekningen minimeras. Slutligen, medan provuppsättningen kräver en liten mängd prov och reagenser, är de låga volymerna mottagliga för avdunstning under avbildningssessionen. Det är viktigt att regelbundet kontrollera provmatrisen (~ 30-45 min) och tillsätt buffert efter behov för att förhindra att proverna torkar.
Det nuvarande protokollet demonstrerade användningen av SiMPull för att kvantifiera membranreceptorfosforyleringstillstånd. Även om det är fokuserat på EGFR kan tillvägagångssättet tillämpas på andra cellytereceptorer och intracellulära proteiner och proteinkomplex, så länge lämpliga antikroppar finns tillgängliga. En annan potentiell användning för SiMPull är att undersöka innehållet och fosforyleringsstatusen hos fasavskiljda kondensat. Dessutom kan SiMPull användas för att mäta andra PTM, såsom ubiquitination. Därför ger SiMPull ett unikt verktyg för cellbiologer att förhöra PTM på intakta proteiner och korrelera PTM-mönster med cellulärt resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 och R01CA248166 till DSL. EMB stöddes genom ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) och JAR av UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi erkänner tacksamt att använda University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delad resurs, som stöds av NIH P30CA118100. Vi vill uppmärksamma Drs. Ankur Jain och Taekijip Ha, vars ursprungliga utveckling av SiMPull inspirerade detta arbete.
ES-C nuvarande adress: Immunodynamics Group, Laboratoriet för integrativ cancerimmunologi, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al.
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T.
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
