Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

Abstract

פוספורילציה היא שינוי פוסט-טרנסלציוני הכרחי המווסת את תפקוד החלבון ומכוון את תוצאות האיתות של התאים. השיטות הנוכחיות למדידת פוספורילציה של חלבונים אינן יכולות לשמר את ההטרוגניות בזרחון על פני חלבונים בודדים. הבדיקה של משיכה חד-מולקולה (SiMPull) פותחה כדי לחקור את ההרכב של קומפלקסים מקרומולקולריים באמצעות מיצוי חיסוני של חלבונים על מכסה זכוכית ולאחר מכן הדמיה של מולקולה אחת. הטכניקה הנוכחית היא התאמה של SiMPull המספקת כימות חזק של מצב הזרחון של קולטני ממברנה באורך מלא ברמת המולקולה הבודדת. הדמיה של אלפי קולטנים בודדים בדרך זו מאפשרת לכמת את דפוסי הזרחון של חלבונים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך SiMPull הממוטב, מהכנת דגימה ועד הדמיה. אופטימיזציה של הכנת זכוכית ופרוטוקולי קיבוע נוגדנים משפרת עוד יותר את איכות הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מספק קוד לניתוח נתונים של מולקולה בודדת המחשב את חלקם של הקולטנים הזרחניים בתוך דגימה. בעוד שעבודה זו מתמקדת בזרחון של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR), ניתן להכליל את הפרוטוקול לקולטני ממברנה אחרים ולמולקולות איתות ציטוזוליות.

Introduction

איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים 1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות לחקור זרחון חלבונים. ניתוח כתמים מערביים מצוין לתיאור מגמות של זרחון חלבונים, אך הוא כמותי למחצה8 ואינו מספק מידע על ההטרוגניות של המערכת מכיוון שאלפי עד מיליוני קולטנים ממוצעים יחד. בעוד שהכתמים המערביים מאפשרים לחקור דגימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו לטירוזינים ספציפיים, הם אינם יכולים לספק מידע על דפוסי זרחון מרובי אתרים בתוך אותו חלבון. פוספופרוטומיקה כמותית מדווחת על שפע פוספוטירוזין, אך ישנן מגבלות לאיתור זרחון מרובה אתרים, שכן שאריות העניין צריכות להיות ממוקמות בתוך אותו פפטיד (בדרך כלל 7-35 חומצות אמינו) שנוצר על ידי עיכול אנזימטי 9,10,11.

כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, בדיקת המשיכה של מולקולה אחת כלפי מטה (SiMPull) הותאמה לכימות מצבי הזרחון של קולטנים שלמים ברמת המולקולה הבודדת. SiMPull הוכח לראשונה ככלי רב עוצמה לחקירת קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי Jain et al.12,13. ב-SiMPull, קומפלקסים מקרומולקולריים עברו מיצוי חיסוני (IP) על כיסויי זכוכית פונקציונליים של נוגדנים ולאחר מכן נותחו באמצעות מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת עבור מספר תת-יחידה של חלבונים ו-CO-IP עם רכיבים מורכבים12. שינוי של Kim et al.14, המכונה SiMBlot, היה הראשון שהשתמש בווריאציה של SiMPull כדי לנתח פוספורילציה של חלבונים שעברו דנטורציה. פרוטוקול SiMBlot מסתמך על לכידת חלבוני פני השטח של התאים שעברו ביוטינילציה באמצעות כיסויים מצופים NeutrAvidin, אשר נבדקים לאחר מכן לזרחון עם תוויות נוגדנים ספציפיות לפוספו14. למרות ההתקדמות הזו, היה צורך בשיפורים כדי להפוך את הכימות של שינויים פוסט-טרנסלציוניים לחזק יותר וישים יותר למגוון רחב יותר של חלבונים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישת SiMPull אופטימלית ששימשה לכימות דפוסי זרחון של קולטן גורם גדילה אפידרמלי שלם (EGFR) בתגובה למגוון מצבי ליגנד ומוטציות אונקוגניות15. בעוד שעבודה זו מתמקדת ב- EGFR, ניתן ליישם גישה זו על כל קולטן ממברנה וחלבונים ציטוזוליים בעלי עניין (POI), שעבורם קיימים נוגדנים איכותיים. הפרוטוקול כולל שלבים להפחתת הפלואורסצנציה אוטומטית של דגימה, תכנון מערך דגימות הדורש נפח דגימה מינימלי עם הכנה סימולטנית של עד 20 דגימות, ואופטימיזציה של תווי תיוג נוגדנים ותנאי קיבוע. אלגוריתמים לניתוח נתונים פותחו לזיהוי וכימות של מולקולות בודדות של חלבונים זרחניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת כיסוי

הערה: עבור שלב זה, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), הכולל שכבה כפולה של כפפות ניטריל, משקפי בטיחות או מגן פנים, ומעיל מעבדה.

  1. בצעו תחריט פיראנה כדי להסיר פסולת אורגנית מהזכוכית.
    זהירות: תמיסת פיראנה היא חומר מחמצן חזק שהוא קורוזיבי ותגובתי מאוד כאשר הוא בא במגע עם חומרים אורגניים. התגובה עם פסולת אורגנית היא אקסותרמית ובעלת פוטנציאל נפיץ. לכן, ההליך חייב להתבצע במכסה אדים כימי עם אבנט הוריד. כלי זכוכית Pyrex נדרשים כדי להתמודד עם פתרון פיראנה.
    1. הכינו את סביבת העבודה בתוך מכסה אדים כימי. מסדרים כיסויים ללא חפיפה בתחתית זכוכית 4 ליטר, "התגובה", ומניחים את התגובה על לוחית חמה בחום עדין. אפשרו לכלי הזכוכית להתחמם למשך 10 דקות. הניחו זכוכית "פסולת" 1 ליטר עם 500 מ"ל של ddH2O פרוקסימלית לכוס התגובה.
    2. הוסיפו 49 מ"ל של 12 N חומצה גופרתית (H2SO4) באיטיות לכוס התגובה עם פיפטה סרולוגית מזכוכית. יש לשטוף את הפיפטה בכוס הפסולת לפני הסילוק.
    3. הוסיפו 21 מ"ל של 30% מי חמצן (H2O2) באופן טיפתי עם פיפטה סרולוגית מזכוכית לכוס התגובה. פזרו באיטיות את טיפות H2O2 באופן שווה על פני החלק התחתון של בקבוקון התגובה כדי למנוע מרווה מקומית של תגובת התחריט של הפיראנה. יש לשטוף את הפיפטה בכוס הפסולת לפני הסילוק.
      אזהרה: הוסיפו תמיד את H2O2 ל-H2SO4, ולעולם לא להיפך.
    4. פיראנה תחרוט את הכיסויים במשך 30 דקות. עצבני בעדינות את התוכן של התגובה כל 5 דקות.
    5. מרווים את תמיסת הפיראנה על ידי שפיכת תכולת הפסולת לתוך התגובה. מעבירים את הנוזל באיטיות במורד דופן התגובה כדי למזער את ההתזה. הסר את התגובה מהפלטה החמה.
    6. כאשר התגובה מרווה ומתקררת, שפכו את תמיסת הפיראנה בחזרה לכוס הפסולת לנטרול מבלי להסיר את הכיסויים החרוטים מכוסות התגובה.
    7. לנטרל את תמיסת הפיראנה עם תוספת הדרגתית של בסיס חלש. לדוגמה, השתמש במסה מופרזת של 20 גרם של תמיסת סודיום ביקרבונט (NaHCO3)/100 מ"ל פיראנה.
      אזהרה: אין לאחסן פתרונות פיראנה במיכלי פסולת אטומים. הפתרון חייב תמיד להיות מנוטרל לפני הסילוק. תגובת הנטרול מייצרת בועות נמרצות ועשויה להיות נפיצה אם אינה נשלטת על ידי תוספת הדרגתית של הבסיס החלש.
    8. מערבבים את התמיסה המנוטרלת עם מוט ערבוב זכוכית ונותנים לה להגיב במשך שעתיים. העלו את ה-pH ל->4 והשליכו את הפתרון.
    9. בין התוספות של בסיס חלש לתמיסת הפיראנה, מעבירים את הכיסויים החרוטים מכוס התגובה לתוך משפך בוכנר עם מוט ערבוב זכוכית ושוטפים במשך 5 דקות בהפעלת ddH2O.
      הערה: המשך מיד לשלב הבא או אחסן את כיסויי הפיראנה החרוטים למשך עד שבועיים ב- ddH2O בצנצנת זכוכית אטומה או בצלחת פטרי (עטיפה בסרט איטום, ראה טבלת חומרים).
  2. אמבט-סוניק את הכיסויים בממסים אורגניים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. מניחים את הכיסויים בצנצנת קופלין מזכוכית (ראו טבלת חומרים) ומכסים במתנול (CH3OH). אוטמים את המכסה לצנצנת עם סרט איטום ומרחצאות-סוניקט למשך 10 דקות. מזגו בזהירות את המתנול מתוך צנצנת קופלין לתוך בקבוק אחסון זכוכית.
    2. ממלאים את צנצנת קופלין באצטון (C3H6O), אוטמים את המכסה, ועושים אמבטיה-סוניקט למשך 10 דקות. מזגו בזהירות את האצטון מתוך צנצנת הקופלין לתוך בקבוק אחסון זכוכית.
      אזהרה: מתנול דליק ורעיל מאוד. יש להשתמש במכסה אדים כימי. אצטון הוא דליק ומגרה. לכן, טפלו בו ואחסנו אותו בזכוכית, והשתמשו בו במכסה אדים כימי. השליכו כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במתנול ובאצטון עד פי חמישה כל אחד.
  3. הפעל את משטח הכיסוי לצורך פונקציונליזציה של סילאן.
    1. אמבט-סוניקט עם 1 M אשלגן הידרוקסיד (KOH) במשך 20 דקות. בזהירות לשפוך את KOH מתוך צנצנת Coplin לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לשימוש חוזר.
      אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ומגרה. יש להשתמש במכסה אדים כימי ולא לאחסן בזכוכית. אחסנו אותו בצינורות פוליפרופילן. השליכו כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר ב- KOH עד חמש פעמים.
    2. יש לשטוף פעמיים עם ddH2O. לנקז ddH2O מהכיסויים, ולאחר מכן לחמם כל כיסוי על ידי הנפת הלהבה של מבער בונזן כדי להסיר את כל לחות פני השטח. מניחים את הכיסויים בצנצנת קופלין יבשה.
  4. בצע כסות אמינוסילניזציה.
    1. הכן את תמיסת האמינוסילן על ידי ערבוב של 69.4 מ"ל של מתנול עם 3.6 מ"ל של חומצה אצטית (CH3COOH) בבקבוקון חרוטי. הוסיפו 720 μL של N-(2-אמינואתיל)-3-אמינופרופילטרימתוקסיסילן (אמינו-סילן) וערבבו היטב (ראו טבלת חומרים).
      אזהרה: חומצה אצטית היא דליקה וקורוזיבית. טפלו בפיפטות זכוכית ואחסנו בזכוכית. עבודה עם חומצה אצטית במכסה אדים כימי. אמינוסילן הוא סכנת שאיפה רעילה חריפה, רגישות וחומר מגרה. זה מזיק לחיים הימיים. יש להשתמש במכסה אדים כימי. השליכו את הכימיקלים כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
      הערה: אמינוסילן רגיש לאור ועובר הידרוליזה במהירות במים. כל השלבים עם מגיב זה צריכים להתבצע בתנאי תאורה מינימליים כדי לשמור על פעילות. טהרו את הבקבוק בגז חנקן והפעילו סרט איטום לפני האחסון במייבש כהה. החלף כל 6-9 חודשים.
    2. מיד להוסיף את תמיסת אמינוסילן לצנצנת קופלין. מכסים ומורחים את סרט האיטום, וממשיכים להגן מפני האור.
    3. דגירה של הכיסויים בתמיסת האמינוסילן למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT). Bath-sonicate במשך דקה אחת ולאחר מכן דגירה במשך 10 דקות נוספות. יש לשפוך בזהירות את תמיסת האמינוסילן לתוך מיכל פסולת המיועד ל-CH3OH עם עקבות אמינוסילן ו-CH3COOH.
    4. יש לשטוף את הכיסויים במתנול ולשפוך את התמיסה למיכל פסולת המיועד למתנול.
    5. יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם ddH2O. לנקז את הכיסויים, לטשטש את עודפי הלחות ולייבש את האוויר לחלוטין למשך 10 דקות.
  5. בצע את הכנת המערך / תפקוד ביוטין-PEG של הכיסויים.
    1. הכן 1 M NaHCO3 (pH 8.5) מלאי עבודה על ידי המסת 84.5 מ"ג של NaHCO3 לתוך 1 מ"ל של ddH2O. לריכוז סופי של 10 mM NaHCO3, יש לדלל 1 M NaHCO3 ל-ddH2O (1:100).
    2. ציירו מערך רשת על הכיסויים המיאמיסילניים היבשים בעזרת עט מחסום הידרופובי (ראו טבלת חומרים) והמתינו עד שהדיו יתייבש. כתוב מזהה על הכיסוי כדי לסמן את הכיוון הנכון. מניחים את הכיסויים בתא לח.
      הערה: המערך צריך לכלול 16-20 ריבועים, בגודל של כ-4 מ"מ x 4 מ"מ.
    3. כדי להפוך את התמיסה ביוטין-PEG succinimidyl valerate (ביוטין-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG), ראשית, הסר mPEG וביוטין-PEG (ראה טבלת חומרים) מהמקפיא ושיווי משקל ל-RT. הוסף 153 מ"ג של mPEG ו-3.9 מ"ג של ביוטין-PEG (~1:39 ביוטין-PEG:mPEG) לצינור מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל, והוסף מחדש ב-609 מיקרול של 10 mM NaHCO3 על ידי צנרת עדינה. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת ב RT כדי להסיר בועות.
      הערה: זמן מחצית החיים של הידרוליזה של succinimidyl valerate במאגר pH 8.5 הוא ~ 30 דקות. לאחר הוספת המאגר ל- mPEG, המשך עם השלבים הבאים במהירות האפשרית. שלב זה הוא קריטי.
    4. החל את תמיסת ביוטין-PEG/mPEG כדי לכסות לחלוטין כל ריבוע במערכי הכיסויים, בדרך כלל 10-15 מיקרול' לריבוע. אין לאפשר לנוזל לעלות על גדותיו של החלל המוגדר. אחסנו את הכיסויים בתא לחות בחושך למשך 3-4 שעות ב-RT.
    5. שטפו את הכיסויים בכמויות אדירות של מים על ידי טבילה רציפה שלהם בכוסות זכוכית בגודל 3x250 מ"ל מלאות ב-ddH2O במשך 10 שניות כל אחת.
    6. הוציאו את כל הלחות מהכיסויים בגז חנקן. אחסנו את הכיסויים גב אל גב בצינור חרוטי 50 מ"ל מלא בחנקן, עטוף בסרט איטום בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: המשך מיד לשלב 2 או לאחסן כיסויים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני השימוש.

2. הכנת SiMPull lysate

אזהרה: ה-PPE הנדרש לשאר השלבים של הפרוטוקול הם כפפות ניטריל, משקפי בטיחות ומעילי מעבדה.

הערה: הליסאטים הוכנו מתאי CHO הדביקים המבטאים EGFR-GFP. התאים צופו בתרבית רקמה של 60 מ"מ (TC60) במשךהלילה 12,13. תאי CHO עברו תרבית ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-500 ננוגרם/מ"ל של גנטיקאין (ראו טבלת חומרים). ניתן להשתמש גם בקווי תאים דביקים אחרים או בתאי השעיה.

  1. צלחת את התאים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. שטפו את צלחת התרבית (המכילה את התאים) ב-1 מ"ל של 1x PBS. הוסיפו 1 מ"ל של 1x טריפסין ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים. באמצעות פיפטה, מעבירים את התאים המנותקים מהצלחת לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. קח 10 μL של כחול טריפאן וערבב עם 10 μL של תרחיף התא בצינור צנטריפוגה נפרד. ספירת תאים באמצעות 10 μL של תערובת התאים במונה תאים אוטומטי, בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
    3. צלחת 8 x 105 תאים לילה בצלחת פטרי TC60. צלחת מנה אחת לכל תנאי.
      הערה: עבור המחקר הנוכחי, התאים לא טופלו או טופלו עם Pervanadate ו- EGF כמתואר בשלב 2.4.1.
  2. הכן את הפתרונות הבאים להכנת lysate התא.
    1. הכן קר כקרח 1x PBS (pH 7.4).
    2. הכינו מאגר ליזיס, תמיסה של 1% חומר ניקוי לא יוני ולא מתנוון (ראו טבלת חומרים) ב-50 mM Tris-HCl (pH 7.2) ו-150 mM NaCl בתוספת מעכב פרוטאז/פוספטאז (PPI) (1:100 מהמלאי). מניחים שפופרת על מאגוז ומאפשרים לחיץ לערבב במשך 15 דקות. שמור את הפתרון המוכן על הקרח.
    3. הכינו את החיץ של הטירוד לריכוז סופי של 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM גלוקוז ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) (ראו טבלת חומרים). חממו את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את הבקרה החיובית עבור phosphorylation - 1 mM pervanadate טיפול.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי. פרבנדאט הוא הצורה המחומצנת של מעכב ונדאט-אן של חלבון טירוזין פוספטזות16. מניעת דה-פוספורילציה של חלבונים על-ידי עיכוב פעילות פוספטאז גורמת לדגימה עם זרחון גבוה.
    1. הכינו מלאי של 200 mM של נתרן אורתובנדט פעיל (Na3VO4).
      1. כדי להכין תמיסה של 100 מ"ל, הוסיפו 3.89 גרם של Na3VO4 (ראו טבלת חומרים) ל-90 מ"ל של ddH2O והתמוססו תוך כדי ערבוב. התאם את ה- pH ל- 10 על-ידי הוספת HCl או NaOH בצורה נפתחת. הוספת HCl תהפוך את הפתרון לצהוב.
      2. הביאו נפח ל-100 מ"ל עם ddH2O. הרתיחו את התמיסה על ידי חימום במיקרוגל. לאחר הרתחה, הפתרון יהיה חסר צבע.
      3. מצננים את הפתרון ל-RT ומתאימים מחדש את ה-pH ל-10. יש לחזור על כוונון הרתיחה, הקירור וה-pH פעמיים עד ארבע פעמים נוספות, עד שה-pH יתייצב על 10. Aliquot ולחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. הכן מלאי של 30 mM pervanadate (PV) על ידי ערבוב של 20.4 μL של 3% H2O2 עם 100 μL של 200 mM Na3VO4 ו- 546.8 μL של ddH2O (ריכוזים שווים של H2O2 והפעיל את Na3VO4). דגירה בחושך ב- RT במשך 15 דקות.
    3. הכן 1 mM PV במאגר של Tyrode. עבור פתרון של 10 מ"ל, הוסף 0.33 מ"ל של מלאי PV של 30 mM ל- 9.67 מ"ל של 37 °C של המאגר של Tyrode. לטפל בתאים מיד.
    4. לשטוף תאים פעם אחת עם 3 מ"ל של המאגר של Tyrode. הוסף 3 מ"ל של 1 mM PV במאגר של Tyrode לתאים ודגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (74 °F).
  4. בצע את גירוי הליגנד.
    1. לעורר תאים עם ליגנד של עניין באמצעות ריכוז, זמן וטמפרטורה מתאימים. עבור גירוי EGFR מקסימלי, דגירה עם 1 מ"ל של 50 ננומטר גורם גדילה אפידרמלי (EGF, ראה טבלת חומרים) + 1 mM של PV במאגר של Tyrode למשך 5 דקות ב 37 °C (37 °C).
  5. לבצע ליזיס של תאים.
    1. לאחר הטיפול התאי הרצוי, הניחו את המנה על הקרח ושטפו עם 1x PBS קר כקרח. הסר לחלוטין את הנפח המלא של PBS באמצעות פיפטה.
    2. הוסף 180 μL של מאגר lysis (שלב 2.2.2) לצלחת. השתמשו במגרד תאים כדי למשוך חיץ סביב הצלחת כדי לכסות את התאים במלואם. הפעילו לחץ יציב ועקבי עם מגרד התאים על פני כל המשטח התרביתי כדי לשבש את התאים במלואם.
      הערה: נפח מאגר הליזיס צריך להישמר לכל הפחות כדי להבטיח ריכוז חלבון גבוה.
    3. פיפטה את התאים המכוסים והעבירה אותם לצינור של 1.5 מ"ל. שמור את הצינור על קרח במשך 30 דקות. מערבולת הליזטים כל 5 דקות.
      הערה: אם ה- POI מורכב מיחידות משנה מרובות או רגיש לדיסוציאציה, אל תסובב את ה- lysates.
    4. צנטריפוגה של התאים השקועים ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה. זה מכיל את סך החלבון lysate.
    5. שמרו 10 μL של הליזט ודללו אותו ל-90 μL של מאגר הליזיס עבור ניתוח בדיקה צבעונית ביסינכונינית (BCA)17. אחסנו את שארית החלבון ליזאט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    6. קבע את ריכוז החלבון הכולל של הליזאט באמצעות ניתוח BCA (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתן להכין את סך כל החלבון lysates ביום הניסוי ולהשתמש בהם טריים או מאוחסנים כאליקוטים חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 12 שבועות. אין להקפיא/להפשיר.

3. פונקציונליזציה של המערך עם הנוגדן biotinylated

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. T50 Buffer, תמיסה של 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו-50 mM NaCl. הפתרון יציב למשך חודש ב- RT.
    2. T50-BSA על ידי תוספת של מאגר T50 עם 0.1 מ"ג/מ"ל של BSA. שמור את הפתרון המוכן על הקרח.
    3. 10 מ"ג/מ"ל של נתרן בורוהידריד (NaBH4) ב-1x PBS. הכן זאת מיד לפני השימוש.
    4. 0.2 מ"ג/מ"ל של NeutrAvidin (ראו טבלת חומרים) במאגר T50.
      אזהרה: NaBH4 הוא חומר מחזר והוא דליק. תמיד לטהר את המיכל עם גז חנקן לאחר השימוש ולאחסן אותו במייבש.
  2. לתפקד את המערך עם הנוגדן biotinylated.
    1. הסר את המערכים הפונקציונליים של PEG-ביוטין מהמקפיא ושווי המשקל את הצינור החרוטי ל-RT לפני הפתיחה. הניחו את הכיסויים כשהמערך מכוון כלפי מעלה על סרט איטום מרופד בתרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ (TC100).
      הערה: צמצם את התאורה התקורה. כל הפתרונות צריכים "לחרוז" על הריבועים המוגדרים על ידי המערך ההידרופובי. הוסף נפח מתאים של תמיסה כדי לכסות לחלוטין כל ריבוע (בדרך כלל 10-15 μL) ואל תאפשר לנוזל להציף את השטח המוגדר. כדי להסיר במהירות נוזלים, השתמשו בקו ואקום פנימי המחובר לבקבוק ואקום כדי ללכוד פסולת. אפשרו ל-NaBH4 לעשות דגה במשך שעה אחת לפני הסילוק על ידי השארת הצינור פתוח במכסה האדים הכימי. טיפול NaBH4 נחוץ כדי להפחית את האוטו-פלואורסצנציה ברקע, ובכך להפחית זיהויים של מולקולות בודדות חיוביות כוזבות.
    2. טפלו בכל ריבוע של המערך עם 10 מ"ג/מ"ל של NaBH4 ב-1x PBS למשך 4 דקות ב-RT. שטפו שלוש פעמים עם PBS.
    3. דגירה של כל ריבוע למשך 5 דקות עם 0.2 מ"ג/מ"ל של NeutrAvidin ב-T50. יש לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
      הערה: NeutrAvidin נקשר ל-PEG-ביוטין ומספק אתר קשירת נוגדנים שעברו ביוטינילציה 12,13,15.
    4. דגירה של כל ריבוע למשך 10 דקות עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן ספציפי ל-POI שעבר ביוטינילציה ב-T50-BSA; לשטוף שלוש פעמים עם T50-BSA.
      הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-anti-EGFR IgG שעבר ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) כדי ללכוד EGFR-GFP.

4. SiMPull של POI מליאסטים של תאים שלמים

הערה: מקם את המנה TC100 של מערכי SiMPull פונקציונליים על קרח למשך שארית הכנת SiMPull. שלב זה הוא משיכה למטה של POI מכלל החלבון ליזט. אסור לעשות שימוש חוזר בליזאט לאחר ההפשרה.

  1. הכן את הפתרונות הבאים.
    1. הכן 4% paraformaldehyde (PFA)/0.1% glutaraldehyde (GA) ב 1x PBS.
      אזהרה: PFA ו- GA הם מקבעים כימיים רעילים וחומרים מסרטנים פוטנציאליים. ללבוש PPE. השליכו את הכימיקלים כפסולת מסוכנת בהתאם לתקנות ולהנחיות המקומיות.
    2. הכן 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. להפשיר ולערבב את הליזאט על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה. תמשיכו לקרח.
  3. דילול 1 μL של הליזט לתוך 100 μL קר כקרח T50-BSA/PPI.
    הערה: במידת הצורך, קבע את מקדם הדילול המתאים של סך החלבון ליזט על-ידי החלת מגוון דילולים על המערך. הצפיפות האופטימלית של קולטני SiMPull לכל אזור מערך היא 0.04-0.08/μm2. ניתן להעריך דילולים של Lysate בשלב 6 (ניתוח נתונים).
  4. דגירה של הליזאט על המערך למשך 10 דקות; ואז לשטוף ארבע פעמים עם T50-BSA /PPI קר כקרח.
  5. דילול נוגדן אנטי-פוספוטירוזין מדולל AF647(ראה טבלת חומרים) ב-T50-BSA/PPI קר כקרח ודגירה על המערך במשך שעה אחת.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פאן אנטי-pTyr (PY99)-AF647 IgG משמש לזיהוי האוכלוסייה הזרחנית של EGFR-GFP. השימוש בנוגדנים המסומנים ישירות מסיר את הצורך בנוגדנים משניים, מגדיל את אפשרויות הסימון ומשפר את עקביות התוצאות. ניתן לקבל נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ממקורות מסחריים. אם הם אינם זמינים באופן מסחרי, נוגדנים יכולים להיות מסומנים בהתאמה אישית באמצעות טכניקות ביו-קונסיגנציה סטנדרטיות, וערכות ביו-מיזוג מסחריות זמינות. כל אצווה של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי צריכה להיבדק לתנאי תיוג אופטימליים על ידי ביצוע SiMPull כדי למדוד עקומת מינון ולמצוא את נקודת הרוויה.
  6. לשטוף שש פעמים עם T50-BSA קר כקרח במשך 6-8 דקות בסך הכל.
  7. יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS קר כקרח.
  8. הדגירו את המערך עם תמיסת PFA/0.1% GA של 4% למשך 10 דקות כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים.
  9. יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחת עם 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS כדי להשבית את הקיבועים.
    הערה: לניסויים המשתמשים ביותר מנוגדן אחד (לדוגמה, זיהוי מספר אתרי פוספוטירוזין), חזור על שלבים 4.5-4.9. ראה שלב 6.2.9 לקבלת מידע על קביעת מכשול סטריק בין שני נוגדנים.

5. רכישת תמונה

הערה: רכישת תמונה של מולקולה בודדת מתבצעת באמצעות מטרת TIRF של 150x ומפצל תמונה הלוכד כל ערוץ ספקטרלי ברביע מסוים של מצלמת emCCD (ראו טבלת חומרים). תמונות כיול נרכשות לראשונה כדי לאפשר רישום תעלה וכיול השגת מצלמה עם רשת יישור תעלות ננו-פטרית (nanogrid) המכילה 20 x 20 מערכים של 200 ± חורים של 50 ננומטר במרחק תוך חור של 3 ± 1 מיקרומטר (גודל כולל ~ 60 מיקרומטר × 60 מיקרומטר).

  1. בצע רישום לערוץ בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: יש צורך ברישום ערוצים מדויק כדי לחשב כראוי את הקולוקליזציה של הפולטים. שלב זה הוא קריטי.
    1. נקו את מטרת הנפט והפקידו טיפת שמן על המטרה. הניחו את הננו-גריד על הבמה להדמיה. באמצעות אור לבן המועבר, התמקדו בתבנית הרשת.
      הערה: תמונות עם הננו-גריד נרכשות באמצעות אור מועבר, העובר דרך הננו-גריד ומתגלה בכל הערוצים הספקטרליים. לחלופין, ניתן להשתמש בחרוזים רב-פלואורסצנטיים הפולטים פלואורסצנציה שזוהתה בכל ערוץ. רכישת התמונה תצטרך להיות מותאמת בהתאם לכל מערך מיקרוסקופ.
    2. רכוש סדרה של 20 תמונות של הרשת. ודא שהפיקסלים אינם רוויים. שמור את סדרת התמונות כ-"Fiducial".
    3. נטרל את הננו-גריד כדי ליצור תבנית אוורירית18. רכשו סדרה של 20 תמונות לכיול רווחים. שמור את התמונה כ"רווח ".
    4. רכשו סדרה של 20 תמונות להסטת המצלמה על ידי חסימת כל האור מלהגיע למצלמה. שמור את התמונה כ"רקע ".
  2. רכוש תמונות SiMPull.
    הערה: לפני הדמיית מערך הכיסוי, החלף את פתרון Tris עבור T50-BSA ושווי המשקל את המערך ל- RT.
    1. נקו את מטרת השמן והפקידו שמן נוסף על המטרה. אבטחו את מערך הכיסויים בשלב המיקרוסקופ.
    2. מטב את עוצמת העירור של כל פלואורופור, את זווית ה-TIRF ואת זמן שילוב המצלמה. המטרה היא להשיג את האות לרעש הגבוה ביותר תוך מזעור ההלבנה הצילומית של הדגימה. תעד את עוצמת הלייזר לעקביות במדידות עתידיות.
      הערה: המחקר הנוכחי השתמש בזמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה עבור הערוץ האדום הרחוק ו-1 שניות עבור הערוץ הירוק. הלייזר 642 ננומטר שימש בהספק לייזר של כ-500 μW, ואילו לייזר 488 ננומטר שימש ב-860 μW, שנמדד לפני עדשת הצינור.
    3. רכוש תמונות עבור כל דגימה. דמיינו תחילה את הערוץ האדום-רחוק, ואחריו כל פלואורופור באורך גל נמוך יותר כדי להפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומיבית. בשל הנפח הנמוך המשמש עבור כל דגימה, בדוק את רמת המאגר כל 30-45 דקות ומלא מחדש לפי הצורך.

6. ניתוח נתונים

  1. הורד את קודי ההדגמה.
    הערה: קוד ההדגמה המסופק וערכות הנתונים לדוגמה מדגימים את זרימת העבודה המלאה של ניתוח נתונים (קבצי קידוד משלימים 1-4). דרישות המערכת המפורטות ב- SiMPullMain.m נמצאות בקובץ קידוד משלים 1.
    1. פתח את השרטוט ושמור בספריית מסמכים/MATLAB אישית (MacOS/Linux) או בספריית מסמכים\MATLAB (Windows).
      הערה: פעולה זו יוצרת ארבע תיקיות חדשות: SiMPull_class, smite, נתונים לדוגמה, יציאות ניתוח לדוגמה.
    2. פתח את הקובץ "ReadMe_Setup.txt" שנמצא בתיקיית SiMPull_class.
    3. התקן את ארגזי הכלים של MATLAB ו- MATLAB: ארגז כלים להתאמת עקומות, ארגז כלים למחשוב מקבילי וארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה.
    4. התקן DipImage19 בהתאם להוראות ההורדה.
    5. התקינו חבילת אנליזה של מולקולה בודדת "smite" כמתואר ב-ReadMe_setup.txt.
      הערה: "smite" זמין במאגר GitHub (ראה טבלת חומרים).
    6. פתח את SiMPullMain.m, שנמצא בתיקיית SiMPull_class, על-ידי גרירת הקובץ לחלון MATLAB.
    7. שנה את הספריה ל- ...\MATLAB\Sample Data\ על-ידי לחיצה על סמל עיון בתיקיה ובחירת התיקיה.
  2. מבט כולל על שלבי עיבוד נתונים
    1. הפעל את SiMPullMain.m - בהתאם להוראות עבור כל סעיף. הפעל כל מקטע בנפרד על-ידי הצבת הסמן במקטע זה ולחיצה על סמל הפעל מקטע.
      הערה: השלבים הכלליים לניתוח נתונים מתוארים בסעיף זה. הוראות מפורטות נמצאות בקוד SiMPullMain.m הנלווה.
    2. הפעל את המקטע "אתחול" כדי להגדיר את הנתיב להגדרת ערוצים ספקטרליים וגודל תמונה.
    3. הפעל את הקטע "מצא רווח מצלמה והסטה" כדי להמיר את רווח המצלמה לפוטונים באמצעות מערכי הנתונים רווח ורקע.
    4. הפעל את המקטע "רישום ערוץ" כדי לחשב את שינוי ההמרה הממוצע המשוקלל המקומי המשמש לרישום תמונה.
    5. עצב ואצור את הנתונים. הפעל את המקטע "הצטרף לערוצים רציפים לתוך תמונה מרובעת". הפעל "הסר מסגרות רעות".
    6. הפעל את הסעיף "התאם מולקולות בודדות ומצא מולקולות חופפות".
      הערה: מקטע זה מבצע פונקציות מרובות כדי למקם מולקולות בודדות בכל ערוץ ולקבוע אירועי קולוקליזציה בין ערוצים ספקטרליים.
    7. כדי לקבוע את ספירת הפוטונים המינימלית לכל התאמת GFP אמיתית, הפעל את "מיטוב סף הפוטונים המינימלי". זהו תהליך איטרטיבי.
      1. ראשית, הגדר smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] והפעל את הקטע. בחר קבצי "נתונים ריקים" כשתתבקש. חזור על הפעולה עם קבצי "CHO-EGFR-GFP".
      2. בחר ערך סף מינימלי מתאים על-ידי השוואת שתי ההיסטוגרמות. הגדר smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] והפעל את הקטע שוב.
    8. הפעל את הסעיף "חישוב אחוז GFP מתאים חיובי עבור אות FR" כדי לתקן לוקליזציות ברקע ולחשב ערכים סופיים.
    9. בצע אפשרות 1 (שלב 6.2.10) או אפשרות 2 (שלב 6.2.11) לפי צורך ניסיוני.
    10. אפשרות 1: נכון לגבי מספר הקולטנים הזמינים בקרום הפלזמה לקשירת ליגנד, כמתואר בהפניה15.
      1. ראשית, סמן קולטני פני שטח ברמות רוויות של צבע NHS Ester פלואורסצנטי (NHS-AF647, ראה טבלת חומרים). לאחר מכן בצע ניסוי SiMPull כדי לקבוע את אחוז הלוקליזציה של GFP שמתחברת ל- AF647.
        הערה: זה מספק הערכה של חלק הקולטנים הזמינים לתיוג NHS והיחס בין הקולטנים על פני השטח (SR).
      2. החל את תיקון ה- SR בחישוב הסופי: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, כאשר NGFP הוא המספר המתוקן של לוקליזציות GFP, NBG הוא מספר לוקליזציה ברקע, ו- NLOC הוא לוקליזציות כוללות.
        הערה: בדוגמה הנוכחית, תיקון זה אינו מיושם מכיוון שפרבנדט הוא חדיר ממברנה16 , ולכן הפעולה של עיכוב פוספטאז אינה מוגבלת לקולטני פני השטח.
    11. אפשרות 2: עבור מדידות זרחון מרובות אתרים, שקול את הפוטנציאל לעכבה סטרית כאשר נעשה שימוש בשני נוגדנים.
      הערה: הפרעה סטרית עלולה לגרום לירידה באחוז הנצפה של קולטנים זרחניים עבור נוגדן 1 בנוכחות נוגדן 2 (P12), בהשוואה לנוגדן 1 בלבד (P1).
      1. השתמש ב- SiMPull כדי לקבוע את P1 ו- P12 ולחשב את מקדם התיקון עבור הפרעה סטרית, בעקבות הפניה15 שפורסמה בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קריקטורה המתארת את תהליך SiMPull מוצגת באיור 1A. הכיסויים מתפקדים תוך שימוש ב-NeutrAvidin כעוגן לנוגדנים נגד EGFR שעברו ביוטינילציה כדי ללכוד EGFR-GFP מתוך סך כל החלבון ליזאטים. לאחר שטיפת חלבון לא מאוגד, הקולטנים הזרחניים מסומנים בנוגדן אנטי-פוספוטירוזין (אנטי-PY)15. איור 1B מציג תמונה של המערך ההידרופובי, שבו ניתן להכין דגימות מרובות ולדמות אותן על אותו כיסוי. אחד היתרונות של מחזיק מדגם זה הוא שנדרשים נפחי דגימה מינימליים של ~ 10 μL. ניתן לדמות את הכיסוי על ידי הצבתו ישירות על במת המיקרוסקופ. עם זאת, כדאי לייצב את הכיסוי על ידי שימוש במחזיק כיסוי. מחזיק הכיסוי המוצג באיור 1B נוצר באמצעות מדפסת תלת-ממד, והשרטוט מסופק בקובץ קידוד משלים 5. הפלואורסצנציה האוטומטית של הדיו ההידרופובי היא מדריך שימושי למציאת מישור המוקד של הדגימה (איור 1C). דוגמה לתמונה גולמית רב-ערוצית מוצגת באיור 1D. שכבה של הערוצים הירוקים והאדומים הרחוקים הגולמיים מוצגת באיור 1E.

איור 2 מתאר את זרימת העבודה של הניתוח ומספק נתונים מייצגים. רכישת נתונים מתחילה תחילה ברכישת fiducials לרישום ערוצים, המשמשים לכיסוי נתוני הערוצים הספקטרליים הבודדים (איור 2A). תמונות בשדה בהיר מצולמות באמצעות תבנית ננו-גרידית העוברת באור לבן ומתגלה בכל ערוץ ספקטרלי של מפצל התמונה (לא מוצג). הערוץ הירוק משמש כערוץ הייחוס, והערוץ האדום-רחוק הוא הערוץ שהוזז. התמרת הממוצע המשוקלל המקומי מחושבת באמצעות פונקציית fitgeotrans20 ב- MATLAB ומשמשת להזזת קואורדינטות אדומות רחוקות למסגרת הקואורדינטות של הערוץ הירוק. טרנספורמציה זו משתמשת במודל פולינומי מסדר שני בכל נקודת בקרה. לאחר מכן נרכשים נתונים רב-ערוציים של מערך SiMPull. זרימת עבודה זו כללה רכישה אוטומטית למחצה, שבה נבחר החזר השקעה התחלתי עבור ריבוע המדגם הספציפי, ושלושה אזורים סביב אזור זה צולמו, כך שכל ערכת נתונים מכילה את התמונה המלאה של ארבעת הצפיות משלושה ROIs עצמאיים (איור 1D). בכל ערוץ ספקטרלי, המיקומים המועמדים לפולט נמצאים על ידי החלת הבדל של מסנן גאוס על תמונות וזיהוי מקסימה מקומית. אזורי משנה (תיבות, איור 2B) מצוירים סביב מקסימה מקומית, וספירת הפוטונים הפולטים נאמדת על ידי ההנחה שכל תת-אזור מכיל רק פולט אחד. אזורי משנה המחזיקים מועמדים לפולט עם ספירת פוטונים מעל ערך מינימלי נשמרים להתאמה. פונקציית התפשטות נקודה גאוסית (PSF) מתאימה לכל מועמד פולט בתוך אזורי משנה קטנים המרוכזים בערך סביב כל פולט. הלוקליזציות המתקבלות עוברות סף על סמך ספירת הפוטונים שלהן, הרקע שלהן, הגבול התחתון של Cramér-Rao של קואורדינטות ההתאמה, שונות PSF (כלומר, רוחב PSF) וערך p המתאר את טובת ההתאמה של מודל PSF. תמונה של גאוס נוצרת עבור כל ערוץ ספקטרלי, עם עוצמה אחידה של כתמי גאוס הממוקמים בקואורדינטות עבור כל התאמה טובה (איור 2C). קולוקליזציה מוצגת באופן חזותי על-ידי כיסוי של תמונות גאוס מכל ערוץ ספקטרלי באמצעות הטרנספורמציה המחושבת מהדגימה הפידוקיאלית (איור 2D). חשוב לתייג באופן פלואורסצנטי את הקולטן לצורך זיהוי מכיוון שעדיין קיימת קשירה לא ספציפית של נוגדני האנטי-פוספוטירוזין לפני השטח כאשר קיים ליזט תאי. ה-EGFR-GFP (תעלה ירוקה) משמש ליצירת מסכה של מיקומי הקולטנים, ורק האות AF647-anti-PY (ערוץ אדום-רחוק) בתוך מסכה זו נספר (איור 2D). זוגות בתוך פיקסל אחד (גודל פיקסל של 106.7 ננומטר) נחשבים לקולקליים ונשמרים ברשימה המכילה את קואורדינטות ערוץ ההפניה. האחוז של AF647 colocalized עם GFP מחושב כדי לקבוע את החלק של קולטנים זרחניים (איור 2E).

ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח איכות נתונים טובה. מאמץ אחד כזה הוא לדגום את מערך הכיסויים עם NaBH4 כפי שמתואר בפרוטוקול כדי להרוות את הפלואורסצנציה האוטומטית בתעלה הירוקה. פלואורסצנציה אוטומטית זו מתייחסת לאות הלא ספציפי עקב זיהומים אפשריים על הזכוכית, המכילים קשרים π יחידים או מצומדים21. זיהומים כאלה הם פוטנציאליים מריאגנטים אמינוסילן ו-PEG המשמשים בתהליך הפונקציונליזציה או אבק מהאוויר, ונוטים לפלואורסצנציה בתעלה הספקטרלית הירוקה. למרות המאמצים לשמור על זכוכית מאוחסנת תחת חנקן, מולקולות אלה עשויות להיווצר גם באמצעות חמצון המתרחש באחסון. NaBH4 שימש גם להפחתת פלואורסצנציה כתוצאה מזיהומים במגלשות ובמיקרו-מערכים, כולל אלה עם ציפוי סילאן16. איור 3A מראה את הירידה במספר גילויי הרקע המתרחשים כאשר הזכוכית החרוטה בפיראנה מטופלת ב-NaBH4. בעוד ש-NaBH4 מפחית את הפלואורסצנציה ברקע באופן דרמטי, חלק מהפולטים עדיין מזוהים בתעלה הירוקה. אפשר לתקן זאת על ידי רכישת תמונות רקע מדגימות נטולות ליזטים (איור 3D) וחיסור המספר הממוצע של לוקליזציות רקע מהדגימות המכילות GFP. פלואורסצנציה מזיהומים לא זוהתה בתעלה האדומה הרחוקה. אם צפיפות הקולטן גבוהה מדי, ניתן למצוא מספר פולטי GFP בתוך נקודה אחת המוגבלת בדיפרקציה (נתונים שלא הוצגו). באמצעות שימוש בצילום שלבים כדי לזהות את מספר ה-GFPs לכל נקודה, מצאנו שצפיפות קולטן בין 0.04-0.08 חלבונים/מיקרומטר2 סיפקה ריווח מספיק בין פולטים בודדים כדי להסיר את הפוטנציאל של מציאת פולטים מרובים לכל נקודה12. ניתן לייעל את צפיפות הקולטן על ידי שינוי כמות נוגדן ה-IP הקשורה למשטח הזכוכית או כמות הליזאט שנוספו. זה קריטי כדי להבטיח כי הנוגדן המכוון POI משמש ברמות רוויה. מומלץ לרכוש עקומת ריכוז נוגדנים על דגימות זרחניות כדי לקבוע את תנאי הסימון המתאימים (איור 3B). בנוסף, יש לאמת את הספציפיות של הפוספו של נוגדן באמצעות דגימות מנוחה ו/או טיפול במעכבי קינאז ספציפיים לחלבון (איור 3B). נוגדנים יתנתקו מהקולטן במהלך חלון הזמן של ההדמיה. טיפול בדגימה בשילוב של PFA ו-GA מנע אובדן אות (איור 3C).

לבסוף, חשוב לייעל את הפרמטרים המתאימים למולקולה אחת. השלב הראשון של "מציאת קופסה" שמזהה מועמדים פוטנציאליים לפולטים (איור 2B) צריך להיות נדיב כדי לאפשר למועמדים רבים לעבור את התאמת גאוס. לפיכך, סף הפוטונים המינימלי למציאת תיבות יכול להיות נמוך יחסית כדי ללכוד את כל הפולטים האמיתיים וכמה כתמי רקע. חשוב גם לא להגדיר את גודל הקופסה ואת הקצבת החפיפה קטנה מדי. שמירה על גודל התיבה בטווח של 5-7 פיקסלים ומתן אפשרות לחפיפה של שני פיקסלים היא אידיאלית עבור פולטים בצפיפות המומלצת. לאחר מציאת התיבה, יש לייעל את סף הפוטונים המינימלי בשלב ההתאמה. פרמטר הפוטונים המינימלי תורם לקביעה אילו פולטים מותאמים של גאוסיאן עוברים כהתאמה אמיתית. כדי לקבוע את סף הפוטון המינימלי המתאים להתאמות GFP אמיתיות, הקוד כולל פונקציית התוויית היסטוגרמה כדי לבחון את הפוטונים/לוקליזציה הן בדגימות הרקע (ללא ליזט של התא) והן בדגימות המכילות GFP (בתוספת ליזט תאים) (איור 3D). שלב זה חשוב מכיוון שבעוד ש- NaBH4 מפחית את כמות הפלואורסצנציה מזיהומים, הוא אינו מסיר את כל לוקליזציות הרקע. איור 3D מדגים את הצורך לקבוע סף פוטון מינימלי כדי להפחית את מספר הזיהויים כתוצאה מזיהומים. כדי לקבוע את הסף הזה, היסטוגרמה של עוצמות פולטות ברקע מחושבת מהדמיה של דגימה שאינה חשופה לליזאט של תאים (איור 3D, למעלה משמאל). רוב פולטי הרקע נמצאו כבעלי ערכים של פחות מ-475 פוטונים. לשם השוואה, הדגימה שהכילה פולטי GFP אמיתיים הראתה חלק משמעותי מההתפלגות מעל 475 (איור 3D, מימין למעלה). הסף נבחר על ידי בדיקה כדי להסיר כמה שיותר ספירות רקע תוך מזעור כמות אובדן האותות ממדגם הליזאט (איור 3D, שורה תחתונה). צפיפות ספירת הרקע הנותרת בסף זה מובאת בחשבון בניתוח הכמותי.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של הכנת דגימה. (A) קריקטורה המתארת את גישת SiMPull. כיסויים מתפקדים עם נוגדן שמזהה את ה-POI כדי ללכוד את ה-POI הזה מ-lysates של תאים שלמים. הזכוכית מצופה תחילה ב-PEG ובביוטין-PEG. לאחר מכן, NeutrAvidin נקשר לביוטין-PEG ומשמש כעוגן לנוגדן נגד POI שעבר ביוטינילציה. חלבונים זרחניים מזוהים לאחר מכן עם נוגדן אנטי-PY המסומן בפלואורסצנטיות. (B) תצלום של מחזיק הכיסוי (אדום) עם מערך כיסויים במקומו ומותקן על במת המיקרוסקופ. המערכים הרב-ממדיים נוצרים באמצעות דיו הידרופובי כדי ליצור עד 20 ריבועי דגימה בודדים על מכסה זכוכית יחיד. הכיסוי הוא 60 מ"מ x 24 מ"מ. (C) תמונות לדוגמה של דיו הידרופובי autofluorescence (magenta) וחרוזים פלואורסצנטיים (ירוק). האוטופלואורסצנציה האוטומטית של הדיו ההידרופובי היא מדריך שימושי למציאת מישור המוקד במשטח הכיסוי. (D) דוגמה לתמונת נתונים גולמית עם ערוצים ספקטרליים המופרדים בשבב המצלמה על-ידי מפצל התמונה בעל ארבע התצוגות. ערכת מסנני ה-Quad-view כוללת את מסנני הפליטה הבאים: כחול (445/45 ננומטר), ירוק (525/45 ננומטר), אדום (600/37 ננומטר), אדום-רחוק (685/40 ננומטר). (E) שכבה גולמית של ערוצים ירוקים ואדומים רחוקים. התיבה הלבנה מציינת את האזור שנבדק עוד יותר באיור 2B-D. סרגל קנה מידה (C-E) = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה של ניתוח נתונים. (A) רישום הערוץ מתבצע לראשונה בתמונות שנרכשו מהננו-גריד. לאחר חיתוך שני הערוצים הספקטרליים המעניינים (כאן, ירוק ואדום רחוק), התמונות הפידוקיאליות עבור כל ערוץ הן שכבת-על (משמאל). הגדלת התיבה בתמונה השמאלית (Inset) מראה שהתמונות עדיין לא נרשמו באמת. הפולטים בכל ערוץ מתאימים למודל גאוסיאני והם מקומיים (רישום). לוקליזציה של פולטים מוצגת כעיגולים עבור הערוץ האדום הרחוק וצלבים עבור הערוץ הירוק. השלב האחרון הוא להחיל טרנספורמציה ממוצעת משוקללת מקומית כדי להעביר את קואורדינטות לוקליזציה של ערוצים אדומים רחוקים למסגרת הייחוס של הערוץ הירוק (Aligned). התמרת הממוצע המשוקלל המקומי המחושבת משמשת לאחר מכן לרישום נתוני SiMPull הבאים. (B) תמונות מייצגות של הערוץ הירוק/EGFR-GFP והערוץ האדום-רחוק/AF647-anti-PY. פולטים בודדים מעל ספירת הפוטונים ברקע מזוהים ומסומנים בתיבות. (C) פרופיל הפליטה בתוך כל קופסה שנבחרה מתאים למודל של גאוס, והפולטים שמתאימים לדגם של PSF פלואורופור יחיד נשמרים. (D) מסכה נוצרת מפולטי GFP כדי לזהות את המיקום של EGFR-GFP (ירוק). קולוקליזציה של EGFR-GFP ו-AF647-anti-PY מזהה קולטנים זרחניים (לבנים). (E) החלק של הקולטנים הזרחניים מחושב מהתקפים הקולוקליים של EGFR-GFP ו-AF647-anti-PY. גרף העמודות משווה את הטיפול ב-PV + EGF לתאי מנוחה, בממוצע למדידות מרובות. פסי שגיאה מייצגים שגיאת תקן המחושבת בהנחה של התפלגות בינומית. סרגל קנה מידה = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שלבים קריטיים כדי להבטיח את איכות הנתונים. (A) משמאל לימין, שלושת הפאנלים הראשונים הם תמונות מייצגות של הפלואורסצנציה האוטומטית על זכוכית בתנאים המתאימים: לאחר תחריט פיראנה, עם PEG, וטיפול PEG בתוספת NaBH4 (מסומן עם +). בנוסף, פונקציונליזציה של פני השטח נשמרת לאחר טיפול NaBH4 כפי שהוכח על ידי קשירת PY99-AF647 מינימלית שאינה ספציפית תוך שמירה על קשירה חזקה של EGFR-GFP מהליזאט. (B) יש לרכוש עקומת רוויה עבור כל אצווה של נוגדנים המשמשים להבטחת תיוג נוגדנים אופטימלי. נתון זה מציג את עקומת הריכוז לסימון EGFR בנוגדן פוספוטירוזין ספציפי לאתר, anti-EGFR-pY1173. זרחון מינימלי מזוהה בתאים לא מטופלים (מנוחה, יהלום אפור). כבקרה לקשירת קשר לא ספציפית, התאים טופלו גם במעכב EGFR קינאז, Lapatinib, לפני שהוסיפו 100 ננומטר של EGF (משולש מג'נטה), מה שמראה את המניעה הצפויה של זרחון EGFR. פסי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית בהנחה של התפלגות בינומיאלית. (C) קיבוע הדגימה בשילוב של PFA ו-GA מונע דיסוציאציה של נוגדנים לאורך זמן. פסי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית בהנחה של התפלגות בינומיאלית. (ד) תוצאות חיוביות שגויות אינן נכללות על ידי בחירת הסף המתאים להתאמת גאוס. השוואת ההיסטוגרמה של עוצמות התאמה בסף נמוך (סף = 0; למעלה) בין רקע (ללא ליזט) לבין נתונים ממשיים (בתוספת ליזט תא) מאפשרת בחירה של ערך מתאים (סף = 475; למטה) כדי להסיר התאמות מנקודות אוטופלואורסצנטיות בערוץ הירוק. קו המג'נטה האנכי מציין סף פוטון של 475. היסטוגרמות מחושבות מאותו מספר של ROIs עבור כל סוג דגימה (n = 3). סרגל קנה מידה = 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ zip המכיל סקריפטים וכלי עזר להפעלת ניתוח SiMPull. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 2: קובץ zip המכיל את חבילת ניתוח המולקולות הבודדות של smite . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 3: קובץ zip המכיל את הנתונים לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 4: קובץ zip המכיל פלטי ניתוח נתונים לדוגמה מייצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 5: תוכנית מחזיק מכסה להדפסה תלת-ממדית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שתואר כאן הותאם כדי לאפשר מדידות כמותיות של זרחון הקולטן ברמת החלבון הבודד. פותחו מספר שינויים פשוטים אך חשובים בפרוטוקול SiMPull ששיפרו את אמינות המדידה לזיהוי פוספו-טירוזין, כולל הפחתת האוטו-פלואורסצנציה באמצעות טיפול ב-NaBH4 ופרסום הדגימה כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים. שימוש במסכת התעלה הירוקה כדי לזהות מיקומי קולטנים לחישוב קולוקליזציה עם הנוגדן נגד PY גם משפר את דיוק המדידה על ידי הסרת ממצאים פוטנציאליים מהקשירה הלא ספציפית של הנוגדן לליסאט התא. ההדמיה הדו-צבעית שימשה לזיהוי חלקם של הקולטנים שזרחו. בתרחיש זה, הקולטן תויג גנטית עם GFP, והנוגדן סומן ישירות בצבע אדום רחוק. גישת SiMPull חלה על מטרות חלבון אחרות שעבורן קיימים נוגדנים ספציפיים, כולל חלבונים תוך-תאיים. בנוסף, מכיוון שאין צורך בתנאי דנטורציה, ניתן גם ללכוד קולטנים/קומפלקסים מרובי סובוניטים. עם זאת, ניתן לשלב דנטורציה אם ה- PTMs המעניינים ממוקמים באזורים מובנים של החלבון14. בסופו של דבר, ניתן להרחיב בקלות את SiMPull כך שיכלול תיוג סימולטני של פוספו-טירוזינים מובחנים על קולטנים בודדים כדי לכמת תבניות זרחון מרובות אתרים15. חקירת קולטנים שלמים באורך מלא באופן כזה אינה יכולה להיות מושגת בשיטות סטנדרטיות אחרות, כולל כתם מערבי וספקטרומטריית מסה פוספו.

יחד עם היתרונות של SiMPull, כמה מגבלות צריך להילקח בחשבון. כמו בכל טכניקה מבוססת נוגדנים, הזיקה והספציפיות של הנוגדנים שבהם נעשה שימוש הן קריטיות להצלחת המדידה. לכן, חשוב לייעל את תנאי תיוג הנוגדנים ולהימנע באופן אידיאלי מנוגדנים משניים על ידי שימוש בנוגדנים ראשוניים המסומנים ישירות. יתר על כן, הנוגדנים הקשורים לפני השטח יזרזו חלבונים הממוקמים בקרום הפלזמה ובתוך תאים ציטוזוליים. זה יכול לזלזל בזרחון מכיוון שחלבונים מקומיים של ציטוזול אינם נגישים לליגנד האקסוגני שנוסף. יש לנקוט צעדים נוספים כדי לתקן את רמות פני הקולטן (שלב 6.2.10). הנוגדנים האנטי-פוספוטירוזין הפגינו קשר לא ספציפי כלשהו ברגע שהליזאט היה נוכח. כדי להימנע מממצא זה, ה-EGFR תויג גנטית עם GFP כדי לזהות את מיקומם של הקולטנים, מה שאיפשר לנו להוציא את האות האנטי-PY מהקולטן. אם יש לחקור חלבונים אנדוגניים, אז צביעה נגדית עם נוגדן חלבון כולל יכולה לספק את תמונת המסכה, עם תיקון מתאים לכל קשירה שאינה ספציפית. לבסוף, בעוד ש-SiMPull מספק מידע על הטרוגניות ברמת החלבון, הליסאט שנוצר בפרוטוקול זה הוא מאלפי תאים, והשתנות בין התא לתא הולכת לאיבוד. עם זאת, ההתקדמות לעבר SiMPull חד-תאי נעשתה באמצעות תא זרימה המורכב מכיסוי וצד מיקרוסקופ עם מרווח של 10 מיקרומטר; החיידקים ציפו בדלילות על הכיסוי ואילו המגלשה תפקדה עם נוגדנים כדי ללכוד את החלבונים הרצויים. עם התזה של החיידקים, החלבונים מכל תא נלכדו באזור סגור על שקופית22 המצופה בנוגדנים. ניתוח SiMPull דומה של תאים חד-תאיים חד-תאיים של תאי יונקים וזרחון חלבונים עשוי להיות אפשרי בעתיד.

פרוטוקול SiMPull מכיל מספר שלבים קריטיים הנדרשים כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה. לדוגמה, הפרוטוקול כולל הכנה משוכללת של זכוכית כיסוי. כיסויי תחריט פיראנה מנקה ביסודיות את הזכוכית ומגבירים את קבוצות ההידרוקסיל וההידרופיליות, הדרושים כדי לייעל את פני השטח של הכיסוי. לאחר מספר שטיפות עם ממיסים אורגניים, טיפול KOH מספק קבוצות הידרוקסיל נוספות לאמינוסילניזציה 13,23, אשר מצפה את הכוס בקבוצות אמין עבור PEG וקשירת ביוטין-PEG. ניקוי או פונקציונליזציה לא תקינים בכל אחד מהשלבים הללו תפריע למשיכת חלבון כלפי מטה. שליטה על היחס הטוחן של PEG:biotin-PEG, יחד עם ריכוז ליזט, הם גורמים מרכזיים בהשגת צפיפות IP מתאימה של חלבון על מצע SiMPull. כמו בכל בדיקה ביולוגית, קיימת שונות בין תכשירי ליזט תאיים, וניתן לראות הבדלים קטנים בין אחוזי הזרחון בין שכפול הדגימות. לכן, חשוב למדוד את רמות הזרחון של אתרי טירוזין שונים בתוך אותה דגימה. תא הדגימה המתואר בפרוטוקול זה מספק מערכת לאיסוף נקודות נתונים רבות בסשן הדמיה אחד ומאפשר ממוצע על פני ניסויי SiMPull מרובים.

בצד רכישת התמונה, חשוב לקבל את הדגימה הפידוקיאלית כדי להבטיח שכבת-על מדויקת של הערוץ; אחרת, קולוקליזציה לא תהיה מדויקת. חשוב גם למטב את עוצמת הלייזר ואת הגדרות המצלמה כדי למקסם את האות לרעש ובמקביל למזער את הלבנת התמונות. לבסוף, בעוד שמערך הדגימות דורש כמות קטנה של דגימה וריאגנטים, הנפחים הנמוכים רגישים לאידוי במהלך הפעלת ההדמיה. חשוב לבדוק מעת לעת את מערך הדגימות (כ-30-45 דקות) ולהוסיף מאגר לפי הצורך כדי למנוע ייבוש דגימות.

הפרוטוקול הנוכחי הדגים את השימוש ב- SiMPull לכימות מצבי זרחון של קולטן הממברנה. בעודה מתמקדת ב-EGFR, ניתן ליישם את הגישה על קולטני פני תאים אחרים ועל חלבונים תוך-תאיים וקומפלקסים של חלבונים, כל עוד קיימים נוגדנים מתאימים. שימוש פוטנציאלי נוסף עבור SiMPull הוא לחקור את התוכן ואת מצב הזרחון של עיבויים מופרדים פאזה. בנוסף, SiMPull יכול לשמש למדידת PTMs אחרים, כגון ubiquitination. לכן, SiMPull מספק כלי ייחודי לביולוגים של התא לחקור PTMs על חלבונים שלמים ולתאם דפוסי PTM עם התוצאות התאית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35GM126934, R01AI153617, ו- R01CA248166 ל- DSL. EMB נתמך באמצעות תוכנית ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) ו- JAR על ידי תוכנית UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). אנו מודים על השימוש במשאב המשותף של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת ניו מקסיקו, הנתמך על ידי NIH P30CA118100. אנו רוצים להודות לד"ר אנקור ג'יין ולטאקיג'יפ הא, שהפיתוח המקורי שלהם של SiMPull היווה השראה לעבודה זו.
כתובת נוכחית של ES-C: קבוצת אימונודינמיקה, המעבדה לאימונולוגיה אינטגרטיבית של סרטן, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, בת'סדה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 184
בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter