Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En optimalisert enkeltmolekyls pull-down-analyse for kvantifisering av proteinfosforylering

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Den nåværende protokollen beskriver prøvepreparering og dataanalyse for å kvantifisere proteinfosforylering ved hjelp av en forbedret enkeltmolekyls pull-down (SiMPull) analyse.

Abstract

Fosforylering er en nødvendig posttranslasjonsendring som regulerer proteinfunksjonen og styrer cellesignaleringsresultatene. Nåværende metoder for å måle proteinfosforylering kan ikke bevare heterogeniteten i fosforylering på tvers av individuelle proteiner. Enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse ble utviklet for å undersøke sammensetningen av makromolekylære komplekser via immunoprecipitation av proteiner på en glassdekslelip etterfulgt av enkeltmolekylavbildning. Den nåværende teknikken er en tilpasning av SiMPull som gir robust kvantifisering av fosforyleringstilstanden til membranreseptorer i full lengde på enkeltmolekylnivå. Avbildning av tusenvis av individuelle reseptorer på denne måten gjør det mulig å kvantifisere proteinfosforyleringsmønstre. Den nåværende protokollen beskriver den optimaliserte SiMPull-prosedyren, fra prøvepreparering til avbildning. Optimalisering av glassforberedelse og antistofffikseringsprotokoller forbedrer datakvaliteten ytterligere. Den nåværende protokollen gir kode for dataanalysen med ett molekyl som beregner brøkdelen av reseptorer fosforert i en prøve. Mens dette arbeidet fokuserer på fosforylering av den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR), kan protokollen generaliseres til andre membranreseptorer og cytosoliske signalmolekyler.

Introduction

Membran-assosiert signalering er innstilt av en kombinasjon av ligandindusert membranreseptoraktivering og rekruttering av nedstrøms tilbehørsproteiner som forplanter signalet. Fosforylering av sentrale tyrosiner i reseptorcytoplasmatiske haler er avgjørende for å initiere dannelsen av signalkomplekser, eller signalosomer 1,2. Derfor er et viktig spørsmål i biologi hvordan fosforyleringsmønstre opprettes og vedlikeholdes for å rekruttere signalpartnere og diktere cellulære resultater. Dette inkluderer å forstå heterogeniteten til reseptorfosforylering, både i overflod og i de spesifikke fosfotyrosinmønstrene som kan gi et middel til å manipulere signalutganger ved å diktere sammensetningen av signalosomet 3,4,5,6,7. Det er imidlertid begrensninger i dagens metoder for å forhøre proteinfosforylering. Vestlig blotanalyse er utmerket for å beskrive trender for proteinfosforylering, men er semi-kvantitativ8 og gir ikke informasjon om systemets heterogenitet fordi tusenvis til millioner av reseptorer er gjennomsnittlig sammen. Mens vestlige flekker tillater probing av en prøve ved hjelp av fosfospesifikke antistoffer mot spesifikke tyrosiner, kan de ikke gi informasjon om multisite fosforyleringsmønstre i samme protein. Kvantitativ fosfoproteomikk rapporterer om fosfotyrosin overflod, men det er begrensninger for å oppdage multisite fosforylering, da rester av interesse må være plassert innenfor samme peptid (vanligvis 7-35 aminosyrer) som genereres ved enzymatisk fordøyelse 9,10,11.

For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, har enkeltmolekylets pull-down (SiMPull) analyse blitt tilpasset for å kvantifisere fosforyleringstilstandene til intakte reseptorer på enkeltmolekylnivå. SiMPull ble først demonstrert som et kraftig verktøy for å forhøre makromolekylære komplekser av Jain et al.12,13. I SiMPull ble makromolekylære komplekser immunoprecipitated (IP) på antistoff-funksjonaliserte glassdeksler og deretter analysert gjennom enkeltmolekylmikroskopi for proteinunderenhetsnummer og co-IP med komplekse komponenter12. En modifikasjon av Kim et al.14, kalt SiMBlot, var den første som brukte en variant av SiMPull til å analysere fosforylering av denaturerte proteiner. SiMBlot-protokollen er avhengig av å fange biotinylerte celleoverflateproteiner ved hjelp av NeutrAvidin-belagte deksler, som deretter undersøkes for fosforylering med fosfospesifikk antistoffmerking14. Til tross for disse fremskrittene var det nødvendig med forbedringer for å gjøre kvantifiseringen av posttranslasjonell modifikasjon mer robust og anvendelig for et bredere spekter av proteiner.

Den nåværende protokollen beskriver en optimalisert SiMPull-tilnærming som ble brukt til å kvantifisere fosforyleringsmønstre av intakt epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) som svar på en rekke ligandforhold og onkogene mutasjoner15. Mens dette arbeidet fokuserer på EGFR, kan denne tilnærmingen brukes på alle membranreseptorer og cytosoliske proteiner av interesse (POI), for hvilke kvalitetsantistoffer er tilgjengelige. Protokollen inneholder trinn for å redusere prøve autofluorescence, en prøvematrisedesign som krever minimalt prøvevolum med samtidig forberedelse av opptil 20 prøver, og optimalisering av antistoffmerking og fikseringsforhold. Dataanalysealgoritmer er utviklet for enkeltmolekyldeteksjon og kvantifisering av fosforylaterte proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverlip forberedelse

MERK: For dette trinnet må man bruke personlig verneutstyr (PVU), som inkluderer et dobbeltlag med nitrilhansker, vernebriller eller ansiktsskjerm og en labfrakk.

  1. Utfør piranha etsning for å fjerne organisk rusk fra glasset.
    FORSIKTIG: Piranha-løsningen er et sterkt oksidasjonsmiddel som er etsende og svært reaktivt når det kommer i kontakt med organiske materialer. Reaksjon med organisk rusk er eksotermisk og potensielt eksplosiv. Dermed må prosedyren utføres i en kjemisk avtrekkshette med rammen senket. Pyrex glassvarer er nødvendig for å håndtere piranha-løsningen.
    1. Forbered arbeidsområdet inne i en kjemisk avtrekkshette. Ordne deksler uten overlapping i bunnen av et 4 L glassbeger, "reaksjons" begeret, og plasser reaksjonsbegeret på en kokeplate med mild varme. La glasset varme i 10 min. Plasser et "avfall" 1 L glassbeger med 500 ml ddH2O proksimalt til reaksjonsbegeret.
    2. Tilsett 49 ml 12 N svovelsyre (H2SO4) langsomt til reaksjonsbegeret med en glassserologisk pipette. Skyll pipetten i avfallsbegeret før avhending.
    3. Tilsett 21 ml 30% hydrogenperoksid (H2O2) dråpevis med en glass serologisk pipette til reaksjonsbegeret. Fordel H2O2-dråpene jevnt over bunnen av reaksjonsflasken for å forhindre lokalisert slukking av piranha etsningsreaksjonen. Skyll pipetten i avfallsbegeret før avhending.
      FORSIKTIG: Legg alltid H2O2 i H2SO4, og aldri omvendt.
    4. Piranha etser dekslene i 30 min. Rør forsiktig innholdet i reaksjonsbegeret hvert 5.
    5. Slukk piranha-løsningen ved å helle innholdet i avfallsbegeret i reaksjonsbegeret. Overfør væsken sakte ned i veggen på reaksjonsbegeret for å minimere sprut. Fjern reaksjonsbegeret fra varmeplaten.
    6. Når reaksjonen slukkes og avkjøles, hell piranha-løsningen tilbake i avfallsbegeret for nøytralisering uten å fjerne de etsede dekslene fra reaksjonsbegeret.
    7. Nøytraliser piranha-løsningen med gradvis tilsetning av en svak base. Bruk for eksempel en overdreven masse 20 g natriumbikarbonat (NaHCO3)/100 ml piranha-løsning.
      FORSIKTIG: Ikke oppbevar piranha-løsninger i forseglede avfallsbeholdere. Oppløsningen må alltid nøytraliseres før avhending. Nøytraliseringsreaksjonen produserer kraftige bobler og kan være eksplosiv hvis den ikke kontrolleres av den gradvise tilsetningen av den svake basen.
    8. Rør den nøytraliserte løsningen med en rørestang i glass og la den reagere i 2 timer. Hev pH til >4 og kast oppløsningen.
    9. Mellom tilleggene av svak base til piranha-løsningen, overfør de etsede dekslene fra reaksjonsbegeret til en Buchner-trakt med en glassrørestang og skyll i 5 minutter i å kjøre ddH2O.
      MERK: Fortsett umiddelbart til neste trinn eller oppbevar piranha etsede deksler i opptil 2 uker i ddH2O i en forseglet glassburk eller Petri-tallerken (pakk med tetningsfilm, se Materialbord).
  2. Bath-sonicate dekslene i organiske løsningsmidler ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Legg dekslene i en Coplin-krukke i glass (se Materialbord) og dekk med metanol (CH3OH). Forsegle lokket til krukken med tetningsfilm og bad-soniker i 10 min. Hell metanolen forsiktig ut av Coplin-krukken i en glassflaske.
    2. Fyll Coplin-kannen med aceton (C3H6O), forsegle lokket og bad-soniker i 10 min. Hell acetonen forsiktig ut av Coplin-krukken i en glassflaske.
      FORSIKTIG: Metanol er brannfarlig og akutt giftig. Brukes i en kjemisk avtrekkshette. Aceton er brannfarlig og irriterende. Håndter derfor med og oppbevar det i glass, og bruk det i en kjemisk avtrekkshette. Deponeres som farlig avfall i henhold til lokale forskrifter og retningslinjer.
      MERK: Metanol og aceton kan brukes på nytt opptil fem ganger hver.
  3. Aktiver dekslene for silanfunksjonalisering.
    1. Bath-sonicate med 1 M kaliumhydroksid (KOH) i 20 min. Hell KOH forsiktig ut av Coplin Jar i et 50 ml konisk rør for gjenbruk.
      FORSIKTIG: KOH er etsende og irriterende. Brukes i en kjemisk avtrekkshette og må ikke oppbevares i glass. Oppbevar den i polypropylenrør. Deponeres som farlig avfall i henhold til lokale forskrifter og retningslinjer.
      MERK: KOH kan gjenbrukes opptil fem ganger.
    2. Skyll to ganger med ddH2O. Tøm ddH2O fra dekslene, og varm deretter opp hvert deksle ved å vifte gjennom flammen på en Bunsen-brenner for å drive av all overflatefuktighet. Legg dekslene i en tørr Coplin-krukke.
  4. Utfør coverlip aminosilanisering.
    1. Forbered aminosilaneoppløsningen ved å blande 69,4 ml metanol med 3,6 ml eddiksyre (CH3COOH) i en konisk kolbe. Tilsett 720 μL N-(2-aminoetyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (aminosilane) og bland godt (se Materialtabellen).
      FORSIKTIG: Eddiksyre er brannfarlig og etsende. Håndtak med glasspipetter og oppbevar i glass. Arbeid med eddiksyre i en kjemisk avtrekkshette. Aminosilane er en akutt giftig innåndingsfare, en sensibilisator og en irriterende. Det er skadelig for vannlivet. Brukes i en kjemisk avtrekkshette. Kast kjemikaliene som farlig avfall i henhold til lokale forskrifter og retningslinjer.
      MERK: Aminosilane er lysfølsom og hydrolyserer raskt i vann. Alle trinn med dette reagenset må utføres under minimale lysforhold for å beholde aktiviteten. Tøm flasken med nitrogengass og påfør tetningsfilm før lagring i en mørk tørkemaskin. Skift ut hver 6-9 måneder.
    2. Tilsett umiddelbart aminosilaneløsningen i Coplin-krukken. Dekk og påfør tetningsfilmen, fortsett å beskytte mot lys.
    3. Inkuber dekslene i aminosilaneløsningen i 10 min i mørket ved romtemperatur (RT). Bath-sonicate i 1 min og deretter inkubere i ytterligere 10 min. Hell aminosilaneløsningen forsiktig i en avfallsbeholder beregnet for CH3OH med sporaminosilane og CH3COOH.
    4. Skyll dekslene med metanol og hell oppløsningen i en avfallsbeholder beregnet på metanol.
    5. Skyll dekslene tre ganger i 2 minutter hver med ddH2O. Tøm dekslene, tørk bort overflødig fuktighet og lufttørk helt i 10 minutter.
  5. Utfør matrisepreparatet/biotin-PEG-funksjonaliseringen av dekslene.
    1. Forbered 1 M NaHCO3 (pH 8,5) arbeidslager ved å oppløse 84,5 mg NaHCO3 til 1 ml ddH2O. For endelig konsentrasjon på 10 mM NaHCO3, fortynn 1 M NaHCO3 til ddH2O (1:100).
    2. Tegn en rutenettmatrise på de tørre aminosilaniserte dekslene med en hydrofob barrierepenn (se Materialbord) og vent til blekket tørker. Skriv en identifikator på omslaget for å markere riktig retning. Plasser dekslene i et fuktet kammer.
      MERK: Matrisen skal bestå av 16-20 ruter, ca. 4 mm x 4 mm i størrelse.
    3. For å lage biotin-PEG succinimidyl valerate (biotin-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG) løsning, fjern først mPEG og biotin-PEG (se Materialliste) fra fryseren og likevekt til RT. Tilsett 153 mg mPEG og 3,9 mg biotin-PEG (~1:39 biotin-PEG:mPEG) i et 1,5 ml mikrosenterrør, og resuspend i 609 μL 10 mM NaHCO3 ved skånsom pipettering. Sentrifuge ved 10.000 x g i 1 min på RT for å fjerne bobler.
      MERK: Hydrolysens halveringstid for succinimidyl valerate i pH 8,5 buffer er ~30 min. Etter å ha lagt bufferen til mPEG, fortsett med følgende trinn så raskt som mulig. Dette trinnet er kritisk.
    4. Påfør biotin-PEG/mPEG-løsningen for å dekke hver firkant helt i dekslene, vanligvis 10-15 μL per kvadrat. Ikke la væske overløpe det definerte rommet. Oppbevar dekslene i et fuktighetskammer i mørket i 3-4 timer ved RT.
    5. Vask dekslene med store mengder vann ved å dyppe dem sekvensielt i 3x 250 ml glassbeger fylt med ddH2O i 10 s hver.
    6. Kjør av all fuktighet fra dekslene med nitrogengass. Oppbevar dekslene back-to-back i et nitrogenfylt 50 ml konisk rør innpakket med tetningsfilm ved -20 °C.
      MERK: Fortsett umiddelbart til trinn 2 eller oppbevar deksler ved -20 °C i opptil 1 uke før bruk.

2. Forberedelse av SiMPull lysat

FORSIKTIG: Det nødvendige verneutstyret for de resterende trinnene i protokollen er nitrilhansker, vernebriller og labfrakker.

MERK: Lysatene ble fremstilt fra de tilhenger cho cellene som uttrykker EGFR-GFP. Cellene ble belagt i en 60 mm vevskultur (TC60) tallerken over natten 12,13. CHO-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% foster bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin og 500 ng/ml genetin (se materialfortegnelse). Andre tilhengercellelinjer eller suspensjonsceller kan også brukes.

  1. Plater cellene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Vask kulturretten (som inneholder cellene) med 1 ml 1x PBS. Tilsett 1 ml 1x Trypsin og inkuber i 5 minutter ved 37 °C for å løsne cellene. Bruk en pipette, overfør de frittliggende cellene fra parabolen til et 1,5 ml sentrifugerør.
    2. Ta 10 μL trypan blå og bland med 10 μL celleoppheng i et separat sentrifugerør. Tell celler ved hjelp av 10 μL av celleblandingen i en automatisk celleteller, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell).
    3. Plate 8 x 105 celler over natten i en TC60 petriskål. Tallerken en tallerken per tilstand.
      MERK: For den nåværende studien ble cellene enten ubehandlet eller behandlet med Pervanadate og EGF som beskrevet i trinn 2.4.1.
  2. Forbered følgende løsninger for cellelyspreparatet.
    1. Forbered iskald 1x PBS (pH 7.4).
    2. Klargjør lysisbuffer, en løsning på 1% ikke-ionisk, ikke-degenererende vaskemiddel (se Materialtabell) i 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) og 150 mM NaCl supplert med Protease/Fosfatasehemmer (PPI) (1:100 fra lager). Plasser røret på en mutter og la bufferen blande i 15 minutter. Hold den tilberedte løsningen på is.
    3. Forbered Tyrodes buffer for en endelig konsentrasjon på 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM glukose og 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA) (se Materiallisten). Varm oppløsningen til 37 °C.
  3. Forbered den positive kontrollen for fosforylering - 1 mM pervanadatbehandling.
    MERK: Dette trinnet er valgfritt. Pervandate er den peroksiderte formen av vanadat-en hemmer av protein tyrosinfosfater16. Forebygging av proteindefosforylering ved å hemme fosfataseaktivitet resulterer i en svært fosforylert prøve.
    1. Forbered en 200 mM lager av aktivert natrium orthovanadate (Na3VO4).
      1. For å tilberede 100 ml oppløsning tilsettes 3,89 g Na3VO4 (se materialtabellen) til 90 ml ddH2O og oppløses under omrøring. Juster pH til 10 ved å legge til HCl eller NaOH dropwise. Hvis du legger til HCl, blir løsningen gul.
      2. Ta volumet til 100 ml med ddH2O. Kok oppløsningen ved å varme den opp i mikrobølgeovnen. Etter koking vil løsningen være fargeløs.
      3. Avkjøl løsningen til RT og juster pH til 10. Gjenta justeringen av koking, kjøling og pH to til fire ganger til, til pH stabiliserer seg ved 10. Aliquot og oppbevar ved -20 °C.
    2. Forbered et lager på 30 mM pervanadate (PV) ved å blande 20,4 μL 3% H2O2 med 100 μL 200 mM Na3VO4 og 546,8 μL ddH2O (hestekonsentrasjoner av H2O2 og aktivert Na3VO4). Inkuber i mørket på RT i 15 min.
    3. Klargjør 1 mM PV i Tyrodes buffer. For 10 ml oppløsning, tilsett 0,33 ml 30 mM PV-lager til 9,67 ml 37 °C Tyrodes buffer. Behandle celler umiddelbart.
    4. Vask celler en gang med 3 ml Tyrodes buffer. Tilsett 3 ml 1 mM PV i Tyrodes buffer i cellene og inkuber i 15 min ved 37 °C.
  4. Utfør ligandstimuleringen.
    1. Stimulere celler med ligaen av interesse ved hjelp av passende konsentrasjon, tid og temperatur. For maksimal EGFR-stimulering, inkuber med 1 ml 50 nM epidermal vekstfaktor (EGF, se materialtabell) + 1 mM PV i Tyrodes buffer i 5 min ved 37 °C.
  5. Utfør cellelys.
    1. Etter ønsket cellebehandling, legg parabolen på is og vask med iskald 1x PBS. Fjern hele volumet av PBS fullstendig ved hjelp av en pipette.
    2. Tilsett 180 μL lysisbuffer (trinn 2.2.2) på platen. Bruk en celleskraper til å trekke bufferen rundt platen for å dekke cellene fullstendig. Påfør fast, konsistent trykk med celleskraperen over hele den kultiverte overflaten for å lyse cellene fullt ut.
      MERK: Volumet av lysisbuffer må holdes på et minimum for å sikre høy proteinkonsentrasjon.
    3. Pipette de lysede cellene og overfør dem til et 1,5 ml rør. Hold røret på is i 30 min. Virvel lyser hver 5 min.
      MERK: Hvis interessepunktet består av flere underenheter eller er følsomt for dissosiasjon, må du ikke viske ut lysatene.
    4. Sentrifuger de lysede cellene ved 16 000 x g i 20 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør ved hjelp av en pipette. Dette inneholder det totale proteinlyset.
    5. Reserver 10 μL av lysatet og fortynn det til 90 μL av lysisbufferen for bicinkononinisk kolorimetrisk analyse (BCA) analyse17. Oppbevar det gjenværende totale proteinlyset ved -80 °C.
    6. Bestem total proteinkonsentrasjon ved hjelp av BCA-analyse (se Materialtabell).
      MERK: Totale proteinlysater kan tilberedes på eksperimentdagen og brukes friske eller lagres som engangs aliquots ved -80 °C i opptil 12 uker. Ikke frys/tine.

3. Funksjonalisering av matrisen med det biotinylerte antistoffet

  1. Forbered følgende løsninger.
    1. T50 Buffer, en løsning på 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 50 mM NaCl. Løsningen er stabil i 1 måned på RT.
    2. T50-BSA ved å supplere T50 buffer med 0,1 mg/ml BSA. Hold den tilberedte løsningen på is.
    3. 10 mg/ml natriumborohydrid (NaBH4) i 1x PBS. Forbered dette umiddelbart før bruk.
    4. 0,2 mg/ml NeutrAvidin (se materialfortegnende) i T50-buffer.
      FORSIKTIG: NaBH4 er et reduksjonsmiddel og er brannfarlig. Tøm alltid beholderen med nitrogengass etter bruk og oppbevar den i en tørkeapparat.
  2. Funksjonaliser matrisen med det biotinylerte antistoffet.
    1. Fjern PEG-biotin funksjonaliserte arrayer fra fryseren og likevekt det koniske røret til RT før åpning. Plasser dekslene med matrisen orientert opp på en tetningsfilm foret 100 mm vevskultur (TC100) tallerken.
      MERK: Minimer overheadbelysningen. Alle løsninger skal "perle opp" på rutene som er definert av det hydrofobe arrayet. Tilsett et passende løsningsvolum for å dekke hver firkant helt (vanligvis 10-15 μL) og ikke la væske overløpe det definerte rommet. Hvis du raskt vil fjerne væsker, bruker du en intern vakuumledning festet til en vakuumflaske for å fange opp avfall. La NaBH4 avfettes i 1 time før avhending ved å la røret stå åpent i den kjemiske avtrekkshetten. NaBH4-behandling er nødvendig for å redusere autofluorescens i bakgrunnen, og dermed redusere falske positive enkeltmolekyldeteksjoner.
    2. Behandle hver kvadrat av matrisen med 10 mg/ml NaBH4 i 1x PBS i 4 min ved RT. Vask tre ganger med PBS.
    3. Inkuber hver firkant i 5 min med 0,2 mg/ml NeutrAvidin i T50. Vask tre ganger med T50-BSA.
      MERK: NeutrAvidin binder seg til PEG-biotin og gir et bindende sted for biotinylerte antistoffer 12,13,15.
    4. Inkuber hver firkant i 10 min med 2 μg/ml biotinylert POI-spesifikt antistoff i T50-BSA; vask tre ganger med T50-BSA.
      MERK: Den nåværende protokollen bruker biotinylert anti-EGFR IgG (se Materialfortegnelse) for å fange EGFR-GFP.

4. SiMPull av POI fra helcellede lysater

MERK: Plasser TC100-retten med funksjonaliserte SiMPull-rekker på is for resten av SiMPull-preparatet. Dette trinnet er nedtrekk av et POI fra total proteinlysat. Lysatet må ikke gjenbrukes etter opptining.

  1. Forbered følgende løsninger.
    1. Forbered 4% paraformaldehyd (PFA)/0,1% glutaraldehyd (GA) i 1x PBS.
      FORSIKTIG: PFA og GA er giftige kjemiske fikseringer og potensielle kreftfremkallende stoffer. Bruk verneutstyr. Kast kjemikaliene som farlig avfall i henhold til lokale forskrifter og retningslinjer.
    2. Forbered 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. Tine og bland lysatet ved å pipette forsiktig opp og ned. Hold deg på isen.
  3. Fortynn 1 μL av lysatet til 100 μL iskald T50-BSA/PPI.
    MERK: Om nødvendig, bestem riktig fortynningsfaktor for det totale proteinlyset ved å påføre en rekke fortynninger på matrisen. Den optimale tettheten til SiMPull-reseptorer per matriseområde er 0,04-0,08/μm2. Lysatfortynning kan vurderes i trinn 6 (Dataanalyse).
  4. Inkuber lysatet på matrisen i 10 min; Vask deretter fire ganger med iskald T50-BSA/PPI.
  5. Fortynn AF647-konjugert antifosfotyrosinantistoff (se Materialfortegnelse) i iskald T50-BSA/PPI og inkuber på matrisen i 1 time.
    MERK: I den nåværende protokollen brukes en pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG til å identifisere fosforylatert populasjon av EGFR-GFP. Bruken av direkte merkede antistoffer fjerner behovet for sekundære antistoffer, øker merkingsalternativene og forbedrer konsistensen av resultatene. Fluorescerende merkede antistoffer kan fås fra kommersielle kilder. Hvis det ikke er kommersielt tilgjengelig, kan antistoffer tilpasses merket ved hjelp av standard biokonjugeringsteknikker, og kommersielle biokonjugeringssett er tilgjengelige. Hver gruppe fluorescerende merkede antistoffer må testes for optimale merkingsforhold ved å utføre SiMPull for å måle en dosekurve og finne metningspunktet.
  6. Vask seks ganger med iskald T50-BSA i totalt 6-8 min.
  7. Vask to ganger med iskald 1x PBS.
  8. Inkuber matrisen med 4% PFA / 0,1% GA-løsning i 10 min for å forhindre antistoffdissosiasjon.
  9. Vask to ganger i 5 minutter hver med 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS for å inaktivere fikseringsmiddelene.
    MERK: For eksperimenter som bruker mer enn ett antistoff (f.eks. påvising av flere fosfotyrosinsteder), gjentar du trinn 4.5-4.9. Se trinn 6.2.9 for informasjon om fastsettelse av sterisk hindring mellom to antistoffer.

5. Bildeoppkjøp

MERK: Enkeltmolekylell bildeanskaffelse utføres ved hjelp av et 150x TIRF-mål og en bildesplitter som fanger hver spektralkanal i en bestemt kvadrant av emCCD-kameraet (se Tabell over materialer). Kalibreringsbilder anskaffes først for å muliggjøre kanalregistrering og kameraforsterkningskalibrering med et nanopatnert kanaljusteringsgitter (nanogrid) som inneholder 20 x 20 matriser på 200 ± 50 nm hull i en intrahullavstand på 3 ± 1 μm (total størrelse ~ 60 μm × 60 μm).

  1. Utfør kanalregistrering ved å følge trinnene nedenfor.
    MERK: Nøyaktig kanalregistrering er nødvendig for å beregne colokaliseringen av emittere på riktig måte. Dette trinnet er kritisk.
    1. Rengjør oljemålet og deponer en dråpe olje på målet. Plasser nanogridet på scenen for avbildning. Fokuser på rutenettmønsteret ved hjelp av overført hvitt lys.
      MERK: Bilder med nanogridet er anskaffet ved hjelp av overført lys, som passerer gjennom nanogridet og oppdages i alle spektralkanaler. Alternativt kan man bruke multifluorescerende perler som avgir fluorescens som oppdages i hver kanal. Bildeanskaffelse må optimaliseres i henhold til hvert mikroskopoppsett.
    2. Skaff deg en serie på 20 bilder av rutenettet. Kontroller at bildepunktene ikke er mettet. Lagre bildeserien som "Fiducial".
    3. Defokuser nanogridet for å lage et luftig mønster18. Skaff deg en serie på 20 bilder for å få kalibreringer. Lagre bildet som "Gain".
    4. Skaff deg en serie på 20 bilder for kameraforskyvning ved å blokkere alt lys fra å gå til kameraet. Lagre bildet som "Bakgrunn".
  2. Hent SiMPull-bilder.
    MERK: Før du ser på coverlip-arrayet, må du bytte Tris-løsningen mot T50-BSA og likevekte matrisen til RT.
    1. Rengjør oljemålet og deponer ekstra olje på målet. Fest dekslene på mikroskopstadiet.
    2. Optimaliser hver fluorofors eksitasjonskraft, TIRF-vinkel og kameraintegreringstid. Målet er å oppnå den høyeste signal-til-støy mens du minimerer fotobleaching av prøven. Registrer laserkraften for konsistens i fremtidige målinger.
      MERK: Den nåværende studien brukte 300 ms eksponeringstid for den fjernrøde kanalen og 1 s for den grønne kanalen. Laseren på 642 nm ble brukt med omtrent 500 μW lasereffekt, mens 488 nm laser ble brukt ved 860 μW, målt før rørlinsen.
    3. Hent bilder for hvert eksempel. Bilde den fjernrøde kanalen først, etterfulgt av hver nedre bølgelengde fluorofor for å redusere fotobleaching. På grunn av det lave volumet som brukes for hver prøve, kontroller buffernivået hver 30-45 min og etterfyll etter behov.

6. Dataanalyse

  1. Last ned demokodene.
    MERK: Den medfølgende demokoden og eksempeldatasettene demonstrerer hele arbeidsflyten for dataanalyse (Tilleggskodingsfiler 1-4). Systemkravene som er oppført i SiMPullMain.m, finnes i Tilleggskodingsfil 1.
    1. Pakk ut og lagre i en personlig Documents/MATLAB-katalog (MacOS/Linux) eller Documents\MATLAB (Windows).
      MERK: Dette genererer fire nye mapper: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Åpne ReadMe_Setup.txt-filen som du finner i SiMPull_class-mappen.
    3. Installer MATLAB- og MATLAB-verktøykasser: Verktøykasse for kurvetilpasning, Verktøykasse for parallell databehandling og verktøykasse for statistikk og maskinlæring.
    4. Installer DipImage19 i henhold til nedlastingsinstruksjonene.
    5. Installer "smite" enkeltmolekylanalysepakke som beskrevet i ReadMe_setup.txt.
      MERK: "smite" er tilgjengelig på GitHub-repositoriet (se Tabell over materialer).
    6. Åpne SiMPullMain.m, som du finner i SiMPull_class mappe, ved å dra filen inn i MATLAB-vinduet.
    7. Endre katalogen til ...\MATLAB\Eksempeldata\ ved å klikke ikonet Bla gjennom etter mappe og velge mappen.
  2. Oversikt over databehandlingstrinn
    1. Kjør SiMPullMain.m - ved å følge instruksjonene for hver seksjon. Utfør hver inndeling enkeltvis ved å plassere markøren i den delen og klikke kjør inndeling-ikonet.
      MERK: De generelle trinnene for dataanalyse er beskrevet i denne delen. Detaljerte instruksjoner finnes i den medfølgende SiMPullMain.m-koden.
    2. Kjør delen Initialisering for å angi banen for å definere spektralkanaler og bildestørrelse.
    3. Kjør delen "Finn kameraforsterkning og forskyvning" for å konvertere kameraforsterkning til fotoner ved hjelp av Gain- og Background-datasettene.
    4. Kjør delen "Kanalregistrering" for å beregne den lokale vektede gjennomsnittstransformasjonen som brukes til bilderegistrering.
    5. Formater og kurater dataene. Kjør delen Bli med i sekvensielle kanaler i et firebilde. Kjør "Fjern ugyldige rammer".
    6. Kjør delen "Fit Single Molecules and Find Overlapping Molecules".
      MERK: Denne delen utfører flere funksjoner for å lokalisere enkeltmolekyler i hver kanal og bestemme colokaliseringshendelser mellom spektralkanaler.
    7. For å bestemme minimum antall foton per ekte GFP-passform, kjør "Optimaliser minimum fotonterskel". Dette er en iterativ prosess.
      1. Først setter du smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] og kjør delen. Velg "Tomme data" filer når du blir bedt om det. Gjenta med "CHO-EGFR-GFP" -filene.
      2. Velg en passende minimumsterskelverdi ved å sammenligne de to histogrammene. Sett smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] og kjør delen på nytt.
    8. Kjør delen Beregn prosent av GFP passer positivt for FR-signal for å korrigere bakgrunnslokaliseringer og beregne endelige verdier.
    9. Utfør alternativ 1 (trinn 6.2.10) eller alternativ 2 (trinn 6.2.11) i henhold til eksperimentelt behov.
    10. Alternativ 1: Korrekt for antall reseptorer som er tilgjengelige ved plasmamembranen for ligandbinding, som beskrevet i referanse15.
      1. Først merker du overflatereseptorer med mettende nivåer av fluorescerende NHS Ester-fargestoff (NHS-AF647, se Materialfortegnelser). Utfør deretter et SiMPull-eksperiment for å bestemme prosentandelen av GFP-lokalisering som colokaliserer med AF647.
        MERK: Dette gir et estimat av brøkdelen av reseptorer som er tilgjengelige for NHS-merking og forholdet mellom reseptorer på overflaten (SR).
      2. Bruk SR-korreksjonen i den endelige beregningen: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, der NGFP er det korrigerte antallet GFP-lokaliseringer, NBG er bakgrunnslokaliseringsnummeret, og NLOC er totale lokaliseringer.
        MERK: I det nåværende eksemplet brukes ikke denne korreksjonen fordi Pervanadate er membrangjennomtrengelig16 og derfor er virkningen av fosfatasehemming ikke begrenset til overflatereseptorer.
    11. Alternativ 2: For multisite fosforyleringsmålinger, vurder potensialet for sterisk hindring når to antistoffer brukes.
      MERK: Sterisk hindring kan forårsake en reduksjon i den observerte prosentandelen fosforylaterte reseptorer for antistoff 1 når det er i nærvær av antistoff 2 (P12), sammenlignet med antistoff 1 alene (P1).
      1. Bruk SiMPull til å bestemme P1 og P12 og beregne korreksjonsfaktoren for sterisk hindring, etter tidligere publisert referanse15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tegneserie som viser SiMPull-prosessen er vist i figur 1A. Coverlips er funksjonalisert ved hjelp av NeutrAvidin som anker for biotinylerte anti-EGFR antistoffer for å fange EGFR-GFP fra totale proteinlytter. Etter å ha vasket bort ubundet protein, er fosforylaterte reseptorer merket med et anti-fosfotyrosin (anti-PY) antistoff15. Figur 1B viser et bilde av den hydrofobe matrisen, der flere prøver kan tilberedes og avbildes på samme deksle. En fordel med denne prøveholderen er at det kreves minimale prøvevolumer på ~ 10 μL. Dekslene kan avbildes ved å plassere det direkte på mikroskopstadiet. Det er imidlertid nyttig å stabilisere dekslene ved å bruke en deksleslipholder. Deksleholderen som vises i figur 1B , ble opprettet ved hjelp av en 3D-skriver, og plantegningen leveres i tilleggskodingsfil 5. Den hydrofobe blekkets autofluorescens er en nyttig veiledning for å finne fokusplanet til prøven (figur 1C). Et eksempel på et raw-bilde med flere stokker vises i figur 1D. Et overlegg av de rågrønne og fjernrøde kanalene er vist i figur 1E.

Figur 2 skisserer analysearbeidsflyten og gir representative data. Datainnsamlingen starter først med anskaffelse av fiducials for kanalregistrering, som brukes til å legge over de enkelte spektralkanaldataene (figur 2A). Lysfeltbilder tas med et nanogridmønster som passerer hvitt lys og oppdages i hver spektralkanal i bildesplitteren (vises ikke). Den grønne kanalen fungerer som referansekanal, og den helt røde kanalen er den forskjøvne kanalen. Den lokale vektede gjennomsnittstransformasjonen beregnes ved hjelp av fitgeotrans20-funksjonen i MATLAB og brukes til å flytte fjernrøde koordinater inn i koordinatrammen til den grønne kanalen. Denne transformeringen bruker en polynom modell i andre rekkefølge på hvert kontrollpunkt. Flerkanalsdata for SiMPull-matrisen hentes deretter. Denne arbeidsflyten besto av en halvautomatisert anskaffelse, der en start-ROI ble valgt for den bestemte eksempelplassen, og tre områder rundt dette området ble avbildet, slik at hvert datasett inneholder hele firevisningsbildet fra tre uavhengige ROIer (figur 1D). I hver spektralkanal finnes emitterkandidatplasseringene ved å bruke en forskjell på gaussisk filter på bilder og identifisere lokal maxima. Underregioner (bokser, figur 2B) tegnes rundt lokal maxima, og antall emitterfotoner beregnes ved å anta at hver underregion bare inneholder én sender. Underregioner som holder emitterkandidater med fotonantall over en minimumsverdi beholdes for montering. En gaussisk punktspredningsfunksjon (PSF) passer til hver emitterkandidat innenfor små underregioner som er omtrent sentrert rundt hver emitter. De resulterende lokaliseringene er terskel basert på fotonantallet, bakgrunnen, Cramér-Rao nedre grense for tilpasningskoordinatene, PSF-variansen (dvs. PSF-bredde) og en p-verdi som beskriver godheten til passformen til PSF-modellen. Et gaussisk bilde opprettes for hver spektralkanal, med gaussiske blober med jevn intensitet plassert ved koordinatene for hver god passform (figur 2C). Colocalization visualiseres ved å legge over de gaussiske bildene fra hver spektralkanal ved hjelp av transformeringen beregnet fra den fiduciale prøven (figur 2D). Det er viktig å fluorescerende merke reseptoren for identifisering siden det fortsatt er ikke-spesifikk binding av antifosfotyrosin antistoffer til overflaten når cellelysat er til stede. EGFR-GFP (grønn kanal) brukes til å generere en maske av reseptorplasseringene, og bare AF647-anti-PY-signalet (fjernrød kanal) i den masken telles (figur 2D). Par innenfor 1 piksel (106,7 nm pikselstørrelse) anses å være colokalisert og lagret i en liste som inneholder referansekanalkoordinatene. Andelen AF647 colokalisert med GFP beregnes for å bestemme brøkdelen av fosforiede reseptorer (figur 2E).

Det er flere kritiske trinn for å sikre god datakvalitet. En slik innsats er å inkubere coverlip array med NaBH4 som beskrevet i protokollen for å slukke autofluorescence i den grønne kanalen. Denne autofluorescensen refererer til det ikke-spesifikke signalet på grunn av mulige urenheter på glasset, som inneholder enkle eller konjugiserte πbindinger 21. Slike urenheter er potensielt fra aminosilane- og PEG-reagensene som brukes i funksjonaliseringsprosessen eller støv fra luften, og har en tendens til å fluoresce i den grønne spektralkanalen. Til tross for innsats for å holde glass lagret under nitrogen, kan disse molekylene også genereres gjennom oksidasjon som oppstår i lagring. NaBH4 har også blitt brukt til å redusere fluorescens fra urenheter på lysbilder og mikroarrays, inkludert de med silanbelegg16. Figur 3A viser reduksjonen i antall bakgrunnsdeteksjoner som oppstår når piranha etset glass behandles med NaBH4. Mens NaBH4 reduserer bakgrunnsfluorescens dramatisk, oppdages fortsatt noen emittere i den grønne kanalen. Man kan korrigere dette ved å innhente bakgrunnsbilder fra lysatefrie prøver (figur 3D) og trekke det gjennomsnittlige antallet bakgrunnslokaliseringer fra de GFP-inneholdende prøvene. Fluorescens fra urenheter ble ikke oppdaget i den ytre røde kanalen. Hvis reseptortettheten er for høy, finner du flere GFP-sendere på ett enkelt difffraksjonsbegrenset sted (data vises ikke). Ved hjelp av trinnfotobleking for å identifisere antall fastleger per punkt, fant vi ut at en reseptortetthet mellom 0,04-0,08 proteiner/μm2 ga tilstrekkelig avstand mellom enkelte emittere for å fjerne potensialet for å finne flere emittere per punkt12. Reseptortettheten kan optimaliseres ved å variere mengden IP-antistoff som er bundet til glassoverflaten eller mengden lysat som tilsetts. Det er viktig å sikre at antistoffet rettet mot POI brukes ved metningsnivåer. Det anbefales å skaffe seg en antistoffkonsentrasjonskurve på fosforylaterte prøver for å bestemme de riktige merkingsforholdene (figur 3B). I tillegg må fosfo-spesifisiteten til et antistoff valideres med hvileprøver og/eller behandling med proteinspesifikke kinasehemmere (figur 3B). Antistoffer vil ta avstand fra reseptoren under bildetidsvinduet. Behandling av prøven med en kombinasjon av PFA og GA forhindret signaltap (figur 3C).

Til slutt er det viktig å optimalisere enkeltmolekylets tilpasningsparametere. Det første "box finding"-trinnet som identifiserer potensielle emitterkandidater (figur 2B) må være sjenerøse for at mange kandidater skal kunne gjennomgå gaussisk tilpasning. Dermed kan den minste fotonterskelen for boksfunn være relativt lav for å fange alle ekte emittere og noen bakgrunnsflekker. Det er også viktig å ikke angi boksstørrelse og overlappingsgodtgjørelse for liten. Å holde boksstørrelsen innenfor 5-7 piksler og tillate overlapping med to bildepunkter er ideelt for emittere ved anbefalt tetthet. Etter at boksen er funnet, må minimumsterskelen for fotoner i monteringstrinnet optimaliseres. Minimum photons parameter bidrar til å bestemme hvilke Gaussian monterte emittere passerer som en sann passform. For å finne riktig minimumsterskel for foton for ekte GFP-tilpasning, inneholder koden en histogramtegningsfunksjon for å undersøke fotonene/lokaliseringen i både bakgrunn (ingen cellelysat) og GFP-inneholdende (plusscellelyse) (figur 3D). Dette trinnet er viktig fordi, mens NaBH4 reduserer mengden fluorescens fra urenheter, fjerner den ikke alle bakgrunnslokaliseringer. Figur 3D viser behovet for å angi en minimumsterskel for foton for å redusere antall deteksjoner fra urenheter. For å bestemme denne terskelen beregnes et histogram av bakgrunnsemitterintensiteter fra avbildning av et utvalg som ikke er utsatt for cellelys (figur 3D, øverst til venstre). De fleste av bakgrunnssenderne ble funnet å ha verdier mindre enn 475 fotoner. Til sammenligning viste prøven som inneholder ekte GFP-emittere en betydelig brøkdel av fordelingen over 475 (figur 3D øverst til høyre). Terskelen velges ved inspeksjon for å fjerne så mange bakgrunnsantall som mulig, samtidig som mengden signaltap fra lysatprøven minimeres (figur 3D, nederste rad). Den gjenværende bakgrunnstellingstettheten ved denne terskelen redegjøres for i den kvantitative analysen.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over prøveforberedelse. (A) Tegneserie som viser SiMPull-tilnærmingen. Coverlips er funksjonalisert med et antistoff som gjenkjenner POI for å fange at POI fra hele celle lysater. Glasset er først belagt med PEG og biotin-PEG. NeutrAvidin er deretter bundet til biotin-PEG og fungerer som et anker for det biotinylerte anti-POI-antistoffet. Fosforrylaterte proteiner oppdages deretter med et fluorescerende merket anti-PY-antistoff. (B) Fotografi av deksleholderen (rød) med deksler på plass og montert på mikroskopstadiet. De multisample matrisene genereres ved hjelp av hydrofob blekk for å lage opptil 20 individuelle prøve firkanter på en enkelt glassdekslerlip. Dekslene er 60 mm x 24 mm. (C) Eksempelbilder av hydrofob blekk autofluorescence (magenta) og fluorescerende perler (grønn). Autofluorescence av hydrofob blekk er en nyttig guide for å finne fokusplanet på dekslene. (D) Eksempel på et RAW-databilde med spektralkanaler atskilt på kamerabrikken av bildesplitteren med fire visninger. Firevisningsfiltersettet inneholder følgende utslippsfiltre: blå (445/45 nm), grønn (525/45 nm), rød (600/37 nm), fjernrød (685/40 nm). (E) Rå overlegg av grønne og fjernrøde kanaler. Den hvite boksen angir området som er nærmere undersøkt i figur 2B-D. Skalalinje (C-E) = 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for dataanalyse. (A) Kanalregistrering utføres først på bilder hentet fra nanogridet. Etter å ha beskåret de to spektralkanalene av interesse (her, grønn og fjernrød), blir de fiduciale bildene for hver kanal lagt over (venstre). Utvidelse av boksen i venstre bilde (Innsett) viser at bildene ennå ikke er registrert. Senderne i hver kanal passer til en gaussisk modell og er lokalisert (Registrering). Lokalisering av emittere vises som sirkler for den ytre røde kanalen og krysser for den grønne kanalen. Det siste trinnet er å bruke en lokal vektet gjennomsnittstransformasjon for å flytte de fjernrøde kanallokaliseringskoordinatene til den grønne kanalreferanserammen (Justert). Den beregnede lokale vektede gjennomsnittstransformasjonen brukes deretter til å registrere de påfølgende SiMPull-dataene. (B) Representative bilder av den grønne/EGFR-GFP-kanalen og den fjernrøde/AF647-anti-PY-kanalen. Enkelte sendere over antall fotoner i bakgrunnen identifiseres og merkes med bokser. (C) Utslippsprofilen i hver valgte boks passer til en gaussisk modell, og senderne som passer til modellen til en enkelt fluorofor PSF beholdes. (D) Det opprettes en maske fra GFP-senderne for å identifisere plasseringen av EGFR-GFP (grønn). Colocalization av EGFR-GFP og AF647-anti-PY identifiserer fosforylaterte reseptorer (hvite). (E) Fraksjonen av fosforylaterte reseptorer beregnes ut fra de colokaliserte EGFR-GFP- og AF647-anti-PY-reseptorene. Stolpediagrammet sammenligner PV + EGF-behandling med hvileceller, gjennomsnittet for flere målinger. Feilfelt representerer standardfeil beregnet med tanke på en binomisk fordeling. Skalalinje = 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kritiske trinn for å sikre datakvalitet. (A) Fra venstre mot høyre er de tre første panelene representative bilder av autofluorescensen på glass under de respektive forholdene: etter piranha-etsning, med PEG og PEG pluss NaBH4-behandling (indikert med +). I tillegg beholdes overflatefunksjonalisering etter NaBH4-behandling som demonstrert ved minimal ikke-spesifikk PY99-AF647-binding, samtidig som den beholder robust binding av EGFR-GFP fra lysatet. (B) Det må anskaffes en metningskurve for hver gruppe antistoffer som brukes til å sikre optimal antistoffmerking. Denne figuren viser konsentrasjonskurven for merking av EGFR med det stedsspesifikke fosfotyrosinantistoffet, anti-EGFR-pY1173. Minimal fosforylering påvises i ubehandlede celler (Hvile, grå diamant). Som en kontroll for ikke-spesifikk binding ble celler også behandlet med EGFR kinase inhibitor, Lapatinib, før de la til 100 nM EGF (magenta trekant), som viser forventet forebygging av EGFR fosforylering. Feilfelt representerer standardfeil forutsatt en binomisk distribusjon. (C) Fiksering av prøven med en kombinasjon av PFA og GA forhindrer antistoffdissosiasjon over tid. Feilfelt representerer standardfeil forutsatt en binomisk distribusjon. (D) Falske positiver utelukkes ved å velge riktig terskel for gaussisk tilpasning. Sammenligning av histogrammet for tilpasningsintensiteter ved en lav terskel (Terskel = 0; øverst) mellom bakgrunn (ingen lysate) og reelle data (pluss cellelysat) gjør det mulig å velge riktig verdi (Terskel = 475; bunn) for å fjerne passer fra autofluorescent flekker i den grønne kanalen. Den loddrette magentalinjen angir en terskel på 475 foton. Histogrammer beregnes fra samme antall ROIer for hver utvalgstype (n = 3). Skalalinje = 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggskodingsfil 1: ZIP-fil som inneholder skript og verktøy for å kjøre SiMPull-analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodingsfil 2: zip-fil som inneholder smite enkeltmolekylanalysepakken. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 3: ZIP-fil som inneholder eksempeldataene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 4: ZIP-fil som inneholder representative eksempeldataanalyseutganger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 5: Deksler stokkholder blåkopi for 3D-utskrift. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her ble optimalisert for å muliggjøre kvantitative målinger av reseptorfosforylering på enkeltproteinnivå. Flere enkle, men viktige modifikasjoner av SiMPull-protokollen ble utviklet som forbedret påliteligheten til målingen for fosfo-tyrosindeteksjon, inkludert reduksjon av autofluorescence med NaBH4-behandling og etterfiksering av prøven for å forhindre antistoffdissosiasjon. Bruk av den grønne kanalmasken til å identifisere reseptorplasseringer for beregning av colokalisering med anti-PY-antistoffet forbedrer også målenøyaktigheten ved å fjerne potensielle artefakter fra den ikke-spesifikke bindingen av antistoffet til cellelyset. Tofarget avbildning ble brukt til å oppdage brøkdelen av reseptorer fosforilert. I dette scenariet ble reseptoren genetisk merket med GFP, og antistoffet ble direkte merket med et fjernt rødt fargestoff. SiMPull-tilnærmingen gjelder for andre proteinmål som spesifikke antistoffer er tilgjengelige for, inkludert intracellulære proteiner. I tillegg, fordi denatureringsforhold ikke er nødvendig, kan multisubunit reseptorer / komplekser også fanges opp. Denaturering kan imidlertid innlemmes hvis PTM-ene av interesse ligger i strukturerte områder avproteinet 14. Til syvende og sist kan SiMPull lett utvides til å omfatte samtidig merking av distinkte fosfo-tyrosiner på individuelle reseptorer for å kvantifisere multisite fosforyleringsmønstre15. Avhør av intakte reseptorer i full lengde på en slik måte kan ikke oppnås ved andre standardmetoder, inkludert vestlig blotting og fosfomassespektrometri.

Sammen med fordelene med SiMPull må noen begrensninger vurderes. Som med enhver antistoffbasert teknikk er affiniteten og spesifisiteten til antistoffer som brukes, avgjørende for suksessen til målingen. Derfor er det viktig å optimalisere antistoffmerkingsforhold og ideelt unngå sekundære antistoffer ved å bruke direkte merkede primære antistoffer. Videre vil de overflatebundne antistoffene utløse proteiner lokalisert til plasmamembranen og i cytosoliske rom. Dette kan undervurdere fosforylering siden cytosollokaliserte proteiner ikke er tilgjengelige for den eksogent tilsatte liganden. Ekstra tiltak må tas for å korrigere reseptorens overflatenivåer (trinn 6.2.10). Antifosfotyrosinantistoffene viste noen ikke-spesifikke bindinger når lysat var til stede. For å unngå denne artefakten ble EGFR genetisk merket med GFP for å identifisere plasseringen av reseptorer, noe som tillot oss å utelukke anti-PY-signalet fra reseptoren. Hvis endogene proteiner skal avhøres, kan mottiltak med et totalt proteinantistoff gi maskebildet, med passende korreksjon for enhver ikke-spesifikk binding. Til slutt, mens SiMPull gir informasjon om heterogenitet på proteinnivå, er lysatet som genereres i denne protokollen fra tusenvis av celler, og celle-til-celle-variasjon går tapt. Imidlertid har fremskritt mot encellet SiMPull blitt gjort ved hjelp av et strømningskammer som består av en dekslelip og en mikroskopside med et 10 μm gap; bakterier var tynt belagt på dekslene mens lysbildet ble funksjonalisert med antistoff for å fange de ønskede proteinene. Ved lysis av bakteriene ble proteinene fra hver celle fanget i et begrenset område på antistoffbelagt lysbilde22. Lignende encellet SiMPull-analyse av pattedyrceller og proteinfosforylering kan være mulig i fremtiden.

SiMPull-protokollen inneholder flere kritiske trinn som kreves for å sikre data av høy kvalitet. For eksempel inneholder protokollen en forseggjort forberedelse av dekslene glass. Piranha etsende deksler renser glasset grundig og øker hydroksylgrupper og hydrofilitet, som er nødvendige for å optimalisere dekslene. Etter flere vasker med organiske løsningsmidler, koh behandling gir ekstra hydroksyl grupper for aminosilanisering 13,23, som dekker glasset med amin grupper for PEG og biotin-PEG binding. Feil rengjøring eller funksjonalisering på noen av disse trinnene vil forstyrre protein-nedtrekk. Kontroll av molarforholdet mellom PEG: biotin-PEG, sammen med lysatkonsentrasjon, er nøkkelfaktorer for å oppnå passende protein IP-tetthet på SiMPull-substratet. Som med enhver biologisk analyse, er det variasjon mellom cellelyspreparater, og små forskjeller mellom fosforyleringsprosenter kan ses mellom prøvereplikasjoner. Derfor er det viktig å måle fosforyleringsnivåene til forskjellige tyrosinsteder i samme prøve. Eksempelkammeret som er beskrevet i denne protokollen, gir et system for å samle mange datapunkter i én bildebehandlingsøkt og gjør det mulig å beregne gjennomsnittet over flere SiMPull-eksperimenter.

På bildeinnhentingssiden er det viktig å få tak i den fiduciale prøven for å sikre et nøyaktig kanaloverlegg; Ellers vil colocalization ikke være nøyaktig. Det er også viktig å optimalisere laserkraft og kamerainnstillinger for å maksimere signal-til-støy samtidig som fotobleaching minimeres. Til slutt, mens prøvematrisen krever en liten mengde prøve- og reagenser, er de lave volumene utsatt for fordampning under bildebehandlingsøkten. Det er viktig å periodisk kontrollere prøvematrisen (~ 30-45 min) og legge til buffer etter behov for å forhindre at prøver tørker.

Den nåværende protokollen demonstrerte bruken av SiMPull for å kvantifisere membranreseptorfosforyleringstilstander. Mens den fokuserer på EGFR, kan tilnærmingen brukes på andre celleoverflatereseptorer og intracellulære proteiner og proteinkomplekser, så lenge passende antistoffer er tilgjengelige. En annen potensiell bruk for SiMPull er å forhøre innholdet og fosforyleringsstatusen til faseseparerte kondensater. I tillegg kan SiMPull brukes til å måle andre PTMer, for eksempel allestedsnærværende. Derfor gir SiMPull et unikt verktøy for cellebiologer å forhøre PTMer på intakte proteiner og korrelere PTM-mønstre med cellulært utfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 og R01CA248166 til DSL. EMB ble støttet gjennom ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) og JAR av UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi erkjenner takknemlig å bruke University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delt ressurs, støttet av NIH P30CA118100. Vi ønsker å anerkjenne Dr. Ankur Jain og Taekijip Ha, hvis opprinnelige utvikling av SiMPull inspirerte dette arbeidet.
ES-C nåværende adresse: Immunodynamikk Gruppe, Laboratorium for integrativ kreftimmunologi, Senter for kreftforskning, National Cancer Institute, Bethesda

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Tags

Biokjemi utgave 184
En optimalisert enkeltmolekyls pull-down-analyse for kvantifisering av proteinfosforylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter