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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.

Abstract

La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l'eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L'imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all'imaging. L'ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L'attuale protocollo fornisce il codice per l'analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all'interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.

Introduction

La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi 1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell'eterogeneità della fosforilazione del recettore, sia in abbondanza che nei modelli specifici di fosfotirosina che possono fornire un mezzo per manipolare le uscite di segnalazione dettando la composizione del signalosoma 3,4,5,6,7. Tuttavia, ci sono limitazioni nei metodi attuali per interrogare la fosforilazione delle proteine. L'analisi Western blot è eccellente per descrivere le tendenze della fosforilazione delle proteine, ma è semi-quantitativa8 e non fornisce informazioni sull'eterogeneità del sistema perché migliaia o milioni di recettori sono mediati insieme. Mentre i western blot consentono di sondare un campione utilizzando anticorpi fosfo-specifici contro tirosine specifiche, non possono fornire informazioni sui modelli di fosforilazione multisito all'interno della stessa proteina. La fosfoproteomica quantitativa riporta l'abbondanza di fosfotirosina, ma ci sono limitazioni al rilevamento della fosforilazione multisito, poiché i residui di interesse devono essere localizzati all'interno dello stesso peptide (tipicamente 7-35 amminoacidi) generato dalla digestione enzimatica 9,10,11.

Per superare i limiti sopra menzionati, il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato adattato per quantificare gli stati di fosforilazione dei recettori intatti a livello di singola molecola. SiMPull è stato dimostrato per la prima volta come un potente strumento per interrogare complessi macromolecolari da Jain et al.12,13. In SiMPull, i complessi macromolecolari sono stati immunoprecipitati (IP) su coverslip di vetro funzionalizzati con anticorpi e quindi analizzati attraverso la microscopia a singola molecola per il numero di subunità proteiche e co-IP con componenti complessi12. Una modifica di Kim et al.14, chiamata SiMBlot, è stata la prima a utilizzare una variazione di SiMPull per analizzare la fosforilazione delle proteine denaturate. Il protocollo SiMBlot si basa sulla cattura di proteine di superficie cellulari biotinilate utilizzando coverslip rivestiti con NeutrAvidin, che vengono quindi sondati per la fosforilazione con l'etichettatura degli anticorpi fosfo-specifici14. Nonostante questi progressi, erano necessari miglioramenti per rendere la quantificazione della modificazione post-traduzionale più robusta e applicabile a una gamma più ampia di proteine.

Il presente protocollo descrive un approccio SiMPull ottimizzato che è stato utilizzato per quantificare i modelli di fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico intatto (EGFR) in risposta a una serie di condizioni del ligando e mutazioni oncogeniche15. Mentre questo lavoro si concentra sull'EGFR, questo approccio può essere applicato a qualsiasi recettore di membrana e proteine citosoliche di interesse (POI), per le quali sono disponibili anticorpi di qualità. Il protocollo include passaggi per ridurre l'autofluorescenza del campione, un design dell'array di campioni che richiede un volume minimo del campione con preparazione simultanea fino a 20 campioni e l'ottimizzazione delle condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi. Sono stati sviluppati algoritmi di analisi dei dati per il rilevamento e la quantificazione di proteine fosforilate a singola molecola.

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Protocol

1. Preparazione coverslip

NOTA: Per questo passaggio, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), che includono un doppio strato di guanti in nitrile, occhiali di sicurezza o visiera e un camice da laboratorio.

  1. Eseguire l'incisione piranha per rimuovere i detriti organici dal vetro.
    ATTENZIONE: La soluzione di Piranha è un forte agente ossidante corrosivo e altamente reattivo a contatto con materiali organici. La reazione con detriti organici è esotermica e potenzialmente esplosiva. Pertanto, la procedura deve essere eseguita in una cappa chimica con l'anta abbassata. La vetreria Pyrex è necessaria per gestire la soluzione di piranha.
    1. Preparare lo spazio di lavoro all'interno di una cappa aspirante chimica. Disporre i coverslip senza sovrapposizioni sul fondo di un bicchiere di vetro da 4 L, il becher "a reazione" e posizionare il becher di reazione su una piastra riscaldante con calore delicato. Lasciare scaldare la vetreria per 10 minuti. Posizionare un becher di vetro "di scarto" da 1 L con 500 mL di ddH2O prossimale al becher di reazione.
    2. Aggiungere lentamente 49 mL di acido solforico 12 N (H2SO4) al becher di reazione con una pipetta sierologica di vetro. Risciacquare la pipetta nel becher di scarto prima dello smaltimento.
    3. Aggiungere 21 mL di perossido di idrogeno al 30% (H2O2) a goccia con una pipetta sierologica di vetro al becher di reazione. Distribuire lentamente le goccioline H2O2 in modo uniforme sul fondo del pallone di reazione per evitare la tempra localizzata della reazione di incisione piranha. Risciacquare la pipetta nel becher di scarto prima dello smaltimento.
      ATTENZIONE: aggiungere sempre H2O2 in H2SO4 e mai viceversa.
    4. Piranha incide le coperture per 30 minuti. Agitare delicatamente il contenuto del becher di reazione ogni 5 minuti.
    5. Spegnere la soluzione di piranha versando il contenuto del becher di scarto nel becher di reazione. Trasferire il liquido lentamente lungo la parete del becher di reazione per ridurre al minimo gli schizzi. Rimuovere il becher di reazione dalla piastra di cottura.
    6. Quando la reazione viene spenta e raffreddata, versare nuovamente la soluzione di piranha nel becher di scarto per la neutralizzazione senza rimuovere le coperture incise dal becher di reazione.
    7. Neutralizzare la soluzione piranha con l'aggiunta graduale di una base debole. Ad esempio, utilizzare una massa eccessiva di 20 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3) / 100 mL di soluzione di piranha.
      ATTENZIONE: Non conservare le soluzioni di piranha in contenitori sigillati per rifiuti. La soluzione deve essere sempre neutralizzata prima dello smaltimento. La reazione di neutralizzazione produce bolle vigorose e può essere esplosiva se non controllata dall'aggiunta graduale della base debole.
    8. Mescolare la soluzione neutralizzata con un'asta di vetro e lasciarla reagire per 2 ore. Aumentare il pH a >4 e smaltire la soluzione.
    9. Tra le aggiunte di base debole alla soluzione di piranha, trasferire i coverslips incisi dal becher di reazione in un imbuto Buchner con un'asta di agitazione in vetro e risciacquare per 5 minuti in ddH2O in esecuzione.
      NOTA: Procedere immediatamente al passaggio successivo o conservare le coperture incise piranha per un massimo di 2 settimane in ddH2O in un barattolo di vetro sigillato o in una capsula di Petri (avvolgere con pellicola sigillante, vedere Tabella dei materiali).
  2. Bagnare le coperture in solventi organici seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare le coperture in un barattolo di vetro Coplin (vedere Tabella dei materiali) e coprire con metanolo (CH3OH). Sigillare il coperchio al barattolo con pellicola sigillante e bagno-sonicate per 10 minuti. Versare con cura il metanolo dal barattolo Coplin in una bottiglia di vetro.
    2. Riempire il barattolo Coplin con acetone (C3H6O), sigillare il coperchio e bagnare per 10 minuti. Versare con cura l'acetone dal barattolo Coplin in una bottiglia di vetro.
      ATTENZIONE: il metanolo è infiammabile e acutamente tossico. Utilizzare in una cappa aspirante chimica. L'acetone è infiammabile e irritante. Pertanto, maneggiarlo e conservarlo in vetro e utilizzarlo in una cappa aspirante chimica. Smaltire come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: Metanolo e acetone possono essere riutilizzati fino a cinque volte ciascuno.
  3. Attivare la superficie coverslip per la funzionalizzazione del silano.
    1. Bagno-sonicato con idrossido di potassio 1 M (KOH) per 20 min. Versare con attenzione il KOH dal barattolo Coplin in un tubo conico da 50 ml per il riutilizzo.
      ATTENZIONE: KOH è corrosivo e irritante. Utilizzare in una cappa aspirante chimica e non conservare in vetro. Conservalo in tubi di polipropilene. Smaltire come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: KOH può essere riutilizzato fino a cinque volte.
    2. Risciacquare due volte con ddH2O. Scolare ddH2O dai coperchi, quindi riscaldare ogni coverslip agitando la fiamma di un bruciatore Bunsen per eliminare tutta l'umidità superficiale. Posizionare le coperture in un barattolo coplin asciutto.
  4. Eseguire l'aminosilanizzazione coverslip.
    1. Preparare la soluzione di aminosilano mescolando 69,4 mL di metanolo con 3,6 ml di acido acetico (CH3COOH) in un matraccio conico. Aggiungere 720 μL di N-(2-amminoetil)-3-amminopropiltrimetossisilano (aminosilano) e mescolare bene (vedere Tabella dei materiali).
      ATTENZIONE: l'acido acetico è infiammabile e corrosivo. Maneggiare con pipette di vetro e conservare in vetro. Lavora con acido acetico in una cappa chimica. L'aminosilano è un rischio di inalazione acutamente tossico, un sensibilizzante e un irritante. È dannoso per la vita acquatica. Utilizzare in una cappa aspirante chimica. Smaltire le sostanze chimiche come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
      NOTA: L'aminosilano è fotosensibile e idrolizza rapidamente in acqua. Tutti i passaggi con questo reagente devono essere eseguiti in condizioni di luce minime per mantenere l'attività. Pulire la bottiglia con azoto gassoso e applicare la pellicola sigillante prima di conservarla in un essiccatore scuro. Sostituire ogni 6-9 mesi.
    2. Aggiungere immediatamente la soluzione di aminosilano al barattolo coplin. Coprire e applicare il film sigillante, continuando a proteggere dalla luce.
    3. Incubare i coverslip nella soluzione di aminosilano per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (RT). Bath-sonicate per 1 minuto e poi incubare per altri 10 minuti. Versare con attenzione la soluzione di aminosilano in un contenitore per rifiuti designato per CH3OH con tracce di aminosilano e CH3COOH.
    4. Risciacquare i coperchi con metanolo e versare la soluzione in un contenitore per rifiuti designato per il metanolo.
    5. Risciacquare le coverslip tre volte per 2 minuti ciascuna con ddH2O. Scolare le coperture, tamponare l'umidità in eccesso e asciugare completamente all'aria per 10 minuti.
  5. Eseguire la preparazione dell'array/funzionalizzazione biotina-PEG dei coverslip.
    1. Preparare 1 M NaHCO3 (pH 8,5) di stock di lavoro sciogliendo 84,5 mg di NaHCO3 in 1 mL di ddH2O. Per la concentrazione finale di 10 mM NaHCO3, diluire 1 M NaHCO3 in ddH2O (1:100).
    2. Disegna una griglia sui coperchi aminosilanizzati asciutti con una penna barriera idrofoba (vedi Tabella dei materiali) e attendi che l'inchiostro si asciughi. Scrivi un identificatore sulla copertina per contrassegnare l'orientamento corretto. Posizionare i coverslips in una camera umidificata.
      NOTA: l'array deve essere composto da 16-20 quadrati, di circa 4 mm x 4 mm.
    3. Per produrre la soluzione di biotina-PEG succinimidyl valerate (biotin-PEG)/mPEG succinimidyl valerate (mPEG), in primo luogo, rimuovere mPEG e biotina-PEG (vedere Tabella dei materiali) dal congelatore ed equilibrare a RT. Aggiungere 153 mg di mPEG e 3,9 mg di biotina-PEG (~1:39 biotina-PEG:mPEG) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere in 609 μL di 10 mM NaHCO3 mediante un tubo delicato. Centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto a RT per rimuovere le bolle.
      NOTA: L'emivita di idrolisi del succinimidyl valerate in pH 8,5 tampone è di ~ 30 min. Dopo aver aggiunto il buffer a mPEG, procedere con i seguenti passaggi il più rapidamente possibile. Questo passaggio è fondamentale.
    4. Applicare la soluzione di biotina-PEG/mPEG per coprire completamente ogni quadrato negli array di coverslip, in genere 10-15 μL per quadrato. Non lasciare che il liquido superi lo spazio definito. Conservare le coperture in una camera di umidità al buio per 3-4 ore a RT.
    5. Lavare le coperture con abbondanti quantità di acqua immergendole sequenzialmente in 3 bicchieri di vetro da 250 ml riempiti con ddH2O per 10 s ciascuno.
    6. Scaccia tutta l'umidità dai coperchi con azoto gassoso. Conservare le coperture back-to-back in un tubo conico da 50 mL riempito di azoto avvolto con pellicola sigillante a -20 °C.
      NOTA: Procedere immediatamente al passaggio 2 o conservare le coperture a -20 °C per un massimo di 1 settimana prima dell'uso.

2. Preparazione del lisato SiMPull

ATTENZIONE: I DPI richiesti per le fasi rimanenti del protocollo sono guanti in nitrile, occhiali di sicurezza e camici da laboratorio.

NOTA: I lisati sono stati preparati dalle cellule CHO aderenti che esprimono EGFR-GFP. Le cellule sono state placcate in una coltura tissutale di 60 mm (TC60) durante la notte12,13. Le cellule CHO sono state coltivate in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale, l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e 500 ng/ ml di geneticaina (vedere Tabella dei materiali). Possono essere utilizzate anche altre linee cellulari aderenti o celle di sospensione.

  1. Placcare le celle seguendo i passaggi seguenti.
    1. Lavare il piatto di coltura (contenente le cellule) con 1 mL di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 1x Tripsina e incubare per 5 minuti a 37 °C per staccare le cellule. Utilizzando una pipetta, trasferire le celle staccate dal piatto a un tubo centrifugo da 1,5 ml.
    2. Prendere 10 μL di tripano blu e mescolare con 10 μL di sospensione cellulare in un tubo centrifugo separato. Contare le celle utilizzando 10 μL della miscela cellulare in un contatore automatico di celle, secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    3. Piastra 8 x 105 celle durante la notte in una capsula di Petri TC60. Piatto un piatto per condizione.
      NOTA: Per il presente studio, le cellule non sono state trattate o trattate con Pervanadate ed EGF come descritto nel passaggio 2.4.1.
  2. Preparare le seguenti soluzioni per la preparazione del lisato cellulare.
    1. Preparare 1 PBS ghiacciato (pH 7,4).
    2. Preparare il tampone di lisi, una soluzione di detergente non ionico all'1% non degenerante (vedi Tabella dei materiali) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) e 150 mM NaCl integrato con Proteasi/Inibitore della Fosfatasi (PPI) (1:100 da magazzino). Posizionare il tubo su un nutator e lasciare che il tampone si mescoli per 15 minuti. Conservare la soluzione preparata sul ghiaccio.
    3. Preparare il tampone di Tyrode per una concentrazione finale di 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM di glucosio e 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) (vedere Tabella dei materiali). Riscaldare la soluzione a 37 °C.
  3. Preparare il controllo positivo per la fosforilazione - 1 mM di trattamento con pervanadato.
    NOTA: questo passaggio è facoltativo. Pervandate è la forma perossidata di vanadato,un inibitore della proteina tirosina fosfatasi16. Prevenire la defosforilazione delle proteine inibendo l'attività della fosfatasi si traduce in un campione altamente fosforilato.
    1. Preparare uno stock di 200 mM di ortovanadato di sodio attivato (Na3VO4).
      1. Per preparare una soluzione da 100 ml, aggiungere 3,89 g di Na3VO4 (vedere Tabella dei materiali) a 90 mL di ddH2O e sciogliere mescolando. Regolare il pH a 10 aggiungendo HCl o NaOH a goccia. L'aggiunta di HCl renderà la soluzione gialla.
      2. Portare il volume a 100 ml con ddH2O. Far bollire la soluzione riscaldandola nel microonde. Dopo l'ebollizione, la soluzione sarà incolore.
      3. Raffreddare la soluzione a RT e regolare nuovamente il pH a 10. Ripetere l'ebollizione, il raffreddamento e la regolazione del pH altre due o quattro volte, fino a quando il pH si stabilizza a 10. Aliquota e conservare a -20 °C.
    2. Preparare uno stock di 30 mM pervanadato (PV) mescolando 20,4 μL di 3% H2O2 con 100 μL di 200 mM Na3VO4 e 546,8 μL di ddH2O (concentrazioni equimolari di H2O2 e Na3VO4 attivato). Incubare al buio a RT per 15 min.
    3. Preparare 1 mM PV nel buffer di Tyrode. Per una soluzione da 10 mL, aggiungere 0,33 mL di stock fotovoltaico da 30 mM a 9,67 mL di tampone Tyrode a 37 °C. Trattare immediatamente le cellule.
    4. Lavare le cellule una volta con 3 ml di tampone di Tyrode. Aggiungere 3 mL di 1 mM PV nel tampone di Tyrode alle cellule e incubare per 15 minuti a 37 °C.
  4. Eseguire la stimolazione del ligando.
    1. Stimolare le cellule con il ligando di interesse utilizzando la concentrazione, il tempo e la temperatura appropriati. Per la massima stimolazione EGFR, incubare con 1 mL di 50 nM di fattore di crescita epidermico (EGF, vedi Tabella dei materiali) + 1 mM di PV nel tampone di Tyrode per 5 minuti a 37 °C.
  5. Eseguire la lisi cellulare.
    1. Dopo il trattamento cellulare desiderato, posizionare il piatto su ghiaccio e lavare con 1x PBS ghiacciato. Rimuovere completamente l'intero volume di PBS utilizzando una pipetta.
    2. Aggiungere 180 μL di tampone di lisi (punto 2.2.2) alla piastra. Utilizzare un raschietto cellulare per tirare il tampone attorno alla piastra per coprire completamente le celle. Applicare una pressione ferma e costante con il raschietto cellulare su tutta la superficie coltivata per lisare completamente le cellule.
      NOTA: Il volume del tampone di lisi deve essere mantenuto al minimo per garantire un'elevata concentrazione proteica.
    3. Pipettare le celle lisate e trasferirle in un tubo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice i lisati ogni 5 min.
      NOTA: se il POI è costituito da più subunità o è sensibile alla dissociazione, non vorticare i lisati.
    4. Centrifugare le cellule lisate a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 ml utilizzando una pipetta. Questo contiene il lisato proteico totale.
    5. Riservare 10 μL del lisato e diluirlo in 90 μL del tampone di lisi per l'analisi del saggio colorimetrico bicinchoninico (BCA)17. Conservare il lisato proteico totale rimanente a -80 °C.
    6. Determinare la concentrazione totale di proteine lisate utilizzando l'analisi BCA (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: i lisati proteici totali possono essere preparati il giorno dell'esperimento e utilizzati freschi o conservati come aliquote monouso a -80 °C per un massimo di 12 settimane. Non congelare/scongelare.

3. Funzionalizzazione dell'array con l'anticorpo biotinilato

  1. Preparare le soluzioni seguenti.
    1. T50 Buffer, una soluzione di 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 50 mM NaCl. La soluzione è stabile per 1 mese a RT.
    2. T50-BSA integrando il tampone T50 con 0,1 mg/mL di BSA. Conservare la soluzione preparata sul ghiaccio.
    3. 10 mg/mL di boroidruro di sodio (NaBH4) in 1x PBS. Preparare questo immediatamente prima dell'uso.
    4. 0,2 mg/mL di NeutrAvidin (vedere Tabella dei materiali) in tampone T50.
      ATTENZIONE: NaBH4 è un agente riducente ed è infiammabile. Pulire sempre il contenitore con azoto gassoso dopo l'uso e conservarlo in un essiccatore.
  2. Funzionalizzare l'array con l'anticorpo biotinilato.
    1. Rimuovere gli array funzionalizzati PEG-biotina dal congelatore ed equilibrare il tubo conico in RT prima dell'apertura. Posizionare il coverslip con l'array orientato verso l'alto su un piatto di coltura tissutale (TC100) rivestito con pellicola sigillante.
      NOTA: ridurre al minimo l'illuminazione dall'alto. Tutte le soluzioni dovrebbero "perline" sui quadrati definiti dall'array idrofobo. Aggiungere un volume appropriato di soluzione per coprire completamente ogni quadrato (in genere 10-15 μL) e non lasciare che il liquido trabocchi nello spazio definito. Per rimuovere rapidamente i liquidi, utilizzare una linea di vuoto interna collegata a un pallone sottovuoto per catturare i rifiuti. Lasciare che NaBH4 degasi per 1 ora prima dello smaltimento lasciando il tubo aperto nella cappa dei fumi chimici. Il trattamento con NaBH4 è necessario per ridurre l'autofluorescenza di fondo, riducendo così i rilevamenti di singole molecole false positive.
    2. Trattare ogni quadrato dell'array con 10 mg/mL di NaBH4 in 1x PBS per 4 minuti a RT. Lavare tre volte con PBS.
    3. Incubare ogni quadrato per 5 minuti con 0,2 mg/mL di NeutrAvidin in T50. Lavare tre volte con T50-BSA.
      NOTA: NeutrAvidin si lega a PEG-biotina e fornisce un sito di legame per gli anticorpi biotinilati 12,13,15.
    4. Incubare ogni quadrato per 10 minuti con 2 μg/mL di anticorpo biotinilato POI-specifico in T50-BSA; lavare tre volte con T50-BSA.
      NOTA: Il presente protocollo utilizza IgG anti-EGFR biotinilato (vedi Tabella dei materiali) per catturare EGFR-GFP.

4. SiMPull di POI da lisati a cellule intere

NOTA: posizionare la parabola TC100 degli array SiMPull funzionalizzati sul ghiaccio per il resto della preparazione SiMPull. Questo passaggio è il pull-down di un POI dal lisato proteico totale. Il lisato non deve essere riutilizzato dopo lo scongelamento.

  1. Preparare le soluzioni seguenti.
    1. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA)/0,1% di glutaraldeide (GA) in 1x PBS.
      ATTENZIONE: PFA e GA sono fissativi chimici tossici e potenziali agenti cancerogeni. Indossare DPI. Smaltire le sostanze chimiche come rifiuti pericolosi secondo le normative e le linee guida locali.
    2. Preparare 10 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  2. Scongelare e mescolare il lisato pipettando delicatamente su e giù. Continua sul ghiaccio.
  3. Diluire 1 μL del lisato in 100 μL di T50-BSA/PPI ghiacciato.
    NOTA: se necessario, determinare il fattore di diluizione appropriato del lisato proteico totale applicando una serie di diluizioni all'array. La densità ottimale dei recettori SiMPull per area array è 0,04-0,08/μm2. Le diluizioni del lisato possono essere valutate nella fase 6 (Analisi dei dati).
  4. Incubare il lisato sull'array per 10 minuti; quindi lavare quattro volte con T50-BSA/PPI ghiacciato.
  5. Diluire l'anticorpo anti-fosfotirosina coniugato AF647 (vedere Tabella dei materiali) in T50-BSA/PPI ghiacciato e incubare sull'array per 1 ora.
    NOTA: Nel presente protocollo, un pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG viene utilizzato per identificare la popolazione fosforilata di EGFR-GFP. L'uso di anticorpi direttamente etichettati elimina la necessità di anticorpi secondari, aumentando le opzioni di etichettatura e migliorando la coerenza dei risultati. Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono essere ottenuti da fonti commerciali. Se non disponibili in commercio, gli anticorpi possono essere etichettati su misura utilizzando tecniche di bioconiugazione standard e sono disponibili kit di bioconiugazione commerciali. Ogni lotto di anticorpi marcati fluorescentemente deve essere testato per condizioni di etichettatura ottimali eseguendo SiMPull per misurare una curva di dose e trovare il punto di saturazione.
  6. Lavare sei volte con T50-BSA ghiacciato per un totale di 6-8 min.
  7. Lavare due volte con 1x PBS ghiacciato.
  8. Incubare l'array con una soluzione al 4% di PFA/0,1% ga per 10 minuti per prevenire la dissociazione degli anticorpi.
  9. Lavare due volte per 5 minuti ciascuno con 10 mM Tris-HCl, pH 7.4/PBS per inattivare i fissativi.
    NOTA: per gli esperimenti che utilizzano più di un anticorpo (ad esempio, rilevando più siti di fosfotirosina), ripetere i passaggi 4.5-4.9. Vedere il passo 6.2.9 per informazioni sulla determinazione dell'ostacolo sterico tra due anticorpi.

5. Acquisizione di immagini

NOTA: l'acquisizione di immagini a singola molecola viene eseguita utilizzando un obiettivo TIRF 150x e uno splitter di immagini che cattura ciascun canale spettrale in un quadrante specifico della telecamera emCCD (vedere Tabella dei materiali). Le immagini di calibrazione vengono prima acquisite per consentire la registrazione del canale e la calibrazione del guadagno della telecamera con una griglia di allineamento dei canali nanopatterned (nanogrid) che contiene 20 x 20 array di fori da 200 ± 50 nm a una distanza intraforale di 3 ± 1 μm (dimensione totale ~ 60 μm × 60 μm).

  1. Eseguire la registrazione del canale seguendo i passaggi seguenti.
    NOTA: è necessaria una registrazione accurata del canale per calcolare correttamente la colocalizzazione degli emettitori. Questo passaggio è fondamentale.
    1. Pulisci l'obiettivo petrolifero e deposita una goccia di petrolio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul palco per l'imaging. Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrarsi sul modello di griglia.
      NOTA: Le immagini con la nanogriglia vengono acquisite utilizzando la luce trasmessa, che passa attraverso la nanogriglia e viene rilevata in tutti i canali spettrali. In alternativa, si possono usare perline multifluorescenti che emettono fluorescenza rilevata in ciascun canale. L'acquisizione delle immagini dovrà essere ottimizzata in base a ciascuna configurazione del microscopio.
    2. Acquisisci una serie di 20 immagini della griglia. Assicurarsi che i pixel non siano saturi. Salvare la serie di immagini come "Fiducial".
    3. Sfoca la nanogriglia per creare un modelloAiry 18. Acquisisci una serie di 20 immagini per le calibrazioni del guadagno. Salva l'immagine come "Guadagno".
    4. Acquisire una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera impedendo a tutta la luce di andare alla fotocamera. Salva l'immagine come "Sfondo".
  2. Acquisisci immagini SiMPull.
    NOTA: prima di creare l'imaging dell'array coverslip, sostituire la soluzione Tris con T50-BSA ed equilibrare l'array in RT.
    1. Pulire l'obiettivo petrolifero e depositare olio aggiuntivo sull'obiettivo. Fissare l'array coverslip sul palco del microscopio.
    2. Ottimizza la potenza di eccitazione di ogni fluoroforo, l'angolo TIRF e il tempo di integrazione della telecamera. L'obiettivo è quello di ottenere il più alto rapporto segnale-rumore riducendo al minimo il fotosbiancamento del campione. Registrare la potenza del laser per coerenza nelle misurazioni future.
      NOTA: il presente studio ha utilizzato un tempo di esposizione di 300 ms per il canale rosso lontano e 1 s per il canale verde. Il laser a 642 nm è stato utilizzato con una potenza laser di circa 500 μW, mentre il laser a 488 nm è stato utilizzato a 860 μW, misurato prima della lente valvolare.
    3. Acquisire immagini per ogni campione. Immagina prima il canale rosso lontano, seguito da ogni fluoroforo a lunghezza d'onda inferiore per ridurre il fotosbiancamento. A causa del basso volume utilizzato per ciascun campione, controllare il livello del buffer ogni 30-45 minuti e ricostituire secondo necessità.

6. Analisi dei dati

  1. Scarica i codici demo.
    NOTA: il codice demo fornito e i set di dati di esempio illustrano l'intero flusso di lavoro di analisi dei dati (file di codifica supplementari 1-4). I requisiti di sistema elencati in SiMPullMain.m si trovano nel file di codifica supplementare 1.
    1. Decomprimi e salva in una directory personale Documents/MATLAB (MacOS/Linux) o Documents\MATLAB (Windows).
      NOTA: in questo modo vengono generate quattro nuove cartelle: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Apri il file "ReadMe_Setup.txt" che si trova nella cartella SiMPull_class.
    3. Installa MATLAB e MATLAB Toolboxes: Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning toolbox.
    4. Installare DipImage19 secondo le istruzioni per il download.
    5. Installare il pacchetto di analisi a singola molecola "smite" come descritto nella ReadMe_setup.txt.
      NOTA: "smite" è disponibile nel repository GitHub (vedere Tabella dei materiali).
    6. Apri SiMPullMain.m, che si trova nella cartella SiMPull_class, trascinando il file nella finestra MATLAB.
    7. Cambia la directory in ...\MATLAB\Sample Data\ facendo clic sull'icona Cerca cartella e selezionando la cartella.
  2. Panoramica delle fasi di trattamento dei dati
    1. Eseguire SiMPullMain.m - seguendo le istruzioni per ogni sezione. Eseguire ogni sezione singolarmente posizionando il cursore in tale sezione e facendo clic sull'icona Esegui sezione.
      NOTA: i passaggi generali per l'analisi dei dati sono descritti in questa sezione. Istruzioni dettagliate si trovano nel codice SiMPullMain.m allegato.
    2. Eseguire la sezione "Inizializzazione" per impostare il percorso per definire i canali spettrali e le dimensioni dell'immagine.
    3. Esegui la sezione "Trova guadagno e offset della fotocamera" per convertire il guadagno della fotocamera in fotoni utilizzando i set di dati Guadagno e Sfondo.
    4. Eseguire la sezione "Registrazione canale" per calcolare la trasformazione media ponderata locale utilizzata per la registrazione delle immagini.
    5. Formattare e curare i dati. Esegui la sezione "Unisci canali sequenziali in un'immagine quadrupla". Esegui "Rimuovi frame danneggiati".
    6. Esegui la sezione "Adatta singole molecole e trova molecole sovrapposte".
      NOTA: questa sezione esegue più funzioni per localizzare singole molecole in ciascun canale e determinare gli eventi di colocalizzazione tra canali spettrali.
    7. Per determinare il numero minimo di fotoni per il vero adattamento GFP, eseguire la sezione "Ottimizza soglia minima di fotoni". Questo è un processo iterativo.
      1. Innanzitutto, imposta smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] ed eseguire la sezione. Seleziona i file "Dati vuoti" quando richiesto. Ripetere l'operazione con i file "CHO-EGFR-GFP".
      2. Selezionare un valore di soglia minimo appropriato confrontando i due istogrammi. Imposta smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] ed eseguire nuovamente la sezione.
    8. Eseguire la sezione "Calcola percentuale di GFP si adatta positivamente al segnale FR" per correggere le localizzazioni in background e calcolare i valori finali.
    9. Eseguire l'opzione 1 (passaggio 6.2.10) o l'opzione 2 (passaggio 6.2.11) in base alle esigenze sperimentali.
    10. Opzione 1: Correggere il numero di recettori disponibili sulla membrana plasmatica per il legame del ligando, come descritto nel riferimento15.
      1. In primo luogo, etichettare i recettori di superficie con livelli saturanti di colorante fluorescente NHS Ester (NHS-AF647, vedere Tabella dei materiali). Quindi eseguire un esperimento SiMPull per determinare la percentuale di localizzazione GFP che viene colocalizzata con AF647.
        NOTA: Questo fornisce una stima della frazione di recettori disponibili per l'etichettatura NHS e il rapporto tra i recettori sulla superficie (SR).
      2. Applicare la correzione SR nel calcolo finale: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, dove NGFP è il numero corretto di localizzazioni GFP, NBG è il numero di localizzazione in background e NLOC è localizzazioni totali.
        NOTA: Nel presente esempio, questa correzione non viene applicata perché Pervanadato è permeabile alla membrana16 e, pertanto, l'azione dell'inibizione della fosfatasi non è limitata ai recettori di superficie.
    11. Opzione 2: per le misurazioni di fosforilazione multisito, considerare il potenziale di ostacolo sterico quando vengono utilizzati due anticorpi.
      NOTA: l'ostacolo sterico può causare una riduzione della percentuale osservata di recettori fosforilati per l'anticorpo 1 in presenza di anticorpo 2 (P12), rispetto all'anticorpo 1 da solo (P1).
      1. Utilizzare SiMPull per determinare P1 e P12 e calcolare il fattore di correzione per l'ostacolo sterico, seguendo il riferimento15 precedentemente pubblicato.

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Representative Results

Un cartone animato raffigurante il processo SiMPull è mostrato nella Figura 1A. I coverslip sono funzionalizzati utilizzando NeutrAvidin come ancoraggio per gli anticorpi anti-EGFR biotinilati per catturare EGFR-GFP dai lisati proteici totali. Dopo aver lavato via le proteine non legate, i recettori fosforilati sono etichettati con un anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY)15. La Figura 1B mostra un'immagine dell'array idrofobo, in cui è possibile preparare e visualizzare più campioni sullo stesso coverslip. Un vantaggio di questo portacampioni è che sono necessari volumi di campione minimi di ~ 10 μL. Il coverslip può essere ripreso posizionandolo direttamente sul palco del microscopio. Tuttavia, è utile stabilizzare il coverslip utilizzando un supporto coverslip. Il supporto coverslip mostrato nella Figura 1B è stato creato utilizzando una stampante 3D e il progetto è fornito nel file di codifica supplementare 5. L'autofluorescenza dell'inchiostro idrofobo è una guida utile per trovare il piano focale del campione (Figura 1C). Un esempio di immagine raw multicanale è mostrato nella Figura 1D. Una sovrapposizione dei canali verde grezzo e rosso lontano è mostrata nella Figura 1E.

La Figura 2 delinea il flusso di lavoro di analisi e fornisce dati rappresentativi. L'acquisizione dei dati inizia innanzitutto con l'acquisizione di fiduciali per la registrazione del canale, che viene utilizzato per sovrapporre i dati dei singoli canali spettrali (Figura 2A). Le immagini a campo luminoso vengono scattate utilizzando un modello a nanogriglia che passa la luce bianca e viene rilevato in ciascun canale spettrale dello splitter dell'immagine (non mostrato). Il canale verde funge da canale di riferimento e il canale rosso lontano è il canale spostato. La trasformazione media ponderata locale viene calcolata utilizzando la funzione fitgeotrans20 in MATLAB e viene utilizzata per spostare le coordinate rosso lontano nel fotogramma delle coordinate del canale verde. Questa trasformazione utilizza un modello polinomiale di secondo ordine in ogni punto di controllo. Vengono quindi acquisiti i dati multicanale dell'array SiMPull. Questo flusso di lavoro consisteva in un'acquisizione semi-automatizzata, in cui veniva selezionato un ROI iniziale per il quadrato campione specifico e venivano visualizzate tre regioni intorno a quest'area, in modo tale che ogni set di dati contenesse l'immagine quad-view completa da tre ROI indipendenti (Figura 1D). In ogni canale spettrale, le posizioni candidate dell'emettitore vengono trovate applicando una differenza di filtro gaussiano alle immagini e identificando i massimi locali. Le sottoregioni (caselle, Figura 2B) sono disegnate attorno ai massimi locali e i conteggi dei fotoni degli emettitori sono stimati assumendo che ogni sottoregione contenga un solo emettitore. Le sottoregioni che detengono candidati emettitori con conteggi di fotoni superiori a un valore minimo vengono mantenute per il montaggio. Una funzione di diffusione puntiforme gaussiana (PSF) adatta ogni candidato emettitore all'interno di piccole sottoregioni approssimativamente centrate attorno a ciascun emettitore. Le localizzazioni risultanti sono thresholdate in base al conteggio dei fotoni, allo sfondo, al limite inferiore di Cramér-Rao delle coordinate di adattamento, alla varianza PSF (cioè alla larghezza della FPF) e a un valore p che descrive la bontà dell'adattamento del modello PSF. Per ogni canale spettrale viene creata un'immagine gaussiana, con blob gaussiani di intensità uniforme posti alle coordinate per ogni buon adattamento (Figura 2C). La colocalizzazione viene visualizzata sovrapponendo le immagini gaussiane di ciascun canale spettrale utilizzando la trasformata calcolata dal campione fiduciale (Figura 2D). È importante etichettare fluorescentemente il recettore per l'identificazione poiché esiste ancora un legame non specifico degli anticorpi anti-fosfotirosina alla superficie quando è presente il lisato cellulare. L'EGFR-GFP (canale verde) viene utilizzato per generare una maschera delle posizioni dei recettori e viene conteggiato solo il segnale AF647-anti-PY (canale rosso lontano) all'interno di quella maschera (Figura 2D). Le coppie entro 1 pixel (dimensione pixel 106,7 nm) sono considerate colocalizzate e salvate in un elenco contenente le coordinate del canale di riferimento. La percentuale di AF647 colocalizzata con GFP viene calcolata per determinare la frazione dei recettori fosforilati (Figura 2E).

Esistono diversi passaggi critici per garantire una buona qualità dei dati. Uno di questi sforzi è quello di incubare l'array di coverslip con NaBH4 come descritto nel protocollo per spegnere l'autofluorescenza nel canale verde. Questa autofluorescenza si riferisce al segnale non specifico dovuto a possibili impurità sul vetro, contenente legami π singoli o coniugati21. Tali impurità provengono potenzialmente dall'aminosilano e dai reagenti PEG utilizzati nel processo di funzionalizzazione o dalla polvere dell'aria e tendono a fluorescere nel canale spettrale verde. Nonostante gli sforzi per mantenere il vetro immagazzinato sotto azoto, queste molecole possono anche essere generate attraverso l'ossidazione che si verifica in deposito. NaBH4 è stato utilizzato anche per ridurre la fluorescenza da impurità su vetrini e microarray, compresi quelli con rivestimento silano16. La Figura 3A mostra la riduzione del numero di rilevamenti di fondo che si verificano quando il vetro acidato piranha viene trattato con NaBH4. Mentre NaBH4 riduce drasticamente la fluorescenza di fondo, alcuni emettitori vengono ancora rilevati nel canale verde. È possibile correggere questo problema acquisendo immagini di sfondo da campioni privi di lisato (Figura 3D) e sottraendo il numero medio di localizzazioni di sfondo dai campioni contenenti GFP. La fluorescenza da impurità non è stata rilevata nel canale rosso lontano. Se la densità del recettore è troppo alta, è possibile trovare più emettitori GFP all'interno di un singolo punto limitato alla diffrazione (dati non mostrati). Utilizzando il fotosbiancamento graduale per identificare il numero di GFP per spot, abbiamo scoperto che una densità del recettore compresa tra 0,04-0,08 proteine / μm2 forniva una spaziatura sufficiente tra i singoli emettitori per rimuovere il potenziale di trovare più emettitori per spot12. La densità del recettore può essere ottimizzata variando la quantità di anticorpi IP legati alla superficie del vetro o la quantità di lisato aggiunto. È fondamentale garantire che l'anticorpo mirato al POI venga utilizzato a livelli di saturazione. Si raccomanda di acquisire una curva di concentrazione anticorpale su campioni fosforilati per determinare le condizioni di etichettatura appropriate (Figura 3B). Inoltre, la fosfo-specificità di un anticorpo deve essere convalidata con campioni a riposo e/o trattamento con inibitori della chinasi protein-specifici (Figura 3B). Gli anticorpi si dissociano dal recettore durante la finestra temporale di imaging. Il trattamento del campione con una combinazione di PFA e GA ha impedito la perdita di segnale (Figura 3C).

Infine, è importante ottimizzare i parametri di fitting a singola molecola. Il primo passaggio di "box finding" che identifica i potenziali candidati emettitori (Figura 2B) deve essere generoso per consentire a molti candidati di sottoporsi al Fitting gaussiano. Pertanto, la soglia minima di fotoni per la ricerca di scatole può essere relativamente bassa per catturare tutti gli emettitori reali e alcuni punti di sfondo. È anche importante non impostare le dimensioni della scatola e sovrapporre la tolleranza troppo piccola. Mantenere le dimensioni della scatola entro 5-7 pixel e consentire la sovrapposizione di due pixel è l'ideale per gli emettitori alla densità raccomandata. Dopo la ricerca della scatola, la soglia minima dei fotoni nella fase di raccordo deve essere ottimizzata. Il parametro minimo dei fotoni contribuisce a determinare quali emettitori gaussiani passano come un vero adattamento. Per determinare la soglia minima di fotoni corretta per i veri adattamenti GFP, il codice include una funzione di plottaggio dell'istogramma per esaminare i fotoni / localizzazione sia in background (nessun lisato cellulare) che in campioni contenenti GFP (più lisato cellulare) (Figura 3D). Questo passaggio è importante perché, mentre NaBH4 riduce la quantità di fluorescenza da impurità, non rimuove tutte le localizzazioni di sfondo. La Figura 3D dimostra la necessità di impostare una soglia minima di fotoni per ridurre il numero di rilevamenti da impurità. Per determinare questa soglia, un istogramma delle intensità degli emettitori di fondo viene calcolato dall'imaging di un campione che non è esposto al lisato cellulare (Figura 3D, in alto a sinistra). La maggior parte degli emettitori di fondo sono risultati avere valori inferiori a 475 fotoni. In confronto, il campione contenente veri emettitori GFP ha mostrato una frazione significativa della distribuzione superiore a 475 (Figura 3D, in alto a destra). La soglia viene scelta tramite ispezione per rimuovere il maggior numero possibile di conteggi di sfondo riducendo al minimo la quantità di perdita di segnale dal campione lisato (Figura 3D, riga inferiore). La restante densità di conteggio di fondo a questa soglia è contabilizzata nell'analisi quantitativa.

Figure 1
Figura 1: Panoramica della preparazione del campione. (A) Cartone animato raffigurante l'approccio SiMPull. I coverslip sono funzionalizzati con un anticorpo che riconosce il POI per catturare quel POI dai lisati di cellule intere. Il vetro viene prima rivestito con PEG e biotina-PEG. NeutrAvidin è quindi legata alla biotina-PEG e agisce come un ancoraggio per l'anticorpo anti-POI biotinilato. Le proteine fosforilate vengono quindi rilevate con un anticorpo anti-PY marcato in modo fluorescente. (B) Fotografia del supporto coverslip (rosso) con array coverslip in posizione e montato sullo stadio del microscopio. Gli array multicampionamento vengono generati utilizzando inchiostro idrofobo per creare fino a 20 singoli quadrati di campione su un singolo coperchio di vetro. Il coverslip è di 60 mm x 24 mm. (C) Immagini di esempio dell'autofluorescenza dell'inchiostro idrofobo (magenta) e delle perle fluorescenti (verde). L'autofluorescenza dell'inchiostro idrofobo è una guida utile per trovare il piano focale sulla superficie del coverslip. (D) Esempio di un'immagine di dati grezzi con canali spettrali separati sul chip della fotocamera dallo splitter di immagini Quad-view. Il set di filtri Quad-view comprende i seguenti filtri di emissione: blu (445/45 nm), verde (525/45 nm), rosso (600/37 nm), rosso lontano (685/40 nm). (E) Sovrapposizione grezza di canali verdi e rosso lontano. La casella bianca indica la regione ulteriormente esaminata nella Figura 2B-D. Barra della scala (C-E) = 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Flusso di lavoro di analisi dei dati. (A) La registrazione del canale viene eseguita per la prima volta sulle immagini acquisite dalla nanogriglia. Dopo aver ritagliato i due canali spettrali di interesse (qui, verde e rosso lontano), le immagini fiduciali per ciascun canale sono sovrapposte (a sinistra). L'ingrandimento della casella nell'immagine a sinistra (Inserto) mostra che le immagini non sono ancora veramente registrate. Gli emettitori in ogni canale si adattano a un modello gaussiano e sono localizzati (Registrazione). La localizzazione degli emettitori viene mostrata come cerchi per il canale rosso lontano e croci per il canale verde. Il passaggio finale consiste nell'applicare una trasformata media ponderata locale per spostare le coordinate di localizzazione del canale rosso lontano nel sistema di riferimento del canale verde (Allineato). La trasformata media ponderata locale calcolata viene quindi utilizzata per registrare i dati SiMPull successivi. (B) Immagini rappresentative del canale verde/EGFR-GFP e del canale far-red/AF647-anti-PY. I singoli emettitori sopra il conteggio dei fotoni di sfondo sono identificati e contrassegnati con caselle. (C) Il profilo di emissione all'interno di ciascuna scatola selezionata è adatto a un modello gaussiano e vengono mantenuti gli emettitori che si adattano al modello di una singola FPF fluorofora. (D) Viene creata una maschera dagli emettitori GFP per identificare la posizione di EGFR-GFP (verde). La colocalizzazione di EGFR-GFP e AF647-anti-PY identifica i recettori fosforilati (bianchi). (E) La frazione dei recettori fosforilati è calcolata dai fit colocalizzati EGFR-GFP e AF647-anti-PY. Il grafico a barre confronta il trattamento PV + EGF con le cellule a riposo, mediato per misurazioni multiple. Le barre di errore rappresentano l'errore standard calcolato assumendo una distribuzione binomiale. Barra della scala = 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Passaggi critici per garantire la qualità dei dati. (A) Da sinistra a destra, i primi tre pannelli sono immagini rappresentative dell'autofluorescenza su vetro nelle rispettive condizioni: dopo l'incisione piranha, con PEG e PEG più trattamento NaBH4 (indicato con +). Inoltre, la funzionalizzazione superficiale viene mantenuta dopo il trattamento NaBH4 , come dimostrato dal legame PY99-AF647 non specifico minimo, pur mantenendo un robusto legame di EGFR-GFP dal lisato. (B) Per ogni lotto di anticorpi utilizzati deve essere acquisita una curva di saturazione per garantire un'etichettatura ottimale degli anticorpi. Questa figura mostra la curva di concentrazione per l'etichettatura di EGFR con l'anticorpo fosfotirosina sito-specifico, anti-EGFR-pY1173. La fosforilazione minima viene rilevata nelle cellule non trattate (Riposo, diamante grigio). Come controllo per il legame non specifico, le cellule sono state trattate anche con l'inibitore della chinasi EGFR, Lapatinib, prima di aggiungere 100 nM di EGF (triangolo magenta), che mostra la prevenzione attesa della fosforilazione EGFR. Le barre di errore rappresentano l'errore standard assumendo una distribuzione binomiale. (C) La fissazione del campione con una combinazione di PFA e GA impedisce la dissociazione anticorpale nel tempo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard assumendo una distribuzione binomiale. (D) I falsi positivi sono esclusi selezionando la soglia appropriata per l'adattamento gaussiano. Il confronto dell'istogramma delle intensità di adattamento a una soglia bassa (soglia = 0; superiore) tra lo sfondo (senza lisato) e i dati reali (più lisato cellulare) consente la selezione del valore appropriato (soglia = 475; inferiore) per rimuovere gli adattamenti dalle macchie autofluorescenti nel canale verde. La linea verticale magenta indica una soglia di 475 fotoni. Gli istogrammi sono calcolati dallo stesso numero di ROI per ciascun tipo di campione (n = 3). Barra della scala = 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Coding File 1: file zip contenente script e utilità per l'esecuzione dell'analisi SiMPull. Fare clic qui per scaricare questo file.

Supplementary Coding File 2: file zip contenente il pacchetto di analisi a singola molecola smite . Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 3: file zip contenente i dati di esempio. Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 4: file zip contenente output rappresentativi di analisi dei dati di esempio. Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 5: Progetto del supporto coverslip per la stampa 3D. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l'affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell'autofluorescenza con il trattamento con NaBH4 e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L'utilizzo della maschera a canale verde per identificare le posizioni dei recettori per il calcolo della colocalizzazione con l'anticorpo anti-PY migliora anche l'accuratezza della misurazione rimuovendo potenziali artefatti dal legame non specifico dell'anticorpo al lisato cellulare. L'imaging a due colori è stato utilizzato per rilevare la frazione di recettori fosforilati. In questo scenario, il recettore è stato geneticamente etichettato con GFP e l'anticorpo è stato direttamente etichettato con un colorante rosso lontano. L'approccio SiMPull si applica ad altri bersagli proteici per i quali sono disponibili anticorpi specifici, comprese le proteine intracellulari. Inoltre, poiché non sono richieste condizioni di denaturazione, è possibile acquisire anche recettori / complessi multisubunità. Tuttavia, la denaturazione può essere incorporata se i PTM di interesse si trovano in regioni strutturate della proteina14. In definitiva, SiMPull può essere facilmente ampliato per includere l'etichettatura simultanea di fosfo-tirosine distinte su singoli recettori per quantificare i modelli di fosforilazione multisito15. L'interrogazione di recettori intatti a lunghezza intera in questo modo non può essere raggiunta con altri metodi standard, tra cui il western blotting e la spettrometria fosfo-di massa.

Insieme ai vantaggi di SiMPull, è necessario considerare alcune limitazioni. Come per qualsiasi tecnica basata su anticorpi, l'affinità e la specificità degli anticorpi utilizzati sono fondamentali per il successo della misurazione. Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni di etichettatura degli anticorpi e idealmente evitare gli anticorpi secondari utilizzando anticorpi primari direttamente marcati. Inoltre, gli anticorpi legati alla superficie faranno precipitare le proteine localizzate sulla membrana plasmatica e all'interno dei compartimenti citosolici. Questo può sottovalutare la fosforilazione poiché le proteine localizzate in citosol non sono accessibili al ligando aggiunto esogenamente. Devono essere prese ulteriori misure per correggere i livelli superficiali del recettore (punto 6.2.10). Gli anticorpi anti-fosfotirosina hanno mostrato alcuni legami non specifici una volta che il lisato era presente. Per evitare questo artefatto, l'EGFR è stato geneticamente etichettato con GFP per identificare la posizione dei recettori, il che ci ha permesso di escludere il segnale anti-PY dal recettore. Se le proteine endogene devono essere interrogate, la controcolorazione con un anticorpo proteico totale può fornire l'immagine della maschera, con una correzione appropriata per qualsiasi legame non specifico. Infine, mentre SiMPull fornisce informazioni sull'eterogeneità a livello proteico, il lisato generato in questo protocollo proviene da migliaia di cellule e la variabilità da cellula a cellula viene persa. Tuttavia, i progressi verso il SiMPull a cella singola sono stati fatti utilizzando una camera di flusso costituita da un coperchio e un lato del microscopio con uno spazio di 10 μm; i batteri erano scarsamente placcati sul coperchio mentre il vetrino era funzionalizzato con anticorpi per catturare le proteine desiderate. Dopo la lisi dei batteri, le proteine di ciascuna cellula sono state catturate in un'area ristretta sul vetrino22 rivestito di anticorpi. Un'analisi SiMPull a singola cellula simile delle cellule di mammifero e la fosforilazione proteica potrebbero essere possibili in futuro.

Il protocollo SiMPull contiene diversi passaggi critici necessari per garantire dati di alta qualità. Ad esempio, il protocollo include una preparazione elaborata del vetro coverslip. Piranha etching coverslips pulisce a fondo il vetro e aumenta i gruppi ossidrilici e l'idrofilia, che sono necessari per ottimizzare la superficie del coverslip. Dopo diversi lavaggi con solventi organici, il trattamento KOH fornisce ulteriori gruppi ossidrilici per l'aminosilanizzazione13,23, che riveste il vetro con gruppi amminici per il legame PEG e biotina-PEG. La pulizia o la funzionalizzazione improprie in uno di questi passaggi interferiranno con il pull-down delle proteine. Il controllo del rapporto molare di PEG:biotina-PEG, insieme alla concentrazione di lisato, sono fattori chiave per ottenere un'appropriata densità IP proteica sul substrato SiMPull. Come con qualsiasi test biologico, c'è variabilità tra i preparati di lisato cellulare e piccole differenze tra le percentuali di fosforilazione possono essere osservate tra le repliche del campione. Pertanto, è importante misurare i livelli di fosforilazione di diversi siti di tirosina all'interno dello stesso campione. La camera di campionamento descritta in questo protocollo fornisce un sistema per raccogliere molti punti dati in una sessione di imaging e consente la media su più esperimenti SiMPull.

Sul lato dell'acquisizione dell'immagine, è importante ottenere il campione fiduciale per garantire un'accurata sovrapposizione del canale; in caso contrario, la colocalizzazione non sarà accurata. È anche importante ottimizzare la potenza del laser e le impostazioni della fotocamera per massimizzare il rapporto segnale-rumore e allo stesso tempo ridurre al minimo il fotosbiancamento. Infine, mentre l'array di campioni richiede una piccola quantità di campione e reagenti, i bassi volumi sono suscettibili di evaporazione durante la sessione di imaging. È importante controllare periodicamente l'array di campioni (~ 30-45 min) e aggiungere il buffer secondo necessità per evitare che i campioni si secchino.

Il presente protocollo ha dimostrato l'uso di SiMPull per quantificare gli stati di fosforilazione del recettore di membrana. Mentre si concentra sull'EGFR, l'approccio può essere applicato ad altri recettori della superficie cellulare e proteine intracellulari e complessi proteici, purché siano disponibili anticorpi appropriati. Un altro potenziale utilizzo di SiMPull è quello di interrogare il contenuto e lo stato di fosforilazione dei condensati separati di fase. Inoltre, SiMPull può essere utilizzato per misurare altri PTM, come l'ubiquitinazione. Pertanto, SiMPull fornisce uno strumento unico per i biologi cellulari per interrogare i PTM su proteine intatte e correlare i modelli PTM con il risultato cellulare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 to DSL. EMB è stato supportato attraverso il programma ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e JAR dal programma UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Riconosciamo con gratitudine l'utilizzo della risorsa condivisa di microscopia a fluorescenza del Comprehensive Cancer Center dell'Università del New Mexico, supportata da NIH P30CA118100. Vogliamo ringraziare i dottori Ankur Jain e Taekijip Ha, il cui sviluppo originale di SiMPull ha ispirato questo lavoro.
Indirizzo attuale di ES-C: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

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References

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Biochimica Numero 184
Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine
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Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

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