Summary

En optimalisert enkeltmolekyls pull-down-analyse for kvantifisering av proteinfosforylering

Published: June 06, 2022
doi:

Summary

Den nåværende protokollen beskriver prøvepreparering og dataanalyse for å kvantifisere proteinfosforylering ved hjelp av en forbedret enkeltmolekyls pull-down (SiMPull) analyse.

Abstract

Fosforylering er en nødvendig posttranslasjonsendring som regulerer proteinfunksjonen og styrer cellesignaleringsresultatene. Nåværende metoder for å måle proteinfosforylering kan ikke bevare heterogeniteten i fosforylering på tvers av individuelle proteiner. Enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse ble utviklet for å undersøke sammensetningen av makromolekylære komplekser via immunoprecipitation av proteiner på en glassdekslelip etterfulgt av enkeltmolekylavbildning. Den nåværende teknikken er en tilpasning av SiMPull som gir robust kvantifisering av fosforyleringstilstanden til membranreseptorer i full lengde på enkeltmolekylnivå. Avbildning av tusenvis av individuelle reseptorer på denne måten gjør det mulig å kvantifisere proteinfosforyleringsmønstre. Den nåværende protokollen beskriver den optimaliserte SiMPull-prosedyren, fra prøvepreparering til avbildning. Optimalisering av glassforberedelse og antistofffikseringsprotokoller forbedrer datakvaliteten ytterligere. Den nåværende protokollen gir kode for dataanalysen med ett molekyl som beregner brøkdelen av reseptorer fosforert i en prøve. Mens dette arbeidet fokuserer på fosforylering av den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR), kan protokollen generaliseres til andre membranreseptorer og cytosoliske signalmolekyler.

Introduction

Membran-assosiert signalering er innstilt av en kombinasjon av ligandindusert membranreseptoraktivering og rekruttering av nedstrøms tilbehørsproteiner som forplanter signalet. Fosforylering av sentrale tyrosiner i reseptorcytoplasmatiske haler er avgjørende for å initiere dannelsen av signalkomplekser, eller signalosomer 1,2. Derfor er et viktig spørsmål i biologi hvordan fosforyleringsmønstre opprettes og vedlikeholdes for å rekruttere signalpartnere og diktere cellulære resultater. Dette inkluderer å forstå heterogeniteten til reseptorfosforylering, både i overflod og i de spesifikke fosfotyrosinmønstrene som kan gi et middel til å manipulere signalutganger ved å diktere sammensetningen av signalosomet 3,4,5,6,7. Det er imidlertid begrensninger i dagens metoder for å forhøre proteinfosforylering. Vestlig blotanalyse er utmerket for å beskrive trender for proteinfosforylering, men er semi-kvantitativ8 og gir ikke informasjon om systemets heterogenitet fordi tusenvis til millioner av reseptorer er gjennomsnittlig sammen. Mens vestlige flekker tillater probing av en prøve ved hjelp av fosfospesifikke antistoffer mot spesifikke tyrosiner, kan de ikke gi informasjon om multisite fosforyleringsmønstre i samme protein. Kvantitativ fosfoproteomikk rapporterer om fosfotyrosin overflod, men det er begrensninger for å oppdage multisite fosforylering, da rester av interesse må være plassert innenfor samme peptid (vanligvis 7-35 aminosyrer) som genereres ved enzymatisk fordøyelse 9,10,11.

For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, har enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse blitt tilpasset for å kvantifisere fosforyleringstilstandene til intakte reseptorer på enkeltmolekylnivå. SiMPull ble først demonstrert som et kraftig verktøy for å forhøre makromolekylære komplekser av Jain et al.12,13. I SiMPull ble makromolekylære komplekser immunoprecipitated (IP) på antistoff-funksjonaliserte glassdeksler og deretter analysert gjennom enkeltmolekylmikroskopi for proteinunderenhetsnummer og co-IP med komplekse komponenter12. En modifikasjon av Kim et al.14, kalt SiMBlot, var den første som brukte en variant av SiMPull til å analysere fosforylering av denaturerte proteiner. SiMBlot-protokollen er avhengig av å fange biotinylerte celleoverflateproteiner ved hjelp av NeutrAvidin-belagte deksler, som deretter undersøkes for fosforylering med fosfospesifikk antistoffmerking14. Til tross for disse fremskrittene var det nødvendig med forbedringer for å gjøre kvantifiseringen av posttranslasjonell modifikasjon mer robust og anvendelig for et bredere spekter av proteiner.

Den nåværende protokollen beskriver en optimalisert SiMPull-tilnærming som ble brukt til å kvantifisere fosforyleringsmønstre av intakt epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) som svar på en rekke ligandforhold og onkogene mutasjoner15. Mens dette arbeidet fokuserer på EGFR, kan denne tilnærmingen brukes på alle membranreseptorer og cytosoliske proteiner av interesse (POI), for hvilke kvalitetsantistoffer er tilgjengelige. Protokollen inneholder trinn for å redusere prøve autofluorescence, en prøvematrisedesign som krever minimalt prøvevolum med samtidig forberedelse av opptil 20 prøver, og optimalisering av antistoffmerking og fikseringsforhold. Dataanalysealgoritmer er utviklet for enkeltmolekyldeteksjon og kvantifisering av fosforylaterte proteiner.

Protocol

1. Coverlip forberedelse MERK: For dette trinnet må man bruke personlig verneutstyr (PVU), som inkluderer et dobbeltlag med nitrilhansker, vernebriller eller ansiktsskjerm og en labfrakk. Utfør piranha etsning for å fjerne organisk rusk fra glasset.FORSIKTIG: Piranha-løsningen er et sterkt oksidasjonsmiddel som er etsende og svært reaktivt når det kommer i kontakt med organiske materialer. Reaksjon med organisk rusk er eksotermisk og potensielt eksplosiv. D…

Representative Results

En tegneserie som viser SiMPull-prosessen er vist i figur 1A. Coverlips er funksjonalisert ved hjelp av NeutrAvidin som anker for biotinylerte anti-EGFR antistoffer for å fange EGFR-GFP fra totale proteinlytter. Etter å ha vasket bort ubundet protein, er fosforylaterte reseptorer merket med et anti-fosfotyrosin (anti-PY) antistoff15. Figur 1B viser et bilde av den hydrofobe matrisen, der flere prøver kan tilberedes og avbildes på samm…

Discussion

Protokollen beskrevet her ble optimalisert for å muliggjøre kvantitative målinger av reseptorfosforylering på enkeltproteinnivå. Flere enkle, men viktige modifikasjoner av SiMPull-protokollen ble utviklet som forbedret påliteligheten til målingen for fosfo-tyrosindeteksjon, inkludert reduksjon av autofluorescence med NaBH4-behandling og etterfiksering av prøven for å forhindre antistoffdissosiasjon. Bruk av den grønne kanalmasken til å identifisere reseptorplasseringer for beregning av colokaliserin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 og R01CA248166 til DSL. EMB ble støttet gjennom ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) og JAR av UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi erkjenner takknemlig å bruke University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delt ressurs, støttet av NIH P30CA118100. Vi ønsker å anerkjenne Dr. Ankur Jain og Taekijip Ha, hvis opprinnelige utvikling av SiMPull inspirerte dette arbeidet.
ES-C nåværende adresse: Immunodynamikk Gruppe, Laboratorium for integrativ kreftimmunologi, Senter for kreftforskning, National Cancer Institute, Bethesda

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Play Video

Cite This Article
Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

View Video