Den nåværende protokollen beskriver prøvepreparering og dataanalyse for å kvantifisere proteinfosforylering ved hjelp av en forbedret enkeltmolekyls pull-down (SiMPull) analyse.
Fosforylering er en nødvendig posttranslasjonsendring som regulerer proteinfunksjonen og styrer cellesignaleringsresultatene. Nåværende metoder for å måle proteinfosforylering kan ikke bevare heterogeniteten i fosforylering på tvers av individuelle proteiner. Enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse ble utviklet for å undersøke sammensetningen av makromolekylære komplekser via immunoprecipitation av proteiner på en glassdekslelip etterfulgt av enkeltmolekylavbildning. Den nåværende teknikken er en tilpasning av SiMPull som gir robust kvantifisering av fosforyleringstilstanden til membranreseptorer i full lengde på enkeltmolekylnivå. Avbildning av tusenvis av individuelle reseptorer på denne måten gjør det mulig å kvantifisere proteinfosforyleringsmønstre. Den nåværende protokollen beskriver den optimaliserte SiMPull-prosedyren, fra prøvepreparering til avbildning. Optimalisering av glassforberedelse og antistofffikseringsprotokoller forbedrer datakvaliteten ytterligere. Den nåværende protokollen gir kode for dataanalysen med ett molekyl som beregner brøkdelen av reseptorer fosforert i en prøve. Mens dette arbeidet fokuserer på fosforylering av den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR), kan protokollen generaliseres til andre membranreseptorer og cytosoliske signalmolekyler.
Membran-assosiert signalering er innstilt av en kombinasjon av ligandindusert membranreseptoraktivering og rekruttering av nedstrøms tilbehørsproteiner som forplanter signalet. Fosforylering av sentrale tyrosiner i reseptorcytoplasmatiske haler er avgjørende for å initiere dannelsen av signalkomplekser, eller signalosomer 1,2. Derfor er et viktig spørsmål i biologi hvordan fosforyleringsmønstre opprettes og vedlikeholdes for å rekruttere signalpartnere og diktere cellulære resultater. Dette inkluderer å forstå heterogeniteten til reseptorfosforylering, både i overflod og i de spesifikke fosfotyrosinmønstrene som kan gi et middel til å manipulere signalutganger ved å diktere sammensetningen av signalosomet 3,4,5,6,7. Det er imidlertid begrensninger i dagens metoder for å forhøre proteinfosforylering. Vestlig blotanalyse er utmerket for å beskrive trender for proteinfosforylering, men er semi-kvantitativ8 og gir ikke informasjon om systemets heterogenitet fordi tusenvis til millioner av reseptorer er gjennomsnittlig sammen. Mens vestlige flekker tillater probing av en prøve ved hjelp av fosfospesifikke antistoffer mot spesifikke tyrosiner, kan de ikke gi informasjon om multisite fosforyleringsmønstre i samme protein. Kvantitativ fosfoproteomikk rapporterer om fosfotyrosin overflod, men det er begrensninger for å oppdage multisite fosforylering, da rester av interesse må være plassert innenfor samme peptid (vanligvis 7-35 aminosyrer) som genereres ved enzymatisk fordøyelse 9,10,11.
For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, har enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse blitt tilpasset for å kvantifisere fosforyleringstilstandene til intakte reseptorer på enkeltmolekylnivå. SiMPull ble først demonstrert som et kraftig verktøy for å forhøre makromolekylære komplekser av Jain et al.12,13. I SiMPull ble makromolekylære komplekser immunoprecipitated (IP) på antistoff-funksjonaliserte glassdeksler og deretter analysert gjennom enkeltmolekylmikroskopi for proteinunderenhetsnummer og co-IP med komplekse komponenter12. En modifikasjon av Kim et al.14, kalt SiMBlot, var den første som brukte en variant av SiMPull til å analysere fosforylering av denaturerte proteiner. SiMBlot-protokollen er avhengig av å fange biotinylerte celleoverflateproteiner ved hjelp av NeutrAvidin-belagte deksler, som deretter undersøkes for fosforylering med fosfospesifikk antistoffmerking14. Til tross for disse fremskrittene var det nødvendig med forbedringer for å gjøre kvantifiseringen av posttranslasjonell modifikasjon mer robust og anvendelig for et bredere spekter av proteiner.
Den nåværende protokollen beskriver en optimalisert SiMPull-tilnærming som ble brukt til å kvantifisere fosforyleringsmønstre av intakt epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) som svar på en rekke ligandforhold og onkogene mutasjoner15. Mens dette arbeidet fokuserer på EGFR, kan denne tilnærmingen brukes på alle membranreseptorer og cytosoliske proteiner av interesse (POI), for hvilke kvalitetsantistoffer er tilgjengelige. Protokollen inneholder trinn for å redusere prøve autofluorescence, en prøvematrisedesign som krever minimalt prøvevolum med samtidig forberedelse av opptil 20 prøver, og optimalisering av antistoffmerking og fikseringsforhold. Dataanalysealgoritmer er utviklet for enkeltmolekyldeteksjon og kvantifisering av fosforylaterte proteiner.
Protokollen beskrevet her ble optimalisert for å muliggjøre kvantitative målinger av reseptorfosforylering på enkeltproteinnivå. Flere enkle, men viktige modifikasjoner av SiMPull-protokollen ble utviklet som forbedret påliteligheten til målingen for fosfo-tyrosindeteksjon, inkludert reduksjon av autofluorescence med NaBH4-behandling og etterfiksering av prøven for å forhindre antistoffdissosiasjon. Bruk av den grønne kanalmasken til å identifisere reseptorplasseringer for beregning av colokaliserin…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 og R01CA248166 til DSL. EMB ble støttet gjennom ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) og JAR av UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi erkjenner takknemlig å bruke University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delt ressurs, støttet av NIH P30CA118100. Vi ønsker å anerkjenne Dr. Ankur Jain og Taekijip Ha, hvis opprinnelige utvikling av SiMPull inspirerte dette arbeidet.
ES-C nåværende adresse: Immunodynamikk Gruppe, Laboratorium for integrativ kreftimmunologi, Senter for kreftforskning, National Cancer Institute, Bethesda
1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
15 mL conical tube | |||
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
Buchner funnel | |||
Bunsen burner | |||
Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
DipImage | https://diplib.org/ | ||
DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
emCCD camera | Andor iXon | ||
Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
Fusion 360 software | Autodesk | ||
Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
Glass serological pipettes | |||
Glass Stir Rod | |||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
Ice | |||
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
in-house vacuum line | |||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
Milli-Q water | |||
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
Nanogrid | Miraloma Tech | ||
NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Nitrogen (compressed gas) | |||
NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
Pyrex 1 L beaker | |||
PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
Pyrex 250 mL beakers | |||
Pyrex 4 L beaker | |||
Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
Serological pipette controller | |||
Serological Pipettes | |||
smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |