Summary
Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.
Abstract
Fosforilasyon, protein fonksiyonunu düzenleyen ve hücre sinyal sonuçlarını yönlendiren gerekli bir posttranslasyonel modifikasyondur. Protein fosforilasyonunu ölçmek için mevcut yöntemler, tek tek proteinler arasında fosforilasyondaki heterojenliği koruyamaz. Tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi, makromoleküler komplekslerin bileşimini, proteinlerin bir cam kapak kapağı üzerindeki immünopresipitasyonu ve ardından tek moleküllü görüntüleme yoluyla araştırmak için geliştirilmiştir. Mevcut teknik, tek molekül seviyesinde tam uzunluktaki membran reseptörlerinin fosforilasyon durumunun sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayan SiMPull'un bir uyarlamasıdır. Binlerce bireysel reseptörün bu şekilde görüntülenmesi, protein fosforilasyon paternlerinin ölçülmesine izin verir. Mevcut protokol, numune hazırlamadan görüntülemeye kadar optimize edilmiş SiMPull prosedürünü detaylandırır. Cam hazırlama ve antikor fiksasyon protokollerinin optimizasyonu veri kalitesini daha da artırır. Mevcut protokol, bir numune içinde fosforile edilen reseptörlerin fraksiyonunu hesaplayan tek moleküllü veri analizi için kod sağlar. Bu çalışma epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyonuna odaklanırken, protokol diğer membran reseptörlerine ve sitozolik sinyal moleküllerine genelleştirilebilir.
Introduction
Membranla ilişkili sinyalleşme, ligand kaynaklı membran reseptör aktivasyonu ve sinyali yayan aşağı akış aksesuar proteinlerinin işe alınmasının bir kombinasyonu ile ayarlanır. Reseptör sitoplazmik kuyruklarındaki anahtar tirozinlerin fosforilasyonu, sinyal komplekslerinin veya sinyalozomların oluşumunu başlatmak için kritik öneme sahiptir 1,2. Bu nedenle, biyolojide önemli bir soru, sinyal ortaklarını işe almak ve hücresel sonuçları dikte etmek için fosforilasyon modellerinin nasıl oluşturulduğu ve sürdürüldüğüdür. Bu, reseptör fosforilasyonunun heterojenliğini, hem bol miktarda hem de sinyalozom 3,4,5,6,7'nin bileşimini dikte ederek sinyal çıkışlarını manipüle etmenin bir yolunu sağlayabilen spesifik fosfotirozin modellerinde anlamayı içerir. Bununla birlikte, protein fosforilasyonunu sorgulamak için mevcut yöntemlerde sınırlamalar vardır. Batı leke analizi, protein fosforilasyon eğilimlerini tanımlamak için mükemmeldir, ancak yarı kantitatif8'dir ve sistemin heterojenliği hakkında bilgi sağlamaz, çünkü binlerce ila milyonlarca reseptörün ortalaması birlikte alınır. Batı lekeleri, spesifik tirozinlere fosfo-spesifik antikorlar kullanarak bir numunenin araştırılmasına izin verirken, aynı protein içindeki çok bölgeli fosforilasyon paternleri hakkında bilgi sağlayamazlar. Kantitatif fosfoproteomikler fosfotirozin bolluğu hakkında rapor verir, ancak çok bölgeli fosforilasyonun saptanmasında sınırlamalar vardır, çünkü ilgilenilen kalıntıların enzimatik sindirim9,10,11 tarafından üretilen aynı peptid (tipik olarak 7-35 amino asit) içinde bulunması gerekir.
Yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için, tek moleküllü aşağı çekme (SiMPull) testi, tek moleküllü seviyedeki sağlam reseptörlerin fosforilasyon durumlarını ölçmek için uyarlanmıştır. SiMPull, makromoleküler kompleksleri sorgulamak için güçlü bir araç olarak ilk olarak Jain ve ark.12,13 tarafından gösterilmiştir. SiMPull'da, makromoleküler kompleksler antikor işlevselleştirilmiş cam kapaklar üzerinde immünoprepite edildi (IP) ve daha sonra protein alt birim sayısı ve karmaşık bileşenlerle ko-IP için tek moleküllü mikroskopi ile analiz edildi12. Kim ve ark.14 tarafından SiMBlot olarak adlandırılan bir modifikasyon, denatüre proteinlerin fosforilasyonunu analiz etmek için SiMPull'un bir varyasyonunu kullanan ilk kişi oldu. SiMBlot protokolü, NeutrAvidin kaplı kapaklar kullanılarak biyotinile hücre yüzey proteinlerinin yakalanmasına dayanır ve bunlar daha sonra fosfo-spesifik antikor etiketleme14 ile fosforilasyon için incelenir. Bu ilerlemelere rağmen, posttranslasyonel modifikasyonun nicelleştirilmesini daha sağlam ve daha geniş bir protein yelpazesine uygulanabilir hale getirmek için iyileştirmelere ihtiyaç vardı.
Mevcut protokol, bir dizi ligand koşuluna ve onkojenik mutasyonlara yanıt olarak bozulmamış epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyon paternlerini ölçmek için kullanılan optimize edilmiş bir SiMPull yaklaşımını tanımlamaktadır15. Bu çalışma EGFR'ye odaklanırken, bu yaklaşım, kaliteli antikorların mevcut olduğu herhangi bir membran reseptörü ve sitozolik proteinlere (POI) uygulanabilir. Protokol, numune otofloresansını azaltma adımlarını, 20 numuneye kadar eşzamanlı hazırlık ile minimum numune hacmi gerektiren bir numune dizisi tasarımını ve antikor etiketleme ve sabitleme koşullarının optimizasyonunu içerir. Fosforile proteinlerin tek moleküllü tespiti ve nicelleştirilmesi için veri analiz algoritmaları geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kapak kapağı hazırlığı
NOT: Bu adım için, çift katmanlı nitril eldiven, güvenlik gözlüğü veya yüz siperliği ve bir laboratuvar önlüğü içeren kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmesi gerekir.
- Camdaki organik kalıntıları gidermek için piranha aşındırma işlemi yapın.
DİKKAT: Piranha çözeltisi, organik malzemelerle temas ettiğinde aşındırıcı ve oldukça reaktif olan güçlü bir oksitleyici ajandır. Organik enkaz ile reaksiyon ekzotermiktir ve potansiyel olarak patlayıcıdır. Bu nedenle, prosedür kanat indirilmiş kimyasal bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Piranha çözeltisini işlemek için Pyrex cam eşyalar gereklidir.- Çalışma alanını kimyasal bir duman davlumbazının içine hazırlayın. Kapakları, 4 L'lik bir cam kabın, "reaksiyon" kabının altına üst üste binmeden düzenleyin ve reaksiyon kabını hafif ısıya sahip bir ocak üzerine yerleştirin. Cam eşyaların 10 dakika ısınmasına izin verin. Reaksiyon kabına 500 mL ddH2O proksimal ile "atık" 1 L cam bir kab yerleştirin.
- Bir cam serolojik pipet ile reaksiyon kabına yavaşça 49 mL 12 N sülfürik asit (H2SO4) ekleyin. Pipetleri bertaraf etmeden önce atık kabında durulayın.
- Reaksiyon kabına bir cam serolojik pipet ile damla damla21mL% 30 hidrojen peroksit (H 2 O2) ekleyin. Piranhaaşındırma reaksiyonunun lokalize söndürülmesini önlemek için H2O2 damlacıklarını reaksiyon şişesinin tabanına eşit olarak yavaşça dağıtın. Pipetleri bertaraf etmeden önce atık kabında durulayın.
DİKKAT: Her zamanH2SO4'e H2 O2ekleyin ve asla tersi olmasın. - Piranha, kapakları 30 dakika boyunca kazıyın. Reaksiyon kabının içeriğini her 5 dakikada bir nazikçe çalkalayın.
- Piranha çözeltisini, atık kabın içeriğini reaksiyon kabına dökerek söndürün. Sıçramayı en aza indirmek için sıvıyı reaksiyon kabının duvarından yavaşça aşağı aktarın. Reaksiyon kabını ocaktan çıkarın.
- Reaksiyon söndürüldüğünde ve soğutulduğunda, piranha çözeltisini, aşınmış kapak kapaklarını reaksiyon kabından çıkarmadan nötralizasyon için atık kabın içine geri dökün.
- Piranha çözeltisini, zayıf bir bazın kademeli olarak eklenmesiyle nötralize edin. Örneğin, aşırı kütle 20 g sodyum bikarbonat (NaHCO3) / 100 mL piranha çözeltisi kullanın.
DİKKAT: Piranha çözeltilerini kapalı atık konteynerlerinde saklamayın. Çözelti bertaraf edilmeden önce daima nötralize edilmelidir. Nötralizasyon reaksiyonu kuvvetli kabarcıklar üretir ve zayıf bazın kademeli olarak eklenmesiyle kontrol edilmezse patlayıcı olabilir. - Nötralize edilmiş çözeltiyi bir cam karıştırma çubuğu ile karıştırın ve 2 saat boyunca reaksiyona girmesine izin verin. PH'ı >4'e yükseltin ve çözeltiyi atın.
- Piranha çözeltisine zayıf baz ilaveleri arasında, kazınmış kapak fişlerini reaksiyon kabından bir cam karıştırma çubuğu ile bir Buchner hunisine aktarın ve ddH2O çalışırken 5 dakika durulayın.
NOT: Hemen bir sonraki adıma geçin veya piranha kazınmış örtü fişleriniddH 2O'da 2 haftaya kadar kapalı bir cam kavanozda veya Petri kabında saklayın (sızdırmazlık filmi ile sarın, bkz.
- Banyo-sonicate kapakları aşağıdaki adımları izleyerek organik çözücüler içinde kaymak.
- Kapak fişlerini cam bir Coplin kavanozuna yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) ve metanol (CH3OH) ile örtün. Kapağı kavanoza sızdırmazlık filmi ve banyo sonikatıyla 10 dakika boyunca kapatın. Metanolü Coplin kavanozundan dikkatlice bir cam saklama şişesine dökün.
- Coplin kavanozunu asetonla doldurun (C3H6O), kapağı kapatın ve 10 dakika boyunca banyo sonikatın. Asetonu Coplin kavanozundan dikkatlice bir cam saklama şişesine dökün.
DİKKAT: Metanol yanıcı ve akut toksiktir. Kimyasal bir duman davlumbazında kullanın. Aseton yanıcı ve tahriş edicidir. Bu nedenle, camla tutun ve camda saklayın ve kimyasal bir duman davlumbazında kullanın. Tehlikeli atıkları yerel yönetmeliklere ve yönergelere uygun olarak bertaraf edin.
NOT: Metanol ve aseton, her biri beş defaya kadar tekrar kullanılabilir.
- Silan işlevselliği için kapak kaydırma yüzeyini etkinleştirin.
- 20 dakika boyunca 1 M potasyum hidroksit (KOH) ile banyo-sonikat. KOH'yi Coplin Kavanozundan tekrar kullanım için dikkatlice 50 mL'lik bir konik tüpe dökün.
DİKKAT: KOH aşındırıcı ve tahriş edicidir. Kimyasal bir duman davlumbazında kullanın ve camda saklamayın. Polipropilen tüplerde saklayın. Tehlikeli atıkları yerel yönetmeliklere ve yönergelere uygun olarak bertaraf edin.
NOT: KOH beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. - ddH 2 O ile iki kezdurulayın ddH2O'yu kapak kapaklarından boşaltın ve ardından tüm yüzey nemini gidermek için bir Bunsen brülörünün alevinden sallayarak her bir kapak kaymasını ısıtın. Kapak fişlerini kuru bir Coplin kavanozuna yerleştirin.
- 20 dakika boyunca 1 M potasyum hidroksit (KOH) ile banyo-sonikat. KOH'yi Coplin Kavanozundan tekrar kullanım için dikkatlice 50 mL'lik bir konik tüpe dökün.
- Coverslip aminosilianizasyonu gerçekleştirin.
- Konik bir şişede 69.4 mL metanolü 3.6 mL asetik asit (CH3COOH) ile karıştırarak aminosilan çözeltisini hazırlayın. 720 μL N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoksisilan (aminosilan) ekleyin ve iyice karıştırın (bkz.
DİKKAT: Asetik asit yanıcı ve aşındırıcıdır. Cam pipetlerle tutun ve camda saklayın. Kimyasal bir duman davlumbazında asetik asit ile çalışın. Aminosilan akut toksik bir inhalasyon tehlikesi, bir hassaslaştırıcı ve tahriş edicidir. Sucul yaşama zararlıdır. Kimyasal bir duman davlumbazında kullanın. Kimyasalları yerel yönetmeliklere ve yönergelere uygun olarak tehlikeli atık olarak atın.
NOT: Aminosilan ışığa duyarlıdır ve suda hızla hidrolize olur. Bu reaktifle ilgili tüm adımların, aktiviteyi korumak için minimum ışık koşullarında gerçekleştirilmesi gerekir. Şişeyi azot gazı ile temizleyin ve karanlık bir kurutucuda saklamadan önce sızdırmazlık filmi uygulayın. Her 6-9 ayda bir değiştirin. - Hemen aminosilan çözeltisini Coplin kavanozuna ekleyin. Işıktan korunmaya devam ederek sızdırmazlık filmini örtün ve uygulayın.
- Kapakları aminosilan çözeltisindeki kapakları oda sıcaklığında (RT) karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika boyunca banyo-sonicate ve sonra başka bir 10 dakika için inkübe edin. Aminosilan çözeltisini, eser aminosilan ve CH3 COOHile CH3OH için belirlenmiş bir atık kabına dikkatlice dökün.
- Kapakları metanol ile durulayın ve çözeltiyi metanol için belirlenmiş bir atık kabına dökün.
- Kapak fişlerini her biri 2 dakika boyunca ddH2O ile üç kez durulayın.
- Konik bir şişede 69.4 mL metanolü 3.6 mL asetik asit (CH3COOH) ile karıştırarak aminosilan çözeltisini hazırlayın. 720 μL N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoksisilan (aminosilan) ekleyin ve iyice karıştırın (bkz.
- Kapak kapaklarının dizi hazırlama/biotin-PEG işlevselleştirmesini gerçekleştirin.
- 84.5 mg NaHCO 3'ü 1 mL ddH2O'ya çözerek 1 M NaHCO3 (pH 8.5) çalışma stoğu hazırlayın. 10 mM NaHCO 3'ün son konsantrasyonu için, 1 M NaHCO3'ü ddH2 O'ya(1:100) seyreltin.
- Kuru aminosilatörlü kapak fişlerine hidrofobik bariyer kalemle bir ızgara dizisi çizin (bkz. Malzeme Tablosu) ve mürekkebin kurumasını bekleyin. Doğru yönü işaretlemek için kapak fişine bir tanımlayıcı yazın. Kapak kapaklarını nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.
NOT: Dizi, yaklaşık 4 mm x 4 mm boyutlarında 16-20 kareden oluşmalıdır. - Biotin-PEG süksinimidil valerat (biotin-PEG) / mPEG süksinimidil valerat (mPEG) çözeltisini yapmak için, önce mPEG ve biotin-PEG'i ( Malzeme Tablosuna bakınız) dondurucudan çıkarın ve RT'ye dengeleyin. 153 mg mPEG ve 3.9 mg biotin-PEG (~ 1:39 biotin-PEG: mPEG) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve nazik pipetleme ile 609 μL 10 mM NaHCO3'te askıya alın. Kabarcıkları çıkarmak için RT'de 1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın.
NOT: pH 8.5 tamponunda süksinimidil valeratın hidroliz yarı ömrü ~ 30 dakikadır. Arabelleği mPEG'e ekledikten sonra, aşağıdaki adımlarla mümkün olduğunca hızlı bir şekilde devam edin. Bu adım çok önemlidir. - Biotin-PEG / mPEG çözeltisini, kapak kayma dizilerindeki her kareyi, tipik olarak kare başına 10-15 μL'yi tamamen kaplamak için uygulayın. Sıvının tanımlanan alanı taşmasına izin vermeyin. Kapak kapaklarını RT'de 3-4 saat boyunca karanlıkta bir nem odasında saklayın.
- Kapak fişlerini sırayla her biri 10 s içinddH 2O ile doldurulmuş 3x 250 mL cam kaplara batırarak bol miktarda suyla yıkayın.
- Kapak kapaklarındaki tüm nemi azot gazı ile uzaklaştırın. Kapak kapaklarını -20 °C'de sızdırmazlık filmi ile sarılmış azot dolu 50 mL konik bir tüpte arka arkaya saklayın.
NOT: Hemen adım 2'ye ilerleyin veya kapakları kullanımdan 1 hafta öncesine kadar -20 °C'de saklayın.
2. SiMPull lizatının hazırlanması
DİKKAT: Protokolün kalan adımları için gerekli KKD'ler nitril eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlükleridir.
NOT: Lisatlar, EGFR-GFP eksprese eden yapışkan CHO hücrelerinden hazırlanmıştır. Hücreler12,13 gece boyunca 60 mm'lik bir doku kültürü (TC60) kabında kaplandı. DMEM'de CHO hücreleri, %10 fetal sığır serumu, %1 L-glutamin, %1 Penisilin-Streptomisin ve 500 ng/mL genetikin ile desteklenerek kültüre alındı (bakınız Materyal Tablosu). Diğer yapışkan hücre hatları veya süspansiyon hücreleri de kullanılabilir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri plakalayın.
- Kültür kabını (hücreleri içeren) 1 mL 1x PBS ile yıkayın. 1 mL 1x Tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Bir pipet kullanarak, ayrılan hücreleri çanaktan 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 10 μL tripan mavisi alın ve ayrı bir santrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın. Üreticinin talimatlarına göre, otomatik bir hücre sayacında hücre karışımının 10 μL'sini kullanarak hücreleri sayın (bkz.
- TC60 petri kabında gece boyunca 8 x 105 hücre tabaklayın. Koşul başına bir tabak tabaklayın.
NOT: Bu çalışma için, hücreler ya tedavi edilmemiş ya da adım 2.4.1'de açıklandığı gibi Pervanadat ve EGF ile muamele edilmiştir.
- Hücre lizat hazırlığı için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın.
- Buz gibi soğuk 1x PBS (pH 7.4) hazırlayın.
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) ve Proteaz/Fosfataz İnhibitörü (PPI) (stoktan 1:100) ile desteklenmiş 150 mM NaCl'de %1 iyonik olmayan, dejenere olmayan deterjan çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) olan lizis tamponu hazırlayın. Tüpü bir nutator üzerine yerleştirin ve tamponun 15 dakika boyunca karışmasına izin verin. Hazırlanan çözeltiyi buz üzerinde tutun.
- Tyrode tamponunu 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH7.2), 20 mM glikoz ve% 0.1 Sığır Serum Albümini (BSA) nihai konsantrasyonu için hazırlayın (bkz. Çözeltiyi 37 ° C'ye ısıtın.
- Fosforilasyon için pozitif kontrolü hazırlayın - 1 mM pervanadat tedavisi.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Pervanda, vanadatın peroksitlenmiş şeklidir - protein tirozin fosfatazların bir inhibitörü16. Fosfataz aktivitesini inhibe ederek protein defosforilasyonunu önlemek, yüksek fosforile edilmiş bir numune ile sonuçlanır.- 200 mM'lik bir aktif sodyum ortovanadat stoğu hazırlayın (Na3VO4).
- 100 mL'lik çözelti hazırlamak için, 90 mL ddH2O'ya 3,89 g Na3VO4 (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin ve karıştırırken çözün. HCl veya NaOH damla damla ekleyerek pH'ı 10'a ayarlayın. HCl eklenmesi çözeltiyi sararır.
- ddH2O ile hacmi 100 mL'ye getirin. çözeltiyi mikrodalgada ısıtarak kaynatın. Kaynattıktan sonra, çözelti renksiz olacaktır.
- Çözeltiyi RT'ye soğutun ve pH'ı 10'a yeniden ayarlayın. Kaynatma, soğutma ve pH ayarını pH 10'da stabilize olana kadar iki ila dört kez daha tekrarlayın. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın.
- 20.4 μL%3 H 2O 200 μL'lik 200 μL 200 mM Na 3 VO 4 ve546.8 μL ddH 2 O (H2O ve aktive Na 3 VO4'üneşmolar konsantrasyonları) ile karıştırarak 30mM pervanadat (PV) stoğu hazırlayın. RT'de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Tyrode'un tamponunda 1 mM PV hazırlayın. 10 mL'lik çözelti için, 9,67 mL'lik 37 °C Tyrode tamponuna 0,33 mL 30 mM PV stoğu ekleyin. Hücreleri hemen tedavi edin.
- Hücreleri bir kez 3 mL Tyrode tamponu ile yıkayın. Hücrelere tirodun tamponuna 3 mL'lik 1 mM PV ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 200 mM'lik bir aktif sodyum ortovanadat stoğu hazırlayın (Na3VO4).
- Ligand stimülasyonunu gerçekleştirin.
- Uygun konsantrasyon, zaman ve sıcaklık kullanarak hücreleri ilgilenilen ligandla uyarın. Maksimum EGFR stimülasyonu için, 1 mL 50 nM Epidermal Büyüme Faktörü (EGF, Malzeme Tablosuna bakınız) + 37 ° C'de 5 dakika boyunca Tyrode tamponunda 1 mM PV ile inkübe edin.
- Hücre lizisi gerçekleştirin.
- İstenilen hücre tedavisinden sonra, bulaşığı buz üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk 1x PBS ile yıkayın. Pipet kullanarak PBS'nin tüm hacmini tamamen çıkarın.
- Plakaya 180 μL lizis tamponu (adım 2.2.2) ekleyin. Hücreleri tamamen örtmek üzere tamponu plakanın etrafına çekmek için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri tamamen lize etmek için tüm kültürlü yüzey boyunca hücre kazıyıcı ile sert, tutarlı bir basınç uygulayın.
NOT: Yüksek protein konsantrasyonu sağlamak için lizis tamponunun hacminin minimumda tutulması gerekir. - Lize edilmiş hücreleri pipetleyin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Her 5 dakikada bir lizatları vorteksleyin.
NOT: POI birden fazla alt birimden oluşuyorsa veya ayrışmaya duyarlıysa, lizatları vortekse etmeyin. - Lised hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj edin. Bir pipet kullanarak süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Bu, toplam protein lizatını içerir.
- Lisattan 10 μL'yi ayırın ve bikinkoninik kolorimetrik tahlil (BCA) analizi17 için lizis tamponunun 90 μL'sine seyreltin. Kalan toplam protein lizatını -80 ° C'de saklayın.
- BCA analizini kullanarak lizat toplam protein konsantrasyonunu belirleyin (bkz.
NOT: Toplam protein lizatları deney gününde hazırlanabilir ve taze olarak kullanılabilir veya 12 haftaya kadar -80 ° C'de tek kullanımlık alikotlar olarak saklanabilir. Donmayın/çözmeyin.
3. Dizinin biyotinile antikor ile işlevselleştirilmesi
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- T50 Tampon, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 50 mM NaCl'lik bir çözeltidir. Çözüm, RT'de 1 ay boyunca kararlıdır.
- T50 tamponunu 0.1 mg / mL BSA ile destekleyerek T50-BSA. Hazırlanan çözeltiyi buz üzerinde tutun.
- 1x PBS'de 10 mg / mL sodyum borohidrit (NaBH4). Bunu kullanmadan hemen önce hazırlayın.
- T50 tamponunda 0.2 mg/mL NeutrAvidin (bakınız Malzeme Tablosu).
DİKKAT: NaBH4 bir indirgeyici maddedir ve yanıcıdır. Kullandıktan sonra kabı daima azot gazı ile temizleyin ve bir kurutucuda saklayın.
- Diziyi, biyotinile edilmiş antikor ile işlevselleştirin.
- PEG-biyotin işlevselleştirilmiş dizilerini dondurucudan çıkarın ve açmadan önce konik tüpü RT'ye dengeleyin. Kapak kapağını, dizi yukarı doğru yönlendirilmiş olarak 100 mm doku kültürü (TC100) plakası üzerine sızdırmazlık filmi kaplı bir tabağa yerleştirin.
NOT: Baş üstü aydınlatmayı en aza indirin. Tüm çözümler, hidrofobik dizi tarafından tanımlanan kareler üzerinde "boncuklanmalı". Her kareyi (tipik olarak 10-15 μL) tamamen kaplamak için uygun bir çözelti hacmi ekleyin ve sıvının tanımlanan alandan taşmasına izin vermeyin. Sıvıları hızlı bir şekilde çıkarmak için, atıkları yakalamak üzere vakum şişesine bağlı bir şirket içi vakum hattı kullanın. NaBH4'ün kimyasal duman davlumbazında tüpü açık bırakarak bertaraf etmeden önce 1 saat boyunca gazdan arındırmasına izin verin. NaBH4 tedavisi, arka plan otofloresansını azaltmak ve böylece yanlış pozitif tek molekül tespitlerini azaltmak için gereklidir. - Dizinin her karesini RT'de 4 dakika boyunca 1x PBS'de 10 mg / mL NaBH4 ile tedavi edin.
- T50'de 0.2 mg / mL NeutrAvidin ile her kareyi 5 dakika boyunca inkübe edin. T50-BSA ile üç kez yıkayın.
NOT: NeutrAvidin, PEG-biyotine bağlanır ve biyotinile antikorlar için bir bağlanma yeri sağlar12,13,15. - T50-BSA'da 2 μg/mL biyotinile POI-spesifik antikor ile her kareyi 10 dakika boyunca inkübe edin; T50-BSA ile üç kez yıkayın.
NOT: Mevcut protokol, EGFR-GFP'yi yakalamak için biyotinile anti-EGFR IgG (bakınız Malzeme Tablosu) kullanmaktadır.
- PEG-biyotin işlevselleştirilmiş dizilerini dondurucudan çıkarın ve açmadan önce konik tüpü RT'ye dengeleyin. Kapak kapağını, dizi yukarı doğru yönlendirilmiş olarak 100 mm doku kültürü (TC100) plakası üzerine sızdırmazlık filmi kaplı bir tabağa yerleştirin.
4. Tüm hücre lizatlarından POI'nin SiMPull'u
NOT: İşlevselleştirilmiş SiMPull dizilerinden oluşan TC100 çanağını SiMPull preparatının geri kalanı için buz üzerine yerleştirin. Bu adım, bir POI'nin toplam protein lizatından aşağı çekilmesidir. Lisat çözüldükten sonra tekrar kullanılmamalıdır.
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) veya% 0.1 glutaraldehit (GA) hazırlayın.
DİKKAT: PFA ve GA, toksik kimyasal fiksatörler ve potansiyel kanserojenlerdir. KKD giyin. Kimyasalları yerel yönetmeliklere ve yönergelere uygun olarak tehlikeli atık olarak atın. - 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 hazırlayın.
- 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) veya% 0.1 glutaraldehit (GA) hazırlayın.
- Lisatı yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün ve karıştırın. Buz üzerinde tutun.
- Lisattan 1 μL'yi 100 μL buz gibi soğuk T50-BSA/PPI olarak seyreltin.
NOT: Gerekirse, diziye bir dizi seyreltme uygulayarak toplam protein lizatının uygun seyreltme faktörünü belirleyin. Dizi alanı başına SiMPull reseptörlerinin optimal yoğunluğu 0.04-0.08 / μm2'dir. Lisat seyreltmeleri adım 6'da (Veri analizi) değerlendirilebilir. - Dizideki lizatı 10 dakika boyunca inkübe edin; daha sonra buz gibi soğuk T50-BSA/PPI ile dört kez yıkayın.
- AF647-konjuge anti-fosfotirozin antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) buz gibi soğuk T50-BSA/PPI'da seyreltin ve dizi üzerinde 1 saat inkübe edin.
NOT: Mevcut protokolde, EGFR-GFP'nin fosforile popülasyonunu tanımlamak için bir pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG kullanılmıştır. Doğrudan etiketlenmiş antikorların kullanılması, ikincil antikorlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır, etiketleme seçeneklerini arttırır ve sonuçların tutarlılığını iyileştirir. Floresan etiketli antikorlar ticari kaynaklardan elde edilebilir. Ticari olarak mevcut değilse, antikorlar standart biyokonjugasyon teknikleri kullanılarak özel olarak etiketlenebilir ve ticari biyokonjugasyon kitleri mevcuttur. Floresan olarak etiketlenmiş antikorların her bir partisinin, bir doz eğrisini ölçmek ve doygunluk noktasını bulmak için SiMPull gerçekleştirilerek optimum etiketleme koşulları için test edilmesi gerekir. - Buz gibi soğuk T50-BSA ile toplam 6-8 dakika boyunca altı kez yıkayın.
- Buz gibi soğuk 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Antikor ayrışmasını önlemek için diziyi 10 dakika boyunca %4 PFA/%0,1 GA çözeltisi ile inkübe edin.
- Fiksatörleri etkisiz hale getirmek için her biri 5 dakika boyunca 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS ile iki kez yıkayın.
NOT: Birden fazla antikor kullanan deneyler için (örneğin, birden fazla fosfotirozin bölgesi tespit etmek), 4.5-4.9 arasındaki adımları tekrarlayın. İki antikor arasındaki sterik engelin belirlenmesi hakkında bilgi için adım 6.2.9'a bakınız.
5. Görüntü alma
NOT: Tek moleküllü görüntü yakalama, 150x TIRF hedefi ve emCCD kameranın belirli bir çeyreğindeki her spektral kanalı yakalayan bir görüntü ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Kalibrasyon görüntüleri ilk olarak, 3 ± 1 μm (toplam boyut ~ 60 μm ± 60 μm) delik içi mesafede 200 × 50 nm delik içeren nanodesenli kanal hizalama ızgarası (nanogrid) ile kanal kaydı ve kamera kazancı kalibrasyonuna izin vermek için elde edilir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek kanal kaydı gerçekleştirin.
NOT: Yayıcıların kolokalizasyonunu doğru bir şekilde hesaplamak için doğru kanal kaydı gereklidir. Bu adım çok önemlidir.- Yağ hedefini temizleyin ve hedefe bir damla yağ bırakın. Nanoızgarayı görüntüleme için sahneye yerleştirin. İletilen beyaz ışığı kullanarak, ızgara desenine odaklanın.
NOT: Nanogrid ile görüntüler, nanogridden geçen ve tüm spektral kanallarda tespit edilen iletilen ışık kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, her kanalda tespit edilen floresan yayan multifloresan boncuklar kullanılabilir. Görüntü yakalamanın her mikroskop kurulumuna göre optimize edilmesi gerekecektir. - Izgaranın 20 görüntüsünden oluşan bir dizi elde edin. Piksellerin doygun olmadığından emin olun. Görüntü serisini "Güvenilir" olarak kaydedin.
- Havadar bir desen18 oluşturmak için nanoızgarayı bulanıklaştırın. Kazanç kalibrasyonları için 20 görüntüden oluşan bir dizi elde edin. Görüntüyü "Kazanç" olarak kaydedin.
- Tüm ışığın kameraya gitmesini engelleyerek kamera ofseti için 20 görüntüden oluşan bir dizi elde edin. Görüntüyü "Arka Plan" olarak kaydedin.
- Yağ hedefini temizleyin ve hedefe bir damla yağ bırakın. Nanoızgarayı görüntüleme için sahneye yerleştirin. İletilen beyaz ışığı kullanarak, ızgara desenine odaklanın.
- SiMPull görüntülerini edinin.
NOT: Coverslip dizisini görüntülemeden önce, Tris çözümünü T50-BSA ile değiştirin ve diziyi RT ile dengeleyin.- Petrol hedefini temizleyin ve hedefe ek yağ koyun. Kapak kaydırma dizisini mikroskop aşamasında sabitleyin.
- Her floroforun uyarma gücünü, TIRF açısını ve kamera entegrasyon süresini optimize edin. Amaç, numunenin fotobeyazlatmasını en aza indirirken en yüksek sinyal-gürültü elde etmektir. Gelecekteki ölçümlerde tutarlılık için lazer gücünü kaydedin.
NOT: Bu çalışmada uzak kırmızı kanal için 300 ms maruz kalma süresi ve yeşil kanal için 1 s kullanılmıştır. 642 nm lazer yaklaşık 500 μW lazer gücünde kullanılırken, 488 nm lazer, tüp lensten önce ölçülen 860 μW'da kullanıldı. - Her örnek için görüntü alın. Önce uzak kırmızı kanalı, ardından fotobeyazlatmayı azaltmak için her bir düşük dalga boylu floroforu görüntüleyin. Her numune için kullanılan düşük hacim nedeniyle, tampon seviyesini her 30-45 dakikada bir kontrol edin ve gerektiğinde doldurun.
6. Veri analizi
- Demo kodlarını indirin.
NOT: Sağlanan demo kodu ve örnek veri kümeleri, tam veri analizi iş akışını gösterir (Ek Kodlama Dosyaları 1-4). SiMPullMain.m'de listelenen sistem gereksinimleri Ek Kodlama Dosyası 1'de bulunur.-
Sıkıştırmayı açın ve kişisel bir Belgeler/MATLAB (MacOS/Linux) veya Belgeler\MATLAB (Windows) dizinine kaydedin .
NOT: Bu, dört yeni klasör oluşturur: SiMPull_class, smite, Örnek Veri, Örnek Çözümleme Çıktıları. - ReadMe_Setup.txt klasöründe bulunan "SiMPull_class" dosyasını açın.
- MATLAB ve MATLAB Araç Kutularını Yükleme: Eğri Sığdırma Araç Kutusu, Paralel Bilgi İşlem Araç Kutusu ve İstatistik ve Makine Öğrenimi araç kutusu.
- DipImage19'u indirme talimatlarına göre yükleyin.
- ReadMe_setup.txt açıklandığı gibi "smite" tek moleküllü analiz paketini kurun.
NOT: "smite" GitHub deposunda mevcuttur (bkz. - SiMPull_class klasörde bulunan SiMPullMain.m'yi dosyayı MATLAB penceresine sürükleyerek açın.
- Dizini ...\MATLAB\Sample Data\ olarak değiştirin, Klasöre gözat simgesine tıklayıp klasörü seçin.
-
Sıkıştırmayı açın ve kişisel bir Belgeler/MATLAB (MacOS/Linux) veya Belgeler\MATLAB (Windows) dizinine kaydedin .
- Veri işleme adımlarına genel bakış
- SiMPullMain.m'yi çalıştırın - her bölüm için talimatları izleyin. İmleci o bölüme yerleştirip Bölümü Çalıştır simgesini tıklatarak her bölümü ayrı ayrı yürütün.
NOT: Veri çözümlemesi için genel adımlar bu bölümde açıklanmıştır. Ayrıntılı talimatlar ekteki SiMPullMain.m kodunda bulunur. - Spektral kanalları ve görüntü boyutunu tanımlamak üzere yolu ayarlamak için "Başlatma" bölümünü çalıştırın.
- Kazanç ve Arka Plan veri kümelerini kullanarak kamera kazancını fotonlara dönüştürmek için "Kamera Kazancı ve Ofseti Bul" bölümünü çalıştırın.
- Görüntü kaydı için kullanılan yerel ağırlıklı ortalama dönüşümü hesaplamak için "Kanal Kaydı" bölümünü çalıştırın.
- Verileri biçimlendirin ve düzenleyin. "Sıralı Kanalları Dörtlü Görüntüde Birleştir" bölümünü çalıştırın. "Kötü Çerçeveleri Kaldır" ı çalıştırın.
- "Tek Molekülleri Sığdırın ve Çakışan Molekülleri Bul" bölümünü çalıştırın.
NOT: Bu bölüm, her kanaldaki tek molekülleri lokalize etmek ve spektral kanallar arasındaki kolokalizasyon olaylarını belirlemek için birden fazla işlevi yürütür. - Gerçek GFP uyumu başına minimum foton sayısını belirlemek için, "Minimum Foton Eşiğini En İyi Duruma Getir" i çalıştırın. Bu yinelemeli bir işlemdir.
- İlk olarak, smf'yi ayarlayın. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] öğesine dokunun ve bölümü çalıştırın. İstendiğinde "Boş Veri" dosyalarını seçin. "CHO-EGFR-GFP" dosyalarıyla tekrarlayın.
- İki histogramı karşılaştırarak uygun bir minimum eşik değeri seçin. smf'yi ayarlayın. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] öğesine dokunun ve bölümü yeniden çalıştırın.
- Arka plan yerelleştirmelerini düzeltmek ve nihai değerleri hesaplamak için "GFP'nin FR Sinyali için Pozitif Uyum Yüzdesini Hesapla" bölümünü çalıştırın.
- Deneysel ihtiyaca göre Seçenek 1'i (adım 6.2.10) veya Seçenek 2'yi (adım 6.2.11) gerçekleştirin.
- Seçenek 1: Referans15'te açıklandığı gibi, ligand bağlanması için plazma zarında bulunan reseptör sayısı için doğrudur.
- İlk olarak, yüzey reseptörlerini doygunluk düzeylerinde floresan NHS Ester boyası ile etiketleyin (NHS-AF647, bakınız Malzeme Tablosu). Ardından, AF647 ile birlikte lokalize olan GFP lokalizasyonunun yüzdesini belirlemek için bir SiMPull deneyi gerçekleştirin.
NOT: Bu, NHS etiketlemesi için mevcut reseptörlerin fraksiyonunun ve yüzeydeki reseptörlerin oranının (SR) bir tahminini sağlar. - SR düzeltmesini son hesaplamada uygulayın: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, NGFP düzeltilmiş GFP lokalizasyon sayısı, NBG arka plan yerelleştirme numarası ve NLOC toplam yerelleştirmelerdir.
NOT: Bu örnekte, Pervanadat membran geçirgen16 olduğu için bu düzeltme uygulanmamıştır ve bu nedenle fosfataz inhibisyonunun etkisi yüzey reseptörleri ile sınırlı değildir.
- İlk olarak, yüzey reseptörlerini doygunluk düzeylerinde floresan NHS Ester boyası ile etiketleyin (NHS-AF647, bakınız Malzeme Tablosu). Ardından, AF647 ile birlikte lokalize olan GFP lokalizasyonunun yüzdesini belirlemek için bir SiMPull deneyi gerçekleştirin.
- Seçenek 2: Çok bölgeli fosforilasyon ölçümleri için, iki antikor kullanıldığında sterik engel potansiyelini göz önünde bulundurun.
NOT: Sterik engel, Antikor 2 (P12) varlığında, tek başına Antikor 1'e (P1) kıyasla, Antikor 1 için fosforile reseptörlerin gözlenen yüzdesinde bir azalmaya neden olabilir.- P1 ve P12'yi belirlemek ve daha önce yayınlanmış Referans15'i izleyerek sterik engel için düzeltme faktörünü hesaplamak için SiMPull'u kullanın.
- SiMPullMain.m'yi çalıştırın - her bölüm için talimatları izleyin. İmleci o bölüme yerleştirip Bölümü Çalıştır simgesini tıklatarak her bölümü ayrı ayrı yürütün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SiMPull işlemini gösteren bir karikatür Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kapak fişleri, toplam protein lizatlarından EGFR-GFP'yi yakalamak için biyotinile anti-EGFR antikorları için bir çapa olarak NeutrAvidin kullanılarak işlevselleştirilir. Bağlı olmayan proteini yıkadıktan sonra, fosforile reseptörler bir anti-fosfotirozin (anti-PY) antikoru15 ile etiketlenir. Şekil 1B , aynı kapak fişi üzerinde birden fazla numunenin hazırlanabileceği ve görüntülenebileceği hidrofobik dizinin bir görüntüsünü göstermektedir. Bu numune tutucunun bir avantajı, ~ 10 μL'lik minimum numune hacimlerinin gerekli olmasıdır. Kapak kayması, doğrudan mikroskop aşamasına yerleştirilerek görüntülenebilir. Bununla birlikte, bir kapak fişi tutucu kullanarak kapak fişini stabilize etmek yararlıdır. Şekil 1B'de gösterilen kapak kapağı tutucu bir 3B yazıcı kullanılarak oluşturulmuştur ve plan Ek Kodlama Dosyası 5'te verilmiştir. Hidrofobik mürekkebin otofloresansı, numunenin odak düzlemini bulmak için yararlı bir kılavuzdur (Şekil 1C). Çok kanallı ham görüntü örneği Şekil 1B'de gösterilmiştir. Ham yeşil ve uzak kırmızı kanalların bir bindirmesi Şekil 1E'de gösterilmiştir.
Şekil 2, analiz iş akışını özetler ve temsili veriler sağlar. Veri toplama ilk olarak, bireysel spektral kanal verilerini bindirmek için kullanılan kanal kaydı için referansların alınmasıyla başlar (Şekil 2A). Parlak alan görüntüleri, beyaz ışığı geçiren ve görüntü ayırıcının her spektral kanalında algılanan bir nanogrid deseni kullanılarak alınır (gösterilmez). Yeşil kanal referans kanalı olarak işlev görür ve uzak kırmızı kanal kaydırılmış kanaldır. Yerel ağırlıklı ortalama dönüşüm, MATLAB'daki fitgeotrans20 işlevi kullanılarak hesaplanır ve uzak kırmızı koordinatları yeşil kanalın koordinat çerçevesine kaydırmak için kullanılır. Bu dönüşüm, her kontrol noktasında ikinci dereceden bir polinom modeli kullanır. SiMPull dizisinin çok kanallı verileri daha sonra alınır. Bu iş akışı, belirli bir örnek kare için bir başlangıç YG'sinin seçildiği ve bu alanın etrafındaki üç bölgenin görüntülendiği, böylece her veri kümesinin üç bağımsız YG'den tam dörtlü görünümlü görüntüyü içerdiği yarı otomatik bir alımdan oluşuyordu (Şekil 1D). Her spektral kanalda, yayıcı aday konumları, görüntülere Gauss filtresinin bir farkı uygulanarak ve yerel maksimumu tanımlayarak bulunur. Alt bölgeler (kutular, Şekil 2B) yerel maksimumun etrafına çizilir ve her bir alt bölgenin yalnızca bir yayıcı içerdiği varsayılarla yayıcı foton sayıları tahmin edilir. Foton sayıları minimum değerin üzerinde olan yayıcı adaylarını tutan alt bölgeler, uyum için korunur. Bir Gauss nokta yayılma fonksiyonu (PSF), her bir yayıcı adayını, kabaca her bir yayıcının etrafında merkezlenmiş küçük alt bölgelere sığdırır. Elde edilen lokalizasyonlar, foton sayısına, arka planlarına, uygun koordinatların Cramér-Rao alt sınırına, PSF varyansına (yani PSF genişliğine) ve PSF modelinin uyumunun iyiliğini tanımlayan bir p-değerine göre eşiklenir. Her spektral kanal için bir Gauss görüntüsü oluşturulur, her iyi uyum için koordinatlara eşit yoğunlukta Gauss lekeleri yerleştirilir (Şekil 2C). Kolokalizasyon, referans örnekleminden hesaplanan dönüşüm kullanılarak her spektral kanaldan Gauss görüntülerinin üst üste bindirilmesiyle görselleştirilir (Şekil 2D). Hücre lizatı mevcut olduğunda anti-fosfotirozin antikorlarının yüzeye spesifik olmayan bir şekilde bağlanması nedeniyle, tanımlama için reseptörü floresan olarak etiketlemek önemlidir. EGFR-GFP (yeşil kanal), reseptör konumlarının bir maskesini oluşturmak için kullanılır ve bu maske içindeki yalnızca AF647-anti-PY sinyali (uzak kırmızı kanal) sayılır (Şekil 2D). 1 piksel (106,7 nm piksel boyutu) içindeki çiftlerin birlikte lokalize edildiği ve referans kanal koordinatlarını içeren bir listeye kaydedildiği kabul edilir. GFP ile kolokalize AF647 yüzdesi, fosforile reseptörlerin fraksiyonunu belirlemek için hesaplanır (Şekil 2E).
İyi veri kalitesi sağlamak için birkaç kritik adım vardır. Böyle bir çaba, yeşil kanaldaki otofloresansı söndürmek için protokolde açıklandığı gibi kapak kayma dizisini NaBH4 ile inkübe etmektir. Bu otofloresan, cam üzerindeki olası safsızlıklar nedeniyle, tek veya konjuge π bağları içeren spesifik olmayan sinyali ifade eder21. Bu tür safsızlıklar potansiyel olarak işlevselleştirme işleminde kullanılan aminosilan ve PEG reaktiflerinden veya havadan gelen tozdan kaynaklanır ve yeşil spektral kanalda floresan olma eğilimindedir. Camı azot altında saklama çabalarına rağmen, bu moleküller depolamada meydana gelen oksidasyon yoluyla da üretilebilir. NaBH4 ayrıca, silan kaplamalı olanlar da dahil olmak üzere slaytlar ve mikrodiziler üzerindeki safsızlıklardan kaynaklanan floresanları azaltmak için de kullanılmıştır16. Şekil 3A, piranha kazınmış cam NaBH4 ile muamele edildiğinde meydana gelen arka plan algılamalarının sayısındaki azalmayı göstermektedir. NaBH4 arka plan floresansını önemli ölçüde azaltırken, bazı yayıcılar hala yeşil kanalda tespit edilir. Lizat içermeyen örneklerden arka plan görüntüleri elde ederek (Şekil 3D) ve GFP içeren örneklerden ortalama arka plan lokalizasyonu sayısını çıkararak bunu düzeltebilirsiniz. Kirliliklerden kaynaklanan floresan uzak kırmızı kanalda tespit edilmedi. Reseptör yoğunluğu çok yüksekse, tek bir kırınım sınırlı nokta içinde birden fazla GFP yayıcı bulunabilir (veriler gösterilmemiştir). Nokta başına GFP sayısını tanımlamak için kademeli fotobeyazlatma kullanarak, 0.04-0.08 protein / μm2 arasındaki bir reseptör yoğunluğunun,nokta 12 başına birden fazla yayıcı bulma potansiyelini ortadan kaldırmak için tek yayıcılar arasında yeterli boşluk sağladığını bulduk. Reseptör yoğunluğu, cam yüzeye bağlı IP antikor miktarını veya eklenen lizat miktarını değiştirerek optimize edilebilir. POI'yi hedef alan antikorun doygunluk seviyelerinde kullanıldığından emin olmak çok önemlidir. Uygun etiketleme koşullarını belirlemek için fosforile numuneler üzerinde bir antikor konsantrasyon eğrisi elde edilmesi önerilir (Şekil 3B). Ek olarak, bir antikorun fosfo-özgüllüğünün, istirahat örnekleri ve / veya proteine özgü kinaz inhibitörleri ile tedavi ile doğrulanması gerekir (Şekil 3B). Antikorlar, görüntüleme süresi penceresinde reseptörden ayrışacaktır. Numunenin PFA ve GA'nın bir kombinasyonu ile işlenmesi sinyal kaybını önledi (Şekil 3C).
Son olarak, tek moleküllü bağlantı parametrelerini optimize etmek önemlidir. Potansiyel yayıcı adaylarını tanımlayan ilk "kutu bulma" adımının (Şekil 2B), birçok adayın Gauss Fitting'inden geçmesine izin vermek için cömert olması gerekir. Bu nedenle, kutu bulma için minimum foton eşiği, tüm gerçek yayıcıları ve bazı arka plan noktalarını yakalamak için nispeten düşük olabilir. Kutu boyutunu ayarlamamak ve ödeneği çok küçük üst üste bindirmemek de önemlidir. Kutu boyutunu 5-7 piksel içinde tutmak ve iki piksel üst üste binmesine izin vermek, önerilen yoğunluktaki yayıcılar için idealdir. Kutu bulduktan sonra, montaj adımındaki minimum foton eşiğinin optimize edilmesi gerekir. Minimum foton parametresi, hangi Gauss donanımlı yayıcıların gerçek bir uyum olarak geçtiğini belirlemeye katkıda bulunur. Gerçek GFP uyumları için uygun minimum foton eşiğini belirlemek için, kod hem arka plan (hücre lizatı yok) hem de GFP içeren (artı hücre lizat) örneklerdeki fotonları / lokalizasyonu incelemek için bir histogram çizim işlevi içerir (Şekil 3D). Bu adım önemlidir, çünkü NaBH4 safsızlıklardan floresan miktarını azaltırken, tüm arka plan lokalizasyonlarını kaldırmaz. Şekil 3D, safsızlıklardan kaynaklanan algılama sayısını azaltmak için minimum foton eşiği ayarlama ihtiyacını göstermektedir. Bu eşiği belirlemek için, hücre lizatına maruz kalmayan bir numunenin görüntülenmesiyle arka plan yayıcı yoğunluklarının histogramı hesaplanır (Şekil 3D, sol üstte). Arka plan yayıcılarının çoğunluğunun 475 fotondan daha az değerlere sahip olduğu bulunmuştur. Buna karşılık, gerçek GFP yayıcıları içeren örneklem, 475'in üzerindeki dağılımın önemli bir bölümünü göstermiştir (Şekil 3D, sağ üstte). Eşik, lizat numunesinden sinyal kaybı miktarını en aza indirirken mümkün olduğunca çok sayıda arka plan sayımını kaldırmak için inceleme ile seçilir (Şekil 3D, alt satır). Bu eşikte kalan arka plan sayısı yoğunluğu, nicel analizde hesaplanır.
Şekil 1: Örnek hazırlamaya genel bakış. (A) SiMPull yaklaşımını gösteren karikatür. Coverslip'ler, POI'yi tüm hücre lizatlarından yakalamak için POI'yi tanıyan bir antikor ile işlevselleştirilir. Cam ilk önce PEG ve biotin-PEG ile kaplanır. NeutrAvidin daha sonra biyotin-PEG'e bağlanır ve biyotinile anti-POI antikoru için bir çapa görevi görür. Fosforile proteinler daha sonra floresan olarak etiketlenmiş bir anti-PY antikoru ile tespit edilir. (B) Kapak kapağı tutucusunun (kırmızı) kapak kayması dizisi yerinde ve mikroskop sahnesine monte edilmiş fotoğrafı. Çok örnekli diziler, tek bir cam kapak kapağı üzerinde 20 adede kadar ayrı örnek karesi oluşturmak için hidrofobik mürekkep kullanılarak oluşturulur. Kapak kapağı 60 mm x 24 mm'dir. (C) Hidrofobik mürekkep otofloresansının (macenta) ve floresan boncukların (yeşil) örnek görüntüleri. Hidrofobik mürekkebin otofloresansı, kapak kayma yüzeyindeki odak düzlemini bulmak için yararlı bir kılavuzdur. (D) Kamera yongasında Dört görünümlü görüntü ayırıcı ile ayrılmış spektral kanallara sahip ham veri görüntüsü örneği. Dört görünümlü filtre seti aşağıdaki emisyon filtrelerini içerir: mavi (445/45 nm), yeşil (525/45 nm), kırmızı (600/37 nm), uzak kırmızı (685/40 nm). (E) Yeşil ve uzak kırmızı kanalların ham kaplaması. Beyaz kutu, Şekil 2B-D'de daha ayrıntılı olarak incelenen bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu (C-E) = 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Veri analizi iş akışı . (A) Kanal kaydı ilk olarak nanogridden elde edilen görüntüler üzerinde gerçekleştirilir. İlgilenilen iki spektral kanalı kırptıktan sonra (burada, yeşil ve uzak kırmızı), her kanal için referans görüntüleri üst üste bindirilir (solda). Soldaki görüntüdeki (Giriş) kutunun büyütülmesi, görüntülerin henüz tam olarak kaydedilmediğini gösterir. Her kanaldaki yayıcılar bir Gauss modeline uyar ve yerelleştirilmiştir (Kayıt). Yayıcıların lokalizasyonu, uzak kırmızı kanal için daireler ve yeşil kanal için kesişmeler olarak gösterilir. Son adım, uzak kırmızı kanal yerelleştirme koordinatlarını yeşil kanal referans çerçevesine (Hizalanmış) kaydırmak için yerel ağırlıklı ortalama bir dönüşüm uygulamaktır. Hesaplanan yerel ağırlıklı ortalama dönüşüm daha sonra sonraki SiMPull verilerini kaydetmek için kullanılır. (B) Yeşil/EGFR-GFP kanalının ve uzak kırmızı/AF647-anti-PY kanalının temsili görüntüleri. Arka plan foton sayısının üzerindeki tek yayıcılar tanımlanır ve kutularla işaretlenir. (C) Seçilen her kutudaki emisyon profili bir Gauss modeline uygundur ve tek bir florofor PSF modeline uyan yayıcılar tutulur. (D) EGFR-GWP'nin (yeşil) yerini belirlemek için GFP yayıcılardan bir maske oluşturulur. EGFR-GFP ve AF647-anti-PY'nin kolokalizasyonu, fosforile reseptörleri (beyaz) tanımlar. (E) Fosforile reseptörlerin fraksiyonu, kolokalize EGFR-GFP ve AF647-anti-PY uyumlarından hesaplanır. Çubuk grafik, PV + EGF tedavisini, çoklu ölçümler için ortalaması alınan dinlenme hücreleriyle karşılaştırır. Hata çubukları, binom dağılımı varsayılarak hesaplanan standart hatayı temsil eder. Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Veri kalitesini sağlamak için kritik adımlar. (A) Soldan sağa, ilk üç panel, ilgili koşullar altında cam üzerindeki otofloresanın temsili görüntüleridir: piranha aşındırmadan sonra, PEG ile ve PEG artı NaBH4 tedavisi (+ ile belirtilir). Ek olarak, NaBH4 işleminden sonra, minimal spesifik olmayan PY99-AF647 bağlaması ile gösterildiği gibi yüzey işlevselliği korunurken, EGFR-GFP'nin lizattan sağlam bağlanması korunur. (B) Optimal antikor etiketlemesini sağlamak için kullanılan her bir antikor grubu için bir doygunluk eğrisi elde edilmelidir. Bu şekil, EGFR'yi bölgeye özgü fosfotirozin antikoru, anti-EGFR-pY1173 ile etiketlemek için konsantrasyon eğrisini göstermektedir. Tedavi edilmeyen hücrelerde minimal fosforilasyon tespit edilir (Dinlendirme, gri elmas). Spesifik olmayan bağlanma için bir kontrol olarak, hücreler, EGFR fosforilasyonunun beklenen önlenmesini gösteren 100 nM EGF (macenta üçgen) eklenmeden önce EGFR kinaz inhibitörü Lapatinib ile de tedavi edildi. Hata çubukları, binom dağılımı varsayılarak standart hatayı temsil eder. (C) Numunenin PFA ve GA'nın bir kombinasyonu ile fiksasyonu, zamanla antikor ayrışmasını önler. Hata çubukları, binom dağılımı varsayılarak standart hatayı temsil eder. (D) Gauss uyumu için uygun eşik seçilerek yanlış pozitifler hariç tutulur. Arka plan (lizat yok) ve gerçek veri (artı hücre lizatı) arasında düşük bir eşikte (Eşik = 0; üst) uyum yoğunluklarının histogramını karşılaştırmak, yeşil kanaldaki otofloresan noktalardan uyumları gidermek için uygun değerin (Eşik = 475; alt) seçilmesine olanak tanır. Dikey macenta çizgisi 475 foton eşiğini gösterir. Histogramlar, her numune türü için aynı sayıda yatırım getirisinden hesaplanır (n = 3). Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: SiMPull analizini çalıştırmak için komut dosyaları ve yardımcı programlar içeren zip dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 2: smite tek moleküllü analiz paketini içeren zip dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 3: örnek verileri içeren zip dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 4: temsili örnek veri analizi çıktılarını içeren zip dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 5: 3D baskı için kapak fişi tutucu planı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, tek protein seviyesinde reseptör fosforilasyonunun kantitatif ölçümlerini sağlamak için optimize edilmiştir. SiMPull protokolünde, NaBH4 tedavisi ile otofloresanın azaltılması ve antikor ayrışmasını önlemek için numunenin son sabitlenmesi de dahil olmak üzere fosfo-tirozin tespiti için ölçümün güvenilirliğini artıran birkaç basit ama önemli değişiklik geliştirilmiştir. Anti-PY antikoru ile kolokalizasyonun hesaplanması için reseptör konumlarını tanımlamak için yeşil kanal maskesinin kullanılması, antikorun hücre lizatına spesifik olmayan bağlanmasından potansiyel artefaktları çıkararak ölçüm doğruluğunu da artırır. İki renkli görüntüleme, fosforile edilen reseptörlerin fraksiyonunu tespit etmek için kullanıldı. Bu senaryoda, reseptör genetik olarak GFP ile etiketlendi ve antikor doğrudan çok kırmızı bir boya ile etiketlendi. SiMPull yaklaşımı, hücre içi proteinler de dahil olmak üzere spesifik antikorların mevcut olduğu diğer protein hedefleri için geçerlidir. Ek olarak, denatüre koşulları gerekli olmadığından, çok alt birimli reseptörler / kompleksler de yakalanabilir. Bununla birlikte, ilgili PTM'ler protein14'ün yapılandırılmış bölgelerinde bulunuyorsa, denatürasyon dahil edilebilir. Nihayetinde, SiMPull, çok bölgeli fosforilasyon modellerini ölçmek için bireysel reseptörler üzerinde farklı fosfo-tirozinlerin eşzamanlı etiketlenmesini içerecek şekilde kolayca genişletilebilir15. Tam uzunlukta, bozulmamış reseptörlerin bu şekilde sorgulanması, batı lekelenmesi ve fosfo-kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer standart yöntemlerle elde edilemez.
SiMPull'un avantajlarının yanı sıra, bazı sınırlamaların da dikkate alınması gerekir. Herhangi bir antikor bazlı teknikte olduğu gibi, kullanılan antikorların afinitesi ve özgüllüğü, ölçümün başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, antikor etiketleme koşullarını optimize etmek ve ideal olarak doğrudan etiketlenmiş birincil antikorları kullanarak ikincil antikorlardan kaçınmak önemlidir. Ayrıca, yüzeye bağlı antikorlar, plazma zarına lokalize olmuş proteinleri ve sitozolik bölmeler içinde çökeltecektir. Bu, fosforilasyonu hafife alabilir, çünkü sitosol-lokalize proteinlere eksojen olarak eklenen ligand için erişilemez. Reseptör yüzey seviyelerini düzeltmek için ekstra adımlar atılmalıdır (adım 6.2.10). Anti-fosfotirozin antikorları, lizat mevcut olduğunda spesifik olmayan bir bağlanma sergiledi. Bu artefakttan kaçınmak için, EGFR, reseptörlerin yerini tanımlamak için genetik olarak GFP ile etiketlendi, bu da anti-PY sinyalini reseptörden dışlamamızı sağladı. Endojen proteinler sorgulanacaksa, toplam protein antikoru ile karşı boyama, spesifik olmayan herhangi bir bağlanma için uygun düzeltme ile maske görüntüsünü sağlayabilir. Son olarak, SiMPull, protein düzeyinde heterojenlik hakkında bilgi sağlarken, bu protokolde üretilen lizat binlerce hücreden gelir ve hücreden hücreye değişkenlik kaybolur. Bununla birlikte, tek hücreli SiMPull'a doğru ilerlemeler, bir kapak kayması ve 10 μm boşluklu bir mikroskop tarafından oluşan bir akış odası kullanılarak yapılmıştır; bakteriler kapak kayması üzerine seyrek olarak kaplanırken, slayt istenen proteinleri yakalamak için antikor ile işlevselleştirildi. Bakterilerin lizisi üzerine, her hücreden gelen proteinler, antikor kaplı slayt22 üzerindeki sınırlı bir alanda yakalandı. Memeli hücrelerinin benzer tek hücreli SiMPull analizi ve protein fosforilasyonu gelecekte mümkün olabilir.
SiMPull protokolü, yüksek kaliteli veriler sağlamak için gereken birkaç kritik adımı içerir. Örneğin, protokol kapak kayması camının ayrıntılı bir şekilde hazırlanmasını içerir. Piranha aşındırma kapakları camı iyice temizler ve kapak kayma yüzeyini optimize etmek için gereken hidroksil gruplarını ve hidrofilikliği arttırır. Organik çözücülerle yapılan birkaç yıkamanın ardından, KOH işlemi, camı PEG ve biyotin-PEG bağlanması için amin gruplarıyla kaplayan aminosilizasyon 13,23 için ek hidroksil grupları sağlar. Bu adımların herhangi birinde yanlış temizlik veya işlevselleştirme, protein aşağı çekilmesine müdahale edecektir. PEG:biotin-PEG'in molar oranının kontrolü, lizat konsantrasyonu ile birlikte, SiMPull substratı üzerinde uygun protein IP yoğunluğunun elde edilmesinde anahtar faktörlerdir. Herhangi bir biyolojik tahlilde olduğu gibi, hücre lizat preparatları arasında değişkenlik vardır ve örnek replikasyonları arasında fosforilasyon yüzdeleri arasında küçük farklılıklar görülebilir. Bu nedenle, aynı numune içindeki farklı tirozin bölgelerinin fosforilasyon seviyelerini ölçmek önemlidir. Bu protokolde açıklanan örnek odacık, bir görüntüleme oturumunda birçok veri noktası toplamak için bir sistem sağlar ve birden fazla SiMPull deneyinin ortalamasının alınmasına izin verir.
Görüntü yakalama tarafında, doğru bir kanal kaplaması sağlamak için referans örneğini elde etmek önemlidir; aksi takdirde, kolokalizasyon doğru olmayacaktır. Sinyal-gürültüyü en üst düzeye çıkarmak ve aynı zamanda fotobeyazlatmayı en aza indirmek için lazer gücünü ve kamera ayarlarını optimize etmek de önemlidir. Son olarak, numune dizisi az miktarda numune ve reaktif gerektirirken, düşük hacimler görüntüleme seansı sırasında buharlaşmaya karşı hassastır. Numune dizisini periyodik olarak kontrol etmek (~ 30-45 dakika) ve numunelerin kurumasını önlemek için gerektiğinde tampon eklemek önemlidir.
Mevcut protokol, membran reseptörü fosforilasyon durumlarını ölçmek için SiMPull'un kullanımını göstermiştir. EGFR'ye odaklanırken, yaklaşım, uygun antikorlar mevcut olduğu sürece diğer hücre yüzey reseptörlerine ve hücre içi proteinlere ve protein komplekslerine uygulanabilir. SiMPull için bir başka potansiyel kullanım, fazla ayrılmış kondensatların içeriğini ve fosforilasyon durumunu sorgulamaktır. Ek olarak, SiMPull, ubikitinasyon gibi diğer PTM'leri ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, SiMPull, hücre biyologlarının PTM'leri bozulmamış proteinler üzerinde sorgulamaları ve PTM modellerini hücresel sonuçla ilişkilendirmeleri için benzersiz bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R35GM126934, R01AI153617 ve R01CA248166 to DSL tarafından desteklenmiştir. EMB, ASERT-IRACDA programı (NIH K12GM088021) ve UNM MARC programı (NIH 2T34GM008751-20) tarafından JAR aracılığıyla desteklenmiştir. NIH P30CA118100 tarafından desteklenen New Mexico Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi floresan mikroskobu ortak kaynağını kullanarak minnetle teşekkür ederiz. SiMPull'un orijinal gelişimi bu çalışmaya ilham veren Dr. Ankur Jain ve Taekijip Ha'ya teşekkür etmek istiyoruz.
ES-C mevcut adresi: İmmünodinamik Grubu, Bütünleştirici Kanser İmmünolojisi Laboratuvarı, Kanser Araştırmaları Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
References
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al.
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T.
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
