Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).
Abstract
Die Phosphorylierung ist eine notwendige posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert und die Ergebnisse der Zellsignalisierung steuert. Aktuelle Methoden zur Messung der Proteinphosphorylierung können die Heterogenität der Phosphorylierung über einzelne Proteine hinweg nicht erhalten. Der Einzelmolekül-Pulldown-Assay (SiMPull) wurde entwickelt, um die Zusammensetzung makromolekularer Komplexe durch Immunpräzipitation von Proteinen auf einem Glasdeckglas zu untersuchen, gefolgt von Einzelmolekül-Bildgebung. Die aktuelle Technik ist eine Adaption von SiMPull, die eine robuste Quantifizierung des Phosphorylierungszustands von Membranrezeptoren in voller Länge auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die Abbildung von Tausenden von einzelnen Rezeptoren auf diese Weise ermöglicht die Quantifizierung von Proteinphosphorylierungsmustern. Das vorliegende Protokoll beschreibt das optimierte SiMPull-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung. Die Optimierung von Glaspräparations- und Antikörperfixierungsprotokollen verbessert die Datenqualität weiter. Das aktuelle Protokoll liefert Code für die Einzelmolekül-Datenanalyse, die den Anteil der in einer Probe phosphorylierten Rezeptoren berechnet. Während sich diese Arbeit auf die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) konzentriert, kann das Protokoll auf andere Membranrezeptoren und zytosolische Signalmoleküle verallgemeinert werden.
Introduction
Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen 1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenität der Rezeptorphosphorylierung, sowohl im Überfluss als auch in den spezifischen Phosphotyrosinmustern, die ein Mittel zur Manipulation der Signalausgänge bieten können, indem sie die Zusammensetzung des Signalosoms 3,4,5,6,7 diktieren. Es gibt jedoch Einschränkungen in den derzeitigen Methoden zur Abfrage der Proteinphosphorylierung. Die Western-Blot-Analyse eignet sich hervorragend zur Beschreibung von Trends der Proteinphosphorylierung, ist jedoch semi-quantitativ8 und liefert keine Informationen über die Heterogenität des Systems, da Tausende bis Millionen von Rezeptoren zusammen gemittelt werden. Während westliche Blots die Untersuchung einer Probe mit Phospho-spezifischen Antikörpern gegen bestimmte Tyrosine ermöglichen, können sie keine Informationen über Multisite-Phosphorylierungsmuster innerhalb desselben Proteins liefern. Quantitative Phosphoproteomiken berichten über die Phosphotyrosin-Häufigkeit, aber es gibt Einschränkungen beim Nachweis der Multisite-Phosphorylierung, da sich die interessierenden Reste innerhalb desselben Peptids (typischerweise 7-35 Aminosäuren) befinden müssen, das durch enzymatische Verdauung erzeugt wird 9,10,11.
Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde der Einzelmolekül-Pull-Down-Assay (SiMPull) angepasst, um die Phosphorylierungszustände intakter Rezeptoren auf Einzelmolekülebene zu quantifizieren. SiMPull wurde erstmals von Jain et al.12,13 als leistungsfähiges Werkzeug zur Befragung makromolekularer Komplexe demonstriert. In SiMPull wurden makromolekulare Komplexe immunpräzipitiert (IP) auf Antikörper-funktionalisierten Glasdeckgläsern und dann durch Einzelmolekülmikroskopie auf Proteinuntereinheitennummer und Co-IP mit komplexen Komponentenanalysiert 12. Eine Modifikation von Kim et al.14, genannt SiMBlot, war die erste, die eine Variation von SiMPull verwendete, um die Phosphorylierung von denaturierten Proteinen zu analysieren. Das SiMBlot-Protokoll beruht auf der Erfassung biotinylierter Zelloberflächenproteine unter Verwendung von NeutrAvidin-beschichteten Deckgläsern, die dann zur Phosphorylierung mit Phospho-spezifischer Antikörpermarkierunguntersucht werden 14. Trotz dieser Fortschritte waren Verbesserungen erforderlich, um die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikation robuster und auf ein breiteres Spektrum von Proteinen anwendbarer zu machen.
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen optimierten SiMPull-Ansatz, der verwendet wurde, um Phosphorylierungsmuster des intakten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) als Reaktion auf eine Reihe von Ligandenbedingungen und onkogenen Mutationen zu quantifizieren15. Während sich diese Arbeit auf EGFR konzentriert, kann dieser Ansatz auf jeden Membranrezeptor und zytosolische Proteine von Interesse (POI) angewendet werden, für die hochwertige Antikörper verfügbar sind. Das Protokoll umfasst Schritte zur Reduzierung der Probenautofluoreszenz, ein Probenarray-Design, das ein minimales Probenvolumen bei gleichzeitiger Vorbereitung von bis zu 20 Proben erfordert, und die Optimierung der Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen. Datenanalysealgorithmen wurden für den Einzelmolekülnachweis und die Quantifizierung phosphorylierter Proteine entwickelt.
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Protocol
1. Deckglas-Vorbereitung
HINWEIS: Für diesen Schritt muss man persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, die eine doppelte Schicht Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz und einen Laborkittel umfasst.
- Führen Sie Piranha-Ätzen durch, um organische Ablagerungen aus dem Glas zu entfernen.
ACHTUNG: Piranha-Lösung ist ein starkes Oxidationsmittel, das bei Kontakt mit organischen Materialien korrosiv und hochreaktiv ist. Die Reaktion mit organischen Ablagerungen ist exotherm und potenziell explosiv. Daher muss das Verfahren in einem chemischen Abzug mit abgesenktem Flügel durchgeführt werden. Für die Handhabung der Piranha-Lösung sind Pyrex-Glaswaren erforderlich.- Bereiten Sie den Arbeitsbereich in einem chemischen Abzug vor. Ordnen Sie Deckgläser ohne Überlappung im Boden eines 4-Liter-Glasbechers, des "Reaktionsbechers", an und legen Sie das Reaktionsbecherglas mit sanfter Hitze auf eine Kochplatte. Lassen Sie die Glaswaren für 10 Minuten erwärmen. Legen Sie ein "Abfall" 1 L Glasbecherglas mit 500 ml ddH2O proximal auf das Reaktionsbecherglas.
- 49 ml 12 N Schwefelsäure (H2SO4) langsam mit einerserologischen Glaspipette in das Reaktionsbecherglas geben. Spülen Sie die Pipette vor der Entsorgung im Abfallbecherglas ab.
- 21 ml 30% Wasserstoffperoxid (H2O2)tropfenweise mit einer serologischen Glaspipette in das Reaktionsbecherglas geben. Verteilen Sie dieH2O2-Tröpfchenlangsam gleichmäßig über den Boden desReaktionskolbens, um ein lokales Abschrecken der Piranha-Ätzreaktion zu verhindern. Spülen Sie die Pipette vor der Entsorgung im Abfallbecherglas ab.
ACHTUNG: Fügen Sie H 2 O2 immer in das H2SO 4 hinzu undniemals umgekehrt. - Piranha ätzt die Deckblätter für 30 min. Den Inhalt des Reaktionsbechers alle 5 Minuten vorsichtig rühren.
- Quen Sie die Piranha-Lösung ab, indem Sie den Inhalt des Abfallbechers in das Reaktionsbecherglas gießen. Übertragen Sie die Flüssigkeit langsam die Wand des Reaktionsbechers hinunter, um das Spritzen zu minimieren. Entfernen Sie das Reaktionsbecherglas von der Kochplatte.
- Wenn die Reaktion abgeschreckt und abgekühlt ist, gießen Sie die Piranha-Lösung zur Neutralisierung zurück in das Abfallbecherglas, ohne die geätzten Deckgläser vom Reaktionsbecherglas zu entfernen.
- Neutralisieren Sie die Piranha-Lösung mit der allmählichen Zugabe einer schwachen Basis. Verwenden Sie beispielsweise eine übermäßige Masse von 20 g Natriumbicarbonat (NaHCO 3) / 100 ml Piranha-Lösung.
ACHTUNG: Lagern Sie Piranha-Lösungen nicht in versiegelten Abfallbehältern. Die Lösung muss vor der Entsorgung immer neutralisiert werden. Die Neutralisationsreaktion erzeugt kräftige Blasen und kann explosiv sein, wenn sie nicht durch die allmähliche Zugabe der schwachen Basis kontrolliert wird. - Rühren Sie die neutralisierte Lösung mit einem Glasrührstab um und lassen Sie sie 2 h reagieren. Erhöhen Sie den pH-Wert auf >4 und entsorgen Sie die Lösung.
- Zwischen den Zugabe von schwacher Basis zur Piranha-Lösung die geätzten Deckgläser aus dem Reaktionsbecher in einen Buchner-Trichter mit einem Glasrührstab geben und 5 min bei Ausführung von ddH2O abspülen.
HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort oder bewahren Sie die geätzten Piranha-Deckgläser bis zu 2 Wochen in ddH2O in einem versiegelten Glasgefäß oder einer Petrischale auf (mit Siegelfolie umwickeln, siehe Materialtabelle).
- Beschallen Sie die Deckgläser in organischen Lösungsmitteln mit den folgenden Schritten.
- Legen Sie die Deckgläser in ein Coplin-Glas aus Glas (siehe Materialtabelle) und bedecken Sie sie mit Methanol (CH3OH). Verschließen Sie den Deckel mit Dichtungsfolie und Badebeschallung für 10 min. Gießen Sie das Methanol vorsichtig aus dem Coplin-Glas in eine Glasvorratsflasche.
- Füllen Sie das Coplin-Glas mit Aceton (C3H6O), verschließen Sie den Deckel und baden, um 10 Minuten zu beschallen. Gießen Sie das Aceton vorsichtig aus dem Coplin-Glas in eine Glasvorratsflasche.
ACHTUNG: Methanol ist brennbar und akut giftig. Verwendung in einem chemischen Abzug. Aceton ist brennbar und reizend. Behandeln und lagern Sie es daher in Glas und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
HINWEIS: Methanol und Aceton können jeweils bis zu fünf Mal wiederverwendet werden.
- Aktivieren Sie die Deckglasoberfläche für die Silanfunktionalisierung.
- Badebeschallung mit 1 M Kaliumhydroxid (KOH) für 20 min. Gießen Sie den KOH vorsichtig aus dem Coplin Jar in ein 50 ml konisches Rohr zur Wiederverwendung.
ACHTUNG: KOH ist ätzend und reizend. In einem chemischen Abzug verwenden und nicht in Glas lagern. Lagern Sie es in Polypropylenröhren. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
HINWEIS: KOH kann bis zu fünf Mal wiederverwendet werden. - Zweimal mit ddH 2 O abspülen. ddH2O aus den Deckgläsern abtropfen lassen und dann jeden Deckglas erhitzen, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners winken, um die gesamte Oberflächenfeuchtigkeit abzuleiten. Legen Sie die Deckgläser in ein trockenes Coplin-Glas.
- Badebeschallung mit 1 M Kaliumhydroxid (KOH) für 20 min. Gießen Sie den KOH vorsichtig aus dem Coplin Jar in ein 50 ml konisches Rohr zur Wiederverwendung.
- Führen Sie eine Deckglasaminosilanisierung durch.
- Die Aminosilanlösung wird hergestellt, indem 69,4 ml Methanol mit 3,6 ml Essigsäure (CH3COOH) in einem konischen Kolben gemischt werden. 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan (Aminosilan) zugeben und gut mischen (siehe Materialtabelle).
ACHTUNG: Essigsäure ist brennbar und korrosiv. Mit Glaspipetten handhaben und in Glas aufbewahren. Arbeiten Sie mit Essigsäure in einem chemischen Abzug. Aminosilan ist eine akut toxische Inhalationsgefahr, ein Sensibilisator und ein Reizstoff. Es ist schädlich für das Wasserleben. Verwendung in einem chemischen Abzug. Entsorgen Sie die Chemikalien als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
HINWEIS: Aminosilan ist lichtempfindlich und hydrolysiert schnell in Wasser. Alle Schritte mit diesem Reagenz müssen unter minimalen Lichtverhältnissen durchgeführt werden, um die Aktivität aufrechtzuerhalten. Spülen Sie die Flasche mit Stickstoffgas aus und tragen Sie die Siegelfolie auf, bevor Sie sie in einem dunklen Exsikkator lagern. Alle 6-9 Monate ersetzen. - Fügen Sie die Aminosilanlösung sofort in das Coplin-Glas hinzu. Decken Sie die Dichtungsfolie ab und tragen Sie sie auf, um weiterhin vor Licht zu schützen.
- Inkubieren Sie die Deckgläser in der Aminosilanlösung für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT). Badebeschallung für 1 min und dann weitere 10 min inkubieren. Gießen Sie die Aminosilanlösung vorsichtig in einen für CH 3 OH bestimmten Abfallbehälter mit SpurenvonAminosilan und CH3COOH.
- Spülen Sie die Deckgläser mit Methanol aus und gießen Sie die Lösung in einen für Methanol bestimmten Abfallbehälter.
- Spülen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 2 min mit ddH2O ab. Die Deckgläser abtropfen lassen, überschüssige Feuchtigkeit abtupfen und 10 Minuten lang vollständig an der Luft trocknen.
- Die Aminosilanlösung wird hergestellt, indem 69,4 ml Methanol mit 3,6 ml Essigsäure (CH3COOH) in einem konischen Kolben gemischt werden. 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan (Aminosilan) zugeben und gut mischen (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die Array-Vorbereitung/Biotin-PEG-Funktionalisierung der Deckgläser durch.
- Es wird ein 1 m NaHCO 3 (pH 8,5) Arbeitsmaterial hergestellt, indem 84,5 mgNaHCO 3 in 1 ml ddH2 O gelöst werden. Für eine Endkonzentration von 10 mM NaHCO 3 1 MNaHCO 3 in ddH2O (1:100) verdünnen.
- Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift ein Rasterarray auf die trockenen aminosilanisierten Deckgläser (siehe Materialtabelle) und warten Sie, bis die Tinte getrocknet ist. Schreiben Sie einen Bezeichner auf das Deckblatt, um die richtige Ausrichtung zu markieren. Legen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer.
HINWEIS: Das Array sollte aus 16-20 Quadraten bestehen, die ungefähr 4 mm x 4 mm groß sind. - Um die Biotin-PEG-Succinimidylvalerate (Biotin-PEG)/mPEG-Succinimidylvalerat-Lösung (mPEG) herzustellen, entfernen Sie zunächst mPEG und Biotin-PEG (siehe Materialtabelle) aus dem Gefrierschrank und gleichen sie auf RT aus. 153 mg mPEG und 3,9 mg Biotin-PEG (~1:39 Biotin-PEG:mPEG) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und in 609 μL 10 mM NaHCO3 durch sanftes Pipettieren resuspendieren. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min bei RT, um Blasen zu entfernen.
HINWEIS: Die Hydrolysehalbwertszeit von Succinimidylvalerat in pH 8,5 Puffer beträgt ~30 min. Nachdem Sie den Puffer zu mPEG hinzugefügt haben, fahren Sie so schnell wie möglich mit den folgenden Schritten fort. Dieser Schritt ist entscheidend. - Tragen Sie die Biotin-PEG/mPEG-Lösung auf, um jedes Quadrat in den Deckglas-Arrays vollständig abzudecken, typischerweise 10-15 μL pro Quadrat. Lassen Sie nicht zu, dass Flüssigkeit den definierten Raum überläuft. Lagern Sie die Deckgläser in einer Feuchtigkeitskammer im Dunkeln für 3-4 h bei RT.
- Waschen Sie die Deckgläser mit reichlich Wasser, indem Sie sie nacheinander in 3x 250 ml Glasbecher tauchen, die mit ddH2O für jeweils 10 s gefüllt sind.
- Jegliche Feuchtigkeit aus den Deckgläsern mit Stickstoffgas ableiten. Lagern Sie die Coverslips Rücken an Rücken in einem stickstoffgefüllten 50 ml konischen Röhrchen, das mit Dichtfolie umwickelt ist, bei -20 °C.
HINWEIS: Fahren Sie sofort mit Schritt 2 fort oder lagern Sie Deckgläser bei -20 °C für bis zu 1 Woche vor dem Gebrauch.
2. Herstellung von SiMPull-Lysat
ACHTUNG: Die erforderliche PSA für die verbleibenden Schritte des Protokolls sind Nitrilhandschuhe, Schutzbrillen und Laborkittel.
HINWEIS: Die Lysate wurden aus den adhärenten CHO-Zellen hergestellt, die EGFR-GFP exprimieren. Die Zellen wurden über Nacht in einer 60 mm Gewebekulturschale (TC60) plattiert12,13. CHO-Zellen wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 500 ng / ml Genetisch (siehe Materialtabelle). Andere adhärente Zelllinien oder Suspensionszellen können ebenfalls verwendet werden.
- Kennzeichnen Sie die Zellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Waschen Sie die Kulturschale (mit den Zellen) mit 1 ml 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 1x Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 5 Minuten bei 37 ° C, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen mit einer Pipette von der Schale in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Nehmen Sie 10 μL Trypanblau und mischen Sie mit 10 μL Zellsuspension in einem separaten Zentrifugenröhrchen. Zählen Sie Zellen mit 10 μL der Zellmischung in einem automatischen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Platte 8 x 105 Zellen über Nacht in einer TC60 Petrischale. Teller ein Gericht pro Bedingung.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden die Zellen entweder unbehandelt oder mit Pervanadat und EGF behandelt, wie in Schritt 2.4.1 beschrieben.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen für die Zelllysatpräparation vor.
- Eiskalt 1x PBS (pH 7,4) zubereiten.
- Es ist ein Lysepuffer herzustellen, eine Lösung aus 1% nichtionischem, nicht degenerierendem Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) und 150 mM NaCl, ergänzt mit Protease/Phosphatase-Inhibitor (PPI) (1:100 ab Lager). Tube auf einen Nutator legen und Puffer für 15 min mischen lassen. Bewahren Sie die vorbereitete Lösung auf Eis auf.
- Bereiten Sie den Puffer des Tyrods für eine Endkonzentration von 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH7,2), 20 mM Glukose und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) vor (siehe Materialtabelle). Die Lösung auf 37 °C erwärmen.
- Bereiten Sie die Positivkontrolle für die Phosphorylierung vor - 1 mM Pervanadatbehandlung.
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Pervandat ist die peroxidierte Form von Vanadat - einem Inhibitor der Proteintyrosinphosphatasen16. Die Verhinderung der Proteindephosphorylierung durch Hemmung der Phosphataseaktivität führt zu einer stark phosphorylierten Probe.- Bereiten Sie einen 200-mM-Vorrat an aktiviertem Natriumorthovanadat (Na3VO4) vor.
- Zur Herstellung einer 100 ml Lösung werden 3,89 gNa3VO4 (siehe Materialtabelle) in 90 ml ddH2O gegeben und unter Rühren gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein, indem Sie HCl oder NaOH tropfenweise hinzufügen. Durch das Hinzufügen von HCl wird die Lösung gelb.
- Bringen Sie das Volumen auf 100 ml mit ddH 2 O. Kochen Sie die Lösung,indem Sie sie in der Mikrowelle erhitzen. Nach dem Kochen ist die Lösung farblos.
- Kühlen Sie die Lösung auf RT ab und stellen Sie den pH-Wert auf 10 wieder her. Wiederholen Sie das Kochen, Abkühlen und die pH-Einstellung noch zwei bis vier weitere Male, bis sich der pH-Wert bei 10 stabilisiert. Aliquot und bei -20 °C lagern.
- Es wird ein Material von 30 mM Pervanadat (PV) hergestellt, indem 20,4 μL 3% H2O2 mit 100 μL200mM Na3 VO 4 und 546,8 μLddH2O (äquimolare Konzentrationen vonH2O2und aktiviertesNa3VO4) gemischt werden. 15 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie 1 mM PV im Puffer von Tyrode vor. Für eine 10-ml-Lösung fügen Sie 0,33 ml 30 mM PV-Material zu 9,67 ml 37 °C Tyrodes Puffer hinzu. Behandeln Sie Zellen sofort.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml Tyrodes Puffer. Fügen Sie 3 ml 1 mM PV in den Puffer der Tyrode zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 min bei 37 °C.
- Bereiten Sie einen 200-mM-Vorrat an aktiviertem Natriumorthovanadat (Na3VO4) vor.
- Führen Sie die Ligandenstimulation durch.
- Stimulieren Sie Zellen mit dem interessierenden Liganden mit geeigneter Konzentration, Zeit und Temperatur. Für eine maximale EGFR-Stimulation inkubieren Sie mit 1 ml von 50 nM epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, siehe Materialtabelle) + 1 mM PV im Tyrode-Puffer für 5 min bei 37 °C.
- Führen Sie eine Zelllyse durch.
- Nach gewünschter Zellbehandlung die Schale auf Eis legen und mit eiskaltem 1x PBS waschen. Entfernen Sie das gesamte PBS-Volumen vollständig mit einer Pipette.
- 180 μL Lysepuffer (Schritt 2.2.2) in die Platte geben. Verwenden Sie einen Zellenschaber zum Ziehen des Puffers um die Platte, um die Zellen vollständig abzudecken. Üben Sie festen, gleichmäßigen Druck mit dem Zellenschaber über die gesamte kultivierte Oberfläche aus, um die Zellen vollständig zu lysieren.
HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers muss auf ein Minimum reduziert werden, um eine hohe Proteinkonzentration zu gewährleisten. - Pipettieren Sie die lysierten Zellen und übertragen Sie sie in eine 1,5-ml-Röhre. Halten Sie die Röhre für 30 min auf Eis. Wirbeln Sie die Lysate alle 5 Minuten ein.
HINWEIS: Wenn der POI aus mehreren Untereinheiten besteht oder empfindlich auf Dissoziation reagiert, sollten Sie die Lysate nicht umdrehen. - Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette auf eine neue 1,5-ml-Röhre. Dieser enthält das Gesamtproteinlysat.
- Halten Sie 10 μL des Lysats zurück und verdünnen Sie es in 90 μL des Lysepuffers für die bicinchoninische kolorimetrische Assay (BCA)Analyse 17. Lagern Sie das restliche Gesamtproteinlysat bei -80 °C.
- Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des Lysats mithilfe der BCA-Analyse (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Gesamtproteinlysate können am Experimenttag hergestellt und frisch verwendet oder als Einwegaliquots bei -80 °C für bis zu 12 Wochen gelagert werden. Nicht einfrieren/auftauen.
3. Funktionalisierung des Arrays mit dem biotinylierten Antikörper
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
- T50-Puffer, eine Lösung von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM NaCl. Die Lösung ist bei RT für 1 Monat stabil.
- T50-BSA durch Ergänzung des T50-Puffers mit 0,1 mg/ml BSA. Bewahren Sie die vorbereitete Lösung auf Eis auf.
- 10 mg/ml Natriumborhydrid (NaBH4) in 1x PBS. Bereiten Sie dies unmittelbar vor dem Gebrauch vor.
- 0,2 mg/ml NeutrAvidin (siehe Materialtabelle) im T50-Puffer.
ACHTUNG: NaBH4 ist ein Reduktionsmittel und brennbar. Spülen Sie den Behälter nach Gebrauch immer mit Stickstoffgas aus und lagern Sie ihn in einem Exsikkator.
- Funktionalisieren Sie das Array mit dem biotinylierten Antikörper.
- Entfernen Sie die funktionalisierten PEG-Biotin-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie das konische Röhrchen vor dem Öffnen mit RT aus. Legen Sie das Deckglas mit dem nach oben ausgerichteten Array auf eine mit Siegelfolie ausgekleidete 100-mm-Gewebekulturschale (TC100).
HINWEIS: Minimieren Sie die Deckenbeleuchtung. Alle Lösungen sollten sich auf den durch das hydrophobe Array definierten Quadraten "abperlen". Fügen Sie ein geeignetes Lösungsvolumen hinzu, um jedes Quadrat vollständig abzudecken (typischerweise 10-15 μL), und lassen Sie nicht zu, dass Flüssigkeit den definierten Raum überläuft. Um Flüssigkeiten schnell zu entfernen, verwenden Sie eine hauseigene Vakuumleitung, die an einer Vakuumflasche befestigt ist, um Abfälle aufzufangen. Lassen Sie NaBH4 vor der Entsorgung 1 h lang entgasen, indem Sie das Rohr im chemischen Abzug offen lassen. Die NaBH 4-Behandlung ist notwendig, um die Autofluoreszenz im Hintergrund zu reduzieren und dadurch die Erkennungfalsch-positiver Einzelmoleküle zu reduzieren. - Behandeln Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 mg/ml NaBH 4 in 1x PBS für 4 min bei RT. Dreimal mit PBS waschen.
- Inkubieren Sie jedes Quadrat für 5 Minuten mit 0,2 mg / ml NeutrAvidin in T50. Dreimal mit T50-BSA waschen.
HINWEIS: NeutrAvidin bindet an PEG-Biotin und bietet eine Bindungsstelle für biotinylierte Antikörper12,13,15. - Inkubieren Sie jedes Quadrat für 10 min mit 2 μg / ml biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50-BSA; Dreimal mit T50-BSA waschen.
HINWEIS: Das vorliegende Protokoll verwendet biotinyliertes Anti-EGFR-IgG (siehe Materialtabelle) zur Erfassung von EGFR-GFP.
- Entfernen Sie die funktionalisierten PEG-Biotin-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie das konische Röhrchen vor dem Öffnen mit RT aus. Legen Sie das Deckglas mit dem nach oben ausgerichteten Array auf eine mit Siegelfolie ausgekleidete 100-mm-Gewebekulturschale (TC100).
4. SiMPull von POI aus ganzzelligen Lysaten
HINWEIS: Stellen Sie die TC100-Schale mit funktionalisierten SiMPull-Arrays für den Rest der SiMPull-Zubereitung auf Eis. Dieser Schritt ist der Pull-Down eines POI aus dem Gesamtproteinlysat. Das Lysat darf nach dem Auftauen nicht wiederverwendet werden.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) / 0,1% Glutaraldehyd (GA) in 1x PBS vor.
ACHTUNG: PFA und GA sind toxische chemische Fixiermittel und potenzielle Karzinogene. Tragen Sie PSA. Entsorgen Sie die Chemikalien als gefährlichen Abfall gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien. - Bereiten Sie 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 vor.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) / 0,1% Glutaraldehyd (GA) in 1x PBS vor.
- Tauen und mischen Sie das Lysat, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Bleiben Sie auf Eis.
- 1 μL des Lysats in 100 μL eiskaltes T50-BSA/PPI verdünnen.
HINWEIS: Bestimmen Sie bei Bedarf den geeigneten Verdünnungsfaktor des Gesamtproteinlysatsats, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen auf das Array anwenden. Die optimale Dichte der SiMPull-Rezeptoren pro Array-Bereich beträgt 0,04-0,08/μm2. Lysatverdünnungen können in Schritt 6 (Datenanalyse) beurteilt werden. - Inkubieren Sie das Lysat auf dem Array für 10 min; dann viermal mit eiskaltem T50-BSA/PPI waschen.
- Verdünnen Sie AF647-konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (siehe Materialtabelle) in eiskaltem T50-BSA/PPI und inkubieren Sie auf dem Array für 1 h.
HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wird ein pan-anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG verwendet, um die phosphorylierte Population von EGFR-GFP zu identifizieren. Durch die Verwendung von direkt markierten Antikörpern entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern, wodurch die Kennzeichnungsmöglichkeiten erweitert und die Konsistenz der Ergebnisse verbessert wird. Fluoreszenzmarkierte Antikörper können aus kommerziellen Quellen gewonnen werden. Wenn sie nicht im Handel erhältlich sind, können Antikörper mit Standard-Biokonjugationstechniken individuell gekennzeichnet werden, und kommerzielle Biokonjugationskits sind verfügbar. Jede Charge fluoreszierend markierter Antikörper muss auf optimale Markierungsbedingungen getestet werden, indem SiMPull durchgeführt wird, um eine Dosiskurve zu messen und den Sättigungspunkt zu finden. - Sechsmal mit eiskaltem T50-BSA insgesamt 6-8 min waschen.
- Zweimal mit eiskaltem 1x PBS waschen.
- Inkubieren Sie das Array mit 4% PFA/0,1% GA-Lösung für 10 Minuten, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern.
- Waschen Sie zweimal für jeweils 5 Minuten mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 / PBS, um die Fixiermittel zu inaktivieren.
HINWEIS: Bei Experimenten mit mehr als einem Antikörper (z. B. Nachweis multipler Phosphotyrosinstellen) wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.9. Siehe Schritt 6.2.9 für Informationen zur Bestimmung der sterischen Behinderung zwischen zwei Antikörpern.
5. Bildaufnahme
HINWEIS: Die Einzelmolekül-Bildaufnahme wird mit einem 150-fachen TIRF-Objektiv und einem Bildteiler durchgeführt, der jeden Spektralkanal in einem bestimmten Quadranten der emCCD-Kamera erfasst (siehe Materialtabelle). Kalibrierungsbilder werden zunächst aufgenommen, um eine Kanalregistrierung und Kameraverstärkungskalibrierung mit einem nanostrukturierten Kanalausrichtungsgitter (Nanogrid) zu ermöglichen, das 20 x 20 Arrays von 200 ± 50 nm-Löchern in einem Intrahole-Abstand von 3 ± 1 μm (Gesamtgröße ~ 60 μm × 60 μm) enthält.
- Führen Sie die Kanalregistrierung mit den folgenden Schritten durch.
HINWEIS: Eine genaue Kanalregistrierung ist erforderlich, um die Kolokalisierung von Emittern richtig zu berechnen. Dieser Schritt ist entscheidend.- Reinigen Sie das Ölobjektiv und deponieren Sie einen Tropfen Öl auf dem Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne. Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster.
HINWEIS: Bilder mit dem Nanogitter werden mit Durchlicht aufgenommen, das durch das Nanogitter geht und in allen Spektralkanälen detektiert wird. Alternativ kann man multifluoreszierende Perlen verwenden, die die in jedem Kanal detektierte Fluoreszenz emittieren. Die Bildaufnahme muss entsprechend jedem Mikroskop-Setup optimiert werden. - Erwerben Sie eine Serie von 20 Bildern des Rasters. Stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind. Speichern Sie die Bildserie als "Fiducial".
- Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein Airy-Muster18 zu erzeugen. Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern für Verstärkungskalibrierungen. Speichern Sie das Bild unter dem Namen "Gain".
- Erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern für den Kamera-Offset, indem Sie verhindern, dass das gesamte Licht zur Kamera gelangt. Speichern Sie das Bild unter dem Motto "Hintergrund".
- Reinigen Sie das Ölobjektiv und deponieren Sie einen Tropfen Öl auf dem Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne. Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster.
- Erfassen Sie SiMPull-Bilder.
HINWEIS: Bevor Sie das Deckglas-Array abbilden, tauschen Sie die Tris-Lösung gegen T50-BSA aus und gleichen Sie das Array mit RT aus.- Reinigen Sie das Ölobjektiv und deponieren Sie zusätzliches Öl auf dem Ziel. Befestigen Sie das Coverslip-Array auf der Mikroskopstufe.
- Optimieren Sie die Anregungsleistung, den TIRF-Winkel und die Kameraintegrationszeit jedes Fluorophors. Ziel ist es, das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen und gleichzeitig die Photobleiche der Probe zu minimieren. Zeichnen Sie die Laserleistung auf, um die Konsistenz bei zukünftigen Messungen zu gewährleisten.
HINWEIS: Die vorliegende Studie verwendete 300 ms Belichtungszeit für den fernroten Kanal und 1 s für den grünen Kanal. Der 642-nm-Laser wurde mit einer Laserleistung von etwa 500 μW verwendet, während der 488-nm-Laser mit 860 μW verwendet wurde, gemessen vor der Röhrenlinse. - Erfassen Sie Bilder für jede Probe. Stellen Sie sich zuerst den fernroten Kanal vor, gefolgt von jedem Fluorophor mit niedrigerer Wellenlänge, um die Photobleiche zu reduzieren. Aufgrund des geringen Volumens, das für jede Probe verwendet wird, überprüfen Sie den Pufferstand alle 30-45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf.
6. Datenanalyse
- Laden Sie die Demo-Codes herunter.
HINWEIS: Der bereitgestellte Demo-Code und die Beispieldatensätze veranschaulichen den vollständigen Datenanalyse-Workflow (Supplementary Coding Files 1-4). Die in SiMPullMain.m aufgeführten Systemanforderungen finden Sie in der Supplementary Coding File 1.-
Entpacken und Speichern in einem persönlichen Documents/MATLAB (MacOS/Linux)- oder Documents\MATLAB (Windows)-Verzeichnis.
HINWEIS: Dadurch werden vier neue Ordner generiert: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs. - Öffnen Sie die Datei "ReadMe_Setup.txt" im Ordner SiMPull_class.
- Installieren Sie MATLAB- und MATLAB-Toolboxen: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox und Statistics and Machine Learning Toolbox.
- Installieren Sie DipImage19 gemäß den Download-Anweisungen.
- Installieren Sie das "Smite"-Einzelmolekül-Analysepaket wie in ReadMe_setup.txt beschrieben.
HINWEIS: "smite" ist im GitHub-Repository verfügbar (siehe Materialverzeichnis). - Öffnen Sie die Datei SiMPullMain.m, die sich in SiMPull_class Ordner befindet, indem Sie die Datei in das MATLAB-Fenster ziehen.
- Wechseln Sie in das Verzeichnis ...\MATLAB\Sample Data\, indem Sie auf das Symbol Ordner suchen klicken und den Ordner auswählen.
-
Entpacken und Speichern in einem persönlichen Documents/MATLAB (MacOS/Linux)- oder Documents\MATLAB (Windows)-Verzeichnis.
- Übersicht der Datenverarbeitungsschritte
- Führen Sie SiMPullMain.m aus - folgen Sie den Anweisungen für jeden Abschnitt. Führen Sie jeden Abschnitt einzeln aus, indem Sie den Cursor in diesem Abschnitt platzieren und auf das Symbol Abschnitt ausführen klicken.
HINWEIS: Die allgemeinen Schritte für die Datenanalyse werden in diesem Abschnitt beschrieben. Detaillierte Anweisungen finden Sie im beigefügten SiMPullMain.m-Code. - Führen Sie den Abschnitt "Initialisierung" aus, um den Pfad zum Definieren von Spektralkanälen und Bildgröße festzulegen.
- Führen Sie den Abschnitt "Kameraverstärkung und -versatz suchen" aus, um die Kameraverstärkung mithilfe der Verstärkungs- und Hintergrund-Datasets in Photonen umzuwandeln.
- Führen Sie den Abschnitt "Kanalregistrierung" aus, um die lokale gewichtete mittlere Transformation zu berechnen, die für die Bildregistrierung verwendet wird.
- Formatieren und kuratieren Sie die Daten. Führen Sie den Abschnitt "Sequenzielle Kanäle zu einem Quad-Image verbinden" aus. Führen Sie "Ungültige Frames entfernen" aus.
- Führen Sie den Abschnitt "Einzelne Moleküle anpassen und überlappende Moleküle finden" aus.
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden mehrere Funktionen ausgeführt, um einzelne Moleküle in jedem Kanal zu lokalisieren und Kolokalisierungsereignisse zwischen Spektralkanälen zu bestimmen. - Um die minimale Photonenzahl pro echter GFP-Anpassung zu bestimmen, führen Sie den "Optimize Minimum Photon Threshold" aus. Dies ist ein iterativer Prozess.
- Stellen Sie zuerst smf ein. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] und führen Sie den Abschnitt aus. Wählen Sie "Leere Daten"-Dateien, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Wiederholen Sie den Vorgang mit den Dateien "CHO-EGFR-GFP".
- Wählen Sie einen geeigneten Mindestschwellenwert aus, indem Sie die beiden Histogramme vergleichen. Stellen Sie smf ein. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] und führen Sie den Abschnitt erneut aus.
- Führen Sie den Abschnitt "Calculate Percentage of GFP fits Positive for FR Signal" aus, um Hintergrundlokalisierungen zu korrigieren und Endwerte zu berechnen.
- Führen Sie Option 1 (Schritt 6.2.10) oder Option 2 (Schritt 6.2.11) entsprechend dem experimentellen Bedarf aus.
- Option 1: Korrigieren Sie die Anzahl der Rezeptoren, die an der Plasmamembran für die Ligandenbindung zur Verfügung stehen, wie in Referenz15 beschrieben.
- Erstens, markieren Sie Oberflächenrezeptoren mit gesättigten Konzentrationen von fluoreszierendem NHS-Ester-Farbstoff (NHS-AF647, siehe Materialtabelle). Führen Sie dann ein SiMPull-Experiment durch, um den Prozentsatz der GFP-Lokalisierung zu bestimmen, der mit AF647 kolokalisiert wird.
HINWEIS: Dies liefert eine Schätzung des Anteils der für die NHS-Markierung verfügbaren Rezeptoren und des Verhältnisses der Rezeptoren auf der Oberfläche (SR). - Wenden Sie die SR-Korrektur in der endgültigen Berechnung an: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, wobei NGFP die korrigierte Anzahl von GFP-Lokalisierungen, NBG die Hintergrundlokalisierungsnummer und NLOC die Gesamtlokalisierungen ist.
HINWEIS: Im vorliegenden Beispiel wird diese Korrektur nicht angewendet, da Pervanadatmembrandurchlässig 16 ist und daher die Wirkung der Phosphatasehemmung nicht auf Oberflächenrezeptoren beschränkt ist.
- Erstens, markieren Sie Oberflächenrezeptoren mit gesättigten Konzentrationen von fluoreszierendem NHS-Ester-Farbstoff (NHS-AF647, siehe Materialtabelle). Führen Sie dann ein SiMPull-Experiment durch, um den Prozentsatz der GFP-Lokalisierung zu bestimmen, der mit AF647 kolokalisiert wird.
- Option 2: Berücksichtigen Sie für Multisite-Phosphorylierungsmessungen das Potenzial für sterische Behinderungen, wenn zwei Antikörper verwendet werden.
HINWEIS: Sterische Behinderung kann zu einer Verringerung des beobachteten Prozentsatzes phosphorylierter Rezeptoren für Antikörper 1 führen, wenn Antikörper 2 (P12) vorhanden ist, verglichen mit Antikörper 1 allein (P1).- Verwenden Sie SiMPull, um P1 und P12 zu bestimmen und den Korrekturfaktor für sterische Behinderung gemäß der zuvor veröffentlichten Referenz15 zu berechnen.
- Führen Sie SiMPullMain.m aus - folgen Sie den Anweisungen für jeden Abschnitt. Führen Sie jeden Abschnitt einzeln aus, indem Sie den Cursor in diesem Abschnitt platzieren und auf das Symbol Abschnitt ausführen klicken.
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Representative Results
Ein Cartoon, der den SiMPull-Prozess darstellt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Deckgläser werden mit NeutrAvidin als Anker für biotinylierte Anti-EGFR-Antikörper funktionalisiert, um EGFR-GFP aus dem Gesamtprotein Lysate zu gewinnen. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Protein werden die phosphorylierten Rezeptoren mit einem Anti-Phosphotyrosin (Anti-PY)-Antikörper 15 markiert. Abbildung 1B zeigt ein Bild des hydrophoben Arrays, in dem mehrere Proben vorbereitet und auf demselben Deckglas abgebildet werden können. Ein Vorteil dieses Probenhalters ist, dass minimale Probenvolumina von ~10 μL benötigt werden. Das Deckglas kann abgebildet werden, indem es direkt auf den Mikroskoptisch gelegt wird. Hilfreich ist es jedoch, das Deckglas mit einem Deckglashalter zu stabilisieren. Der in Abbildung 1B dargestellte Deckglashalter wurde mit einem 3D-Drucker erstellt, und der Entwurf wird in der ergänzenden Codierungsdatei 5 bereitgestellt. Die Autofluoreszenz der hydrophoben Tinte ist ein nützlicher Leitfaden, um die Brennebene der Probe zu ermitteln (Abbildung 1C). Ein Beispiel für ein Mehrkanal-Rohbild ist in Abbildung 1D dargestellt. Eine Überlagerung der rohen grünen und far-roten Kanäle ist in Abbildung 1E dargestellt.
Abbildung 2 zeigt den Analyseworkflow und stellt repräsentative Daten bereit. Die Datenerfassung beginnt zunächst mit der Erfassung von Fiducials für die Kanalregistrierung, die verwendet wird, um die einzelnen Spektralkanaldaten zu überlagern (Abbildung 2A). Hellfeldbilder werden mit einem Nanogittermuster aufgenommen, das weißes Licht durchlässt und in jedem Spektralkanal des Bildteilers detektiert wird (nicht gezeigt). Der grüne Kanal fungiert als Referenzkanal, und der fernrote Kanal ist der verschobene Kanal. Die lokale gewichtete Mittelwerttransformation wird mit der Funktion fitgeotrans20 in MATLAB berechnet und verwendet, um fernrote Koordinaten in den Koordinatenrahmen des grünen Kanals zu verschieben. Diese Transformation verwendet an jedem Kontrollpunkt ein Polynommodell zweiter Ordnung. Anschließend werden Mehrkanaldaten des SiMPull-Arrays erfasst. Dieser Workflow bestand aus einer halbautomatischen Erfassung, bei der ein Start-ROI für das spezifische Stichprobenquadrat ausgewählt und drei Bereiche um diesen Bereich herum abgebildet wurden, sodass jedes Dataset das vollständige Vierfachansichtsbild von drei unabhängigen ROIs enthält (Abbildung 1D). In jedem Spektralkanal werden die Emitterkandidatenpositionen gefunden, indem ein Gaußscher Filter auf Bilder angewendet und lokale Maxima identifiziert werden. Unterregionen (Kästchen, Abbildung 2B) werden um lokale Maxima herum gezeichnet, und die Anzahl der Emitterphotonen wird geschätzt, indem angenommen wird, dass jeder Unterbereich nur einen Emitter enthält. Teilbereiche mit Emitterkandidaten mit Photonenzahlen über einem Mindestwert werden für die Anpassung beibehalten. Eine Gaußsche Punktspreizungsfunktion (PSF) passt jedem Emitterkandidaten in kleine Unterregionen, die grob um jeden Emitter zentriert sind. Die resultierenden Lokalisierungen werden basierend auf ihrer Photonenzahl, ihrem Hintergrund, der Cramér-Rao-Untergrenze der Anpassungskoordinaten, der PSF-Varianz (d. h. der PSF-Breite) und einem p-Wert, der die Anpassungsgüte des PSF-Modells beschreibt, gethresholdt. Für jeden Spektralkanal wird ein Gaußsches Bild erstellt, wobei Gaußsche Kleckse mit gleichmäßiger Intensität an den Koordinaten für jede gute Passform platziert werden (Abbildung 2C). Die Kolokalisation wird visualisiert, indem die Gaußschen Bilder aus jedem Spektralkanal unter Verwendung der aus der Fiducialprobe berechneten Transformation überlagert werden (Abbildung 2D). Es ist wichtig, den Rezeptor zur Identifizierung fluoreszierend zu markieren, da es immer noch eine unspezifische Bindung der Anti-Phosphotyrosin-Antikörper an die Oberfläche gibt, wenn Zelllysat vorhanden ist. Der EGFR-GFP (grüner Kanal) wird verwendet, um eine Maske der Rezeptorstellen zu erzeugen, und nur das AF647-Anti-PY-Signal (fernroter Kanal) innerhalb dieser Maske wird gezählt (Abbildung 2D). Paare innerhalb von 1 Pixel (106,7 nm Pixelgröße) gelten als kolokalisiert und werden in einer Liste gespeichert, die die Referenzkanalkoordinaten enthält. Der Prozentsatz von AF647, der mit GFP kolokalisiert ist, wird berechnet, um den Anteil phosphorylierter Rezeptoren zu bestimmen (Abbildung 2E).
Es gibt mehrere kritische Schritte, um eine gute Datenqualität zu gewährleisten. Ein solcher Versuch besteht darin, das Coverslip-Array mit NaBH4 zu inkubieren, wie im Protokoll zum Abschrecken der Autofluoreszenz im grünen Kanal beschrieben. Diese Autofluoreszenz bezieht sich auf das unspezifische Signal aufgrund möglicher Verunreinigungen auf dem Glas, das einzelne oder konjugierte π Bindungen21 enthält. Solche Verunreinigungen stammen möglicherweise aus den Aminosilan- und PEG-Reagenzien, die im Funktionalisierungsprozess verwendet werden, oder aus Staub aus der Luft und neigen dazu, im grünen Spektralkanal zu fluoreszieren. Trotz der Bemühungen, Glas unter Stickstoff zu speichern, können diese Moleküle auch durch Oxidation erzeugt werden, die bei der Lagerung auftritt. NaBH 4 wurde auch verwendet, um die Fluoreszenz von Verunreinigungen auf Objektträgern und Microarrays, einschließlich solcher mit Silanbeschichtung16, zu reduzieren. Abbildung 3A zeigt die Verringerung der Anzahl der Hintergrunderkennungen, die auftreten, wenn das mit Piranha geätzte Glas mit NaBH4 behandelt wird. Während NaBH4 die Hintergrundfluoreszenz dramatisch reduziert, werden einige Emitter immer noch im grünen Kanal detektiert. Man kann dies korrigieren, indem man Hintergrundbilder von lysatfreien Proben (Abbildung 3D) aufnimmt und die durchschnittliche Anzahl von Hintergrundlokalisierungen von den GFP-haltigen Proben subtrahiert. Fluoreszenz aus Verunreinigungen wurde im fernroten Kanal nicht nachgewiesen. Wenn die Rezeptordichte zu hoch ist, können mehrere GFP-Emitter innerhalb eines einzigen beugungsbegrenzten Punktes gefunden werden (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung von Step-Photobleaching zur Identifizierung der Anzahl der GFPs pro Punkt fanden wir heraus, dass eine Rezeptordichte zwischen 0,04-0,08 Proteinen / μm2 einen ausreichenden Abstand zwischen einzelnen Emittern bot, um das Potenzial zu beseitigen, mehrere Emitter pro Punkt12 zu finden. Die Rezeptordichte kann optimiert werden, indem die Menge des an die Glasoberfläche gebundenen IP-Antikörpers oder die Menge des zugegebenen Lysats variiert wird. Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Antikörper, der auf den POI abzielt, in gesättigten Mengen verwendet wird. Es wird empfohlen, eine Antikörperkonzentrationskurve an phosphorylierten Proben zu erfassen, um die geeigneten Markierungsbedingungen zu bestimmen (Abbildung 3B). Darüber hinaus muss die Phosphospezifität eines Antikörpers mit ruhenden Proben und/oder der Behandlung mit proteinspezifischen Kinase-Inhibitoren validiert werden (Abbildung 3B). Antikörper dissoziieren während des Bildgebungszeitfensters vom Rezeptor. Die Behandlung der Probe mit einer Kombination aus PFA und GA verhinderte einen Signalverlust (Abbildung 3C).
Schließlich ist es wichtig, die Einzelmolekül-Anpassungsparameter zu optimieren. Der erste "Box Finding"-Schritt, der potenzielle Emittentenkandidaten identifiziert (Abbildung 2B), muss großzügig sein, damit viele Kandidaten das Gaußsche Fitting durchlaufen können. Daher kann die minimale Photonenschwelle für die Boxfindung relativ niedrig sein, um alle echten Emitter und einige Hintergrundflecken zu erfassen. Es ist auch wichtig, die Kastengröße und das Überlappungskontingent nicht zu klein einzustellen. Die Boxgröße innerhalb von 5-7 Pixeln zu halten und eine Überlappung von zwei Pixeln zuzulassen, ist ideal für Emitter mit der empfohlenen Dichte. Nach der Boxfindung muss die minimale Photonenschwelle im Anpassungsschritt optimiert werden. Der minimale Photonenparameter trägt dazu bei, zu bestimmen, welche Gaußschen Strahler als echte Anpassung durchgehen. Um den richtigen minimalen Photonenschwellenwert für echte GFP-Anpassungen zu bestimmen, enthält der Code eine Histogramm-Plotting-Funktion, um die Photonen/Lokalisation sowohl im Hintergrund (kein Zelllysat) als auch in GFP-haltigen (plus Zelllysat) Proben zu untersuchen (Abbildung 3D). Dieser Schritt ist wichtig, da NaBH4 zwar die Fluoreszenzmenge aus Verunreinigungen reduziert, aber nicht alle Hintergrundlokalisationen entfernt. Abbildung 3D zeigt, dass ein minimaler Photonenschwellenwert festgelegt werden muss, um die Anzahl der Nachweise von Verunreinigungen zu reduzieren. Um diesen Schwellenwert zu bestimmen, wird ein Histogramm der Hintergrundemitterintensitäten aus der Abbildung einer Probe berechnet, die keinem Zelllysat ausgesetzt ist (Abbildung 3D, oben links). Die Mehrheit der Hintergrundemitter hatte Werte von weniger als 475 Photonen. Im Vergleich dazu zeigte die Stichprobe mit echten GFP-Emittern einen signifikanten Anteil der Verteilung über 475 (Abbildung 3D, oben rechts). Der Schwellenwert wird durch Inspektion gewählt, um so viele Hintergrundzählungen wie möglich zu entfernen und gleichzeitig den Signalverlust aus der Lysatprobe zu minimieren (Abbildung 3D, untere Zeile). Die verbleibende Hintergrundzähldichte an diesem Schwellenwert wird in der quantitativen Analyse berücksichtigt.
Abbildung 1: Überblick über die Probenvorbereitung. (A) Karikatur, die den SiMPull-Ansatz darstellt. Deckgläser werden mit einem Antikörper funktionalisiert, der den POI erkennt, um diesen POI aus ganzzelligen Lysaten zu erfassen. Das Glas wird zunächst mit PEG und Biotin-PEG beschichtet. NeutrAvidin wird dann an das Biotin-PEG gebunden und fungiert als Anker für den biotinylierten Anti-POI-Antikörper. Phosphorylierte Proteine werden dann mit einem fluoreszierend markierten Anti-PY-Antikörper nachgewiesen. (B) Foto des Deckglashalters (rot) mit Deckglasanordnung an Ort und Stelle und montiert auf dem Mikroskoptisch. Die Multisample-Arrays werden mit hydrophober Tinte erzeugt, um bis zu 20 einzelne Probenquadrate auf einem einzigen Glasdeckglas zu erzeugen. Das Deckglas ist 60 mm x 24 mm. (C) Beispielbilder der hydrophoben Tintenautofluoreszenz (Magenta) und fluoreszierenden Perlen (grün). Die Autofluoreszenz der hydrophoben Tinte ist ein nützlicher Leitfaden, um die Fokusebene an der Deckglasoberfläche zu finden. (D) Beispiel eines Rohdatenbildes mit Spektralkanälen, die auf dem Kamerachip durch den Quad-View-Bildsplitter getrennt sind. Das Quad-View-Filter-Set enthält die folgenden Emissionsfilter: Blau (445/45 nm), Grün (525/45 nm), Rot (600/37 nm), Far-Red (685/40 nm). (E) Rohe Überlagerung von grünen und far-roten Kanälen. Der weiße Kasten zeigt den in Abbildung 2B-D weiter untersuchten Bereich an. Maßstabsleiste (C-E) = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Workflow für die Datenanalyse . (A) Die Kanalregistrierung wird zuerst auf Bildern durchgeführt, die aus dem Nanogitter aufgenommen wurden. Nach dem Zuschneiden der beiden interessierenden Spektralkanäle (hier grün und far-red) werden die passenden Bilder für jeden Kanal überlagert (links). Eine Vergrößerung der Box im linken Bild (Inset) zeigt, dass die Bilder noch nicht wirklich registriert sind. Die Emitter in jedem Kanal passen in ein Gaußsches Modell und sind lokalisiert (Registration). Die Lokalisierung der Emitter wird als Kreise für den fernroten Kanal und Kreuze für den grünen Kanal angezeigt. Der letzte Schritt besteht darin, eine lokale gewichtete mittlere Transformation anzuwenden, um die weit roten Kanallokalisierungskoordinaten in den grünen Kanalreferenzrahmen (Aligned) zu verschieben. Die berechnete lokale gewichtete Mittelwerttransformation wird dann verwendet, um die nachfolgenden SiMPull-Daten zu registrieren. (B) Repräsentative Bilder des grünen/EGFR-GFP-Kanals und des fernroten/AF647-Anti-PY-Kanals. Einzelne Emitter oberhalb der Hintergrundphotonenzahl werden identifiziert und mit Kästchen markiert. (C) Das Emissionsprofil in jeder ausgewählten Box wird an ein Gaußsches Modell angepasst, und die Emitter, die in das Modell eines einzelnen Fluorophor-PSF passen, werden beibehalten. (D) Aus den GFP-Emittern wird eine Maske erstellt, um den Standort von EGFR-GFP (grün) zu identifizieren. Die Kolokalisation von EGFR-GFP und AF647-anti-PY identifiziert phosphorylierte Rezeptoren (weiß). (E) Der Anteil phosphorylierter Rezeptoren wird aus den kolokalisierten EGFR-GFP- und AF647-Anti-PY-Fitsen berechnet. Das Balkendiagramm vergleicht die PV + EGF-Behandlung mit Ruhezellen, gemittelt für mehrere Messungen. Fehlerindikatoren stellen einen Standardfehler dar, der unter der Annahme einer Binomialverteilung berechnet wird. Maßstabsleiste = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Kritische Schritte zur Sicherstellung der Datenqualität. (A) Von links nach rechts sind die ersten drei Paneele repräsentative Bilder der Autofluoreszenz auf Glas unter den jeweiligen Bedingungen: nach dem Piranha-Ätzen mit PEG und der Behandlung mit PEG plus NaBH4 (angezeigt mit +). Darüber hinaus wird die Oberflächenfunktionalisierung nach der NaBH4-Behandlung beibehalten, wie durch eine minimale unspezifische PY99-AF647-Bindung demonstriert wird, während die robuste Bindung von EGFR-GFP aus dem Lysat erhalten bleibt. (B) Für jede verwendete Charge von Antikörpern ist eine Sättigungskurve zu erstellen, um eine optimale Antikörpermarkierung zu gewährleisten. Diese Abbildung zeigt die Konzentrationskurve zur Markierung von EGFR mit dem ortsspezifischen Phosphotyrosin-Antikörper Anti-EGFR-pY1173. Eine minimale Phosphorylierung wird in unbehandelten Zellen (Ruhe, grauer Diamant) nachgewiesen. Zur Kontrolle der unspezifischen Bindung wurden die Zellen auch mit dem EGFR-Kinase-Inhibitor Lapatinib behandelt, bevor 100 nM EGF (Magenta-Dreieck) hinzugefügt wurden, was die erwartete Prävention der EGFR-Phosphorylierung zeigt. Fehlerindikatoren stellen einen Standardfehler dar, der eine Binomialverteilung annimmt. (C) Die Fixierung der Probe mit einer Kombination aus PFA und GA verhindert eine Zahnkörperdissoziation im Laufe der Zeit. Fehlerindikatoren stellen einen Standardfehler dar, der eine Binomialverteilung annimmt. (D) Fehlalarme werden ausgeschlossen, indem der geeignete Schwellenwert für Gaußsche Anpassung ausgewählt wird. Der Vergleich des Histogramms der Anpassungsintensitäten bei einem niedrigen Schwellenwert (Schwellenwert = 0; oben) zwischen Hintergrund (kein Lysat) und realen Daten (plus Zelllysat) ermöglicht die Auswahl eines geeigneten Wertes (Schwellenwert = 475; unten), um Anpassungen von autofluoreszierenden Punkten im grünen Kanal zu entfernen. Die vertikale Magenta-Linie zeigt eine Schwelle von 475 Photonen an. Histogramme werden aus der gleichen Anzahl von ROIs für jeden Stichprobentyp (n = 3) berechnet. Maßstabsleiste = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Supplementary Coding File 1: Zip-Datei mit Skripten und Dienstprogrammen zum Ausführen der SiMPull-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Kodierungsdatei 2: ZIP-Datei mit dem Smite-Einzelmolekül-Analysepaket. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Supplementary Coding File 3: ZIP-Datei mit den Beispieldaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Kodierungsdatei 4: ZIP-Datei mit repräsentativen Beispieldatenanalyseausgaben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Kodierungsdatei 5: Deckglashalter-Blaupause für den 3D-Druck. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um quantitative Messungen der Rezeptorphosphorylierung auf Einzelproteinebene zu ermöglichen. Es wurden mehrere einfache, aber wichtige Modifikationen am SiMPull-Protokoll entwickelt, die die Zuverlässigkeit der Messung für den Phospho-Tyrosin-Nachweis verbesserten, einschließlich der Verringerung der Autofluoreszenz mit NaBH4-Behandlung und Nachfixierung der Probe, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern. Die Verwendung der grünen Kanalmaske zur Identifizierung von Rezeptorpositionen für die Berechnung der Kolokalisation mit dem Anti-PY-Antikörper verbessert auch die Messgenauigkeit, indem potenzielle Artefakte aus der unspezifischen Bindung des Antikörpers an das Zelllysat entfernt werden. Die Zwei-Farben-Bildgebung wurde verwendet, um den Anteil der phosphorylierten Rezeptoren nachzuweisen. In diesem Szenario wurde der Rezeptor genetisch mit GFP markiert, und der Antikörper wurde direkt mit einem far-red Farbstoff markiert. Der SiMPull-Ansatz gilt für andere Proteinziele, für die spezifische Antikörper verfügbar sind, einschließlich intrazellulärer Proteine. Da keine Denaturierungsbedingungen erforderlich sind, können auch Rezeptoren / Komplexe mit mehreren Untereinheiten erfasst werden. Die Denaturierung kann jedoch eingebaut werden, wenn sich die interessierenden PTMs in strukturierten Regionen des Proteins14 befinden. Letztendlich kann SiMPull leicht erweitert werden, um die gleichzeitige Markierung verschiedener Phospho-Tyrosine auf einzelnen Rezeptoren zu umfassen, um Multisite-Phosphorylierungsmuster zu quantifizieren15. Die Abfrage von intakten Rezeptoren in voller Länge auf diese Weise kann nicht durch andere Standardmethoden, einschließlich Western Blotting und Phospho-Massenspektrometrie, erreicht werden.
Neben den Vorteilen von SiMPull müssen auch einige Einschränkungen beachtet werden. Wie bei jeder Antikörper-basierten Technik sind die Affinität und Spezifität der verwendeten Antikörper entscheidend für den Erfolg der Messung. Daher ist es wichtig, die Bedingungen für die Antikörpermarkierung zu optimieren und im Idealfall sekundäre Antikörper zu vermeiden, indem direkt markierte primäre Antikörper verwendet werden. Darüber hinaus werden die oberflächengebundenen Antikörper Proteine ausfällen, die in der Plasmamembran und in zytosolischen Kompartimenten lokalisiert sind. Dies kann die Phosphorylierung unterschätzen, da Zytosol-lokalisierte Proteine für den exogen hinzugefügten Liganden nicht zugänglich sind. Es müssen zusätzliche Schritte unternommen werden, um die Oberflächenwerte des Rezeptors zu korrigieren (Schritt 6.2.10). Die Anti-Phosphotyrosin-Antikörper zeigten eine unspezifische Bindung, sobald Lysat vorhanden war. Um dieses Artefakt zu vermeiden, wurde der EGFR genetisch mit GFP markiert, um den Standort von Rezeptoren zu identifizieren, was es uns ermöglichte, das Anti-PY-Signal vom Rezeptor auszuschließen. Wenn endogene Proteine abgefragt werden sollen, kann die Gegenfärbung mit einem totalen Proteinantikörper das Maskenbild liefern, mit entsprechender Korrektur für jede unspezifische Bindung. Während SiMPull Informationen über die Heterogenität auf Proteinebene liefert, stammt das in diesem Protokoll erzeugte Lysat aus Tausenden von Zellen, und die Zellvariabilität geht verloren. Fortschritte in Richtung Einzelzell-SiMPull wurden jedoch mit einer Durchflusskammer gemacht, die aus einem Deckglas und einer Mikroskopseite mit einem Abstand von 10 μm besteht; Bakterien wurden spärlich auf dem Deckglas plattiert, während der Objektträger mit Antikörpern funktionalisiert wurde, um die gewünschten Proteine einzufangen. Bei der Lyse der Bakterien wurden die Proteine aus jeder Zelle in einem begrenzten Bereich auf dem antikörperbeschichteten Objektträger22 eingefangen. Eine ähnliche Einzelzell-SiMPull-Analyse von Säugetierzellen und Proteinphosphorylierung könnte in Zukunft möglich sein.
Das SiMPull-Protokoll enthält mehrere kritische Schritte, die erforderlich sind, um eine hohe Datenqualität zu gewährleisten. Zum Beispiel beinhaltet das Protokoll eine aufwendige Vorbereitung des Deckglases. Piranha Ätzbezüge reinigen das Glas gründlich und erhöhen Hydroxylgruppen und Hydrophilie, die zur Optimierung der Deckglasoberfläche benötigt werden. Nach mehreren Waschungen mit organischen Lösungsmitteln liefert die KOH-Behandlung zusätzliche Hydroxylgruppen für die Aminosilanisierung13,23, wodurch das Glas mit Amingruppen für die PEG- und Biotin-PEG-Bindung beschichtet wird. Eine unsachgemäße Reinigung oder Funktionalisierung bei einem dieser Schritte beeinträchtigt den Protein-Pulldown. Die Kontrolle des molaren Verhältnisses von PEG:biotin-PEG sowie die Lysatkonzentration sind Schlüsselfaktoren für die Erzielung einer angemessenen Protein-IP-Dichte auf dem SiMPull-Substrat. Wie bei jedem biologischen Assay gibt es Variabilität zwischen Zelllysatpräparaten, und kleine Unterschiede zwischen den Phosphorylierungsprozentsätzen können zwischen den Probenreplikten beobachtet werden. Daher ist es wichtig, die Phosphorylierungswerte verschiedener Tyrosinstellen innerhalb derselben Probe zu messen. Die in diesem Protokoll beschriebene Probenkammer bietet ein System zur Erfassung vieler Datenpunkte in einer Bildgebungssitzung und ermöglicht die Mittelung über mehrere SiMPull-Experimente.
Auf der Seite der Bilderfassung ist es wichtig, die treuhänderische Probe zu erhalten, um eine genaue Kanalüberlagerung zu gewährleisten. Andernfalls ist die Kolokalisierung nicht korrekt. Es ist auch wichtig, die Laserleistung und die Kameraeinstellungen zu optimieren, um das Signal-Rauschen zu maximieren und gleichzeitig das Photobleichen zu minimieren. Während das Probenarray eine kleine Menge an Proben und Reagenzien benötigt, sind die geringen Volumina während der Bildgebungssitzung anfällig für Verdunstung. Es ist wichtig, das Probenarray regelmäßig zu überprüfen (~ 30-45 min) und bei Bedarf Puffer hinzuzufügen, um das Austrocknen der Proben zu verhindern.
Das vorliegende Protokoll demonstrierte die Verwendung von SiMPull zur Quantifizierung von Membranrezeptor-Phosphorylierungszuständen. Während sich der Ansatz auf EGFR konzentriert, kann er auf andere Zelloberflächenrezeptoren und intrazelluläre Proteine und Proteinkomplexe angewendet werden, sofern geeignete Antikörper verfügbar sind. Eine weitere mögliche Verwendung für SiMPull ist die Abfrage des Inhalts und des Phosphorylierungsstatus von phasengetrennten Kondensaten. Darüber hinaus kann SiMPull verwendet werden, um andere PTMs wie die Ubiquitinierung zu messen. Daher bietet SiMPull ein einzigartiges Werkzeug für Zellbiologen, um PTMs auf intakten Proteinen zu untersuchen und PTM-Muster mit zellulärem Ergebnis zu korrelieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 und R01CA248166 zu DSL unterstützt. EMB wurde durch das ASERT-IRACDA-Programm (NIH K12GM088021) und JAR durch das UNM MARC-Programm (NIH 2T34GM008751-20) unterstützt. Wir danken der Verwendung der gemeinsamen Ressource der Fluoreszenzmikroskopie der University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, die von NIH P30CA118100 unterstützt wird. Wir möchten Dr. Ankur Jain und Dr. Taekijip Ha würdigen, deren ursprüngliche Entwicklung von SiMPull diese Arbeit inspiriert hat.
ES-C anwesende Adresse: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al.
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T.
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
